专利名称：一种固定化酵母细胞及其在腺苷三磷酸生产上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种固定化酵母细胞的制备方法，以及用固定化酵母细胞生物合成腺苷三磷酸的生产工艺。
众所周知，腺苷三磷酸(简称ATP)已广泛用作肌肉萎缩、心肌梗塞、肝炎和各种急救病症中的药物。60年代末人们已利用游离酵母细胞由腺苷(简称A)或腺苷酸(简称AMP)生产腺苷三磷酸。但由于该法不仅酵母细胞利用低(仅使用一次)，而且由于游离酵母细胞混杂于产物中，带来了分离上的困难，故ATP的实际收率不高。为此，从70年代开始，许多生物工作者，致力于开发固定化酵母细胞生产ATP的研究，例如Ado，Y等人在“J.Solid-phaseBiochem，1979，4，43”杂志上公开了一种将速冻酵母细胞固定在乙基纤维素微胶囊中的方法，在柱反应器中连续生产ATP，其初始反应时的ATP的转化率可达70%，以后下降至50%左右;张元亮等人在“河南大学学报，1985年第二期上”公开了一种固定化啤酒酵母细胞生物合成ATP的研究，其初始转化率可达80%，但固定化啤酒酵母细胞使用次数少。总之，到目前为止，用固定化酵母细胞生物合成ATP，由于其转化率远较游离酵母细胞法为低，再加上固定化酵母使用寿命较短，故至今未能实现工业化。
本发明的目的在于制备一种可长期使用的固定化酵母细胞，其生物合成ATP的转化率可达99%以上。
本发明的构思是这样的发明人在长期研究“固定化酵母细胞及其生物合成ATP”过程中发现，现有技术存在如下一些缺陷(1)制备固定化酵母细胞时，温度过高，导致酵母细胞的活性降低;
(2)使用戊二醛溶液使用固定化酵母细胞强化时，温度过高，导致固定化酵母细胞的活性降低;
(3)吸附在固定化酵母细胞上未被封闭的戊二醛醛基存在，影响固定化酵母细胞的活性;
(4)固定化酵母细胞在强化过程中，导致部分糖酵解酶系中巯基酶失活，影响固定化酵母细胞的整体活性;
(5)在使用固定化酵母细胞生物合成ATP的过程中，其中所含的辅酶I不断流失，导致固定化细胞的活性降低，表现在ATP的转化率的迅速下降。
总之，上述诸方面的因素，不仅导致固定化酵母细胞初始活性较低(与游离酵母细胞相比，其初始活性仅为80%)，而且由于在生物合成过程中辅酶I的流失，导致了ATP转化率的迅速下降，影响了工业化的前景。
本发明针对现有技术的上述缺陷，提出了克服这些缺陷的技术措施(1)降低制备固定化酵母细胞时温度，选择适宜于酵母细胞生存的微环境，使酵母细胞处于最宜的活化环境中被固定化;
(2)降低固定化酵母细胞交联强化时的温度，减少交联剂戊二醛对固定化酵母细胞活性的不利影响;
(3)用含有赖氨酸的水溶液洗涤固定化酵母细胞，使吸附在固定化酵母细胞上的戊二醛的游离醛基封闭，以消除游离戊二醛醛基对固定化酵母细胞的不良影响;
(4)用含有亚硫酸氢钠的水溶液洗涤固定化酵母细胞，使在固定化过程中失活的糖酵解酶系中的巯基酶的巯基还原活化;
(5)采用对固定化酵母细胞低温速冻的方法，增加固定化酵母细胞的通透性，降低酶促反应时间;
(6)在反应液(底物)中加入微量的辅酶I(腺嘌呤烟酰胺二核苷酸，可简称NAD)，以补充固定化酵母细胞在酶促反应过程中辅酶I的流失。
本发明亦是这样实现的一.高活性固定化酵母细胞的制备(1)首先用浓度为0.1mol/L，PH为5.8的磷酸缓冲液配制成浓度为12～18%(Wt)的明胶溶液，即为固定化载体溶液;
(2)然后将装有上述溶液容器置于33～37℃水浴中恒温，加入已恒温于15～37℃水浴中的酵母，搅拌混合均匀，倒入盘中铺成2～4mm厚的膜，置于冰箱(4℃)中凝固1～3小时，取出后通过筛网切成10目大小的颗粒(10筛孔/厘米2);
(3)再将上述10目大小的颗粒置于0～10℃，浓度为1.5%(Wt)戊二醛水溶液中交联强化20～25分钟，取出后用去离子水洗净，获得粗制的固定化酵母细胞;
(4)将粗制的固定化酵母细胞，先用含有0.1～1%(Wt)赖氨酸的水溶液洗涤，使交联在固定化酵母细胞上的微量未反应的戊二醛醛基封闭;再用含有0.2～2%(Wt)亚硫酸氢钠水溶液洗涤，使交联过程中失活的糖酵解酶系中的巯基酶的巯基还原活化;最后用去离子水洗净后，置于-25～-40℃低温下速冻，得到本发明所说的固定化酵母细胞。在低温下保存备用。
通过上述方法制得的固定化酵母细胞，可以保持酵母细胞中20多种酶的全部活力，而且所得固定化酵母细胞具有良好的机械强度。
其中制备固定化酵母细胞时的载体溶液与酵母的混合比(Wt)为1∶1～2，最宜的混合比为1∶1.0～1.5。
固定化载体溶液的最宜温度为34～36℃;酵母的最宜温度为18～25℃。
载体的最宜浓度为15%(Wt)。固定化酵母细胞用戊二醛交联强化时最宜温度为4℃，交联时间为22分钟。
二.用本发明所说的固定化酵母细胞生物合成腺苷三磷酸(ATP)的工艺，主要包括如下内容(1)优选反应液(或称底物水溶液)，其摩尔组成比为a腺苷或腺苷酸:30～70mMol/L,b葡萄糖:100～300mMol/L,c硫酸镁:4～20mMol/L,d辅酶I:0～1mMol/L,e磷酸缓冲液:150～350mMol/L,PH=6.5～7.5f水:其余.
(2)固定化酵母细胞(Wt)与反应液(V)之比为1∶1～2。
(3)优选酶促反应温度范围为26～38℃。
(4)优选酶促反应时间为1.5～3小时。
其中反应液的最佳摩尔组成比为a腺苷或腺苷酸:35～45mMol/L,b葡萄糖:150～200mMol/L,c硫酸镁:6～10mMol/L,d辅酶I:0.2～0.4mMol/L,e磷酸缓冲液:200～300mMol/L,PH=7f水其余所说的辅酶I是腺嘌呤烟酰胺二核苷酸的简称。
将本发明所述的固定化酵母细胞与上述组成的反应液，按固液比1∶1～2的比例加入一反应器中，反应器的夹套中通入30～38℃的恒温水，使酶促反应维持在此温度范围内进行，在反应器底部通入压缩的氮气，使固定化酵母细胞呈流态化，反应进行1.5～3.0小时，并每间隔0.5小时取样一次，用常规的琼酯糖电泳法测定ATP的转化率，1.5～2.5小时之间取样，ATP的转化率可达90～99%，3小时的取样已检测不到腺苷或腺苷酸的存在，可见所有的腺苷或腺苷酸都转化成了ATP，反应完毕，开启放料阀，放掉反应器内的料液，再加入新鲜的反应液，重复上述操作。固定化酵母细胞则可长期使用下去。从反应器中放出的料液可通过一D296阴离子树脂交换柱，料液中的ATP为D296阴离子交换树脂所吸附，用水洗脱杂质后，再用含Nacl的水溶液洗脱，收集ATP的级分液，加入酒精。使ATP沉淀，经过滤、真空干燥，可得ATPNa2·2H2O产品。
其中酶促反应温度以34～36℃时为佳。固定化酵母细胞(Wt)与反应液(V)之比宜为1∶1～1.5。
下面将结合实施例进一步阐明本发明的内容实施例1称取3g明胶，加入一盛有17ml、PH为5.8、浓度为0.1Mol/L磷酸缓冲液的三角烧瓶中，置于35℃恒温水浴中，直至完全溶解，然后与保温于18℃水浴中的30g酵母混合、搅匀，倒入瓷盘中铺成2mm左右厚的膜，再置于冰箱(4℃)中凝固2小时，取出后通过一不锈钢筛网切割成10目大小的颗粒，在4℃下置下1.5%戊二醛溶液中交联22分钟，取出后先用去离子水洗涤，再用含有赖氨酸的水溶液洗涤，继用含有亚硫酸氢钠的水溶液洗涤，最后再用去离子水洗净，然后置于-40℃的低温冰箱中速冻，制得本发明所说的固定化酵母细胞，并在此低温下保存备用。
在250ml三角烧瓶中，按照固定化酵母细胞(Wt)反应液(V)＝1∶1的比例加入50克固定化酵母细胞与50ml的反应液，反应液的组成比为腺苷酸40mMol/L，葡萄糖150mMol/L，硫酸镁8mMol/L，辅酶I0.2mMol/L，磷酸缓冲液(PH＝7.0)250mMol/L，其余为水。在35℃下振荡反应2小时后，取样。用琼酯糖电泳测定，ATP的转化率达96%，然后倾出反应后的料液，再加入新的反应液50ml，继续在35℃下振荡反应，重复上述操作步骤。ATP的转化率可始终保持在96%。固定化酵母细胞可长期使用。
将反应后的料液200ml通过D296阴离子树脂交换柱(湿树脂的体积为40ml)，料液中ATP被树脂所吸附留在柱内。用水洗杂后，再用0.7mol/L Nacl-0.01mol/L Hcl组成的水溶液洗脱，收集ATP的级分60ml，然后用酒精沉淀。过滤、真空干燥，可得3.2克ATP Na2·2H2O产品。
实施例2称取0.5kg明胶，加入一盛有2.83l，PH为5.8，浓度为0.1Mol/L磷酸缓冲液的容器中，置于40℃恒温水浴中直至完全溶解。然后冷至37℃下恒温一小时，再加入已在25℃水浴中保温的4.5kg酵母，搅拌混合均匀后，倒入搪瓷盘中，铺成2～4mm厚的膜，置于4℃冰箱中凝固2小时，取出后切割成10目大小的颗粒，再倒入温度为4℃、浓度为1.5%(Wt)、体积为10l的戊二醛溶液中，并置于4℃的冰箱内交联22分钟，取出后先用去离子洗涤，再用含有赖氨酸的水溶液洗涤，继用含有亚硫酸氢钠的水溶液洗涤，最后再用去离子水洗净，然后置于-25℃以下的低温冰箱中速冻，制得本发明的固定化酵母细胞，并在此低温下保存备用。
在一容积为10l的流化床反应器中，加入上述的固定化酵母细胞4kg和反应液6l，反应液的组成比同实施例1。在反应器的夹套内通入36℃恒温水，使系统在恒温状态下进行酶促反应，在反应器的底部通入压缩的氮气(氮气通过空气过滤器除菌)，使反应器中固定化酵母细胞呈流态化，反应3小时后，取样，用琼酯糖电泳法测定，几乎所有的腺苷(或腺苷酸)都转化成ATP，即转化率在99%以上，故反应3小时作为终止时间是适宜的，开启放料阀，放掉反应完毕的料液，再加入6l新鲜的反应液，继续重复上述的酶促反应。本发明的固定化酵母细胞可长期使用，其ATP的转化率可保持在99%左右。提取、分离ATP的方法同实施例1。
由上可见按照本发明的方法所制得的固定化酵母细胞用于生物合成腺苷三磷酸(ATP)具有如下优点1.本发明的固定化酵母细胞的活性与游离酵母细胞的活性相当，用于生物合成腺苷三磷酸(ATP)时，其转化率可达99%以上，大大高于现有技术的80%。
2.适宜的固化条件，使本发明所说的固定化酵母细胞具有足够的强度，可满足工业生产中的长期使用。
3.由于本发明在反应体系中添加了微量的辅酶I，从而抑制了固定化酵母细胞在酶促反应过程中辅酶I流失，使固定化酵母细胞中的20多种酶在参予酶促反应时全部保持良好的整体活性。
4.本发明的固定化酵母细胞适用于反应液含有较高浓度的腺苷或腺苷酸的条件。
5.采用本发明的固定化酵母细胞生物合成腺苷三磷酸(ATP)时，其酶促反应时间可缩短至1.5～3小时，至少比现有技术减少一半。
总之，由于本发明的固定化酵母细胞具有上述的显著优点，因而具有广泛的工业应用前景。
显然，对于任何从事腺苷三磷酸生产的技术人员来说，采用本发明所说的固定化酵母细胞，亦可以将含腺苷或腺苷酸浓度较低的反应液(如腺苷或腺苷酸含量为10～20mMol/L)转化成ATP，此时反应时间可小于1.5小时。
此外，本发明所说的酵母可以是新鲜酵母，亦可以是冻干酵母，当它们被固定化后，在本发明的条件下，ATP的转化率可达96～99%。
权利要求
1.一种以明胶为载体的固定化酵母细胞的制备方法，其特征在于(1)所说的载体系采用浓度为0.1Mol/L，PH为5.8的磷酸缓冲液配制成12～18%(wt)的明胶溶液；(2)将(1)所述的明胶溶液置于33～37℃的恒温水浴中保温，然后按载体与酵母11～2的比例将已在15～37℃水浴中恒温的酵母加入到载体中去，搅拌混匀后倒入盘中铺成2～4mm厚的膜，再置于4℃的冰箱中凝固1～3小时，取出后切成10目大小的颗粒；(3)将(2)所述的10目大小的颗粒置于0～10℃浓度为1.5%(wt)戊二醛水溶液中交联强化20～25分钟，取出后用去离子水洗净，获得粗制的固定化酵母细胞；(4)将(3)所述的粗制的固定化酵母细胞先用含有0.1～1%(wt)赖氨酸的水溶液洗涤，再用含有0.2～2%(wt)亚硫酸氢钠的水溶液洗涤，最后用去离子水洗净后，置于-25～-40℃低温冰箱中速冻，得到本发明所说的固定化酵母细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中载体浓度以15%(Wt)为佳。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于载体与酵母的混合比宜为1∶1.0～1.5。
4.如权利要求1～3之一的方法，其特征在于固定化时载体(明胶溶液)宜恒温至34～36℃，酵母宜恒温至18～25℃。
5.如权利要求1-4之一的方法，其特征在于用1.5%(Wt)戊二醛交联强化固定化酵母细胞的温度为4℃，交联时间为22分钟。
6.如权利要求1-5之一的方法所制得的固定化酵母细胞用于生物合成腺苷三磷酸时，其工艺条件的特征为(1)反应液(底物)摩尔比为a 腺苷或腺苷酸: 30～70 mMol/L,b 葡萄糖: 100～300 mMol/L,c 硫酸镁: 4～20 mMol/L,d 辅酶I: 0～1 mMol/L,e 磷酸缓冲液: 150～350 mMol/L,(PH=6.5～7.5)f 水: 其余;(2)固定化酵母细胞(Wt)与反应液(V)之比为1∶1～2;(3)酶促反应的温度范围为26～38℃;(4)酶促反应时间为1.5～3小时。
7.如权利要求6所述的工艺，其特征在于反应液的摩尔比为a 腺苷或腺苷酸: 35～45 mMol/L,b 葡萄糖: 150～200 mMol/L,c 硫酸镁: 6～10 mMol/L,d 辅酶I: 0.1～0.3 mMol/L,e 磷酸缓冲液PH=7: 200～300 mMol/L,f 水: 其余.
8.如权利要求6或7所述的工艺，其特征在于酶促反应温度为34～36℃。
9.如权利要求6-8之一所述的工艺，其特征在于固定化酵母细胞(Wt)与反应液(V)之比宜为1∶1～1.5。
全文摘要
本发明公开了一种固定化酵母细胞的制备方法及其在腺苷三磷酸(ATP)生产上的应用。采用本发明的固定化酵母细胞可将腺苷或腺苷酸定量地转化成腺苷三磷酸，转化率可达99％以上。
文档编号C12P19/32GK1072957SQ9211381
公开日1993年6月9日 申请日期1992年12月18日 优先权日1992年12月18日
发明者邱蔚然, 徐茜, 王永法 申请人:华东化工学院