专利名称：表达人蛋白c糖基化突变体的载体和化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码新酶原型人蛋白C的新DNA化合物和重组DNA克隆载体。这些酶经原基因工程改造后，其糖基化作用方式与野生型人蛋白C酶原相比完全不同。糖基化作用，特别是当糖类部分含唾液酸水平较高时，可在蛋白质分泌和功能方面起重要作用。本发明的新酶原已经构建，因此每一个糖基化作用位点都已分别改变。所述表达载体提供了在重组寄主细胞中表达这些人蛋白C酶原的简单而有效的方法。本发明提供产生酶原型人蛋白C方法，所述酶原型人蛋白C经活化后，具有比天然形式更高的酰胺解活性和抗凝活性。所述新酶原型人蛋白C在各种糖基化作用位点的氨基酸残基顺序上不同于本领域已知的顺序。这些新酶原型蛋白C在治疗涉及凝固的血液障碍方面有特别的优点。
蛋白C是一种依赖于维生素K的血浆蛋白，在控制止血作用方面具有重大的生理作用。蛋白C作为一个无活性分子被合成，此处称之为“初生蛋白C”。初生蛋白C经复杂的处理，产生很多不同的无活性分子。如同下面所作出的更加充分的叙述。此处将蛋白C的无活性分泌形式称作为“酶原蛋白C”。在血液中，通过涉及凝血调变蛋白一凝血酶复合物的反应，发生蛋白C的活化作用。经活化的蛋白C及其辅助因子蛋白S一起，是一种具有重要生理学意义的抗凝剂。活化的蛋白C能防止血管内血栓症，并控制原有血块的扩大。活化形式蛋白C的作用机理以及无活性酶原活化成活性蛋白酶的机理在近些年内已被阐明(文献综述见J.E.Gardiner and J.H.Griffin，Progress in Hematology，Vol.ⅩⅢ，PP.265-278，ed.Elmer B.Brown，Grune and Stratton，Inc，1983和Esmon，N.L.，1989，Prog.Hemost.Thromb.929-55)。
蛋白C的活化作用涉及凝血酶、凝血链锁反应最终的丝氨酸蛋白酶、以及称之为凝血调变蛋白的与内皮细胞膜相联的糖蛋白。凝血调变蛋白与凝血酶形成一个牢固紧密的化学计量复合物。当凝血调变蛋白与凝血酶复合时，显著地改变了凝血酶的功能性质。在正常情况下，凝血酶将纤维蛋白原凝成块，使血小板活化，并将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转变成它们的活化形式Ⅴa和Ⅷa。最后，凝血酶使蛋白C活化，但是很慢，效能不高，而且该活化作用进一步受到生理Ca2+的抑制。相反，与凝血调变蛋白复合的凝血酶并不使纤维蛋白原凝成块，不使血小板活化，或不将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转变成它们的活化相应物Ⅴa和Ⅷa，但是在生理Ca2+的存在下却成为非常有效的蛋白C酶原的活化剂。通过凝血调变蛋白-凝血酶活化蛋白C酶原的速率常数比单独用凝血酶时高1000倍以上。
为了了解活化蛋白C如何下调血液凝固，下面对凝固酶系统进行简略的叙述。最好把凝固系统作为包括各酶原依次连续活化成为各种活性的丝氨酸蛋白酶的链锁反应来考察。该链锁反应最终产生凝血酶，它经过有限的蛋白分解，将血浆纤维蛋白原转变成不溶性的凝胶纤维蛋白。在凝固链锁反应中，两件关键的事情是一、通过凝血因子Ⅸa使凝血因子Ⅹ转变成Ⅹa;二、通过凝血因子Ⅹa，使凝血酶原转变成凝血酶。这两种反应在细胞表面发生，最显著地在血小板表面，同时两种反应均需辅助因子。主要的辅助因子(因子Ⅴ和Ⅷ)在系统中作为相应的无活性前体流通，但当开头几个凝血酶分子形成时，凝血酶便返回来通过有限的蛋白分解使辅助因子活化。被活化的辅助因子Ⅴa和Ⅷa加速了凝血酶原转变成凝血酶，也加速了因子Ⅹ转变成因子Ⅹa，速率大约提高5个数量级。活化蛋白C优先作用于蛋白的降解和水解，并不可逆地破坏凝血辅助因子Ⅴa和Ⅷa(无活性凝血因子Ⅴ和Ⅷ的活化形式)。反之，凝血因子Ⅴ和Ⅷ在体内对活化的蛋白C来说是非常差的底物。
活化蛋白C的一个重要辅助因子是蛋白S，它是另一种依赖维生素K的血浆蛋白。蛋白S使活化蛋白C介导的因子Ⅴa和Ⅷa的水解增加25倍。
蛋白C被公认为一种有价值的治疗剂(例如1988年10月4日公开的见Bang等人的美国专利No.4，775，625，此处作为参考文献)。经活化的蛋白C是一种比常用的抗凝剂(如肝素及口服羟基香豆精抗凝剂)具有更大治疗指数的新抗血栓剂，在凝血酶再生之前，酶原蛋白C和活化蛋白C两者均无效，因为将凝血因子Ⅴ和Ⅷ转变成Ⅴa和Ⅷa需要凝血酶;这两种辅助因子的活化形式对活化蛋白C来说是较好的底物。活化酶原蛋白C时也需要凝血酶，因为没有凝血调变蛋白-凝血酶复合物，蛋白C酶原是不能有效地转变成其活性相应物的。
活化蛋白C是一种符合要求的抗凝剂，因为活化蛋白C是通过使辅助因子Ⅴa和Ⅷa失活而起作用的。因为因子Ⅴ及Ⅷ转变成它们的活化的相应物Ⅴa和Ⅷa时需要凝血酶，蛋白C仅仅在凝血酶再生之后才起到抗凝剂作用。与活化蛋白C相反，常规的抗凝剂只要给予病人在整个循环中维持恒定的抗凝状态，因此，大大增加了并发出血症的危险，这种危险性超过了蛋白C或活化蛋白C所引起的危险性。所以，活化蛋白C是一种符合要求的、在临床上广泛作为肝素和羟基香豆精的代用品使用的抗凝剂。
在某些疾病状态中(例如遗传性的蛋白C缺乏)，蛋白C酶原具有重大治疗意义。在先天性纯合(homozgous)蛋白C缺乏情况下，患者在童年早期因暴发性紫癜而死亡，这是一种常见的弥散性血管内凝血异常致死形式。在杂合(heterozygous)蛋白C缺乏情况下，患者忍受剧烈的周期性的血栓栓塞发作。临床上充分证实设计用来治疗血友病B或凝血因子Ⅸ缺乏的血浆蛋白浓缩物(含蛋白C作为杂质)，对防治杂合蛋白C缺乏的血管内凝块有作用。在血栓状态下(如弥散性血管内凝固)以及在易发生血栓病的状态下(如严重创伤，大外科手术和癌症)，也已注意到蛋白C的浓度出现反常的偏低。
为了能对本发明蛋白C活化作用的理解，下面给出初生人蛋白C的编码顺序及相应的氨基酸残基顺序。该氨基酸残基顺序及其相关部分也表示出“天然蛋白C”的特性。
其中A为脱氧腺苷酸，G为脱氧鸟苷酸、C为脱氧胞苷酸，T为胸苷酸，ALA为丙氨酸，ARG为精氨酸，ASN为天冬酰胺，ASP为天冬氨酸，-COOH为羧基端，CYS为半胱氨酸，GLN为谷氨酰胺，GLU为谷氨酸，GLY为甘氨酸，HIS为组氨酸，H N-为氨基端，ILE为异亮氨酸，LEU为亮氨酸，LYS为赖氨酸，MET为甲硫氨酸，PHE为苯丙氨酸，PRO为脯氨酸，SER为丝氨酸，THR为苏氨酸，TRP为色氨酸，TYR为酪氨酸及VAL为缬氨酸。
上面给出的DNA顺序得自由编码人蛋白C的人肝mRNA制备的cDNA克隆。本领域专业人员会意识到由于遗传密码的简并性会使人们构建出许多编码同一种氨基酸残基顺序的不同DNA顺序，因此上面给出的初生人蛋白C的cDNA顺序仅仅是许多可能的人蛋白C的编码顺序中的一种。在构建cDNA克隆时，将5′poly G顺序、3′poly C顺序以及5′和3′Pst Ⅰ限制性酶识别顺序构建在编码蛋白C的cDNA顺序的两端。将这些cDNA克隆的两个进行操作以构建一个DNA分子，它既含有初生人蛋白C的编码顺序又含有编码编码区的5′和3′端不转译的mRNA的DNA部分。将该DNA分子插入质粒pBR322的Pst Ⅰ位点，以构建质粒pHC7。因此质粒pHC7既含有上面所示的编码顺序，又分别在所述初生人蛋白C编码顺序的编码链的5′和3′端含有以下附加顺序(也只给出分子的一条链)
由于DNA碱基对的互补性质，双链DNA分子的一条链的顺序足以确定相对链的顺序。质粒pHC7可按常规方法从E.coli K12 RR1/pHC7菌株中分离，该菌株已保藏在北方地区研究实验室(the Northern Regional Research Laboratory(NRRL)，Peoria Illinois)并成为NRRL保藏永久性原种培养物的一部分。E.coli K12 RR1/pHC7可以从NRRL得到，保藏号为NRRL B-15926。质粒pHC7的限制性位点和功能图谱示于附图2。
初生蛋白C也可图解说明如下
pre-pro-初生人蛋白C的氨基酸残基1-42，它编码人蛋白C的信号肽及前肽，对指导蛋白C的分泌和r-羧基化十分重要。
LC-初生蛋白C的氨基酸残基43-197，它一旦经转译后修饰，就构成双链酶原(由单链酶原除去KR二肽而形成，如下所讨论)和活化形式蛋白C的轻链(LC)。
KR-初生人蛋白C的氨基酸残基198-199;这些残基确信要被除去(基于与牛蛋白C的同源性)，可能通过包括先裂解(在残基197-198之间或在199-200之间)然后与羧肽酶或氨酞酶作用形成双链蛋白C的两步程序。
AP-初生蛋白C的氨基酸残基200-211，它构成活化肽，它从蛋白C的酶原形中除去后便得到活化蛋白C。
AHC-初生蛋白C的氨基酸残基212-461，一旦经转译后修饰，组成活化蛋白C的活化重链(AHC)。
HC-蛋白C酶原的二链形式的重链，一旦经转译后修饰，组成氨基酸残基200-461，即AP和AHC。
人蛋白C酶原是在肝中合成的丝氨酸蛋白酶前体，并存在于血液中以表达完整的生物活性，蛋白C需要进行转译后的修饰，该修饰过程需要维生素K。双链的、由二硫键连接的蛋白C酶原，由一个单链酶原通过限制性蛋白水解作用而产生。这种限制性蛋白水解作用被确信包括裂解和除去。将该双链酶原活化成活性丝氨酸蛋白酶的过程包括ARG-LEU肽键(残基211和212)的蛋白水解裂解。后一裂解释放出构成双链酶原分子较大链(重链)氨基末端的十二肽(残基200-211)，即活化肽。蛋白C受到明显地糖基化作用，血浆中成熟的酶含约15-23%碳水化合物。蛋白C也含有若干不平常的氨基酸，包括r-羟基谷氨酸和β-羟基天冬氨酸(赤-L-β羟基天冬氨酸)。r-羧基谷氨酸(gla)由谷氨酸残基经r-谷氨酰基羧化反应而形成，该反应借助于需要维生素K作为辅助因子的肝微粒体羧化酶。
人蛋白C的活化作用也能用图解表示并说明如下。本领域专业人员应该明白，图解中所示的步骤顺序不一定反映体内途径的步骤顺序。
pre-pro-LC-KR-AP-AHC初生蛋白C
本发明提供新的化合物、载体、转化体和重组表达新蛋白C酶原的方法。
为了本发明的目的，在此处所公开的说明书和权利要求书中，下列术语定义如下。
Ad2LP表示腺病毒-2的较大晚期启动子。
本发明描述的蛋白质或肽链中的氨基酸残基缩写如下三字母缩写 氨基酸残基 一字母缩写PHE 苯丙氨酸 F
LEU 亮氨酸 LILE 异亮氨酸 IMET 甲硫氨酸 MVAL 缬氨酸 VSER 丝氨酸 SPRO 脯氨酸 PTHR 苏氨酸 TALA 丙氨酸 ATYR 酪氨酸 YHIS 组氨酸 HGLN 谷氨酰胺 QASN 天冬氨酰胺 NLYS 赖氨酸 KASP 天冬氨酸 DGLU 谷氨酸 ECYS 半胱氨酸 CTRP 色氨酸 WARG 精氨酸 RGLY 甘氨酸 GApR-抗氨苄青霉素表型或授予该表型的基因。
BK-得自BK病毒的DNA。
Enh或增强子-BK病毒的增强子。
ep或SV40ep-含有T-抗原基因的SV40早期启动子、T-抗原结合位点、SV40增强子和SV40复制起点的DNA片段。
r-羧化反应-在谷氨酸r碳原子上加上一个羧基的反应。
r-羧化蛋白-某些谷氨酸残基已经过羧基化的蛋白。
GBMT转录单位-一种修饰性转录控制单位，包括在空间上紧靠腺病毒较大晚期启动子调节元素上游的BK病毒P2增强子、腺病毒-2较大晚期启动子、一种定位激活所述启动子的poly-GT元素和一种含有腺病毒拼接三重先导顺序的DNA顺序。GBMT转录单位是在质粒pGT-h的约900个碱基对的HindⅢ限制性片段上。
IVS-编码内涵子的DNA，也称间插顺序。
MMTpro-小鼠金属硫因-I基因的启动子。
初生蛋白-未经任何转译后修饰刚从mRNA转录本转译产生的多肽。然而诸如谷氨酸残基的r-羧基化以及天冬氨酸残基的羟基化这样的转译后修饰可以在蛋白从mRNA转录本全部被转译之前发生。
NeoR-一种新霉素抗性授予基因，该基因也可用于授予对抗生素G418的抗性。
pA-编码多聚腺苷酸信号的DNA顺序。
启动子-引导DNA转录成RNA的DNA顺序。
蛋白C的活性-人蛋白C的任何性质蛋白水解，酰胺解，酯解以及生物(抗凝固或纤维蛋白溶解)活性。测定蛋白抗凝活性的方法在本领域是众所周知的，参见文献(Grinnell等，1987，Biotechnology 51189)。
重组DNA克隆载体-包括(但不限于)染色体整合试剂、自主复制质粒和噬菌体在内的任何试剂，它包含一个可以添加或已经添加了一个或几个DNA片段的DNA分子。
重组DNA表达载体-启动子已被掺入并已定位驱动基因产物表达的任何重组DNA克隆载体。
重组DNA载体-任何重组的DNA克隆或表达载体。
复制子-控制并允许质粒或其它载体自主复制的DNA顺序。
限制性片段-由一种或多种限制性核酸内切酶的作用而产生的任何线性DNA顺序。
敏感型寄主细胞-没有DNA片段授予其抗性就不能在一定的抗生素或其它毒性化合物存在下生长的寄主细胞。
TcR-抗四环素表型或授予该抗性的基因。
转化作用-将DNA引入受纳寄主细胞从而改变受纳寄主细胞的基因型。
转化体-经过转化的受纳寄主细胞。
转译活化顺序-包括编码核糖体结合位点和转译起始密码子(如5′-ATG-3′)的任何DNA顺序，它使mRNA转录子转译成肽或多肽。
酶原-蛋白水解酶的无酶活性的前体。此处所用蛋白C酶原是指蛋白C的分泌的、无活性形式，无论是单链还是双链。
图1是质粒pLPC-Q097的限制性位点和功能图谱。为本发明公开之目的，这些图没有严格按比例画出。
图2是质粒pLPC-Q248的限制性位点和功能图谱。
图3是质粒pLPC-Q313的限制性位点和功能图谱。
图4是质粒pLPC-Q329的限制性位点和功能图谱。
图5是质粒pGTC的限制性位点和功能图谱。
图6是质粒pGT-d的限制性位点和功能图谱。
图7是质粒pGT-h的限制性位点和功能图谱。
本发明提供编码表达新酶原形式的人蛋白C的DNA化合物。文献(见Bang等人的美国专利4，775，624，1988年10月4日公开，和欧洲专利公开215548，系本文参考文献)中已描述了一些产生天然人蛋白C酶原和天然人蛋白C的若干方法。这些先有技术方法提供了表达在氨基酸顺序上与人血液中存在的酶原形式没有差别的酶原型人蛋白C的方法。当在某种真核细胞系如人肾293细胞系中表达时天然人蛋白C酶原以一种新的糖基化形式分泌，它不同于人血液中的酶原形式。
本发明提供具有改变的糖基化作用方式的酶原形式人蛋白C，这种改变的糖基化作用方式是由于在氨基酸残基顺序上直接定位突变而造成的。当这些酶原被活化时，与天然人蛋白C相比增加了酰胺解活性和抗凝活性。本发明还提供了DNA化合物、重组DNA表达载体、转化的细胞系和重组表达这些新酶原形式人蛋白C的方法。产生这些酶原形式人蛋白C的方法包括(A)用重组DNA载体转化一种真核寄主细胞，所述载体包括(ⅰ)编码一种氨基酸残基顺序的DNA顺序，所述氨基酸残基顺序从氨基端到羧基端包括以下的氨基酸残基顺序
其中R1选自ASN和GLN，R2选自ASN和GLN，R3选自ASN和GLN，R4选自ASN和GLN;和(ⅱ)位驱动所述DNA顺序表达的启动子。
(B)将步骤(A)中转化的宿主细胞培养在适宜于所述DNA顺序表达的条件下;
(C)从所述培养物中回收所述蛋白C酶原。该方法及该方法中所用的化合物详述如下。
本发明还提供用于产生这些新酶原型蛋白C方法的DNA化合物。这些化合物都编码含有指导分泌的信号肽的前肽和得自γ-羧基化(通过依赖于维生素K的γ-羧化酶的作用)的蛋白质的前肽。这类前肽顺序在本领域内已众所周知，例如见文献(Suttie et al.，1987，Proc、Natl、Acad、Sci、84634-637)。为优选和构建方便，信号肽编码顺序和前肽编码顺序都将得自γ-羧基化蛋白的前肽的氨基酸残基顺序。这类γ-羧基化蛋白的实例包括(但不限于)因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原、蛋白S、蛋白Z和蛋白C。编码人蛋白C前肽的DNA顺序最为优选地用于本发明的载体。
本发明的DNA化合物进一步包括人蛋白C轻链的编码顺序，该顺序在转译读码框中紧挨着前肽编码顺序的下游。人蛋白C的轻链含有初生蛋白C的氨基酸残基43到197，如前面背景部分所述，依赖维生素K的血浆蛋白质的氨基端部分如蛋白质C轻链的氨基端部分具有钙结合位点。这些血浆蛋白质的钙结合区域如因子Ⅶ、因子Ⅸ、因子Ⅹ、凝血酶原和蛋白S可以以与人蛋白C轻链的钙结合区域相当的方式使用(见欧洲专利公告0215548A1号第12和13页)。在本发明的一种新酶原形式(Q097)中，轻链中139位的天冬酰胺残基改成谷氨酰胺残基，由此除去了糖基化作用位点。
本发明的DNA化合物进一步包括位于轻链编码顺序转译读码框内在轻链顺序下游与之紧接的二肽LYS-ARG(KR)的编码顺序。二元碱性二肽如LYS-ARG位于初生蛋白轻链的羧基端。LYS-ARG二肽在蛋白质表达中的取向与本发明无关。就本发明的目的而言，二元碱性二肽如LYS-LYS或ARG-ARG与二肽LYS-ARG相当。然而，就本发明的目的而言，优选LYS-ARG，这是天然人蛋白C中的二肽。
LYS-ARG二肽的密码子的下游紧接着是活化肽编码顺序。本领域专业人员会意识到本发明的酶原和天然人蛋白C酶原的主要区别如下所述。
除了轻链139位的取代，其它的氨基酸取代也可提高所得酶原的酰胺解和抗凝固活性。术语“所得酶原”用于指尽管已参照初生人蛋白C中氨基酸的位置描述了取代作用，但初生蛋白C必须首先分泌出来(除去第1～42个氨基酸残基后)才得到酶原形式。在初生人蛋白C139位用谷氨酰胺残基取代天冬酰胺残基产生了本发明的新酶原。在290、355或371的任一位置，用谷氨酰胺残基(在活化的重链中)取代天冬酰胺都可产生本发明的新酶原。
因此，本发明优选的新酶原形式人蛋白C得自氨基酸残基顺序如下的初生人蛋白C分子的分泌和加工
其中R1选自ASN和GLN，R2选自ASN和GLN，R3选自ASN和GLN，R4选自ASN和GLN。
新酶原Q097包括在139位用谷氨酰胺残基取代天冬酰氨残基。酶原Q248在290位用谷氨酰胺残基取代天冬酰胺残基。酶原Q313在355位用谷氨酰胺残基取代天冬酰胺残基，而酶原Q329在371位用谷氨酰胺残基取代天冬酰胺残基。
本领域专业人员会认识到由于遗传密码的简并性，许多种DNA化合物都可编码上面给出的多肽。所以，下面描述的构建过程以及本发明所附的优选DNA化合物、载体和转化体的实施例都仅仅是说明性的，不限制本发明的范围。此外，用GLN取代ASN也是说明性的，不限制本发明的范围，因为也可采用其它取代，只是CYS或PRO除外。而且，本领域专业人员还会认识到，本发明的各种单个氨基酸取代可以结合，以产生其它新酶原。
本发明的所有DNA化合物都是通过人蛋白C基因的定点突变而制备的。然后将经突变的酶原编码分子插入真核表达载体，以便由腺病毒-2的较大晚期启动子驱动该酶原基因表达。所述载体还包括BK病毒的P2增强子部分以增强由启动子驱动的表达。所述载体已转化到大肠杆菌K12AG1细胞中并于1990年1月9日保藏在北方地区研究实验室(Northern Regional Research Laboratories，Peoria，Illinois 61604)并成为该实验室永久性原种培养物的一部分。表Ⅱ给出了具体的培养物和保藏号。
表Ⅱ培养物 保藏号E.coli K12 AG1/pLPC-Q097 NRRL B-18608E.coli K12 AG1/pLPC-Q248 NRRL B-18609E.coli K12 AG1/pLPC-Q313 NRRL B-18610E.coli K12 AG1/pLPC-Q329 NRRL B-18611利用常规方法获得培养物并分离质粒，然后可直接转染到真核寄主细胞中以产生酶原形式的人蛋白C。最好将质粒转化到可表达腺病毒E1A早期基因产物的寄主细胞中，在这种寄主细胞中载体上的BK增强子在E1A的存在下可最有效地增强表达。专业人员会意识到许多寄主细胞都表达或可被用于表达大DNA病毒的早期基因产物。优选的细胞系为人肾293细胞系(得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为ATCC CRL 1573)或金黄仑鼠细胞系AV12-664(ATCC 9595)。胚胎人肾细胞系293最为优选。
为了获得更高水平的表达，可将编码各种酶原形式蛋白C的基因从保藏的载体上切下来并连到含有GBMT转录控制单位的载体上。具体说，质粒pGT-h含有潮霉素抗性授予基因它可(以E.coli K12 AG1的形式)从NRRL获得，保藏号为NRRL B-18592。质粒主链经限制性酶Bcl I消化然后从大肠杆菌的dam甲基化酶菌株(如GM48 NRRL B-15725)中分离质粒DNA而打开。所述新酶原基因可通过用Bcl I消化而分别从其质粒上除去。将载体主链纯化并脱磷酸化，然后将本发明的任何一种新酶原基因连到Bcl I上。将含有位于GBMT转录单位之后的用于表达的新酶原基因的质粒转化到293细胞中，进行培养，并利用本领域熟知的技术从培养物中纯化新酶原。从细胞培养物中纯化人蛋白C的一种方法已公开于Yan所述的方法(欧洲专利公告0363126，1990年4月11日公开)，全部公开内容均作为本文参考。
本发明的化合物还包括本发明初生蛋白一经分泌产生的酶原形式。因此，本发明的化合物包括DNA编码顺序、驱动这些顺序表达的表达载体、由这些编码顺序产生的mRNA转录本一经转译产生的初生蛋白、那些初生蛋白一经分泌产生的酶原和所述酶原的某些活化衍生物。
本发明的DNA化合物也可由化学方法合成，或通过将限制性片段的结合或通过本领域已知的技术相结合。DNA合成仪也可买到，并可用于构建本发明的化合物。
本发明的说明性载体含有BK增强子，它通过本发明编码顺序的腺病毒较大晚期启动子定位刺激转录。本领域专业人员会意识到大量本领域已知的真核启动子、增强子和表达载体都可用于本发明的方法。本领域专业人员还会意识到真核表达载体可以在没有增强子部分的存在下发挥其功能。本发明的关键不在于特定的增强子(如果有的话)或用于驱动蛋白C酶原表达的启动子，而在于新的编码顺序和由该顺序产生的相应的蛋白质。
然而，载体的选择如启动子、增强子、和可选择的标志物会极大地影响真核寄主细胞产生的蛋白质的最终水平。欧洲专利公告0245949号(1987年11月19日公开，系本文参考文献)公开了许多天然酶原蛋白C的表达载体，这些表达载体利用BK增强子刺激能定位驱动初生人蛋白C表达的真核启动子。这些载体一旦转化到也可表达大DNA病毒最早期基因产物(如腺病毒的E1A基因产物)的真核细胞，可驱动特别高水平的表达。这一点可由本发明公开的载体pGT-Q097-h、pGT-Q248-h、pGT-Q313-h和pGT-329h证明，GBMT-E1A基因产物的表达方法对用本发明的载体而言特别优选。
本发明不限于使用特定的真核寄主细胞。许多真核寄主细胞都可从保藏机构如美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，MD20852)得到，并适用于本发明的载体。具体寄主细胞的选择在某种程度上取决于用于驱动本发明蛋白C编码DNA化合物的具体表达的载体。因为本发明的初生人蛋白C和初生人蛋白C衍生物需经历随后的转译后修饰作用，所以某些寄主细胞更优选地用于本发明的载体。根据欧洲专利公告0245949和Grinnel等人的论文(1987，Bio/Technolony 51189)，腺病毒转化的人胚胎肾细胞对重组产生γ-羧基化蛋白如人蛋白C来说特别优选。一种这样的腺病毒转化的人胚胎肾细胞系是293细胞系，它可从ATCC得到293保藏号为ATCC CRL 1573。293细胞系也优选地适用于本发明的载体。
但是，有利于产生γ-羧基化蛋白(如人蛋白C酶原)的腺病毒转化的细胞系不限于腺病毒转化的人胚肾细胞。事实上，腺病毒转化的细胞一般说来是产生γ-羧基化人蛋白C的特殊寄主。这一类型的特别优选的细胞系是可从ATCC得到的AV12-664(下文简称“AV12”)细胞系，保藏号为ATCC CRL 9595。AV12细胞系的构建是将人腺病毒12注入金黄仑鼠的颈背，然后从生成的肿瘤中分离细胞。后面的实例3描述了用例证性载体pGT-Q097-h转化293和AV12细胞系。
本发明载体可转化到各种真核寄主细胞特别是哺乳动物细胞中并在其中表达。不具有可用于分离和鉴定稳定的真核转化株的可选择标记的本发明载体不仅可用于瞬间分析的目的，也可用于共转化之目的，共转化方法公开于美国专利4，399，216(1983年8月26日公开)，在此并入本文作为参考。本发明的载体还包括可使其在大肠杆菌中复制的顺序，因为在大肠杆菌中制备质粒DNA通常比在其它寄主中更为有效。
本发明载体上所含有的人蛋白C的编码顺序在那些其中与结构基因相连的特定启动子起作用的寄主细胞中表达。适用于本发明的寄主细胞实例列于表Ⅲ，附带适当的注解。
表Ⅲ寄主细胞 来源 购自 备注HepG-2 人肝胚细胞瘤 ＊ATCC＃HB8065 美国专利4，393，133描述了该细胞系的使用。
CV-1 非洲绿猴肾细胞 ATCC＃CCL70LLC-MK2 猕猴肾细胞 ATCC＃CCL7LLC-MK2 猕猴肾细胞 ATCC＃CCL7.1 比ATCC＃CCL7生长更衍生物 快。
3T3 小鼠胚成纤维细胞 ATCC＃CCL92CHO-K1 中国金黄仑鼠卵细胞 ATCC＃CCL61 需脯氨酸。CHO-K1衍生物如dhfr-衍生物DXB11可由该寄主产生。
HeLa 人子宫颈上皮样细胞 ATCC＃CCL2RPMI8226 人骨髓瘤 ATCC＃CCL155 IgGλ-型轻链分泌H4IIEC3 小鼠肝细胞瘤 ATCC＃CRL1600 衍生物如8-氮杂鸟嘌呤抗性FAZA寄主细胞可由该寄主产生。
C127I 小鼠成纤维细胞 ATCC＃CRL1616HS-Sultan 人浆细胞细胞瘤 ATCC＃CRL1484BHK- 幼年金黄仑鼠肾细胞 ATCC＃CCL10
如表Ⅲ所示，许多哺乳类细胞都有必要的细胞识别机制和对本发明初生蛋白上信号肽的适当处理程序，并提供转译后修饰如糖基化、γ-羧基化和β-羟基化，如观察到的血浆中的蛋白C。然而，如上所述，HPC的最佳转译后处理过程发生于腺病毒转化的细胞中。对这类真核寄主细胞的转化而言，存在许多载体(如下所讨论)，但是，下面例举的特定载体决非要限制本发明的范围。
pSV2型载体包括构成一个限定的真核转录单位-启动子(ep)、间插顺序(IVS)和聚腺苷酸化(pA)位点的SV40基因组片段。在没有SV40 T-抗原时，质粒pSV2型载体通过整合到寄主细胞染色体DNA中而转化哺乳类和其它真核寄主细胞。已构建了各种质粒pSV2型载体(见Eukaryotic Viral Vectors，Gluzman编，Cold Spring Harbor Laboratories出版，Cold Spring Harbor，New York，1982)，如质粒pSV2-gpt、pSV2-neo、pSV2-dhfr、pSV2-hyg和pSV2-β-球蛋白，其中SV40启动子驱动插入基因的转录。这些载体都适用于本发明的编码顺序，并可从ATCC(在Rockville，Maryland)或NRRL(在Peoria，Illinois)得到。
质粒pSV2-dhfr(ATCC 37146)含有受SV40早期启动子控制的鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)基因。在适当的条件下，获知所述dhfr基因在寄主染色体中被放大或拷贝。该放大作用可以包括与dhfr基因紧密相连的DNA顺序如本发明的初生人蛋白C编码顺序，见Schimke的综述文章(1984，Cell 37705-713)，因此可用于增加本发明蛋白C酶原的产生。
被构建用来在哺乳类和其它真核寄主细胞中表达本发明初生蛋白C和蛋白C酶原的质粒可采用各种启动子。本发明决不限于使用本文所列举的特定的真核启动子。Bucher等人公开的启动子如SV40晚期启动子或真核启动子(Bucher et al.，1986，Nuc.Acids Res.14(24)1009)或得自真核基因(如诱导雌激素的鸡卵清蛋白基因、干扰素基因、诱导糖皮质激素的酪氨酸氨基转移酶基因、胸苷激酶基因及较大早期和晚期腺病毒基因)的启动子都可容易地分离和修饰以用于设计在真核寄主细胞中产生人蛋白C酶原的重组DNA表达载体。真核启动子也可以串联形式用于驱动本发明编码顺序的表达。而且，已知道许多还原病毒可感染很大范围的真核寄主细胞。所述还原病毒DNA的长端重复常常编码启动子的活性，因此可用于驱动本发明编码顺序的表达。
质粒pRSVcat(ATCC 37152)含有劳斯氏肉瘤病毒(RSV)的部分长端重复，RSV已知可感染鸡和其它寄主细胞。RSV的长端重复顺序可以从质粒pRSVcat的～0.76kb Nde Ⅰ-HindⅢ片段分离。RSV的长端重复(Gorman et al.，1982，P.N.A.S.796777)适用于本发明的载体。质粒pMSVi(NRRL B-15929)含有鼠肉瘤病毒(MSV)的长端重复，该病毒已知可感染鼠类和其它寄主细胞。这些重复顺序适合用作本发明载体的启动子。小鼠金属硫因(MMT)启动子也已鉴定出有用于真核宿主细胞的特性，并且适用于本发明的载体。所述MMT启动子存在于15kb的质粒pdBPV-MMTneo(ATCC 37224)中，该质粒可用作构建本发明其它质粒的起始原料。
本发明说明性DNA顺序和质粒的许多修饰和变化都是可能的。例如，遗传密码的简并性使得多肽编码区域及转译终止信号的核苷酸可以被取代，而编码出的多肽顺序不变。这种可取代的顺序可以从已知的人蛋白C氨基酸顺序和DNA顺序推导，并可通过以下常规合成或位点特异性变变方法而构建。合成方法可基本上按照Itakura等人的方法(1977，Science 1981056)和Crea等人的方法(1978，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 755765)进行。因此，本发明决不限于具体例举的那些DNA顺序和质粒。
在本发明的载体转化到真核寄主细胞中后，可以根据可选择表型来选择转化体。所述可选择表型可以由存在于所述表达载体上或存在于与所述表达载体一起转化到寄主细胞中的另一个载体上的可选择标记授与。一旦选择出转化株，便需要鉴定哪种转化株表达最高水平的所述表达载体编码的所需蛋白。这种鉴定在进行共转化方法后特别重要，共转化产生许多只含有可选择标记物的质粒而不含表达载体的转化株。在后面的实例4中描述了一种方法，它不但可以鉴定表达和分泌所需蛋白的细胞，还相对所考察的其它细胞定量所分必的蛋白。该方法还可用于分离可分泌最高水平所需蛋白的活细胞。
将酶原形式人蛋白C活化成活性蛋白C(APC)的方法是老的并为专业人员所熟知。蛋白C可仅由凝血酶活化、由凝血酶/凝血调变蛋白复合物活化、由Russell氏蝰蛇毒液活化或由各种其它方法活化。人蛋白C酶原的活性通过全酰胺解分析或抗凝固作用分析由凝血酶活性而测定凝血酶的活化作用和蛋白C的分析(酰胺解和抗凝性)按照文献(Grinnell et al.，1987，Biotechnology 51189-1192，在此并入本文作为参考)所述方法进行。人蛋白C糖类突变体的酰胺解比活公开于表Ⅳ。
表ⅣAPC形式型 酰胺解活性 %3抗凝活性 相对水平的功能活性(μ/mg)天然APC 32±10 119±24 1Q097 80±10 118±11 2.5Q248 NDbND NDQ313 52±8 98±8 1.4Q329 116±16 128±21 3.9a.以酰胺解分析法测得的量除APTT分析法测得的活化蛋白C的量测定。
b.末做c.与天然APC相比的相对酰胺解活性乘相对抗凝活性用于表Ⅳ分析的酶原分子利用单克隆抗体由ELISA分析而定量，所述单克隆抗体不(不在同样程度上象)与产生该抗体的相同量的野生型分子的(反应那样与)突变体或衍生物反应。因此，根据蛋白含量进一步纯化和定量得到表Ⅴ所示的数据。
表Ⅴ功能活性(单位/mg)HPC 酰胺解(相对于wt HPC) 抗凝固(相对于血浆wt HPC)得自血浆 nd 250(1)wt aPC 35±5(1)(n＝7) 325±65(1.3)(n＝5)Q097 32±4(0.9)(n＝10) 303±33(1.2)(n＝3)Q248 63±12(1.8)(n＝8) 669±172(2.7)(n＝3)Q313 52±7(1.5)(n＝9) 627±99(2.5)(n＝3)Q329 47±6(1.4)(n＝9) 516±29(2.1)(n＝3)第一个圆括号中的数字是对得自血浆的HPC的活性增加倍数。还给出了两次重复或三次重复测定的独立样品(n)的数字。
除了表Ⅴ中所示的增加的衍生物抗凝活性，突变体Q313还表现出对凝血酶的亲和性增加，对仅由凝血酶或与辅助因子凝血调变蛋白复合时活化速率增加约3倍。该速率增加使得酶原型人蛋白C在临床应用上更为敏感，而且还改进了酶原型蛋白C裂解形成活性蛋白C的生产方法。酶原Q313活化的动力学参数示于表Ⅵ。
表Ⅵ底物 Km(μM) k(cat)(min) k(cat)/Km(min-1mM-1)wt HPC 6.1±0.45，n＝3 480±14 79Q313 1.9±0.50，n＝4 380±14 200这些结果是三次独立测定的平均值，这些值由非线性回归分析而确定。
活化蛋白C在防止静脉血栓扩大、动脉血栓形成和防止死亡和器官不能抵抗革兰氏阴性脓毒症、内毒素血症和弥散性血管内血凝固等方面具有基本的抗凝血特性。特别重要的是，本发明活化蛋白C衍生物的功能性活性的增加，将降低上述临床应用的剂量，从而增加安全限度。
本发明的活化重组蛋白C酶原可用于防治各种涉及血管内凝固的获得性疾病，包括深度静脉血栓、肺栓塞、外周动脉血栓、起源于心脏或外周动脉的栓子、急性心肌梗塞、血栓突发及弥散性血管内凝固。这些蛋白C衍生物也可有效地用于治疗患有继发性深度静脉血栓引起的杂合蛋白C不足的病人和患有紫癜暴发病的纯合蛋白C缺乏的病人。活化蛋白C有吸引力的治疗用途在于防止目前由低剂量肝素治疗的深度静脉血栓和肺栓塞。
本发明的蛋白C衍生物同样可用于治疗起源于外周动脉(最显著的是颈动脉)血栓的栓子，这些疾病在目前的治疗体制下还没有令人满意的防治方法，目前的治疗体制包括使用能够抑制血小板功能的药物、口服抗凝剂或其结合物。
本发明的活化衍生物还可用于治疗急性心肌梗塞，因为本发明的衍生物一旦被活化便具有纤维蛋白溶原的性质。在心肌梗塞急性期，这些活化衍生物可以和组织血纤维蛋白溶酶原激活剂一起使用。在冠状动脉血栓闭塞解决后，本发明的酶原可再使用几天以防止急性心肌再梗塞。
活化的蛋白C用于治疗播散性血管内凝固。对患有播散性血管内凝固(DIC)的病人在广泛的临床试验中已使用了肝素和口服抗凝剂，但结果令人失望。而本发明的活化蛋白C及活化衍生物在治疗DIC时比常规抗凝剂有明显的优点。
常规抗凝剂(特别是华法令)可用于治疗侵害性恶性肿瘤。许多肿瘤细胞都产生引起凝固系统活化从而导致局部纤维蛋白沉积的物质。这些纤维蛋白的沉积形成“巢”，癌细胞在其中可进行分裂形成骨髓硬化性损伤。然而，不可能将华法令或其它常规抗凝剂与更强烈并更有效形式的化疗结合使用，因为这种治疗会使血小板急剧下降，而用华法令治疗的血小板减少症会将病人置于不可接受的高风险的严重出血并发症中。本发明的蛋白C衍生物和活化蛋白C一样比常规抗凝剂有更高的选择性，并且比肝素或口服抗凝剂有更高的治疗指数，可以相对安全地用于血小板减小症的病人，因此使得用有效的强烈的化疗与本发明活化的蛋白C结合治疗侵害性癌症的病人成为可能。
本发明的酶原及其活化形式可按照已知方法配制制备药用组合物，其中本发明的人蛋白C酶原或活化的蛋白C与可药用载体混合。合适的载体及其配制剂(包括其它人蛋白如人血清清蛋白)在例如文献(Remington′s Pharmceutical Sciences第16版，1980，Mack出版公司，由Osol等人编辑)中已知描述，该文献在此并入本文作为参考。这类组合物含有有效量的蛋白C酶原或其活化对应物以及合适量的可药用载体，制备适于有效施用于寄主的药用组合物。所述蛋白C组合物可以经非肠道途径给药或通过其它能保证其以有效形式传递到血管中的其他方法给药。
以下实例说明本发明的方法，描述本发明具有代表性的化合物、载体和转化株，但不限制本发明。
实例1质粒pLPC-Q097从NRRL得到大肠杆菌K12 AG1/pLPC-Q097的冻干物，登记号为NRRLB-18608。将这些冻干物倒入装有10ml LB培养基(10g细菌用胰化胨、5g细菌用酵母抽提物、每升10g NaCl;调pH至7.5)的管中，于32℃培养2小时，此时在培养物中加50μg/ml氨苄青霉素，然后于37℃下培养过夜。
取一小部分过夜培养物，以某种方式置于含50μg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂(加有15g/l细菌用琼脂的LB培养基)平板上，从而获得大肠杆菌K12 AG1/pLPC-Q097的单菌落分离菌。将得到的单菌落接种到10ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃下剧烈振荡培养过夜。取10ml过夜培养物接种到500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃下剧烈振荡培养，直到培养物达到静止期。
以下操作沿用Maniatis等人的方法(Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。
于4℃下以4000g离心10分钟收集细胞，弃去上清液。用100毫升冰冷的STE缓冲液(0.1M NaCl;10mM Tris-HCl，pH7.8;1mM EDTA)洗涤细胞沉淀。洗涤后，将细胞沉淀再悬浮于10ml含5mg/ml溶菌酶的溶液1(50mM葡萄糖;25mM Tris-HCl，pH8.0;10mM EDTA)中，室温下放置10分钟。然后向经溶菌酶处理的细胞中加入20ml溶液2(0.2N NaOH和1%SDS)，用倒转法小心混合该溶液。将该混合物在冰上保温10分钟。
向溶解的细胞混合物中加入15ml冰冷的5M乙酸钾，pH4.8，倒转混合该溶液。将该溶液在冰上保温10分钟。5M乙酸钾溶液的制备方法是在28.5ml水和60ml 5M乙酸钾中加入11.5ml冰乙酸;所得的钾浓度为3M，乙酸浓度为5M。
于4℃下，将溶解的细胞混合物以20，000rpm在Beckman SW27(或同等规格的转子)中离心20分钟。细胞的DNA和碎片在管底形成沉淀。回收到约36ml上清液，加入0.6倍体积的异丙醇并混合，所得溶液在室温下放置15分钟。室温下以12，000g离心30分钟收集质粒DNA。弃去上清液，用70%乙醇于室温下洗涤DNA沉淀。倒出乙醇洗涤液，将沉淀置于真空干燥器中干燥。然后将沉淀再悬浮于8ml TE缓冲液中(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA)。
向DNA溶液中加入8克CsCl。在每10ml CsCl-DNA溶液中加入约0.8ml 10mg/ml溴乙锭溶液。该溶液的最终密度约为1.55g/ml，溴乙锭浓度约为600μg/ml。将溶液移至Beckman 50型离心管中，管顶用石蜡油装满，密封后于20℃下以45，000rpm离心24小时。离心后，在可见光下可看见两条DNA带。取下离心管盖后，用带有21号皮下注射针头的注射器沿离心管壁插入而吸出较低的DNA带。
用水饱和的1-丁醇萃取若干次，除去溴化乙锭。用TE缓冲液透析除去CsCl。先后用缓冲的苯酚和氯仿萃取，沉淀出DNA，用70%乙醇洗涤，干燥。得到约1mg质粒pLPC-Q097，于4℃下在TE缓冲液中以约1μg/μl的浓度贮存。质粒pLPC-Q097的限制位点和功能图谱示于附图1。质粒pLPC-Q248、pLPC-Q313和pLPC-Q329以同样的方式从其相应的宿主细胞(也得自NRRL)中分离。它们各自的限制性位点和功能图谱示于附图。
实例2构建质粒pGT-Q097-h质粒pLPC-Q097、pLPC-Q248、pLPC-Q313和pLPC-Q329可直接转化到真核宿主细胞(优选293细胞)中产生高水平的人蛋白C酶原。如果编码突变型酶原的基因被连到某一载体上，这样该基因的表达由GBMT转录单位驱动，则可以得到高水平的表达和分泌产物。
质粒pGTC是这类载体中的一种，在该质粒中野生型人蛋白C酶原基因由GBMT转录单位驱动。野生型蛋白C基因可从载体的Bcl Ⅰ限制性片段上容易地除去，本发明的任何基因可插入载体的Bcl Ⅰ限制性片段。Bcl Ⅰ对质粒DNA的消化受到顺序5′-GATC-3′中的腺嘌呤的甲基化的抑制。因此，要从没有腺嘌呤甲基化酶的大肠杆菌寄主细胞中制备质粒pGTC，腺嘌呤甲基化酶由dam基因编码，该基因的产物使顺序5′-GATC-3′中的腺嘌呤残基甲基化。大肠杆菌K12 GM48(NRRL B-15725)缺乏功能性的dam甲基化酶，因此是制备质粒pGTC DNA的合适寄主，该质粒DNA是构建质粒衍生物的起始材料。
将大肠杆菌K12 GM48细胞进行培养，并使其适于转化，基本按照实例1的方法用质粒pGTC转化大肠杆菌K12 GM48细胞。将转化的细胞置于含有氨苄青霉素的L-琼脂上，一旦具有氨苄青霉素抗性的大肠杆菌K12 GM48/pGTC转化株形成菌落，便可基本按照实例1的方法用一个这种菌落制备质粒pGTC DNA。得到1mg质粒pTGC DNA，并将其悬浮于1ml TE缓冲液中。该方法可用于从质粒pGT-h和pGT-d制备质粒DNA。质粒pGT-d含有GBMT转录单位，但在Bcl Ⅰ位点无基因，所以任何基因可以容易地插入。质粒pGT-d还含有鼠类dhfr基因，因此可利用氨甲蝶呤抗性表型选择任何转化株或进行放大。质粒pGT-h含有GBMT转录单位、易于插入目的基因的Bcl Ⅰ位点和授予潮霉素抗性的基因。含有这些质粒的大肠杆菌K12 AG1菌株于1990年1月18日保藏于NRRL。这些菌株的保藏号为NRRL B-18591(大肠杆菌K12 AG1/pGT-d)、NRRL B-18592(大肠杆菌K12 AG1/pGT-h)和NRRL B-18593(大肠杆菌K12 AG1/pGTC)。以上菌株均可从NRRL得到。这些质粒的限制性位点和功能图谱示于附图。
将约10μl由GM48细胞制备的质粒pLPC-Q097 DNA与20μl 10X Bcl Ⅰ限制性缓冲液(100mM Tris-HCl(pH7.4)、1.5M KCl、100mM MgCl和10mM DTT)、20μl 1mg/ml BSA、5μl限制性酶Bcl Ⅰ(～50单位，如Bethesda Research Laboratories(BRL)所限定，本文所用的所有限制性酶都得自BRL)及145μl水混合，所得反应混合物在37℃下保温2小时。本文所描述的限制性酶反应都常规地由苯酚结束，并用氯仿提取，然后沉淀DNA，用乙醇洗涤，在TE缓冲液中再悬浮DNA。然后将消化的DNA通过1%的琼脂糖制备凝胶电泳，并利用BioRad Prep-A-Gene药盒，按照厂商的指示纯化含有突变基因的约1400碱基对的限制性片段。
然后基本上按照实例1所述的方法从大肠杆菌K12 AG1/pGTC(NRRLB-18592)中分离质粒pGT-h，在GM48细胞中系列并基本上如实例2所述的方法分离。然后如上所述用限制性酶Bcl Ⅰ消化质粒pGT-h DNA，然后分离并纯化较大的载体片段。将该载体片段用TE(pH8.0)调到90μl，然后加入10μl(0.05单位)小牛肠道碱性磷酸酶以使载体末端去磷酸化。将该混合物在37℃下保温30分钟，然后加入10μl 500mM EGTA，将反应物在65℃下保温45分钟以使所述酶失活。反应物然后用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀，洗涤并再悬浮于20μl水中。
将约7μl(10ng)Bcl Ⅰ消化的载体主链与约1μl(100ng)约1400碱基对的质粒pLPC-Q097的Bcl Ⅰ限制性片段、1μl 10X连接酶缓冲液(0.5M Tris-HCl，pH7.6，100mM MgCl，100mM DTT和500μg/ml BSA)及1μl T4 DNA连接酶混合。将该连接反应物在16℃下保温12-16小时。该连接反应可产生含有从GBMT转录单位中定向转录的突变酶原基因的质粒，或所述基因被反向连接的质粒。这些含有以适当取向转录的所述基因的质粒命名为质粒pGT-Q097-h。
冰冷的感受态大肠杆菌K12 AG1细胞得自Strategene(3770 Tansey Road，San Diego，California 92121)。将约5μl所述连接反应物与100μl感受态细胞混合，然后将该细胞-DNA混合物在冰上保温1小时，在42℃下热休克45秒，再在冰上冷却约2分钟。将该细胞-DNA混合物稀释到Falcon 2059试管中的1ml SOC培养基中，并在37℃下培养1小时。将100μl试样平铺于含有氨苄青霉素的LB-琼脂平皿上，在37℃下培养至菌落出现。
将上述菌落分开单个培养，并通过限制性酶分析而考察单个菌落中的质粒DNA。质粒DNA的分离按照实例1的方法以较小规模进行，但省去CsCl步骤直至鉴定出适当的大肠杆菌K12 AG1/pGT-Q097-h转化株。这时进行大规模的高纯度的质粒制备。按照实例1和2的步骤，任何突变酶原基因都可容易地克隆到任何GBMT载体中去，以形成质粒pGT-Q097-h、pGT-Q248-h、pGT-Q313-h和pGT-Q329-h。
实例3用质粒pGT-Q097-h构建腺病毒转化的人胚胎肾细胞系293和腺病毒转化的金黄仑鼠细胞系AV12转化株人胚胎肾细胞系293得自ATCC，登记号为ATCC CRL 1573。腺病毒转化的金黄仑鼠细胞系AV12也得自ATCC，登记号为ATCC CRL 9595。下面描述以293细胞为寄主细胞系的转化方法，但是该方法对大多数真核细胞系(包括AV12细胞系)都普遍适用，并表达本发明的载体。
293细胞以登记号CRL 1573得自ATCC，在-25平方毫米的小瓶中在加有10%热失活马血清的Eagle氏最低限基本培养基(Gibco)中含有融合单层的约5.5×10个细胞。将该小瓶在37℃下培养，培养基一星期换两次。培养基由DMEM(Gibco)加上10%小牛血清、50μg/ml庆大霉素和10μg/ml Aqua MEPHYTON植物甲萘醌维生素K1(Merck Sharp and Dohme，Merch and CO.，Inc.，West Point，PA19486)组成。将这些细胞传代培养，方法是除去培养基，用Hank氏平衡盐溶液(Gibco)冲洗，加入0.25%的胰蛋白酶(含有0.2g/L EDTA)1-2分钟，用新鲜培养基冲洗，吸出，以1∶5或1∶10的传代培养比例分配到新的培养瓶中。
在转化的前一天，将这些细胞以每100mm盘0.7×10个细胞进行接种。灭菌，将溶于TE缓冲液中的乙醇沉淀的质粒DNA用于制备含有25μg/ml转化用质粒DNA和250mM CaCl的2X DNA-CaCl溶液。制备含有280mM NaCl、50mM Hepes和1.5mM磷酸钠的2X HBSS，pH调至7.05-0.15。将2X DNA-CaCl溶液滴加到等体积的无菌2X HBSS中。在加入DNA时，将1枝带有棉花塞的无菌1ml塑料吸管插入含有2X HBSS混合物管中并吹入气泡。在室温下不搅拌放置30-45分钟，以形成磷酸钙-DNA沉淀。
用塑料吸管轻轻吹气而将沉淀混合，并将1ml沉淀(每平皿)直接加到10ml含有受纳细胞的生长培养基中。在37℃下培养4小时后，换用新鲜培养基，细胞在提供选择压力前再培养72小时。对那些不含有在真核细胞中起作用的可选择标记的质粒，转化过程利用一种质粒混合物，
即缺少可选择标记的本发明表达载体和一种含有可在真核细胞中起作用的可选择标记的表达载体。许多载体都可用于这类共转体系，包括质粒pSV2-dhfr(ATCC 37146)、pSV2-neo(ATCC 37149)、pSV2-gpt(ATCC 37145)和pSV2-hyg(NRRL B-18039)。质粒pSV2-hyg授予真核寄主细胞对潮霉素B的抗性。该共转化技术可用选择标记选择含质粒的细胞。对这些细胞进行进一步的考察以鉴定出含有两种转化质粒的细胞。当然，本发明还包括含有对真核细胞可选择标记的表达载体，因此不需使用共转化技术。
对用授予潮霉素抗性的基因的质粒(如质粒pGT-Q097-h)转染的细胞，将潮霉素B加入生长培养基中至最终浓度为约200μg/ml。然后将所述细胞与培养基在37℃下培养一周，3-4天换一次培养基。将所得潮霉素抗性菌落转移到鉴定用的单个培养瓶中，质粒pSV2-neo授予新霉素抗性(G418也用于代替新霉素)，G418抗性菌落的选择基本上按照潮霉素抗性细胞的选择方法进行，只是G418的最终浓度加到300μg/ml。
用二氢叶酸还原酶(dhfr)基因或授予氨甲蝶呤抗性的dhfr基因衍生物作为选择性标记将基因或质粒引入dhfr-缺陷型细胞系中，然后用氨甲蝶呤放大质粒拷贝数量的方法在文献中已有记载。293细胞为dhfr阳性，因此含有包含dhfr基因的质粒的转化株不是仅仅基于dhfr阳性表型进行选择，它还能够在缺少次黄嘌呤和胸腺嘧啶的培养基中生长。缺少功能性dhfr基因并用含dhfr的质粒转化的细胞系可根据dhfr表型进行选择。尽管用dhfr在产dhfr的细胞中作为可选择和可放大标记的方法还未很好地研究，文献中的记载证明dhfr可在产生dhfr的细胞中用作选择性标记和用于基因放大作用。本发明不被用于表达载体的可选择标记所限制。而且，还可使用可放大标记，如金属硫因基因、腺苷脱氨酶基因或多基因抗性类成员如P-糖蛋白基因。
用质粒pGT-Q097-h、pGT-Q248-h、pGT-Q313-h和pGT-Q329-h转化293细胞系，产生许多转化体。这些转化株的分析见实例4。
实例4选择分泌人蛋白C酶原突变型的细胞将实例3得到的潮霉素抗性转化株以每个组织培养皿几百个细胞克隆的密度培养在100mm组织培养皿中。滗出培养基，细胞用5ml Hank氏平衡盐溶液(Gibco)冲洗两次。通过将1ml 1.8%琼脂(47℃)与3ml Dulbecco;s Modified Eagle′s(DME)盐(Gibco，37℃)混合而制备无菌的0.45%琼脂溶液(Sigma Type 4 agarose，catalogue ＃A3643，Sigma Chemical Co.，P.O.Box 14508，St.Louis，MO 63178)，并将2ml该0.45%琼脂溶液铺于所述细胞上。
将硝酸纤维滤膜(Schleicher和Schuell公司，Keene，NH 03431)煮沸，然后高压灭菌2小时以除去对细胞有毒的湿润剂。将滤膜置于琼脂糖层上，除去气泡后在37℃下培养1-3小时。然后除去滤膜并放入PBS(50mM Tris-HCl，pH＝7.2，和150mM NaCl)，所述滤膜预先标记以表明其在平皿中的原始取向以便于以后的菌落鉴定。
为保持滤膜分析期间细胞在平皿上存活，在细胞上盖一个含有2ml 1.8%琼脂(47℃)、2ml DME盐(37℃)和4ml加有20%胎牛牛血清的DME盐溶液(37℃)的8ml混合物。然后将细胞置于37℃培养箱中。
在滤膜上的所有洗涤和反应当滤膜在摇动的平面上时完成。将所述滤膜首先通过在含5%牛奶的PBS中于室温下保温而阻滞，然后在PBS中冲洗4次(每次5分钟)。将10μg/ml生物素化的羊抗人蛋白C多克隆抗体的2.5%牛血清清蛋白溶液加到该滤膜上(以足够的量盖在滤膜上)，然后将该滤膜在37℃下培养1小时。
用于后面制备抗蛋白C抗体的蛋白C的纯化，可按照Kisiel所述方法(1979.J.Clin.Invest.64761)而完成。多克隆抗体可利用E.A.Kabat公开的方法而制备(Structural Concepts in Immunology andImmunochemistry，published in 1968 by Holt，Rhinehart，and Winston)。单克隆抗体也适用于所述检测，单克隆抗体可如Kohler和Milstein公开的方法(1975，Nature，256495)或如美国专利4，696，895、EPO Pub.205046号、Laurell等人(1985，FEBS 191(1)75)、Suzuki等人(1985，J.Biochem、97127-138)和EPO Pub.138222号公开的方法制备。用于所述分析的抗生素D和生物素化的马辣根过氧化物酶(HRP)以Vectastain药合(Veotor Laboratories，Inc.，30 Ingold Road，Burlingame，CA 94010)得到。生物素也得自Vector Labora tories，Inc.
膜滤用PBS在4℃下冲洗四次。然后，制备抗生素D和生物素化的辣根过氧化物酶，并按照Vectastain(Vector Laboratories)药合厂商的指示加入。将所述滤膜与HRP-结合的抗生素D一起在4℃下保温1小时(当分泌蛋白量小时，也可用更长时间，如过夜);然后，滤膜在4℃下用PBS冲洗四次。
为显示滤膜上指示剂的颜色，将溶于冰冷的100%甲醇中的约30mg HRP(4-氯-1-萘酚，Sigma)加到50ml PBS和30μl 30%HO中。再将该混合物加到硝酸纤维滤膜上，室温下保温至显色。分泌本发明人蛋白C酶原最多的菌落，在滤膜上的指征不仅显色最早，而且颜色较深。
滤膜显色后，用原来的平皿再次印迹滤膜以确定菌落与滤膜上印迹的关系。然后选出分泌本发明人蛋白C酶原最多的菌落并用于生产所述酶原。
本领域专业人员会明白上述检测仅仅是说明鉴定高度分泌细胞系的方法。许多检测法都可成功地用于该方法。例如，可以用双抗体反应，即用羊抗蛋白C抗体(IgG)和生物素化的抗羊IgG抗体代替生物素化的羊抗蛋白C抗体。
酶原突变体可从细胞培养物中纯化。从表达所述重组产物的细胞中除去上清液并在Pharmacia Fast flow-Q柱上纯化。将约1ml树脂用20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl、5mM EDTA和4mM苄脒平衡。将培养物上清液通过加入Tris-HCl(pH8.0)调到pH7.4，并调到5mM EDTA和4mM苄脒。将该上清液上样到柱中的树脂上，用3倍柱体积的Tris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl、5mM EDTA洗柱，然后用3倍柱体积的20mM Tris(HCl)、0.15M NaCl、4mM苄脒洗柱。利用含10mM CaCl的20mM Tris-HCl(pH7.4)、0.15M NaCl、5mM苄脒的洗脱缓冲液从柱中洗下重组产物。
产物的比活按照Grinnell等人的方法(1987，Biotechnology 51189-1192)测定如下将从柱中洗脱下的浓缩的并透析过的产物先用固相凝血酶-凝血调变蛋白复合物活化。产物的酰胺解活性通过水解三肽底物S-2366(得自Helena Labs)而测定。产物的抗凝活性利用得自Helena的试剂通过延长活化的部分凝血致活酶的时间而测定。
权利要求
1.一种制备重组DNA载体的方法，该方法包括将(Ⅰ)含有一种蛋白编码顺序的重组DNA化合物和(Ⅱ)含有一种启动子的DNA化合物连接起来，以便启动子在连接后定位驱动所述编码顺序的表达，所述蛋白质从氨基端到羧基端的氨基酸残基顺序如下MET TRP GLN LEU THR SER LEU LEU LEU PHE VAL ALA THR TRP GLY ILESER GLY THR PRO ALA PRO LEU ASP SER VAL PHE SER SER SER GLU ARGALA HIS GLN VAL LEU ARG ILE ARG LYS ARG ALA ASN SER PHE LEU GLUGLU LEU ARG HIS SER SER LEU GLU ARG GLU CYS ILE GLU GLU ILE GYSASP PHE GLU GLU ALA LYS GLU ILE PHE GLN ASN VAL ASP ASP THR LEUALA PHE TRP SER LYS HIS VAL ASP GLY ASP GLN CYS LEU VAL LEU PROLEU GLU HIS PRO CYS ALA SER LEU CYS CYS GLY HIS GLY THR CYS ILEASP GLY ILE GLY SER PHE SER CYS ASP CYS ARG SER GLY TRP GLU GLYARG PHE CYS GLN ARG GLU VAL SER PHE LEU R1CYS SER LEU ASP ASNGLY GLY CYS THR HIS TYR CYS LEU GLU GLU VAL GLY TRP ARG ARG CYSSER CYS ALA PRO GLY TYR LYS LEU GLY ASP ASP LEU LEU GLN CYS HISPRO ALA VAL LYS PHE PRO CYS GLY ARG PRO TRP LYS ARG MET GLU LYSLYS ARG SER HIS LEU LYS ARG ASP THR GLU ASP GLN GLU ASP GLN VALASP PRO ARG LEU ILE ASP GLY LYS MET THR ARG ARG GLY ASP SER PROTRP GLN VAL VAL LEU LEU ASP SER LYS LYS LYS LEU ALA CYS GLY ALAVAL LEU ILE HIS PRO SER TRP VAL LEU THR ALA ALA HIS CYS MET ASPGLU SER LYS LYS LEU LEU VAL ARG LEU GLY GLU TYR ASP LEU ARG ARGTRP GLU LYS TRP GLU LEU ASP LEU ASP ILE LYS GLU VAL PHE VAL HISPRO R2TYR SER LYS SER THR THR ASP ASN ASP ILE ALA LEU LEU HISLEU ALA GLN PRO ALA THR LEU SER GLN THR ILE VAL PRO ILE CYS LEUPRO ASP SER GLY LEU ALA GLU ARG GLU LEU ASN GLN ALA GLY GLN GLUTHR LEU VAL THR GLY TRP GLY TYR HIS SER SER ARG GLU LYS GLU ALALYS ARG R3ARG THR PHE VAL LEU ASN PHE ILE LYS ILE PRO VAL VALPRO HIS R4GLU CYS SER GLU VAL MET SER ASN MET VAL SER GLU ASNMET LEU CYS ALA GLY ILE LEU GLY ASP ARG GLN ASP.ALA CYS GLU GLYASP SER GLY GLY PRO MET VAL ALA SER PHE HIS GLY THR TRP PHE LEUVAL GLY LEU VAL SER TRP GLY GLU GLY CYS GLY LEU LEU HIS ASN TYRGLY VAL TYR THR LYS VAL SER ARG TYR LEU ASP TRP ILE HIS GLY HISILE ARG ASP LYS GLU ALA PRO GLN LYS SER TRP ALA PRO-COOH其中R1选自ASN和GLN，R2选自ASN和GLN，R3选自ASN和GLN，R4选自ASN和GLN。
2.权利要求1的方法，该方法产生含有权利要求1的DNA化合物的重组DNA表达载体。
3.权利要求2的方法，该方法产生一种载体，其中R1为GLN、R2为ASN、43为ASN和R4为ASN。
4.权利要求3的方法，该方法产生选自质粒pLPC-Q097和质粒pGT-Q097-h的质粒。
5.权利要求2的方法，该方法产生一种载体，其中R1为ASN、A2为GLN、R3为ASN和R4为ASN。
6.权利要求5的方法，该方法产生选自质粒pLPC-Q248和质粒pGT-Q248-h的质粒。
7.权利要求2的方法，该方法产生一种载体，其中R1为ASN、R2为ASN、R3为GLN和R4为ASN。
8.权利要求7的方法，该方法产生选自质粒pLPC-Q313和质粒pGT-Q313-h的质粒。
9.权利要求2的方法，该方法产生一种载体，其中R1为ASN、R2为ASN、R3为ASN和R为GLN。
10.权利要求9的方法，该方法产生一种选自质粒pLPC-Q329和质粒pGT-Q329-h的质粒。
11.一种经从真核寄主细胞中分泌重组产生酶原型人蛋白C的方法，该方法包括以下步骤(A)用一种重组DNA载体转化一种真核寄主细胞，所述载体包括(ⅰ)编码一种氨基酸残基顺序的DNA顺序，所述氨基酸残基顺序包括从氨基端到羧基端的以下氨基酸顺序
其中R1选自ASN和GLN，R2选自ASN和GLN，R3选自ASN和GLN和R4选自ASN和GLN;(ⅱ)定位驱动所述DNA顺序表达的启动子;(B)将步骤(A)中转化的寄主细胞培养在允许所述DNA顺序表达的条件下;(C)从所述培养物中回收所述蛋白C酶原。
12.权利要求11的方法，其中在步骤(B)中培养的所述寄主细胞选自293/pLPC-Q097、293/pLPC-Q248、293/pLPC-Q313、293/pLPC-Q329、293/pGT-Q097-h、293/pGT-Q248-h、293/pGT-Q313-h和293/pGT-Q329-h寄主细胞。
全文摘要
本发明描述了一种重组产生高活性酶原型人蛋白C的方法。这些酶原形式不同于天然蛋白C，它们有更高的酰胺解和功能活性及新的糖类结构。还公开了用于该方法的DNA化合物、载体和转化株。
文档编号C12R1/19GK1055560SQ9110120
公开日1991年10月23日 申请日期1991年2月23日 优先权日1990年2月23日
发明者布鲁斯·E·格里茨, 布赖恩·威廉·格林内尔 申请人:伊莱利利公司