专利名称：巴斯德毕赤酵母醇氧化酶ii调节区的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组DNA生物技术领域。本发明的一个方面涉及调节DNA转录的DNA顺序。本发明的另一方面涉及插入上述DNA顺序的载体。本发明的再一个方面涉及用上述载体转化的新的细胞。
本发明一般地涉及遗传物质的操作，特别是从DNA转录RNA之频率的调节。本发明特别涉及巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)醇氧化酶Ⅱ基因的调节区。
随着近年来重组DNA生物技术的发展，已有可能由细胞控制性地产生许多种有用的多肽。已由各种微生物产生了许多真核细胞多肽，如人生长激素、白细胞干扰素、人胰岛素和人胰岛素原。继续应用这些已掌握的技术可望在将来以重组法产生各种其他有用的多肽产物。
在重组技术领域中使用的基本技术是本领域中技术人员已知的。
为完成重组DNA生物技术所需的组成要素包括，但不只限于(1)编码一条或多条所需多肽的基因，其中所说的基因是与适当的控制顺序可操作地连接以便在宿主细胞中表达该基因(可操作地连接是指各成份构成相邻的位置，能够执行其正常功能);
(2)一种载体，通常是可向其中插入一核苷酸顺序的质粒;载体可以是任何能转化某宿主的含核苷酸顺序之构建物;
(3)可将所需之核苷酸顺序转化到其中的一种适当的宿主，宿主也具有使外来的核苷酸顺序编码的信号得以表达的细胞器。
用于重组技术的基本要素是质粒，其为最初见于微生物内的染色体外的环形双股DNA。已知每个细胞内可出现多个质粒拷贝。除天然存在的质粒外，也已制备了各种人工质粒。质粒中包含质粒复制所需要的信息，即自主复制顺序和/或复制原点。质粒中编码的信息还可包括在转化的细胞内进行表型选择的一种或多种标志。表型或标志选择特征，如对抗生素的抗性，可使含目的质粒的宿主细胞克隆被识别并可根据细胞在筛选培养基中生长优势而筛选之。载体或质粒能被一种或多种限制性核酸内切酶特异地切断，这些种酶均可识别一特定的核苷酸顺序。因此，与一个异源基因(即天然状态下该调节基因不与之组合的)可操作地连接的调节区，或者是与其它的核苷的顺序可操作地连接的调节区，能够与所要求的遗传物质可操作地于切割位点或切割位点处构建的末端连接。
然后将载体导入宿主细胞，此时其核苷酸顺序可指导宿主完成各种过程或功能。一些例子包括表达异源多肽。一般将核苷酸引入宿主细胞的过程称为转化。可将载体导入适当宿主内增加拷贝数得到大量载体。常用于增加载体拷贝数的宿主细胞是大肠杆菌。然后从第一种宿主中分离载体并引入第二种宿主，以在其中出现预期的载体指导的活动，如多肽的产生。以这种方式由DNA产生终产物称为表达。当将其基因适当地插入载体同时考虑到载体控制编码之核苷酸顺序的转录和转译时，即可用所得载体指导由插入之基因编码的多肽肽链的生产。
表达是由一调节区控制的。调节区是对各种刺激起反应并影响RNA转录频率的异源核苷酸顺序。对刺激作出反应而打开或关闭表达过程。对刺激作出反应而开始表达通常称为去阻遏或诱导。可诱导之表达系统的一些例子有巴斯德毕赤酵母中的APXI系统、有爪蟾蜍(Xenopuslaevis)中的雌激素体系，以及猴、人、仓鼠、小鼠和大鼠中的金属巯基体系。诱导表达体系比组成体系通常处于更强烈的控制之下。诱导表达体系非常适于基因工程目的。
实践中，可使用重组DNA生物技术产生能表达异源核苷酸顺序的细胞。异源核苷酸顺序为并非天然存在于宿主内的核苷酸顺序。其可以是天然存在于宿主内之调节区与同该调节区无天然关联之结构基因形成的新的重组。另一个例子是某调节区与并非天然存在于宿主内之某一个基因的重组。异源多肽可作为一种融合多肽而产生，即同同源或异源多肽氨基酸顺序的一部分融合的异源多肽。最初得到的融合多肽产物有时是以无活性形式产生的，只有当在细胞内某种环境下被裂解后才有活性。
如先前在欧洲专利申请86114700.7号(已列为参考文献)所述，巴斯德毕赤酵母基因组编码两个醇氧化酶功能基因AOX1和AOX2。
我们已发现了与AOX2结构基因有关的5′调节区。该调节区可被甲醇或碳源饥饿所诱导。但自AOX2调节区表达的最高水平只是AOX1调节区的5-11%左右(AOX1是在列为本文参考文献之欧洲专利申请85201235.0号中公开的)。
可利用AOX2调节区表达异源基因，并特别适用于那些高水平表达蛋白质不利的情况下。
根据本发明，我们已发现、分离并鉴定了一个调节RNA转录之频率的DNA顺序。本发明的新的DNA顺序用于由甲基营养性酵母如巴斯德毕赤酵母产生多肽。
图1显示了AOX1(a)和AOX2(b)基因的限制图谱。
图2显示了pBR322的限制图谱。
图3显示了pYJ8的限制图谱。
图4显示了质粒pYM5的限制图谱。
图5显示了质粒pMR4的限制图谱。
图6显示了构建pMR4的流程图。
图7显示了质粒pBPf1的限制图谱。
图8显示了质粒pYJ55的限制图谱。
图9显示了构建质粒pYJ55的流程图。
图10显示了质粒pSAOH5的限制图谱。
根据本发明，其提供一含有至少对下述的一个条件起反应之调节区的新DNA顺序在宿主环境中存在甲醇或当宿主细胞生长于非甲醇底物上时发生碳源饥饿。本发明的调节区当可操作地连接在编码mRNA的DNA顺序5′端时，能够控制RNA转录的频率。
根据本发明的另一个实施方案，其提供了含上述DNA顺序的质粒和转化的生物体以及产生这些质粒和生物体的方法。
从本文提供的详细描述和权利要求将会更清楚地了解本发明的这些和其他目的。
Ⅰ.醇氧化酶调节区的特征图1(b)中提供的限制图谱内显示完整的AOX2基因。如图1(b)的限制图谱所示，AOX2调节区处于5′端的第一个EcoRⅠ位点和AOX2结构基因的起始密码子之间。编码醇氧化酶Ⅱ蛋白质之该部分DNA顺序是由限制图谱下粗线标示的。图1(a)为比较两个基因而提供了醇氧化酶Ⅰ基因的限制图谱。在基因的编码蛋白质的顺序以外没有观察到明显的顺序同源性。
已通过lacZ融合构建物进一步确定了AOX2调节区的特征，要求不少于约从碱基对-1500至碱基对-1的顺序来满足调节活性(如表1所示)。
表1中提供了含AOX2调节区之DNA片段的核苷酸顺序。
表1AOX2调节区和5′非转译区-1750-1730-1710GGATCTCAAAAACCTAAGTACTTCATTTGAATATAACTCTGCACCTAAATTTACACCTAA-1690-1670-1650CTCTCTATCTAGGCTCTAGATTTGATAGATTCTATAGCCTTTGGTTTGTTATAGTGTTCA-1630-1610-1590CCAACTGGATGTCCTAACGAAATGGTTCTGTGGTCTAGTTGGTTATGGCATATGCTTAAC-1570-1550-1530ACGCATAACGTCCCCAGTTCGATCCTGGGCAGAATCATTATTTTTTGACCGAATTCTTTT-1510-1490-1470TTTCAGACCATATGACCGGTCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT-1450-1430-1410CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT-1390-1370-1350TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA-1330-1310-1290GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT-1270-1250-1230CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG-1210-1190-1170TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG-1150-1130-1110CCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG-1090-1070-1050CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA-1030-1010-990AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT-970-950-930AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT-910-890-870CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA
-850-830-810CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA-790-770-750AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG-730-710-690TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG-670-650-630AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA-610-590-570TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC-550-530-510TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT-490-470-450TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC-430-410-390AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT-370-350-330CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG-310-290-270CATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT-250-230-210ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA-190-170-150AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA-130-110-90AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT-70-50-30CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA-10AACAAATCAACTGAGAAAA
AOX2调节区至少对下述条件之一起反应以甲醇作为甲基营养性酵母宿主如巴斯德毕赤酵母的唯一碳源，或所说宿主细胞的碳源饥饿。此外AOX2调节区刺激β半乳糖苷酶的蛋白质产量约为AOX1调节区的5-11%。
Ⅱ.由巴斯德毕赤酵母中分离醇氧化酶调节区经转化毕赤酵母(pichia)菌株MC100-3(arg 4 his 4 aox 1△;;SARG4 aox 2 △;;phis4)分离AOX2调节区。用p YM5质粒转化含已插入AOX2基因MC100-3之毕赤酵母HIS4基因突变拷贝的该菌株，其中所说的质粒由含有在p BR322之BamHⅠ位点插入之毕赤酵母HIS4基因的2.7kb BglⅡ阶段组成的。用Southern滤膜杂交法筛选几个MC100-3(p YM5)His+转化体的DNA，以得到含有与位于MC100-3之AOX位点之HIS4片段整合的p YM5的转化体。然后用Hind Ⅲ消化这些转化体之一的DNA，导致含AOX2 KpnⅠ位点之5′端5.3kb的顺序、2.7kb之毕赤酵母HIS4基因和4.0kbp BR322的一共约12kb基因组片段的释放。连接Hind Ⅲ切断的DNA并转化到大肠杆菌中。根据抗氨苄青霉素抗性选择转化株。回收质粒pMR4，该质粒的限制图谱示于图5。
Ⅲ.AOX2调节区的性质为比较AOX2和AOX1调节区的表达水平，按与pSAOH5(如图10所示，为-AOX1-lacZ融合载体)尽可能相似的方法构建一个AOX2-lacZ表达载体。图9中显示了AOX2-1acZ载体即pYJ55的构建流程。根据AOX25′端的初步DNA顺序资料揭示，AOX2在结构基因位置上含有两个BamHⅠ位点，与AOX1结构基因所见相同。因此，构建pYJ55的第一步是将含有AOX2调节区和45个碱基对之氨基末端蛋白编码顺序的1.8kbBglⅡ-BamHⅠ片段插入pBPf1的BamHⅠ位点，构成pYJ38。第二步是用BamHⅠ切割pYJ38，并插入与构建AOX1-1acZ载体而插入的同一接头寡核苷酸(5′-GATCACCCGGGT-3′)。该接头的插入破坏了pYJ38的BamHⅠ位点，并在插入点产生了一个新的SmaⅠ位点。用SmaⅠ消化该质粒pYJ45，并将含有修饰过的AOX2启动子的1.8kbSmaⅠ片段插入pBPf1构成质粒pYJ46。用EcoRⅠ消化质粒pJY46以由pYJ46中AOX2片段的5端除去-0.3kb片段。再连接质粒构成质粒pYJ55。图8中提供了质粒pYJ55的限制性酶切图谱。
将质粒p YJ55转化到GS115(his 4)中，并根据表明存在整合之质粒的稳定的His+表型筛选His+转化株。用Southern滤膜杂交法分析几个稳定的His菌株中的基因组DNA，以证实质粒的存在并确定其定位。
为估计AOX1和AOX2的相对强度，通过将这些质粒转化到GS115中来比较由pYJ55和pSAOH5产生的β半乳糖苷酶。转化的GS115菌株分别被定各为GS115(pYJ55)和GS115(pSAOH5)。各菌株均含有在HIS4位点整合的质粒。使各菌株的细胞生长在甘油培养基中，移入没有碳源的培养基中培养24小时，然后再移入含甲醇的培养基中继续培养50小时。在各生长期终了时取出各培养物的样品，制备抽提物并检测β半乳糖苷酶。分析结果如表2中所示。
表2比较AOX1-和AOX2-lacZ融合体的β-半乳糖苷酶表达在碳源中的β-半乳糖苷酶活性(U/μg)菌株启动子甘油无碳源1甲醇GS115(pSAOH5)AOX1＜109566，205GS115(pYJ55)AOX2＜101097391YNB培养基生长于含甘油培养基中的AOX1-lacZ或AOX2-lacZ菌株细胞均未见到显著水平的β半乳糖苷酶。在没有碳源的培养基中，AOX2-1acZ菌株内的酶活性水平约为AOX1-1acZ菌株中观察到的1/10。向含AOX2-1acZ的细胞中加入甲醇，使β半乳糖苷酶的水平约达到AOX2-1acZ细胞的1/9。因此AOX1和AOX2基因是以相似方式被调节的。一个突出的特征是AOX2调节区对甲醇和碳源饥饿的反应弱得多。
虽然本文描述了将融合的AOX2调节区-β半乳糖苷酶基因导入宿主酵母细胞的方法，但本领域技术人员理解，不必为实施本发明而利用环形质粒或β半乳糖苷酶结构基因。因此，可在利用这一连有其它异源基因的调节区时，使用能被保留于酵母中的其他载体。另外，可使用整合载体，将这一可操作地连接到其他异源基因上的调节区整合到宿主酵母细胞的染色体内。还可使用本文描述之由5′端较短DNA顺序组成的，AOX2调节区的功能性突变顺序调节异源基因的表达。
实施例与实施例有关的一般性资料菌株巴斯德毕赤酵母NRNLY-11430巴斯德毕赤酵母GS115(his4)NRRLY-15851巴斯德毕赤酵母PPF1(arg4his4)NRRLY-18017巴斯德毕赤酵母KM7121(arg4his4aox14;;aox2△;;PHIS4)NRRLY-18019大肠杆菌MC10611FaraD139△(araABDIC-leu)7679△lacX74galugalkrpsLhsdR]培养基、缓冲液和溶液IMTris缓冲液121.1gTris碱溶于800ml水中，用浓盐酸(35%)调节到所需pH值;调整pH前将溶液冷却至室温，最后稀释到终体积1升TE缓冲液1.0mMEDTA溶于0.01M(pH7.4)Tris缓冲液
SSC0.15MNacl15mM柠檬酸钠用NaOH调到pH7.0TAE40mM乙酸5mMEDTA溶于0.02M(pH8.3)Tris缓冲液Denhardt′溶液(50X)5gFicoll5g聚乙烯吡咯烷酮5g牛血清白蛋白(BSA;
PentaxFrectionV)加水至总体积500ml20×SSPE20mMEDTA0.16MNaOH0.2M NaH2PO4·H2O3.6MNaCl用NaOH调至pH7.0
LB(Luria-Bertain)培养基5gBacto-trypton5g酵母提取物2.5gNaCl溶于1升水，并用NaOH调至pH7.5YPD培养基1%酵母提取物2%Bacto-trypton2%右旋糖YNB培养基6.75g无氨基酸酵母氮源(DIFCO)溶于1升水中SED1M山梨醇25mMEDTA50mMDTT
SCE缓冲液9.1g山梨醇1.47g柠檬酸钠0.168gEDTA50ml H2O用HCl调到pH5.8CaS1M山梨醇10mM CaCl2过滤除菌PEG溶液20%聚乙二醇-335010mM CaCl210mMTris·HCl(pH7.4)过滤除菌SOS1M山梨醇0.3×YPD培养基10mM CaCl2甲酰胺染料0.1%XylenecylenolFF混合物0.2%溴酚兰10mMEDTA95%去离子甲酰胺顶层凝胶76.8g尿素24ml丙烯酰胺贮备液8ml10×TBE加至终体积160ml丙烯酰胺38g丙烯酰胺储备液2g双-(N，N′-亚甲双丙烯酰胺)加水至终体积为100ml底层凝胶14.4g尿素3.0g蔗糖7.5ml10×TBE4.5ml丙烯酰胺储备液0.3ml溴酚兰溶液(0.01g/ml)加水至总体积为30ml二脱氧ddATP0.125mMddCTP0.10mMddTTP0.80mM
DNTP储备液0.5mMdGTP0.5mMdCTP0.5mMTTP0.5mMdATP10XKlenow稀释缓冲液70mMTris·HCl，pH7.5200mMNaCl70mM MgCl21mMEDTA10XTMD，pH7.50.1MTris·HCl，pH7.50.05M MgCl20.075MDTT除另外具体说明者外，上述溶液均指所使用的基本(Ⅸ)浓度。各实施例中所用的不同浓度是指用基本(Ⅸ)浓度之不同倍数表示的溶液。
再生琼脂(1)琼脂-KCl9g Bacto-琼脂、13.4g氯化钾，240mlH2O、高压灭菌。
(2)10X葡萄糖20g右旋糖、100mlH2O，高压灭菌。
(3)10X YNB6.75g无氨基酸酵母氮源，100mlH2O、高压灭菌。(高压灭菌前或后，加入浓度达200μg/ml任何所需的氨基酸或核酸)。
(4)向240ml熔溶的琼脂-KCl溶液内加入30ml10X葡萄糖和30ml10XYNB。加入0.6ml生物素(0.2mg/ml)和浓度达20μg/ml的任何其他所需氨基酸或核酸。于55°-60℃保持已熔溶的再生琼脂。
巴斯德毕赤酵母的生长使巴斯德毕赤酵母生长于YPD(富集)或YNB(基本)培养基。必要时可向YNB培养基内添加碳源(2%右旋糖、1%甘油或0.5%甲醇)和50μg/ml氨基酸。
顺序测定用Sanger等人[PNAS74，5463，(1977)]的双脱氧核苷酸链终止方法进行DNA顺序分析。
实施例中使用了下列缩写符号EDTA乙二胺四乙酸TEMEDN，N，N′，N′-四甲基乙二胺DTT二硫苏糖醇BSA牛血清白蛋白EtBr溴乙锭Ci居里dATP脱氧腺苷三磷酸dGTP脱氧鸟苷三磷酸TTP胸苷三磷酸dCTP脱氧胞苷三磷酸dXTP“通用”脱氧三磷酸核苷酸寡(dT)12-18购于CollaborativeResearch有限公司Zymolyase60，000购于Miles实验室公司醇氧化酶Ⅱ调节区的分离实施例ⅠPPFIXKM7121的接合和MC100-3的获得将得自新鲜YPD平皿的巴斯德毕赤酵母PPF1(arg4his4)(NRRLY-18017)和KM7121(arg4his4aox 1△;;SARG4 aox 2△;;PHIS4)(NRRL Y-18019)分别接种到含无菌水的试管中。混合各菌株的约5×107个细胞，用超声波简短地破碎细胞团块，并散布于GNAP琼脂平皿(5%右旋糖、2%蛋白胨、1%酵母提取物、0.5%琼脂、2.3%蛋白胨、1%酵母提取物、0.5%琼脂、2.3%营养琼脂)上。以同样方法处理各菌株(约1×108个细胞)的未混合的对照样品。将GNAP平皿于30℃下保温约24小时，然后复制在孢子形成培养基琼脂平皿(0.5%乙酸钠、1%KCl、2%琼脂)上。将这些平皿于30℃于保温约20小时，然后再复制在不含碳源的基本培养基琼脂平皿上。以蒸汽相的基本平皿上的细胞提供甲醇。
5天后，在接受了混合细胞的基本平皿上出现了约200个菌落。在未混合的对照平皿上没有长出菌落，这一结果提示混合的平皿上的Arg+His+Mut+菌落由PPF1与KM7121细胞(Mut+＝甲醇利用)接合所形成的二倍体。用Southern滤膜杂交法检验其中四个菌株的AOX位点，以证实这些Arg+His+Mut+菌株的二倍体性质。所使用的特异性探针是p PG3.0(NRRL B-18022)，AOX2的一个特异性探针;p YJ30 pYJ30(NRRL B-15890)，HIS4的一个特异性探针;和p PG4.0(NRRL B-15868)，AOX1的一个特异性探针。
为形成pPF1 X KM7121二倍体孢子，首先从甲醇培养基二倍体选择平皿中回收一菌落(MC100)。将大约1×106个细胞散布于GNAP平皿上并按上述接合方法处理之，不同的是将孢子形成平皿于30℃下保温4天，以使细胞完全形成孢子。用5ml无菌水冲洗各平皿以由平皿中回收孢子。将悬浮液用3ml磷酸盐缓冲液(0.1M Na3PO4、pH7.5)洗两次。加入终体积分别达2%(v/v)、0.5mg/ml和0.1%的酵母溶胞酶Glusulase(Endo Laboratories，NY)、Zymolyase(60，000单位/克;Miles Laboratories)和β-巯基乙醇的混合物，以破坏营养细胞。混合物于30℃保温5小时。
然后将孢子制剂在含有0.2%吐温80(Tween80)(v/v)的无菌水中洗两次并悬浮于磷酸盐缓冲液中。再将制剂用超声波处理三次(每次20秒钟)以打碎孢子团块。然后稀释孢子制剂的样品，并散布在含2.0%葡萄糖和各50μg/ml精氨酸及组氨酸之基本培养基的无选择性原始皿上。于30℃下保温48小时。然后将各原始皿内容物复制辅敷在下述一系列基本平皿上;1)葡萄糖，-arg，-his;2)葡萄糖，-arg，+his;3)葡萄糖，+arg，-his及4)葡萄糖，+arg，+his。
于30℃保温24小时后，检查菌落的Arg和His表型。然后划线接种在YNB甲醇琼脂平皿上以分析Arg+His-的菌落在甲醇上生长情况。室温培养约一周后，检验平皿上呈现的Mut表型。将一个Arg+His-Mut-菌株定各为MC100-3。
实施例Ⅱ巴斯德毕赤酵母的转化将酵母细胞接种到约10mlYPD培养基中并于30℃下振荡培养12-20小时。然后将细胞悬浮液稀释到A600约0.01至0.1，在YPD培养基中30℃保持对数生长6-8小时。取0.5mlA600约为0.1的种子菌接种在100mlYPD培养基中并于30℃下振荡培养约12-20小时。当A600约为0.2-0.3时(约16-20小时后)，使用DAMONIECDPR-6000型离心机于1500g离心5分钟，以收获培养物。
为制备原生质球，将细胞在10ml无菌水、10ml新制备的SED及10ml无菌的1M山梨醇中各洗一次(每次洗后均按上述方法离心)，然后重新悬浮于5mlSCE缓冲液中。加入5μl浓度为4mg/ml的Zymolyase60，000(MilesLaboratories)并于30℃下保温约30分钟。
按下述方法监测原生质球的形成。在加入Zymolyase之前或刚刚加入之后以及在保温期的不同时间，向900μl5%SDS或900μl1M山梨醇内分别加入100μl等份的细胞。当细胞在SDS中溶胞但不在山梨醇的溶液中溶胞时终止保温。一旦形成了原生质球，即用离心方法(1，000g，5-10分钟)将其在10ml无菌的1M山梨醇中洗一次，在10ml无菌CaS中洗一次，然后再新悬浮于0.6mlCaS中。
为使转化能真正进行，将溶于水或TE缓冲液内的DNA样品(约体积达20μl)加入12×75mm无菌聚丙烯试管内(对于小量DNA，为获得最大转化率，可在各样品中使用1μg(浓度为5mg/ml)超声处理的大肠杆菌DNA)。各DNA样品内加入100μl原生质粒，并于室温下保温约20分钟。向各样品内加入1mlPEG溶液并于室温下保温约15分钟。将样品于1，000g离心5-10分钟并弃去上清。将细胞沉淀物再悬浮于150μlSOS中并于室温下保温30分钟。各加入850μl无菌的1M山梨醇并按下述方法铺板。
在转化样品准备好之前至少30分钟向各平皿倒入10ml再生琼脂。在转化样品处于SOS内时，同时向45-50℃水浴中的试管内分加10ml等分的再生琼脂。然后将样品加入试管内，倾注到含有固态底层琼脂的平皿上，并于30℃下保温3-5天。
按下述方法检测各不同时间原生质球的质量。取10μl样品并加入990μl 1M山梨醇将其稀释100倍。取10μl稀释液，再加990μl等分的1M山梨醇。各取100μl稀释液铺布于YPD琼脂培养基上，以检测保留于制制中未形成原生质球的完整细胞数。将各100μl稀释液加至已添加了40μg/ml宿主所需之所有氨基酸的10ml再生琼脂中，以检测总的可再生原生质球。用于转化实验的最佳值是1-3×107个可再生原生质球/ml和大约1×103个完整细胞/ml。
实施例ⅢMC100-3(pYM5)的构建用BamHⅠ消化约10μg p BR322并使之去磷酸化。用Bg1Ⅱ消化约50μg含有毕赤酵母属HIS4基因的p YJ8(NRRL B-15889)。自0.8%制备性琼脂糖凝胶中分离-2.7kbBglⅡ片段。在含有66mM Tris·Cl(pH7.4)、6.6mMMg Cl2、10mM DTT和0.4mM ATP的10μl总体积中使用0.5单体T4DNA连接酶使300ng BglⅡ片段与300ngBamHⅠ消化的p BR322于4℃下连接24小时。
按实施例Ⅴ中所述方法用连接混合物转化大肠杆菌MC1061使之成为氨苄青霉素抗性菌株。用限制性酶切方法鉴定转化株，并用琼脂糖凝胶电泳法鉴别有正确插入片段长度和正确插入方向的转化株。将该质粒定名为pYM5，并使用Maniatis等人(Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambroox，J.(1982)，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY)所述的碱溶解质粒制备技术由大肠杆菌中回收之。
转化MC100-3之前用StuⅠ消化约10μgpYM5。该步骤在于使质粒在MC100-3中一个HIS4基团顺序处，即天然HIS4位点或修饰的AOX2位点上进行整合。按实施例Ⅱ中简述的方法完成转化过程。
按实施例Ⅳ的方法分离几个MC100-3(p YM5)His+转化株内的DNA，并用Southern滤膜杂交法筛选含有在位于AOX2上HIS4片段处整合之p YM5的转化体。所用的特异性探针是pPG3.0(NRRLB-18022)，为AOX2的一个特异性探针;pYJ30(NRRLB-15890)，为HIS4的一个特异性探针。
醇氧化酶Ⅱ调节区的性质实施例.Ⅳ酵母DNA制备在加有2%右旋糖的100mlYNB培养基中于30℃下培养酵母细胞，直到A600等于1-2，然后用DamonIECDPR-6000离心机以2，000g离心5分钟，以沉淀细胞。将细胞团块在蒸馏水中、SED中、1M山梨醇中相继各洗一次，然后再悬浮于5ml含0.1MTris·Cl(pH7.0)和1M山梨醇的溶液中。将细胞与50-100μl浓度为4mg/ml的Zymolyase60，000(MilesLaboratories)溶液混合于30℃下保温1小时。然后将所得原生质球以1，000g离心5-10分钟并悬浮在5ml溶胞缓冲液
中。加入各100μg/ml蛋白酶K(BoehringerMannheim)和RNaseA(Sigma)并将溶液于37℃下保温30分钟。该制剂与等体积含有异戊醇的氯仿(1∶24，v/v)轻轻混合，并以12，000g离心20分钟以分离各相以除去DNA中的蛋白。将上层水相吸入干净的试管内，并用等体积酚/氯仿/异戊醇提取之。按上述方法分离两相并将上层水相加入含2-3倍体积100%冷乙醇的试管内。轻轻混合样品，并经卷绕在塑料棒上以收集DNA。将DNA直接溶解于1mlTE缓冲液中并对100倍体积TE缓冲液透析过夜。
实施例ⅤpMR4的构建按实施例Ⅳ的方法自实施例Ⅲ中制得的MC100-3(pYM5)His+转化株分离DNA。用HindⅢ消化10μg该基因组DNA并连接之。使连接反应在含66mM Tris·Cl(pH7.4)、6.6mM MgCl2、10mM DTT、0.4mM ATP和0.5单位T4 DNA连接酶的反应混合物中于4℃下进行24小时。
直接用连接反应混合物转化已按Maniatis人(1982)所述方法制成转化作用感受态的大肠杆菌MC1061细胞。在添加了50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基或LB培养基(0.2%(NH4)3PO4，1.2%Na2HPO4，0.013%MgSO4·7H2O，0.074%CaCl2·2H2O、1μg/ml硫胺素，0.4%右旋糖)中培养细胞以选择氨苄青霉素抗性菌株。
按Miniatis等人(1982)所述的方法回收一定名为pMR4的12.0kb质粒。该质粒含有AOX2KpnⅠ位点的5′端5.3kbDNA、毕赤酵母属HIS4基因的2.7kb部分和pBR322的4.0kb部分。
实施例ⅥpYJ55的构建为检验AOX2启动子的调节和表达作用，构建-含有与大肠杆菌lac Z基因融合之AOX2 5′顺序的载体。按制造者推荐的方法用BglⅡ和BamHⅠ消化50μg p MR4(实施例Ⅴ)。自0.8%制备性琼脂糖凝胶中分离含有AOX2启动子的1.8kb BglⅡ-BamHⅠ片段。用BamHⅠ消化10μg p BPf1(NRRL B-15892)并在50μl反应体积中使用碱性磷酸酶使之去磷酸化(在50mM Tris·Cl，pH9.0、1mM MgCl2、100μM ZnCl2、1mM亚精胺中于37℃用1单位酶处理1小时)。按下述方法用T4连接酶连接300ng 1.8kb片段和300ng pBPf1。连接反应在含有66mM Tris·Cl(pH7.6)、5mMMgCl2、5mM二硫苏糖醇、1mM ATP和1 Weiss单位T4连接酶的10μl反应体积中于23℃下进行1小时，所得载体被定名为p YJ38。
按下述方法在pYJ38中产生一新的SmaⅠ限制性位点。使用AppliedBiosystemsDNA合成仪(380A型)，通过氰乙基氨基磷酸酯化学合成接头寡核苷酸;
5′-GATCACCCGGGT-3′用BamHⅠ消化10μg p YJ38并按上述方法用碱性磷酸酶处理之。按上述方法用T4连接酶连接1μg上述接头和0.1μg BamHⅠ消化的p YJ38。此种经修饰的载体被称为p YJ45。用SmaⅠ消化50μg p YJ45得到含有经修饰之AOX2启动子的1.8kb SmaⅠ片段。由0.8%制备性琼脂糖凝胶中分离该片段。按上述方法连接0.3μg片段和0.3μg SmaⅠ消化的p BPf1以构成载体p YJ46。按上述方法由p YJ46中AOX2片段的5′端删除-0.3kb EcoRⅠ片段。用EcoRⅠ消化10μg p YJ46并按上述方法用碱性磷酸酶处理之。同时用EcoRⅠ消化另一份50μg p YJ46并由0.8%制备性琼脂糖凝胶中分离1.5kb片段。连接约各0.3μg磷酸酶处理的p YJ46和分离的1.5kb片段并按上述方法转化到大肠杆菌内。分离一具有正确结构的质粒并定名为p YJ55。
实施例Ⅶ菌株GS115(pYJ55)的建立按实施例Ⅱ中所述方法用质粒pYJ55(实施例Ⅱ)转化组氨酸营养缺陷型巴斯德毕赤酵母GS115(NRRLY-15851;his 4)。用Southern滤膜杂交法分析得自稳定的His+菌株的基因组DNA以确定质粒在基因组DNA中的位点。一个含有在HIS4位点整合之p YJ55的转化体被称为GS115(pYJ55)。
实施例ⅧAOX1和AOX2启动子的比较经检测菌株GS115(pSAOH5)和GS115(pYJ55)的β半乳糖苷酶活性比较了AOX1和AOX2启动子调节和表达作用。使各菌株的100ml培养物在加有1%甘油的YNB培养基中30℃下生长24小时，然后移入没有碳源的YNB培养基中于30℃下生长24小时，再移入加有0.5%甲醇的YNB培养基中于30℃生长50小时。于下述不同时间收集各培养物的样品;1)在甘油培养内生长24小时后，2)在无碳源培养基内生长24小时后，3)在甲醇培养基内生长24和50小时后。分别制备提取物并按下述方法分析β-半乳糖苷酶活性。分析结果如表2所示。
β-半乳糖苷酶活性分析1)所需溶液Z-缓冲液终浓度
Na2HPO4·7H2O 16.1g 0.06MNaH2PO45.5g 0.04MKCl0.75g0.01MMgSO4·7H2O 0.246g 0.001M2-巯基乙醇2.7ml0.05M加至1升;pH应为7邻-硝基苯基-β-D-半乳糖苷(ONPG)将400mgONPG(SigmaN-1127)溶于100ml蒸馏水中，制成4mg/mlONPG溶液2)无细胞蛋白提取物制备各样品在蒸馏水中洗一次，在溶胞缓冲液中洗一次，并重新悬浮于溶胞缓冲液中(浓度为150A600/ml。向350μl等分样品内加入0.5g玻璃珠，并将混合物在搅拌器上搅拌4次，每次60秒钟后，置于冰浴间隔一分钟。从玻璃中分离细胞浆，并在微量管中将悬浮液离心5分钟。将上清液移入聚丙烯小管中继续分析。用Bradford测定法(Bio-Rad)检测各提取物中的总蛋白量。用BSA作为蛋白质标准品。
3)检测方法
1-50μl无细胞蛋白提取物加入1mlZ缓冲液中。然后搅拌混合物并于30℃下保温5分钟。加入0.2μlONPG(4mg/ml)以起始反应。适当时间后(A420＜1)再加入0.5ml1MNaCO溶液终止反应。然后读出420nm吸光率。
4)β-半乳糖苷酶活性单位的计算1单位＝于30℃和pH7条件下每分钟形成的1nM邻位硝酸苯酚(ONP)。1nMONP于420nm处的吸光值(A420)为0.0045(光程长度为1cm)。因此，420nm处吸光值1代表222nMONP/ml，或378nMONP/1.7ml(分析的上清液总体积为1.7ml)。表2中给出的单位数是按下列公式计算的U＝ (A420)/(t(分钟)) ×378
权利要求
1.编码甲基营养酵母醇氧化酶Ⅱ调节区的DNA顺序，所说的调节区对作为宿主唯一碳源之甲醇的存在起反应，且其中所说的顺序是包含于如图1(b)限制性酶切图谱所示的5′端第一个EcoRI位点与AOX2结构基因起始密码子之间的顺序和其功能性突变顺序。
2.编码酵母醇氧化酶Ⅱ调节区的DNA顺序，其中所说的DNA顺序是-1490-1470TCCATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT-1450-1430-1410CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT-1390-1370-1350TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA-1330-1310-1290GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT-1270-1250-1230CCTAATAGAGGTTCGATACTTATTTTGATAATACGACATATTGTCTTACCTCTGAATGTG-1210-1190-1170TCAATACTCTCTCGTTCTTCGTCTCGTCAGCTAAAAATATAACACTTCGAGTAAGATACG-1150-1130-1110CCCAATTGAAGGCTACGAGATATCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG-1090-1070-1050CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA-1030-1010-990AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT-970-950-930AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT-910-890-870CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA-850-830-810CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA-790-770-750AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGATGGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG-730-710-690TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGAGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG-670-650-630AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA-610-590-570TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC-550-530-510TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT-490-470-450TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC-430-410-390AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT-370-350-330CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG-310-290-270CATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT-250-230-210ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA-190-170-150AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA-130-110-90AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT-70-50-30CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA-10AACAAATCAACTGAGAAAA和其功能性突变顺序。
3.根据权利要求1的DNA顺序，其中所说的顺序被可操作地连接于异源基因上。
4.根据权利要求2的DNA顺序，其中所说的顺序被可操作地连接到异源基因上。
5.基本上纯的巴斯德毕赤酵母菌株，其为精氨酸原养型、组氨酸营养缺陷型的，并且不能利用甲醇作为碳源。
6.根据权利要求5的菌株，其中所说的菌株是MC100-3。
全文摘要
一个含有来源于巴斯德毕赤酵母第二醇氧化酶基因调节区(Pichia Pastoris)的新的DNA顺序，以及含有可操作地连接于异源DNA结构基因上之所说调节区的新的DNA构建物。
文档编号C12N15/00GK1039616SQ8910425
公开日1990年2月14日 申请日期1989年6月23日 优先权日1988年6月24日
发明者詹姆斯·迈克尔·克里格 申请人:菲利浦石油公司