专利名称：编码具有腈水化酶活性的多肽的dna片段、含该基因的转化株和用该转化株生产酰胺的方法
技术领域：
本发明涉及由玫瑰色红球菌J-1(RhodococcusrhodochrousJ-1)产生的并编码具有将腈水化为酰胺的腈水化酶活性的多肽的DNA片段。本发明还涉及含该DNA片段的重组DNA和用该重组DNA转化的转化株。本发明进一步涉及用该转化株生产腈水化酶和用该腈水化酶生产酰胺的方法。
公众已知腈水化酶是一种将腈水化为酰胺的酶。产生腈水化酶的微生物包括属于芽孢杆菌属(Bacillus)、杆菌属(Bacteridium)、微球菌属(Micrococcus)和短杆菌属(Brevibacterium)(参阅JP-B-62-21517.1989，USPNo.4001081)、棒状杆菌属(Corynebacterium)和诺卡氏菌属(Nocardia)(参阅JP-B-56-17918/1989，USPNo.4248968)、假单胞菌属(Pseudomonas)(参阅JP-B-59-37951/1984，USPNo.4637982)、红球菌属(Rhodococcus)、节细菌属(Arthrobacter)和微杆菌属(Microbacterium)、(参阅JP-A-61-162193/1986，EP-A-0188316)和玫瑰色红球菌(Rhodococcusrhodochrous)(参阅JP-A-2-470/1990，EP-A-0307926)。
腈水化酶已经用于将腈水化为酰胺。在本发明中，根据重组DNA技术，采用遗传工程方法使微生物含有编码腈水化酶的更多拷贝重组DNA。与常规所用的微生物相比，重组体产生显著高水平的腈水化酶。
本发明人先前公开了由Rhodococcussp.N-774(FERM-BP-1936)产生的DNA片段，该片段编码具有腈水化酶活性的多肽(JP-A-2-119778/1988)。
可是本发明人由玫瑰色红球菌J-1产生的DNA片段用于产生腈水化酶。我们分离到编码腈水化酶的基因，并将该基因插入到适当的质粒载体中，再用该重组质粒转化适当的寄主，从而成功地获得产生对芳腈具有高活性的腈水化酶的转化株。
本发明涉及如下几个方面。
(1)编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA(H)片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α(H)-和β(H)-亚单位α(H)-亚单位51015MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr202530LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro354045AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly505560ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro657075GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla808590SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal95100105PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys110115120SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr125130135LysSerMetGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly140145150ValLeuLysArgAspPheGlyPheAspIleProAspGluValGlu155160165ValArgValTrpAspSerSerSerGluIleArgTyrIleValIle170175180ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu185190195ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla200LeuThrProGlnGluValIleValβ(H)-亚单位
51015MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro202530ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu354045GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle505560SerTrpTrpAspLysSerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn657075GluAsnTyrValAsnGluIleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp808590LeuSerAlaAlaGluArgIleLeuValAlaAspLysIleIleThr95100105GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluIleLeuGluGlyArg110115120TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnIle125130135GluLysAlaIleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu140145150ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLysIleLysVal155160165LysSerMetAsnProLeuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal170175180ArgAsnLysIleGlyGluIleValAlaTyrHisGlyCysGlnIle185190195TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro200205210LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp215220225GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyrLeuIleSerAla;
(2)编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA(L)片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α(L)-和β(L)-亚单位α(L)-亚单位51015MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn202530GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal354045AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer505560ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal657075AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr808590AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln
95100105GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn110115120MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu125130135GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg140145150AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr155160165ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu170175180LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn185190195PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu200205IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAlaβ(L)-亚单位51015MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro202530IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu354045ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla505560PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro657075HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla808590MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu95100105LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr110115120ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln125130135LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu140145150AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla155160165SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg170175180ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp185190195ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr200205210ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro
215220225AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuProAla(3)含有编码所述α(H)-和β(H)-亚单位的核苷酸顺序的(1)的DNA(H)片段，包括α(H)-亚单位的DNA顺序153045GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC607590AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC105120135GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC150165180CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT195210225GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG240255270TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC285300315TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT330345360TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC375390405AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA420435450GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG465480495GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC510525540CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG555570585ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG600CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTAβ(H)-亚单位的DNA顺序153045ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG607590GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG105120135GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA150165180TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC195210225GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG240255270CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC285300315GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGAGATCCTTGAGGGTCGG
330345360TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC375390405GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT420435450CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTGGGTGACAAGATCAAAGTG465480495AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG510525540CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC555570585TATCCCGAGAGCAGCTCCGGGCGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG600615630CTCTACACGGTCGCGTTTTCGGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC645660675GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTACCTGATCTCTGCG(4)含有编码α(L)-和β(L)-亚单位的核苷酸顺序的(2)的DNA(L)片段,包括:
α(L)-亚单位的DNA顺序:
153045ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC607590GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC105120135GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG150165180GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC195210225GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC240255270GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG285300315GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC330345360ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC375390405GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC420435450GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC465480495CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA510525540CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC555570585TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC600615ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC
β(L)-亚单位的DNA顺序153045ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG607590ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG105120135CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG150165180TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG195210225CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG240255270ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA285300315CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG330345360ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA375390405CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG420435450GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC465480495TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT510525540GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC555570585ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC600615630GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG645660675AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCGGCC(5)重组DNA，包括载体中(1)-(4)的DNA(H)或DNA(L);
(6)用(5)的重组DNA转化的转化株;
(7)生产腈水化酶的方法，该方法包括培养(6)所述转化株，并由其培养物回收腈水化酶;
(8)生产酰胺的方法，该方法包括用(7)所述腈水化酶将腈水化成酰胺;
(9)生产酰胺的方法，该方法包括培养(6)所述转化株并用生成的培养物将腈水化成酰胺，所述培养物系经过分离的细菌细胞、其经过处理的或其固定的材料。
本发明详述如下。
本发明按以下(1)-(8)步骤进行(1)腈水化酶的分离和纯化及其部分氨基酸顺序的编排由玫瑰色红球菌J-1(FERMBP-1478)(CCTCCNo.M88091)(CGMCC0143)分离并纯化H型和L型两种腈水化酶，用HPLC将其分离为α和β亚单位。测定该两种亚单位的部分氨基酸顺序(图1)。
(2)制备用于腈水化酶基因的DNA探针由于日本专利公报中所述的Rhodococcussp.N-774的腈水化酶β亚单位与玫瑰色红球菌J-1之间的腈水化酶β亚单位在氨基酸顺序上具有高度的同源性，因此由JP-A-2-119778/1990中所述的JM105/pYUK121(FERMBP-1937)制备DNA探针。含有由Rhodococcussp.N-774产生的腈水化酶基因的质粒pYUK121是由JM105/pYUK121培养制备的。用SphI和SalⅠ消化pYUK121DNA。SphⅠ-SalⅠ片段含有Rhodococcussp.N-774的腈水化酶基因(图2)。用放射性同位素标记DNA片段。
(3)检测含由玫瑰色红球菌J-1的染色体产生的腈水化酶基因的DNA片段由玫瑰色红球菌J-1的培养物制备染色体DNA后，用限制酶对其进行消化，并按Southern杂交方法(Southern，E.M.，J.Mol.Biol，98，503，1975)将其与(2)所述探针杂交。筛选出不同长度的两个DNA片段。
(4)重组质粒的构建重组质粒的构建是将(3)所制备的染色体DNA片段插入质粒载体。
(5)含有重组质粒的转化株的转化和筛选。
用(4)所述的重组质粒制备转化株。按菌落杂交方法(R.BruceWallaceet.al.，Nuc.Aci.Res.9，879，1981)，用(2)所述探针选择含重组质粒的转化株，并再用Southern杂交方法确认重组质粒中是否存在腈水化酶基因。由此选出的质粒命名为pNHJ10H和pNHJ20L。
(6)质粒DNA的分离和纯化以及限制性图的构建分离和纯化(5)所制备的pNHJ10H和pNHJ20L的质粒DNA，构建DNA的限制性图(图3)，以测定含腈水化酶基因的区域。
(7)DNA顺序的编排用适当的限制酶切除插入在pNHJ10H和pNHJ20L中的DNA片段的多余片段，然后将插入的DNA片段用于顺序编排。DNA片段的核苷酸顺序(图4和5)显示其含有由(1)所述氨基酸顺序推导得到的顺序。
(8)用转化株生产腈水化酶并将腈转化为酰胺培养(8)所述的转化株，将细菌细胞与作为腈水化酶底物的腈混合，生产酰胺。
玫瑰色红球菌J-1保藏在日本工业科学技术厅发酵研究所(FERM)，保藏号为FERMBP-1478。含(5)所述pNHJ10H的转化株TG1/pNHJ10H和含(5)所述pNHJ20L的转化株TG1/pNHJ20L也都保藏在该所，保藏号分别为FERMBP-2777和FERMBP-2778。
任何载体都可用于本发明，包括质粒载体(例如pAT153，pMP9，pHC624，pKC7等)和噬菌体载体(例如λgtll(Toyobo)，Charon4A(Amersham)等)。可用的酶包括SphI，SalI，SacI，BamHI和EcoRI等，它们均可通过商业途径得到(TakaraShuao)。各种宿主都可用于转化，包括但不限于大肠杆菌JM105和大肠杆菌TG1。用于转化株的培养基系本领域常用的培养基。
将腈转化酰胺是用腈水化酶，粗制腈水化酶和转化株、分离的细菌细胞或其经处理过的材料等的培养物，它们均由转化株的培养物制备。
本发明适用的腈如欧洲专利公报No.0307926中所述，包括在芳族部分具有4-10个碳原子的芳族腈和具有2-6个碳原子的脂族腈。所述腈的典型例子是4-，3-和2-氰基吡啶，苄腈，2，6-二氟苄腈，2-噻吩腈，2-糠腈，氰基吡嗪，丙烯腈，甲基丙烯腈，巴豆腈，乙腈和3-羟丙腈。
本发明已经公开了由玫瑰色红球菌J-1产生的两种腈水化酶的α和β亚单位的氨基酸顺序和核苷酸顺序，插入表达载体编码腈水化酶的DNA片段，重组载体用于转化。与常规用的微生物相比，转化株含有更多的基因拷贝数和产生更大量的腈水化酶。
如下图1表示由玫瑰色红球菌J-1产生的两种腈水化酶的α和β亚单位的N端氨基酸顺序;
图2表示用作DNA探针的Rhodococcussp.N-774的腈水化酶基因的DNA顺序;
图3表示重组质粒pNHJ10H和pNHJ20L的限制性图;
图4表示在由玫瑰色红球菌J-1产生的pNHJ10H中的DNA片段的DNA顺序推导得到的氨基酸顺序。
图5表示在由玫瑰色红球菌J-1产生的pNHJ20L中的DNA片段的DNA顺序和推导得到的氨基酸顺序。
本发明将通过以下实施例予以详细说明，但决不是以此来限制本发明。
在实施例中使用了以下省略符号TETris-HCl(10mM，pH7.8)，EDTA(1mM，pH8.0)TNETris-HCl(50mM，pH8.0)，EDTA(1mM，pH8.0)，NaCl(50mM)STETris-HCl(50mM，pH8.0)，EDTA(5mM，pH8.0)，蔗糖(35mM)2×YT培养基1.6%胰蛋白胨，1.0%酵母膏，0.5%NaCl。
实施例(1)腈水化酶的分离和纯化及其部分氨基酸顺序的编排在28℃下，将玫瑰色红球菌J-1在培养基中培养80小时。培养基含有酵母膏3g/l，KH2PO40.5g/l，K2HPO40.5g/l，MgSO4·4H2O 0.5g/l，CoCl20.01g/l和巴豆酰胺3g/l(pH7.0)。收集细菌细胞，取其50g用硫酸铵破碎和分级分离。将样品进行透析，并离心透析物。取其上清液装载在DEAE-Cellulofine色谱、Octyl-Senharose
色谱、Phenyl-Sapharose CL-4B色谱和Sephadex G-150色谱上。收集和透析具有酶活性的两部分，将透析物用反向柱装载在HPLC(Senshu Pak VP-304-1251，Senshu Kagaku)，得到两个亚单位(α和β)。用Applied Biosystems model 470A蛋白顺序仪测定α(H)-，β(H)-，α(L)-和β(L)-亚单位的N端氨基酸顺序。氨基酸顺序示于图1。
(2)用于腈水化酶基因的DNA探针的制备在30℃下将含pYUK121的大肠杆菌JM105(FERMBP-1937)培养在100ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养过夜(12小时)。收集细胞细胞，加入TNE，离心该细胞悬浮液。将8mlSTE和10mg溶菌酶加到细胞碎片沉淀物中，该混合物在0℃下温育5分钟后加入4ml0.25MEDTA，然后再在室温下加入2ml的10%SDS和5ml的5MNaCl。生成的混合物在0-4℃下温育3小时后进行超速离心。以1/2体积的30%PEG6000加到上清液中，混合物在0-4℃下温育过夜(12小时)后离心。然后将TNE加入细胞碎片沉淀物中，使体积达到7.5ml，再将CsCl加到悬浮液中。混合物经离心去除蛋白质。将300-500mg/ml溴乙锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中，离心管经热封闭后进行超速离心，并用蠕动泵抽提cccDNA。将略多于等量的水饱和异丙醇加到提取液中，去除溴乙锭。样品经TE透析，得到约3ml纯化的pYUK121。
pYUK121 DNA用SphI和SalI消化，形成含由Rhodococcus sp.N-774产生的腈水化酶基因的2.07kb DNA片段。该片段用32P进行放射性同位素标记，产生探针。探针的核苷酸顺序示于图2。
(3)含染色体腈水化酶基因的DNA片段的制备将玫瑰色红球菌J-1培养在100ml培养基中，培养基含有葡萄糖10g/l，KH2PO40.5g/l，K2HPO40.5g/l，MgSO4·7H2O 0.5g/l，酵母膏1g/l，蛋白胨7.5g/l，CoCl20.01g/l，尿素7.5g/l，甘氨酸1%或氨苄青霉素0.2μg/ml，水11(pH7.2)。收集细菌细胞，细胞碎片经TNE洗涤后悬浮于10ml TE中，加4ml 0.25M EDTA，10-20mg溶菌酶，10-20mg非染色体蛋白酶(achro-moprotease)和10ml 10×SDS。悬浮液在37℃下温育3小时，再加15ml苯酚。该混合物在室温下温育15分钟后离心。取上层将0.7ml的2.5M乙酸钠和乙醚加到上清液中，然后再离心。滗去上层，向底层加二倍体积的乙醇，用玻璃棒取出DNA。该DNA依次用2∶8、1∶9和0∶10(V/V)的TE乙醇各冲洗5分钟，然后再将DNA悬浮在2-4ml的TE(37℃)中。将10μl RNA酶A和T1的混合物加到悬浮液中，在37℃下温育，加入等量苯酚，离心。将多于等量的乙醚加到上清液中，离心。离心后，滗去上层，底层用21含少量氯仿的TE透析过夜后，再用新鲜的TE透析3-4小时。得到4ml粘制染色体DNA。然后按如下所述对染色体DNA进行酶消化将10μlTE，3μl反应缓冲液(10X)和2μlSacI加到15μl粗制染色体DNA中，该混合物在37℃下温育1小时后，在60V的琼脂糖上电泳3小时，用(2)所述探针进行染色体DNA的Southern杂交，得到约6.0kb和9.4kb片段，显示杂交情况极其良好。
15ml的染色体DNA按如上所述用SacⅠ消化，在琼脂糖上进行电泳。从凝胶上切下6.0kb和9.4kb DNA片段后置于3倍体积的8M NaClO4中。经加溶作用后，将各溶液点在GF/C(Whatman)滤纸(直径6mm)上，再在滤纸上先后滴加10滴(≌100ml)含6M NaClO4的TE和10滴(≌10ml)95%乙醇。滤纸经空气干燥3分钟后置于0.5ml Eppendorf管中，加40μl TE，在37℃下温育30分钟，离心。得到约40μl上清液，其中6.0kb和9.4kb DNA片段含有染色体DNA的腈水化酶基因。
按如下所述方法将6.0kbDNA片段插入载体中，以同样方法将9.4KbDNA片段插入载体中。
(4)将染色体DNA片段插入载体将2μlSacⅠ、3μl反应缓冲液(10X)和10μlTE加到10μl的pUC19DNA中，在30℃下温育1小时，加2μl的0.25MEDTA，终止反应。然后再加7μl1MTris-HCl(pH9)和3μlBAP(细菌碱性磷酸酶)，在65℃温育1小时，将TE加到该混合物中，使总体积达到100μl，再用等量苯酚提取3次，在提取液中加等量的醚。取出底层，将10μl3M乙酸钠和250μl乙醇加到该底层液中，在-80℃下温育30分钟，离心，干燥。再悬浮在TE中。
将由此得到的5μlpUC19DNA与(3)所述40μl的6.0kbDNA片段混合后，加入6μl连接缓冲液、6μlATP(6mg/ml)和3μlT4DNA连接酶。该混合物在4℃温育过夜(12小时)，产生的重组质粒含有编码pUC19的SacⅠ位点上所需酶的6.0kbDNA片段。
(5)转化株的转化和筛选将大肠杆菌TG1(Amersham)接种到10ml的2×YT培养基后，在37℃下温育12小时。温育后，将生成的培养物加到浓度为1%的新鲜的2×YT培养基中，该混合物在37℃下温育2小时后离心，将碎片沉淀物悬浮在5ml冷却的50mM CaCl2中。悬浮液在冰上下放置40分钟后离心，再将0.25ml冷却的50mM CaCl2和60μl的按(4)所述的重组DNA加到碎片沉淀物中。该混合物在0℃下温育40分钟，在42℃下热休克2分钟，置于冰上5分钟，然后将其加到10ml的2×YT培养基中，在37℃摇动培育90分钟，离心。将碎片沉淀物悬浮在1ml 2×YT培养基中，取10μl悬浮液两份分别置于含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂板上，在37℃下温育。用菌落杂交方法挑选生长在琼脂板上的菌落，将菌落转移到硝基纤维滤膜上进行消化。将DNA固定在滤膜上并与(2)所述探针杂交，滤膜经放射自显影后，选出重组菌落，再按Southern杂交方法确认转化株中是否存在腈水化酶基因。
(6)重组质粒的分离和纯化以及插入DNA片段限制性图的构建在37℃下将按(5)选择的转化株在100ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中培养过夜(12小时)，收集细菌细胞，并将TNE加到细胞中。再离心收集细胞，并将8mlSTE和10mg溶菌酶加到细胞中。该混合物在0℃下温育5分钟后，加入4ml的0.25MEDTA、2ml的10%SDS(室温)和5ml的5MNaCl，在0-4℃下温育3小时后进行超速离心。将1/2体积的30%PEG6000加到上清液中，在0-4℃下温育过夜(12小时)，再进行离心。将TNE加到碎片沉淀物中，使体积达高至7.5ml。将CsCl加到悬浮液中，除去蛋白质。然后将300-500mg/ml溴化锭加到上清液中，并将混合物转移到离心管中，离心管经热密封后进行超速离心。用蠕动泵移取cccDNA，加入略多于等量的水饱和异丙醇，以除去溴化锭。DNA样品经TE透析，生成约3ml纯化的重组DNA。由此得到的重组质粒，含有6.7kbDNA片段，命名为pNHJ10H(重组质粒含有9.4kbDNA片段，命名为pNHJ20L)。
上述质粒DNA用EcoRI、BamHI，PstⅠ，SacⅠ和SalⅠ消化。构建的限制性图示于图3。
(7)DNA顺序的编排根据构建的限制性图和Southern杂交方法，测定腈水化酶基因在pNHJ10H的片段中的位置。用PstI和SalI切下pNHJ10H中的多余部分即在1.97Kb中形成的6.0KbDNA片段。并且EcoRI和SacI切下pNHJ20L中的多余部分即在1.73Kb中形成的9.4KbDNA片段。
采用Sanger方法(Sanger，F.，Science2141205-1210，1981)和M13噬菌体载体，将上述DNA片段编排顺序。1.97KbDNA片段(pNHJ10H)和1.73KbDNA片段(pNHJ20L)的核苷酸顺序分别示于图4和5。
由核苷酸顺序推导得到的氨基酸顺序与(1)所测定的氨基酸顺序完全一致。顺序分析还证明，该DNA片段含有编码α和β亚单位的顺序。
(8)用转化株生产腈水化酶并用该酶将腈转化为酰胺将TG 1/pNHJ10H和TG l/pNHJ20L接种到10ml含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基中，于30℃下温育过夜(12小时)。将1μl生成的培养物加到100ml的2×YT培养基中(50μg/ml氨苄青霉素，0.1g CoCl2·6H2O/l)。该混合物在30℃下温育4小时，将IPTG加到该合物中，使其最终浓度为1mM，再在30℃下温育10小时。将细胞收集后，悬浮在5ml的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)中。悬浮液经超声波破碎5分钟，在12000×g下离心30分钟。生成的上清液用于酶测定。酶测定是在含50mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)、6mM苄腈和适量酶的反应混合物(12ml)中进行的。该反应在20℃下进行30分钟，加0.2ml的1 M HCl使反应终止。通过HPLC测定反应混合物中形成的苯甲酰胺的量。按上述同样方法但用由大肠杆菌TG1得到的混合物用作对照。当培养在有CoCl2和IPTG存在下的2×YT培养基中时，在含pNHJ10H和pNHJ20L的大肠杆菌无细胞提取液中腈水化酶活性分别为1.75×10-3和6.99×10-3单位/毫克。在TG l/pNHJ10H和pNHJ20L的反应混合物中获得了苯甲酰胺，而在TG1反应混合物中则无苯甲酰胺。
权利要求
1.编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA(H)片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α(H)-和β(H)-亚单位α(H)-亚单位5 10 15MetSerGluHisValAsnLysTyrThrGluTyrGluAlaArgThr20 25 30LysAlaIleGluThrLeuLeuTyrGluArgGlyLeuIleThrPro35 40 45AlaAlaValAspArgValValSerTyrTyrGluAsnGluIleGly50 55 60ProMetGlyGlyAlaLysValValAlaLysSerTrpValAspPro65 70 75GluTyrArgLysTrpLeuGluGluAspAlaThrAlaAlaMetAla80 85 90SerLeuGlyTyrAlaGlyGluGlnAlaHisGlnIleSerAlaVal95100105PheAsnAspSerGlnThrHisHisValValValCysThrLeuCys110115120SerCysTyrProTrpProValLeuGlyLeuProProAlaTrpTyr125 130135LysSerMettGluTyrArgSerArgValValAlaAspProArgGly140145150ValLeuLysArgAspPheGlyPheAsplleProAspGluValGlu155160165ValArgValTrpAspSerSerSerGlulleArgTyrIleVallle170175180ProGluArgProAlaGlyThrAspGlyTrpSerGluGluGluLeu185190195ThrLysLeuValSerArgAspSerMetIleGlyValSerAsnAla200LeuThrProGlnGlnValIleValβ(H)-亚单位5 10 15MetAspGlyIleHisAspThrGlyGlyMetThrGlyTyrGlyPro20 25 30ValProTyrGlnLysAspGluProPhePheHisTyrGluTrpGlu35 40 45GlyArgThrLeuSerIleLeuThrTrpMetHisLeuLysGlyIle5055 60SerTrpTrpAspLySerArgPhePheArgGluSerMetGlyAsn65 70 75GluAsnTyrValAsnGluLleArgAsnSerTyrTyrThrHisTrp80 85 90LerSerAlaAlaGluArglleLcuValAlaAspLysLielleThr95100105GluGluGluArgLysHisArgValGlnGluLieLeuGluGlyArg110115120TyrThrAspArgLysProSerArgLysPheAspProAlaGlnlle125130135GluLysAlalleGluArgLeuHisGluProHisSerLeuAlaLeu140145150ProGlyAlaGluProSerPheSerLeuGlyAspLyslleLysVal155160165LysSerMetAsnProleuGlyHisThrArgCysProLysTyrVal170175180ArgAsnLyslleGlyGlulleValAlaTyrHisGlyCysGlnlle185190195TyrProGluSerSerSerAlaGlyLeuGlyAspAspProArgPro200205210LeuTyrThrValAlaPheSerAlaGlnGluLeuTrpGlyAspAsp215220225GlyAsnGlyLysAspValValCysValAspLeuTrpGluProTyrLeuLlSerSla
2.编码具有腈水化酶活性的多肽的DNA(L)片段，所述多肽含有下列氨基酸顺序的α(L)-和β(L)亚单位α(L)-亚单位5 10 15MetThrAlaHisAsnProValGlnGlyThrLeuProArgSerAsn20 25 30GluGluIleAlaAlaArgValLysAlaMetGluAlaIleLeuVal35 40 45AspLysGlyLeuIleSerThrAspAlaIleAspHisMetSerSer50 55 60ValTyrGluAsnGluValGlyProGlnLeuGlyAlaLysIleVal65 70 75AlaArgAlaTrpValAspProGluPheLysGlnArgLeuLeuThr80 85 90AspAlaThrSerAlaCysArgGluMetGlyValGlyGlyMetGln95 100 105GlyGluGluMetValValLeuGluAsnThrGlyThrValHisAsn110 115 120MetValValCysThrLeuCysSerCysTyrProTrpProValLeu125 130 135GlyLeuProProAsnTrpTyrLysTyrProAlaTyrArgAlaArg140 145 150AlaValArgAspProArgGlyValLeuAlaGluPheGlyTyrThr155 160 165ProAspProAspValGluIleArgIleTrpAspSerSerAlaGlu170 175 180LeuArgTyrTrpValLeuProGlnArgProAlaGlyThrGluAsn185 190 195PheThrGluGluGlnLeuAlaAspLeuValThrArgAspSerLeu200 205IleGlyValSerValProThrThrProSerLysAlaβ(L)-亚单位:5 10 15MetAspGlyIleHisAspLeuGlyGlyArgAlaGlyLeuGlyPro20 25 30IleLysProGluSerAspGluProValPheHisSerAspTrpGlu35 40 45ArgSerValLeuThrMetPheProAlaMetAlaLeuAlaGlyAla50 55 60PheAsnLeuAspGlnPheArgGlyAlaMetGluGlnIleProPro65 70 75HisAspTyrLeuThrSerGlnTyrTyrGluHisTrpMetHisAla80 85 90MetIleHisHisGlyIleGluAlaGlyIlePheAspSerAspGlu95 100 105LeuAspArgArgThrGlnTyrTyrMetAspHisProAspAspThr110 115 120ThrProThrArgGlnAspProGlnLeuValGluThrIleSerGln125 130 135LeuIleThrHisGlyAlaAspTyrArgArgProThrAspThrGlu140 145 150AlaAlaPheAlaValGlyAspLysValIleValArgSerAspAla155 160 165SerProAsnThrHisThrArgArgAlaGlyTyrValArgGlyArg170 175 180ValGlyGluValValAlaThrHisGlyAlaTyrValPheProAsp185 190 195ThrAsnAlaLeuGlyAlaGlyGluSerProGluHisLeuTyrThr200 205 210ValArgPheSerAlaThrGluLeuTrpGlyGluProAlaAlaPro215 220 225AsnValValAsnHisIleAspValPheGluProTyrLeuLeuProAla
3.按权利要求1的DNA(H)片段，其含有α(H)-和β(H)-亚单位的核苷酸顺序，包括α(H)-亚单位的DNA顺序15 30 45GTGAGCGAGCACGTCAATAAGTACACGGAGTACGAGGCACGTACC60 75 90AAGGCGATCGAAACCTTGCTGTACGAGCGAGGGCTCATCACGCCC105 120 135GCCGCGGTCGACCGAGTCGTTTCGTACTACGAGAACGAGATCGGC150 165 180CCGATGGGCGGTGCCAAGGTCGTGGCCAAGTCCTGGGTGGACCCT195 210 225GAGTACCGCAAGTGGCTCGAAGAGGACGCGACGGCCGCGATGGCG240 255 270TCATTGGGCTATGCCGGTGAGCAGGCACACCAAATTTCGGCGGTC285 300 315TTCAACGACTCCCAAACGCATCACGTGGTGGTGTGCACTCTGTGT330 345 360TCGTGCTATCCGTGGCCGGTGCTTGGTCTCCCGCCCGCCTGGTAC375 390 405AAGAGCATGGAGTACCGGTCCCGAGTGGTAGCGGACCCTCGTGGA420 435 450GTGCTCAAGCGCGATTTCGGTTTCGACATCCCCGATGAGGTGGAG465 480 495GTCAGGGTTTGGGACAGCAGCTCCGAAATCCGCTACATCGTCATC510 525 540CCGGAACGGCCGGCCGGCACCGACGGTTGGTCCGAGGAGGAGCTG555 570 585ACGAAGCTGGTGAGCCGGGACTCGATGATCGGTGTCAGTAATGCG600CTCACACCGCAGGAAGTGATCGTA和β(H)-亚单位的DNA顺序15 30 45ATGGATGGTATCCACGACACAGGCGGCATGACCGGATACGGACCG60 75 90GTCCCCTATCAGAAGGACGAGCCCTTCTTCCACTACGAGTGGGAG105 120 135GGTCGGACCCTGTCAATTCTGACTTGGATGCATCTCAAGGGCATA150 165 180TCGTGGTGGGACAAGTCGCGGTTCTTCCGGGAGTCGATGGGGAAC195 210 225GAAAACTACGTCAACGAGATTCGCAACTCGTACTACACCCACTGG240 255 270CTGAGTGCGGCAGAACGTATCCTCGTCGCCGACAAGATCATCACC285 300 315GAAGAAGAGCGAAAGCACCGTGTGCAAGACATCCTTGAGGGTCGG330 345 360TACACGGACAGGAAGCCGTCGCGGAAGTTCGATCCGGCCCAGATC375 390 405GAGAAGGCGATCGAACGGCTTCACGAGCCCCACTCCCTAGCGCTT420 435 450CCAGGAGCGGAGCCGAGTTTCTCTCTCGGTGACAAGATCAAAGTG465 480 495AAGAGTATGAACCCGCTGGGACACACACGGTGCCCGAAATATGTG510 525 540CGGAACAAGATCGGGGAAATCGTCGCCTACCACGGCTGCCAGATC555 570 585TATCCCGAGAGCAGCTCCGCCGGCCTCGGCGACGATCCTCGCCCG600 615 630CTCTACACGGTCGCGTTTTCCGCCCAGGAACTGTGGGGCGACGAC645 660 675GGAAACGGGAAAGACGTAGTGTGCGTCGATCTCTGGGAACCGTACCTGATCTCTGCG
4.按权利要求2的DNA(L)片段，其含有α(L)-和β(L)-亚单位的核苷酸顺序包括α(L)-亚单位的DNA顺序15 30 45ATGACCGCCCACAATCCCGTCCAGGGCACGTTGCCACGATCGAAC60 75 90GAGGAGATCGCCGCACGCGTGAAGGCCATGGAGGCCATCCTCGTC105 120 135GACAAGGGCCTGATCTCCACCGACGCCATCGACCACATGTCCTCG150 165 180GTCTACGAGAACGAGGTCGGTCCTCAACTCGGCGCCAAGATCGTC195 210 225GCCCGCGCCTGGGTCGATCCCGAGTTCAAGCAGCGCCTGCTCACC240 255 270GACGCCACCAGCGCCTGCCGTGAAATGGGCGTCGGCGGCATGCAG285 300 315GGCGAAGAAATGGTCGTGCTGGAAAACACCGGCACGGTCCACAAC330 345 360ATGGTCGTATGTACCTTGTGCTCGTGCTATCCGTGGCCGGTTCTC375 390 405GGCCTGCCACCCAACTGGTACAAGTACCCCGCCTACCGCGCCCGC420 435 450GCTGTCCGCGACCCCCGAGGTGTGCTGGCCGAATTCGGATATACC465 480 495CCCGACCCTGACGTCGAGATCCGGATATGGGACTCGAGTGCCGAA510 525 540CTTCGCTACTGGGTCCTGCCGCAACGCCCAGCCGGCACCGAGAAC555 570 585TTCACCGAAGAACAACTCGCCGACCTCGTCACCCGCGACTCGCTC600 615ATCGGCGTATCCGTCCCCACCACACCCAGCAAGGCC和β(L)-亚单位的DNA顺序15 30 45ATGGATGGAATCCACGACCTCGGTGGCCGCGCCGGCCTGGGTCCG60 75 90ATCAAGCCCGAATCCGATGAACCTGTTTTCCATTCCGATTGGGAG105 120 135CGGTCGGTTTTGACGATGTTCCCGGCGATGGCGCTGGCCGGCGCG150 165 180TTCAATCTCGACCAGTTCCGGGGCGCGATGGAGCAGATCCCCCCG195 210 225CACGACTACCTGACCTCGCAATACTACGAGCACTGGATGCACGCG240 255 270ATGATCCACCACGGCATCGAGGCGGGCATCTTCGATTCCGACGAA285 300 315CTCGACCGCCGCACCCAGTACTACATGGACCATCCGGACGACACG330 345 360ACCCCCACGCGGCAGGATCCGCAACTGGTGGAGACGATCTCGCAA375 390 405CTGATCACCCACGGAGCCGATTACCGACGCCCGACCGACACCGAG420 435 450GCCGCATTCGCCGTAGGCGACAAAGTCATCGTGCGGTCGGACGCC465 480 495TCACCGAACACCCACACCCGCCGCGCCGGATACGTCCGCGGTCGT510 525 540GTCGGCGAAGTCGTGGCGACCCACGGCGCGTATGTCTTTCCGGAC555 570 585ACCAACGCACTCGGCGCCGGCGAAAGCCCCGAACACCTGTACACC600 615 630GTGCGGTTCTCGGCGACCGAGTTGTGGGGTGAACCTGCCGCCCCG645 660 675AACGTCGTCAATCACATCGACGTGTTCGAACCGTATCTGCTACCGGCC
5.重组DNA，包括在载体中的权利要求1-4的DNA(H)或DNA(L)。
6.用权利要求5的重组DNA转化的转化株。
7.生产腈水化酶的方法，该方法包括培养权利要求6所述的转化株和由该培养物回收腈水化酶。
8.生产酰胺的方法，该方法包括用由权利要求6的转化株培养物得到的腈水化酶将腈水化。
9.生产酰胺的方法，该方法包括培养权利要求6所述的转化株和用其生成的培养物、分离的细菌细胞、以及其经过处理的材料，或其固定的材料，将腈水化为酰胺。
全文摘要
本发明公开了由玫瑰色红球菌J-1产生的两种腈水化酶的α-和β-亚单位的氨基酸顺序和核苷酸顺序。将编码腈水化酶的DNA片段插入表达载体并将该重组载体用于转化。转化株与常规用的微生物相比含有基因的更多拷贝和能生产更大量的腈水化酶。
文档编号C12N9/34GK1054616SQ9110132
公开日1991年9月18日 申请日期1991年2月28日 优先权日1990年2月28日
发明者别府辉彦, 山田秀明, 长泽透, 堀之内末治, 西山真 申请人:日东化学工业株式会社, 别府辉彦, 山田秀明