专利名称：脂酰辅酶a脂肪醇o-酰基转移酶的制作方法
本申请是申请日为91年11月20日的USSN07/796，256和申请日为92年8月21日的USSN07/923，411的部分后续申请。
本发明涉及酶，纯化和得到这些酶以及与其相关的氨基酸和核酸序列的方法，以及在基因工程应用中使用这些组合物的方法。
由于植物基因工程技术的发展，使我们有可能转化和再生多种植物品类，以提供具有新的和所希望的特征的植物。对这种植物基因工程技术有兴趣的领域之一是在植物组织中制备有价值的产物。这些应用要求使用各种各样的DNA结构和核酸序列，用于转化过程，以便生成能产生所需产物的植物。例如，需要用植物功能启动子来使基因序列获得适当的表达，这种表达可以在整个植物中或者在经过选择的植物组织中。另外，选择性标记序列经常被用于识别转化了的植物材料。这些植物启动子和选择性标记物提供了有价值的工具，这些工具在获得新植物方面非常有用。
涉及这些基团工程技术的一个所希望的目标是能够提供具有便利的蜡酯来源的作物。在许多工业应用中均需要蜡酯，这些应用包括药品、化妆品、洗涤剂、塑料和润滑剂。这些产品，特别是长链蜡酯以前一直从巨头鲸(一种濒临灭绝的物种)或从沙漠灌木、希蒙德木属(最近)中获得。而这些来源均不能便利地提供蜡酯。因此，为了获得这种化合物的可靠来源，转化的作物是人们所期待的，因为作物就培养、收获和产品提取方面来说易于操作。
然而，为了获得这些转化植物，首先必须获得负责生物合成所需蜡酯产物的基因。蜡酯的制备起因于至少两种酶活性的作用，即脂肪酰基还原酶和脂酰基脂肪醇酰基转移酶，或蜡合酶。对这些酶的初步研究和对脂肪酰基还原酶的广泛分析及纯化过程表明，这些蛋白与膜有关，可是在蜡生物合成中负责脂肪酰基脂肪醇连结反应的酶却一直没有被很好地表征过。因此，还需要对这种酶进行进一步的研究和最终的纯化，以便可以获得编码该酶活性的基因序列。
因此，人们希望设计出一种纯化方案，通过该方案获得蜡合酶蛋白、以及获得确定的氨基酸序列和/或对蜡合酶特异的抗体。在该方案中，可将库筛选、聚合酶链反应(PCR)或免疫技术用于识别表达蜡合酶蛋白的克隆。可以将由此获得的克隆分析，从而识别出与蜡合酶活性有关的核酸序列。然后，可以将蜡合酶核酸序列与脂肪酰基还原酶蛋白(这些蛋白或者是转基因宿主细胞天生的或者是用重组技术提供的)用于在宿主细胞中产生蜡酶。
据报导由正在生长的希蒙德木属胚芽得到的无细胞组织匀浆具有酰基辅酶A脂肪醇酰基转移酶活性。该活性与在差速离心时形成的漂浮蜡垫有关，(Pollard等人(1979)Supra;Wu等人(1981)Supra)。
Wildner和Halliek(AbstractformTheSouthwestConsortiumFifthAnnualMeeting，April22-24，1990，LasCruces，NM.)报导了由具有脂酰基S辅酶A转酰酶活性的股薄肌裸藻得到的多酶复合物的溶解进程。
Pushnik等人(AbstractfromTheSouthwestConsortiumFourthAnnualMeeting，February7，1989，Riverside，Ca.)报导了希蒙德木属酰基辅酶A醇转酰酶蛋白的10倍纯化过程。
图1-图1提供了希蒙德木属脂肪酰基还原酶的核酸序列和转译的氨基酸序列(正如由cDNA序列所确定的)。
图2-图2提供了希蒙德木属蜡合酶cDNA克隆的核酸序列和转译的氨基酸序列。
本发明提供了一种部分纯化的脂酰辅酶A脂肪醇O-酰基转移酶蛋白，其中所说的蛋白在由脂肪醇和脂肪酰基底物形成蜡酯的过程中具有活性。该脂肪酰辅酶A脂肪醇O-酰基转移酶在本文中也被称作“蜡合酶”。本发明的蜡合酶可以与许多脂酰基和脂肪醇底物(包括酰基辅酶A和酰基载体蛋白)具有活性。这些底物的碳链长度可以变化，尽管一种给定的蜡合酶可能对具有特定链长的酰基和醇底物有优先性，或者可能与具有宽范围碳链长度的酰基和醇底物具有活性。
一般来说，本发明的蜡合酶至少对那些链长在12至24碳的酰基和醇底物具有活性，其中该碳链长度可以用式“C2x”表示，其中“x”是6至12中间的一个数，当然其它的酰基或醇底物也可以被试验并发现有活性。另外，由于获得了本发明蜡合酶蛋白，才使下文中所详细描述的进一步的操作过程成为可能。这些操作可以导致其它有关的蜡合酶的制备和发现。
因此，在第一方面，本发明涉及具有蜡合酶酶活性的蛋白制剂，并以一种种子植物蛋白制剂作为示例。这种制剂是通过分馏希蒙德木属胚芽以产生微粒体膜制剂、将来自该膜制剂的蜡合酶蛋白溶解并采用色谱分析法将其进一步纯化而制成的。本文中的希蒙德木属蜡合酶可以接受宽范围的酰基和醇底物，它们可以是饱和的也可以是不饱和的(含有一个或多个碳间双键)。在EnzymeNomenclature°1984中希蒙德木属蜡合酶的活性用E、C、2、3、1、75表示，其推荐名称为“长链醇脂肪酰基转移酶”。
通过这些过程，得到一种部分纯化的蛋白制剂，该制剂含有表观分子量约为57KD的蜡合酶蛋白。因此，本文除了提供了获得这些蜡合酶蛋白的氨基酸序列的方法之外，还提供了通过纯化从种子植物源获得蜡合酶蛋白的方法。
另外，通过本文所述的方法还可以提供来自其它生物体源的蜡合酶蛋白。例如，可以得到不动细菌蜡合酶的部分纯化制剂，其中我们发现该蜡合酶活性与约45KD的肽带有关。同样，本发明还提供了股薄肌裸藻蜡合酶蛋白制剂，其中41KD肽与蜡合酶活性有关。
在本发明第二方面，还涉及到与本发明蜡合酶有关的核酸序列。本文还描述了一些方法，由此可以从本发明的蜡合酶蛋白的氨基酸序列中识别并获得这些序列。本文还描述了这些结构基因序列在分离其它蜡合酶序列中的应用，以及它们在重组结构中的运用，从而在宿主细胞中转录蜡合酶酸序列和/或表达蜡合酶蛋白。本发明还涉及与蜡合酶蛋白有关的其它核酸序列的应用，例如5’和3’非编码区的应用。
在本发明的第三方面，还涉及到含有编码有意和反意蜡合酶序列的重组结构的细胞。特别是涉及到那些含有优选的希蒙德木属蜡合酶酰基辅酶A底物的细胞，如芸苔属植物胚芽中的那些细胞。
另外，本发明还涉及到作为本发明重组结构的表达产物的含有本发明的蜡合酶蛋白的细胞，并且提供了在宿主细胞中产生蜡合酶的方法。此外，本发明还涉及到由于该蛋白在宿主细胞中发生表达而回收到的蜡合酶蛋白。
进一步地，还应该认识到，本发明的蜡合酶也可以用于在那些含有蜡合酶的脂肪酰基和脂肪醇底物的宿主细胞中以制备蜡酯。这些宿主细胞可以天然存在或者通过用编码脂肪酰基还原酶的核酸结构进行转化而获得。脂肪酰基还原酶，或称“还原酶”在催化脂肪酰基基团还原成相应的醇的过程中具有活性。共同未决美国专利申请07/659，975和07/767，251(将它们引入本文作为参考)描述了这些还原酶蛋白。该情报登载于已公开的PCT专利申请WO92/14816中。此外，本文还描述了其它一些蜡合酶蛋白源，它们也是所需的还原酶蛋白源。
在本发明这个方面，还特别涉及到含有本文所述的希蒙德木属蜡合酶的优选的醇底物的植物细胞。还涉及到制备具有这种醇底物的植物细胞的方法，其中所说的细胞用编码脂肪酰基还原酶核酸序列的重组核酸结构转化。因此，那些通常不含有足够量的、被蜡合酶采用的醇底物的宿主细胞可用还原酶结构进行转化以产生醇。由此方法，在宿主细胞中存在的脂肪酰基基团将也提供在蜡酯合成中为蜡合酶所利用的脂肪醇底物源。依靠蜡合酶和还原酶蛋白的特异性，人们确认，用该方法可以获得能产生多种所需要的蜡酯产品的植物细胞。这些产品根据其脂肪醇和脂酰基基团的饱和度和链长不同而具有不同的特性。所以，按照本文方法生产的蜡酯产品可以从宿主细胞中回收并包括在本发明中。
本发明的脂肪辅酶A脂肪醇酰基转移酶包括任意一种氨基序列、如蛋白、多肽或肽片断，该序列在催化由脂肪酰基基团酯化脂肪醇以产生蜡酯的酯化过程中具有活性。本发明的酯酰辅酶A醇酰基转移酶在下文中也被称作“蜡合酶”。
尽管典型地被说成是酰基辅酶A醇酰基转移酶，但是本发明的蜡合酶对许多酰基底物(包括脂酰辅酶A和脂酰基载体蛋白分子)也具有活性。另外，受到蜡合酶作用的酰基和醇底物可能都具有可变的碳链长度和饱和度，尽管该蜡合酶可能对某些分子具有优选活性。
许多不同的生物体都可以由醇或酰基底物产生蜡酯，并且都是本发明的蜡合酶蛋白的合适来源。例如，植物产生表皮或角质层蜡(Kolattukudy(1980)TheBiochemistryofPlants(Stumpf，P.K.和Conn，E.E.，等.)Vol.4，P.571-645)，沙漠灌木，希蒙德木属产生种子贮藏蜡(Ohlrogge等人(Lipids(1978)13203-210)。在各种细菌中也观察到了蜡合成，例如不动细菌属(Fixter等人(1986)J.Gen.Microbiol.1323147-3157)和微球菌(Lloyd(1987)Microbios5229-37)，以及通过单细胞生物体，裸藻(Khan和Kolattukudy(1975)Arch.Biochem.Biophys.170400-408)。另外，在牛睑板腺(Kolattukudy等人(1986)J.LipidRes.27404-411)、鸟尾脂腺，以及多种昆虫和海洋生物的微粒体制剂中也报导了蜡生产和蜡合酶活性。因此，具有不同特性的许多不同的蜡酯可以通过本发明的蜡合酶来生产，而且酶的活性以及所产生的蜡酯的类型取决于所获得的底物或特定的蜡合酶的底物特异性。
为了获得用于酯化反应的蜡合酶蛋白的可靠来源，最好是分离出与蜡合酶有关的核酸序列，以便使这些序列能被克隆到产生蜡合酶的宿主细胞中。例如，可以克隆编码蜡合酶蛋白的核酸序列到表达于大肠杆菌细胞中的载体中，以提供方便的蜡合酶蛋白来源。如此产生的蜡合酶蛋白也可以用于培养抗蜡合酶蛋白的抗体，以便用于从不同源、特别是从植物中识别和纯化出类似的蜡合酶蛋白。另外，对蜡合酶的进一步研究可能导致位点特异诱变反应，从而使其催化特性进一步特征化和得到改善或改变其脂肪醇或脂肪酰基底物特异性。改变了底物特异性的蜡合酶可以与其它FAS酶一起应用。
在本发明之前，蜡合酶蛋白的氨基酸序列不是已知的。因此，为了获得与蜡合酶有关的核酸序列，有必要首先从可获得的源中纯化出蛋白并且至少确定其部分氨基酸序列，以便可以制备用于分离蜡合酶核酸序列的合适探针。
沙漠灌木、Simmondsiachinensis(希蒙德木属)被确定作为候选的蜡合酶蛋白源。开始的研究表明，希蒙德木属蜡合酶是一种整合膜蛋白并且在自然条件下厌水。一般来说，与膜有关的蛋白都难于纯化，因为当将它们溶解时，即从膜环境(在此它们具有正常功能)中分离时，它们容易失去酶活性。已经使用的溶解整合膜蛋白的技术包括向适当的膜部分(frlction)制剂中添加洗涤剂或有机溶剂。如果想要的蛋白仍可用特异酶分析测量的保持功能活性，然后可以使用其它常用的纯化技术，如沉淀、离子交换、凝胶过滤和亲合色谱法。
一般来说，作为获得溶解的膜蛋白的第一个步骤需要具有蜡合酶活性的微粒体膜制剂。标准微粒体膜制剂采用无细胞均浆(CFH)的差速离心产生不含完整细胞，核以及可溶蛋白的膜部分。(例如参见Moore等人(1987)BiologicalMembranesAPracticalApproach.pp37-72，eds，FinalayandEvans.)使用油料种子(oilseeds)，初始离心步骤一般产生粒物、上清液和一种漂浮脂肪垫，然后通过对上清液进行进一步的离心可以回收微粒体膜。
在1991.2.22申请的共同未决申请USSN07/659，975中描述了一种方法，通过该方法获得具有良好酶活性回收的希蒙德木属膜部分，该酶活性与脂肪酰基还原酶(在希蒙德木属中形成蜡合酶所涉及的另一种酶)有关。该方法还提供了具有蜡合酶活性的膜部分(如在以下实施例中所详述的)。其它方法对于本领域普通专业人员来说都是已知的，并且可以用来制备类似的膜制剂。另外，用于在这些制剂中分析蜡合酶活性的方法描述于实施例1中。
对酶进行进一步特征化和纯化的关键步骤是获得溶解的蜡合酶蛋白，使它从其天然双层膜环境中分离，同时保持一定量的可测蜡合酶活性。尽管在少数情况下可使用有机溶剂，但一般来说采用双亲洗涤剂水溶液来使整个膜蛋白从双层膜中分离。许多溶解膜蛋白的不同洗涤剂和方法对本领域专业人员来说是已知的，并且Neugebauer(MethodsEnzymol.(1990)182239-253)和Hjelmiland(MethodsEnzymol.(1990)182253-264)对此亦进行了评述。
人们常发现用于溶解膜蛋白的洗涤剂会抑制所需要的蛋白的酶活性。有几种洗涤剂被试验用于希蒙德木属蜡合酶的溶解，其中包括CHAPS(3-[3-胆酰氨基丙基)-二甲基-氨溶]-1-丙烷磺酸盐)，该物质在共同未决申请USSN07/659，975中被证实在由希蒙德木属纯化脂肪酰基还原酶的过程中是用的。研究发现所有这类物质会抑制蜡合酶活性。尽管在浓度高于CMC时CHAPS会引起强烈的抑制作用，但是我们发现添加磷脂如L-磷脂酰胆碱，以及将CHAPS浓度从0.75%调至0.3%(即低于CMC)可以使部分蜡合酶蛋白活性再生。再生蜡合酶活性的基本条件是在洗涤剂去除或稀释过程中有磷脂存在，以便将蜡合酶蛋白引入磷脂气孔中。该方法不同于再生希蒙德木属还原酶活性所采用的方法，该方法不需加入磷脂。因此，如果在蜡合酶制剂(如由微粒体膜部分制成的制剂)中存在磷脂，通过去除或稀释洗涤剂可以简单地检测活性。然而，在进一步纯化的蜡合酶制剂中，必需加入磷脂才能检测活性。如果高水平(即大于约2%W/V)的磷脂被使用，则通过简单地稀释溶解用的洗涤剂就可以使蜡合酶活性再生。实施例1描述了在溶解的蜡合酶制剂中再生和测定蜡合酶活性的方法。
在实施例4中描述了利用洗涤剂CHAPS溶解希蒙德木属蜡合酶活性的方法。从微粒体膜制剂中获得了约15%的蜡合酶活性。同样，通过对其它洗涤剂的显性蜡合酶抑制剂的可逆性进行研究可以识别出能溶解希蒙德木属或其它候选蜡合酶的其它一些有用的洗涤剂。由于由微粒体膜制剂溶解的蜡合酶活性的百分比较小，因此我们研究一些方法来增加以溶解的形式获得的蜡合酶的百分比。然而，按所述方法得到的溶解的蜡合酶的比例对于进行下文所述的进一步纯化、特征化以及蜡合酶排序是足够的。
由于得到了溶解的蜡合酶蛋白，现在我们可以进行进一步的实验，就底物特异性、辅助因子需要量以及可能的活性抑制方面将该酶特征化。例如，研究发现本发明的希蒙德木属蜡合酶具有宽范围的酰基底物，包括酰基ACP和酰基辅酶A分子。另外，酰基和脂肪醇底物在碳链长度方面具有较宽的大小范围。例如，可以用具有碳链长度为C12至C24的底物来测试活性，并且结果表明它们都能被酶利用。此外，具有不同饱合度的脂肪酰基和脂肪醇都能显示活性。
已经证明对使本发明的蜡合酶进一步特征化非常有用的方法是它能特异标记蜡合酶蛋白。例如，研究发现可以将具有蜡合酶活性的膜制剂与带有放射标记的棕榈酰辅酶A(该蜡合酶的一种底物)一起培养，从而通过SDS聚丙烯酰胺电泳(PAGE)和随后的放射自显影法可以检测到表观分子量约为57KD的带有放射标记的肽带。另外，溶解的蜡合酶蛋白(该蛋白不再显示酶活性)可以被类似地标记，以提供一种可以通过进一步的纯化步骤而跟踪蜡合酶蛋白的便利方法。在实施例2中描述了这些标记方法的细节。
因此，具有本发明的蜡合酶活性的制剂可以作进一步技术处理，例如进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和随后的染色、或在用棕榈酰辅酶A放射标记之后进行SDSPAGE和后续的放射自显影法。用此方法可以证明有约57KD蛋白存在于这些制剂中，并且该蛋白的染色强度与蜡合酶活性水平一致。在进行棕榈酰辅酶A放射标记之后，SDSPAGE和放射自显影法证实标记带跟踪着蜡合酶活性。在下面的实施例中描述了一些实验，这些实验从尺寸排它性(Siyeexclusion)、亲和和反应染色色谱方面，证实57KD肽带局部跟踪着蜡合酶活性。
此外，色谱技术可用来提供植物蜡合酶的浓缩制剂。这类纯化步骤涉及在固定的反应染色基质，例如本发明所用的CibacronBlueF3GA(BlueA)上进行色谱。活性希蒙德木属蜡合酶粘接到装在含约0.4MNacl的缓冲液中的柱上，同时大约85%以上的其它蛋白通过或在随后清洗中去除。正如在共同未决申请USSN07/767.251中所述，在此条件下还原酶蛋白也会粘接在BlueA柱上。本文发现约有20%的载于BlueA柱上的蜡合酶活性可以通过洗脱而回收。有少部分该蜡合酶活性可以用1.0MNacl缓冲液洗脱，它还含有大部分从该柱上回收的活性还原酶，通过用1.5MNacl缓冲液洗脱获得大部分的所回收的还原酶活性，洗液中也含有少量还原酶活性。因此，大部分的可回收的蜡合酶活性是从大部分还原酶蛋白中分离得到的，尽管制剂中的主要蛋白不是57KD蜡合酶，而是56和54KD还原酶蛋白。
在BlueA色谱后对蜡合酶进行的进一步研究表明蜡合酶可以在该柱上进行聚焦。例如，在Superosel2(Pharmacia)上具有蜡合酶活性的BlueA部分的尺寸排它性色谱致使在该柱中空隙部分中的大部分蜡合酶活性被洗脱(排斥限量约为5百万道尔顿)，这表明蜡合酶是聚集形式的。重要的是在保留的部分中检测到少量(～5%)蜡合酶活性，并且通过与蛋白标准比较估计该峰值活性分子的尺寸在～55KD。这一点进一步证明了57KD标记带是蜡合酶，而且还说明蜡合酶活性是由单多肽提供的。
使用这些标记和纯化技术，希蒙德木属蜡合酶蛋白可以以基本纯化的蛋白制剂的形式回收，并且获得氨基酸序列。同样的，由于蜡合酶的脂肪醇底物的厌水特性，还可以推断其它的蜡合酶也与其本来细胞中的膜有关，因此，这里所述的用于希蒙德木属蜡合酶的纯化技术也可用于其它蜡合酶蛋白纯化制剂的回收。
例如，通过肪酰辅酶A还原酶和肪酰辅酶A醇转移酶或蜡合酶的酶作用由股薄股裸藻产生蜡。一般，在该生物体中可以检测到碳链长度为24-32的蜡。正如上文谈到希蒙德木属时所述的，裸藻蜡合酶可用CHAPS/Nacl溶液溶解，并且通过BlueA色谱得到部分纯化的蜡合酶制剂。用该方法可以将与蜡合酶活性有关的41KD肽带识别出来。
另外，我们还知道不动细菌属物种也产生蜡酯组合物，尽管其机理还不十分明确。如本文所述在不动细菌属中也测定脂酰辅酶A醇转移酶或蜡合酶活性。将蜡合酶活性在CHAPS/Nacl中溶解，用BlueA柱色谱法浓缩，并且可以使用如尺寸排它性色谱之类的技术，将其进一步纯化。通过这些方法，可以在部分纯化的制剂中获得与蜡合酶活性有关的约45KD肽带。
尽管这些蜡合酶蛋白的厌水特性对纯化过程是个麻烦，但是使用许多方法都可以实现将基本纯化的蛋白回收。例如，可以将采用连续洗脱电泳工艺的制备性电泳装置用于纯化由BlueA柱得到的57KD蜡合酶。用该方法，可以将在水溶液中含有基本纯化形式的蜡合酶蛋白的凝胶部分识别出来。然后，如果需要可以对蜡合酶蛋白样品进行渗析，并浓缩以提供用于氨基酸排序技术的便利蛋白源。
另外，也可以采用聚丙烯酰胺凝胶并且将蛋白转移到一种膜基上，例如硝化纤维素或聚偏氟己烯(PVDF)。然后可以获得含有蜡合酶蛋白的膜部分，以使蜡合酶基本上不含其它蛋白。然后可将蜡合酶蛋白从膜上取下并做进一步处理，从而确定氨基酸序列。由于本发明的蜡合酶蛋白不能很好地转移到硝化纤维素膜上，故PVDF对排序方法来说是优选的。
通过将来自整个蛋白的N-端氨基酸区域排序，或制备所需蛋白的片断(通过用化学溴化氰消化，或通过用蛋白酶进行酶分裂)可确定蜡合酶的氨基酸序列，适用的蛋白酶的例子包括胰蛋白酶和内蛋白酶lysC，gluC，AspN和argC。然后可将按该方法获得的蜡合酶肽按照本领域专业人员所熟悉的方法排序和纯化。然后可将这些肽序列用于基因分离技术，包括PCR法和cDNA和基因库筛选。
为了证实蜡合酶的一致性还可以进行进一步的实验，例如在大肠杆菌中进行蛋白表达。随后蜡合酶可以在这些细胞中与脂肪酰基和脂肪族醇底物作用产生蜡酯，该蜡酯可以用各种分析方法检测。如果宿主细胞不含蜡合酶醇底物，那么可以通过分析细胞提取物而证实其活性。另外，通过用蜡合酶核酸序列和可购买到的转译箱进行体外转译也可制备蜡合酶蛋白。如果膜插入是活性的关键，那么为了获得活化的蜡合酶蛋白就必须向体外转译样品中添加微粒体膜制剂。其它的试验可以包括免疫分析，此时应制备对候选蛋白特异的抗体而且它在蛋白制剂中可以抑制蜡合酶活性。
因此，需要使用在与蜡合酶活性有关的蛋白质中确定的氨基酸序列来分离核酸序列，从而既可证实蜡合酶蛋白的一致性又可在宿主细胞(原核的或真核的)中使该序列转录和/或使其蛋白表达。
因为蜡合酶是一种被膜束缚的蛋白，所以需要在植物细胞中表达一种候选蛋白以证实其活性。电泳或轰击植物组织使其发生瞬时表达可用于此目的。最后，还需要在植物中(该植物产生可被该酶识别的底物)进行稳定的植物表达。如果用于用蜡合酶序列进行转化的植物不自然地含有该酶的脂肪醇和脂肪酰基酯底物，那么需要制备植物提取物并通过向该提取物中添加蜡合酶底物而测定蜡合酶活性。在下文化中将详细讨论用于用蜡合酶序转化植物宿主的结构和方法。
本发明的核酸可以是基因组或cDNA，并且可以从cDNA或基因库分离或者直接从分离的植物DNA中分离。一但蛋白被纯化和/或得到该蛋白的氨基酸序列，那么那些获得基因序列的方法对于本领域专业人员来说都是已知的。
例如，可以对分离的蛋白培养抗体并用于筛选表达库，从而识别产生植物蜡合酶蛋白或其抗原片段的克隆。另外，可以从该氨基酸序列合成低聚核苷酸，并用于核酸序列的分离过程。该低聚核苷酸可用于PCR以产生核酸片段，然后可将这些核酸片断用于筛选cDNA或基因库。在另一方法中，低聚核苷酸可被直接用于分析Northern或Southern斑点，以识别有用的探针和杂交条件，在该条件下这些低聚核苷酸可用于筛选cDNA或基因库。
本发明的蜡合酶核酸序列包括那些与希蒙德木属蜡合酶蛋白相应的序列，以及可以由希蒙德木属蛋白或者核酸序列得到的序列。“相应的”是指核酸序列，或者是DNA或者是RNA，包括那些编码希蒙德木属蛋白或其一部分的核酸序列，在所说的编码序列的5'端或3'端发现的调节序列，该调节序列在希蒙德木属胚芽中指导蜡合酶的转录或转录和翻译(表达)、不存在在cDNA中的基因内区序列，以及编码前体蜡合酶蛋白的任何前导肽或信号肽的序列(该前体蜡合酶蛋白对于插入到内质网膜中是需要的，但在成熟的蜡合酶中却没有发现)。
由希蒙德木属序列或蛋白“可得到”的序列是指任何与所要的蜡合酶蛋白有关的核酸序列，该序列可由希蒙德木属蜡合酶氨基酸序列合成，或者在不同生物体中识别得到，以及用希蒙德木属蜡合酶核酸序列或者用所制成的对希蒙德木属蜡合酶蛋白的抗体作为探针而分离得到。用该方法，可以发现那些其它的蜡合酶序列同样的可用来分离其它源中的与蜡合酶蛋白有关的核酸序列。
为了分离核酸序列，可采用质粒或病毒载体和本领域专业人员熟知的技术来制备cDNA或基因库。适用的核酸杂交和免疫方法(可用于筛选所要的序列)对于本领域专业人员来说是已知的，并且在例如Maniatis，等人(MolecularClonlngALaboratoryManuul，SecondEdition(1989)ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NewYork)中得到介绍。
一般，使用核酸探针获得的序列在靶序列和给定的编码所述的蜡合酶的序列之间将存在60～70%序列一致性。然而，也可能获得序列一致性50～60%的长序列。核酸探针可以是核酸序列的长片断，也可以是较短的、低聚核苷酸探针。当将较长的核酸片断用作探针时(大于约100bp)，可在低严格的条件下进行筛选，以便从靶样品中获得序列，这些序列与用作探针的序列有20～50%变异(即50～80%序列同源)。低聚核核苷酸探针可以明显地短于编码蜡合酶的整个核酸序列，但至少是约10个，优选至少约15个，更优选至少约20个核苷酸。当用较短区域对较长区域时，则需要更高的序列一致性。因此，希望识别氨基酸序列同一性高的酶活性位点，以便设计低聚核苷酸探针检测同源基因。
为了确定与给定的序列杂交是否可以分离有关的基因，需将该序列标记以便测定(一般使用放射性，尽管其它方法也可以)。将标记的探针加入杂交溶液中，并用含有所需核酸或者Northern或者Southerng斑点(筛选所需的同源源)的滤器进行培养，或用含有cDNA或要筛选的基因克隆的滤器进行培养。杂交和冲洗条件可以变化，以便使该探针杂交所述序列的杂交过程最佳化。较低的温度和较高的盐浓度适合于相关性更小的序列的发生杂交(低严格度)。如果在低严格条件下背景杂交存在问题，可在杂交步骤或冲洗步骤升高温度，和/或降低盐含量以改进特异杂交序列的测定。正如Beltz，等人所讨论的(MethodsinEnzymology(1983)100266-285)，根据所估计的探针熔点可以调节杂交和冲洗温度。
由于适用的探针和适当的杂交以及冲洗条件已按上文所述被识别，因此可以用标记的序列和最佳化的条件筛选cDNA或基因库。首先将库放在固体琼脂培养基上，并且将该DNA送到一种适当的膜(通常是硝化纤维素或尼龙滤器)上。然后用标记过的探针将这些滤器杂交并按上文所述进行冲洗以识别含有有关序列的克隆。
为了进行免疫筛选，可通过用纯化蛋白注射免子或小鼠(或其它适当的小型哺乳动物)以制备希蒙德木属蜡合酶的抗体。制备抗体的方法对本领域专业人员来说是众所周知的，而且可以找到专门从事抗体生产的公司。尽管多克隆抗体一般更适用于基因分离，但是不管是单克隆还是多克隆抗体都可以被生产。
为了筛选想要的植物品种，需要进行Western分析以确定在想要的植物品种的粗提物中存在有关的蛋白，该蛋白与希蒙德木属蜡合酶的抗体发生交叉反应。这一点可以通过将植物提取物蛋白在膜(一般为硝化纤维素)上的制动、随后进行电泳以及用抗体进行培养来完成，有许多不同的系统可用于在硝化纤维素滤器上检测抗体/蛋白复合物，其中包括抗体放射标记和第二抗体/酶轭合系统。Oberfelder已经描述了一些可获得的系统(Focus(1989)BRL/LifeTechnolgies，Inc.111-5)。如果初始的实验不能检测有关的蛋白，那么可使用其它的检测系统和阻断剂。当交叉反应发生时，通过筛选表达库(代表想要的植物品种)可以分离编码相关蛋白的基因。表达库可以在许多商购的载体包括λgtll)中构建，如Maniatis等人所述(上文)。
然后将按上文所述的用DNA杂交或免疫筛选技术识别的克隆纯化并进行DNA分离，以及用已知技术对其进行分析。用该方法可以证实该克隆编码了相关的蜡合酶蛋白。通过与希蒙德木属蜡合酶所用的方法相同的方法使用“新”蜡合酶可以得到其它的蜡合酶。
本领域普通专业人员应该明白本发明的蜡合酶核酸序列可用位点特异诱变或PCR标准技术进行修饰，或者可以在生产在合成核酸序列的过程中完成对序列的修饰。这些修饰过的序列仍涉及本发明的蜡合酶核酸序列。例如，在密码子上的摆动位置可以改变，结果该核酸序列编码相同的氨基酸序列，另外，还可以改变密码子从而产生保守的氨基酸取代物。在每种情况中该肽或蛋白都保持了所需的酶活性，因此它们应被认为是本发明的一部分。
本发明蜡合酶核酸序列可以是DNA或RNA序列、它们由基因DNA。cDNA、mRNA衍生，或者可以是整个或部分合成得到的。该基因序列可以被克隆，例如通过从一种适当的源中分离出基因DNA，以及用聚合酶链反应(PCR)扩增和克隆所述的序列。另外，可以完整地或部分的合成该基因序列，尤其是在需要提供植物优选序列的场合。因此，采用所选定的宿主优选的密码子可以合成全部或部分所需的结构基因(该部分基因编码蜡合酶蛋白)。例如可以将宿主优选的密码子从在所需的宿主品种中表达的蛋白使用最多的密码子中确定出来。
与蜡合酶蛋白有关的核酸序列会有许多用途。例如，可以制备重组结构，该结构可用作探针或者在宿主细胞中使蜡合酶蛋白表达。按照所预定的用途，该结构可以含有编码整个蜡合酶或其一部分的序列。例如，可以识别蜡合酶的关键区域如活性位点。由此，还可以制备仅含有一部分蜡合酶序列的结构，其中所说的一部分蜡合酶序列编码所需的蜡合酶活性所必需的氨基酸。
适用于表达本发明的蜡合酶序列的系统包括原核细胞如大肠杆菌，酵母细胞、以及植物细胞、维管植物和非维管植物细胞均是理想的宿主。用该方法可以制备蜡合酶蛋白用来做进一步的研究，如编码序列的位点特异诱变以分析特异突变对蜡合酶蛋白反应特性的影响。
编码本发明的蜡合酶的DNA序列可以以多种方式与外源DNA结合。外源DNA是指任何与蜡合酶序列无天然连接的DNA序列，它包括来自相同生物体但与酶序列无天然连接的DNA序列。本发明还涉及用于蜡合酶编码序列的有意和反意结构，其中有意序列可用于在宿主细胞中表达蜡合酶，而反意序列可用于降低由靶生物体自然生产的同源蜡合酶蛋白的内源水平。另外，本发明的蜡合酶基因序列可以和全部或部分通常与蜡合酶有关的序列(如调节或膜靶序列)一起用于外源宿主中。
以其部分成份，编码蜡合酶的DNA序列被结合在重组结构中，该结构在5'到3'转录方向上具有一种转录起始控制区，该控制区能够促进在宿主细胞中的转录及翻译过程、编码蜡合酶的核酸序列以转录终止区。根据宿主情况，调节区可以变化，并且可以包括来自病毒、质粒或染色基因或类似物的区域。为了在原核或真核微生物，特别是单细胞宿主中进行表达，可以采用多种组成的可调节的启动子。在微生物中的表达能够提供植物酶的便利源。在所述的转录起始区中有来自细菌和酵母宿主(如大肠杆菌，枯草杆菌，啤酒酵母)的区域，包括基因如β-半乳糖苷酶、T7聚合物、色氨酸E及其类似物。
多数情况下，该重组结构会包含在植物中起作用的调节区，该调节区可以使蜡合酶基因发生表达以产生功能性蜡合酶蛋白。编码植物蜡合酶或其功能片断的开放式解读密码将在其5'端转录起始调节区(例如在蜡合酶结构基因的5'上游处自然发现的野生型序列)相连接。可从天然植物基因中获得许多其它的启动子区，该区可以使结构基因序列发生多种组成或可调节的、例如可诱发的表达。
除了来自天然植物基因的序列之外，其它序列也可以在植物中使组成基因表达，例如与土壤杆菌属基因有关的调节区，包括与nopaline合酶(Nos)、mannopine合酶(Mas)、或真硝碱合酶(Ocs)基因有关的区。有些控制病毒基因表达的区域。例如花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S和19S区也是有用的。本文所用的术语“组成”并非一定是指基因在全部细胞类型中以相同的水平进行表达，但是该基因确实是在宽范围的细胞类型中表达的，尽管某些丰富的变异经常是可测得的。其它适用的转录初始区可以在某些组织中或在一定培养条件下导致优先转录，例如那些来自napin、种子或叶ACP，较小亚单位的RUBISCO、及类似物的区域。
在希望将蜡合酶蛋白表达在植物宿主中的具体方案中，需要使用完整的植物蜡合酶基因的全部或部分基因，也就是所需要采用与结构基因序列在一起的5'上游非编码区和3'下游非编码区。如果需要不同的启动子，例如所述植物宿主天生的启动子或改性的启动子、即具有由一种基因源产生的转录起始区和由另一种基因源产生的翻译起始区的启动子或增强启动子，如双35SCaMV启动子，则可采用标准技术将这些序列结合在一起。
能在植物中导致蜡合酶表达的DNA结构可用于许多种植物，特别是产生蜡合酶脂酰辅酶A底物的植物，如芸苔。还有一些其它植物能产生所需的脂肪酰基底物，如中等或长链脂肪酰基分子，这些植物包括(但不限于)油菜子(Canola种)、向日葵、红花、棉花、萼距花、大豆、花生、椰子和油棕榈，和玉米。
作为蜡合酶脂肪醇底物(除了希蒙德木属外)，人们尚不知道种子植物可以产生大量脂肪醇，尽管该合酶可以采用少量的这种底物。因此，与本发明的蜡合酶结构结合在一起，就可以获得一种靶宿主细胞，该细胞能够由宿主细胞中的脂肪酰基分子产生脂肪醇。例如在共同未决申请USSN07/767，251中描述了植物脂肪及酰基还原酶和在植物细胞中表达还原酶的方法。图1提供了希蒙德木属还原酶的核酸序列和转译的氨基酸序列。因此，通过向宿主植物细胞提供蜡合酶和还原酶蛋白，可以由脂肪醇和脂酰底物产生蜡酯。
除了希蒙德木属还原酶之外，还可将其它生物潜在的还原酶源包括裸藻、不动细菌属、细球菌、某些昆虫和海洋生物，特异化的哺乳动物或鸟的组织(已知这些组织含有蜡酯)、例如牛睑板腺或鸟尾脂肪腺。利用它们产生脂肪醇或蜡酯(如果还存在蜡合酶)的能力，可以识别其它潜在源。
在同一转化过程中可提供蜡合酶和还原酶序列，另外，通过用各种结构进行转化可产生两种不同的转基因植物系，其中一种具有蜡合酶结构，另一种具有还原酶结构。然后可以用已知的植物培养技术将这些植物系杂交，以产生供蜡酯产物制备用的含蜡合酶和还原酶的植物。
为了产生蜡酯，需要从在种子成熟期间经过调节的基因中得到的5'上游非编码区，特别是在植物胚芽组织中优先表达的那些区，如由ACP和napin调节区获得的区。在种子组织中导致优先表达的转录起始区(即在植物其它部分不可测的)被认为适合蜡酯生产，以便使在其它植物部分中的基因产物的任何岐化或副作用降至最小。将这些植物种子收获，并且回收这些种子的脂储备物以提供便利的蜡酯源。因此，在油种子植物中可以生产新的种子产物，该油种子植物在不进行本文所述的蜡合酶结构转化时人们并不知道它们可以以它们的种子脂储备物组份的形式产生蜡酯。
这些“种子特异启动子”可以按照以下技术获得和使用，这些技术是US申请号07/147，781，申请日88年1月25日(现在US申请号07/742，834，申请日81年8月8日)，和US申请号07/492，722申请日90年3月16日名称为“NovelSequencesPreferentiallyExpressedInEarlySeedDevelopmontandMethodsRelatedThereto”，所有这些共同未决申请都引入本文作为参考。
在本发明的重组结构中还可以提供调节转录终止区。转录终止区可通过编码植物蜡合酶的DNA序列提供，或者由一种不同的基因源产生一种便利的转录终止区，特别是那些与转录起始区天然有关的转录终止区。该转录终止区将含有至少约0.5Kb，最好约1-3Kb结构基因3'序列(由该序列得到该终止区)。
根据将DNA表达结构导入宿主细胞的方法，还需要其它DNA序列。重要的是本发明能同样的应用于双子叶和单子叶品种，并且很容易应用到新的和/或改进的转化和再生技术中。
在发展该重组结构的过程中，可以将该结构或其片断的各种组份插入到一种便利的克隆载体中，该载体能在细胞宿主(如大肠杆菌)中复制。有许多载体已被文献描述。每次克隆后，可将质粒分离，并进行进一步处理，如限制、新片断插入、连接、缺失、插入、切除等，以便修整所需序列的组成。一但该结构完成后，就可将其转移到适当的载体上，以便按照该宿主细胞的转化方式做进一步处理。
通常该重组结构中包括一种结构基因，该基因具有在宿主中表达所需的调节区并使转化细胞具有选择。该基因可以对细胞毒素剂，如抗生素、重金属、毒素等产生抗性，并且附加地对营养缺陷性细胞提供原型、病毒免疫性或类似特性。同样的，编码酶的基因是有用的，该酶可用来制备可通过颜色变化如GUS或发光，如虫荧光素酶而识别的化合物。根据引入表达结构或其组成的不同宿主品种的数目，可以使用一种或多种标记，此时对不同的宿主选用不同的条件。
除了供蜡合酶序列转录的序列以外，本发明的DNA结构还可使附加基因或基因获得表达，该基因的蛋白产物可与蜡合酶一起作用产生有价值的最终产品。例如，如上所述，在本发明中还研究了DNA结构，该结构可以使蜡合酶和一种脂肪酰基还原酶获得表达从而可以在转化的宿主中产生蜡合酶。此外，还需要产生具有不同碳链长度和饱和度的不同蜡酯，并且可以通过转化具有不同碳链长度的脂枋醇或脂肪酰基底物的宿主植物来提供。这些植物例如可以通过国际专利申请PCTWO91/16421中公开的方法来获得，该文献描述了各种硫酯酶基因以及使用这些基因在转化的植物宿主中生产具有不同链长的脂肪酰基底物。
此外，为了使油料种子植物宿主中的蜡酯的制备过程最佳化，可考虑降低三酰基甘油酯油的产生(该油一般在这些植物的种子中产生)。一种实现该目的方法是使对该方法起关键作用、但并不是生产蜡酯所必需的基因失去意义。这些基因靶包括二酰基甘油酰基转移酶，和其它催化三酰基甘油合成的酶。另外，可以向油料种子植物提供酶，该酶可用于降解蜡酯作为营养源，例如可以从希蒙德木属或其它各种产生蜡的生物体中分离。用该方法，可以在种子植物中获得最高蜡酯产量。
采用由希蒙德木属中提取蜡的技术或者利用从各种油料种子作物中制取油产物的各种制备方法，可以收获按本文所述方法生产的蜡酯。由此获得的蜡可用于许多工业中，其中包括药物、化妆品、洗涤剂、塑料和润滑剂。应用将随蜡酯组成的链度和饱和度而变化。例如，在每个碳链上具有双带的长链蜡在室温条件下是液体，而具有饱和碳链组成的蜡在室温条件下可能是固体(尤其是当饱和碳链是较长碳链时)。
转化方法并非是本发明的关键，多种植物转化方法都可以使用。当可用较新手法来转化作物时，则可以将它们直接应用于下文中。例如，借助于以土壤杆菌为介质的三元或二元载体转化法可以成功地将对土壤杆菌感染具有天然感受性的许多植物品种转化。用于使核酸序列转移宿主植物细胞中的其它序列可以从植物病原病毒或植物可移位部分中获得。另外，我们发展了显微注射、DNA颗粒轰击、电泳技术，使它们能够转化各种单子叶和双子叶植物种类。
当将土壤杆菌用于植物转化时，则希望它在与下-DNA接壤的一端或两端，优选地在左和右边缘区，更优选地至少在右边缘区具有想要的核酸序列。当采用其它转化方法时，这些边缘区也是有用的。
在将土壤杆菌或根瘤基因(Rhizogenes)序列用于植物转化过程中时，可使用一种载体，该载体可以被导入土壤杆菌中从而与在位于宿主细胞中的Ti或Ri质粒上的T-DNA进行同源重组。含有重组用T-DNA的Ti-或Ri-可以被防护起来(能引起菌瘿形成)或解除防护(不能引起菌瘿形成)，后者只要Vir基因的功能补体存在于转化的土壤杆菌属宿主中就可以容许，所述的Vir基因编码将DNA转移到植物宿主细胞中所必需的执行因子(transactingfactors)。使用防护的土壤杆菌菌株可以得到一种正常植物细胞(其中的一些细胞含有想要的核酸序列)和由于存在瘤形成基因而能形成菌瘿的植物细胞的混合物。含有想要的核酸序列但缺少肿瘤基因的细胞可以从该混合物中选出，从而获得正常的转基因植物。
在优选的采用土壤杆菌作为转化宿主细胞的载体的方法中，与T-DNA接壤的表达或转录结构边缘区可以被插入到一种广宿主范围载体中，该载体能在大肠杆菌和土壤杆菌中进行复制，其中的广宿主范围载体已在文献中有所介绍。通常使用的是pRK2或其衍生物。例如，参见Ditta，等人(Prc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.(1980)777347-7351)和EPA0120515所述，这些文献引入本文作为参考。另外，可将在植物细胞中表达的序列插入含有分离的复制序列的载体中，这些序列中有一种能在大肠杆菌中使载体稳定，其它序列则在土壤杆菌中使载体稳定。例如，参见McBride和Summerfelt(PlantMol.Biol.(1990)14269-276)，其中采用了pRHRI(Jouanin等人，Mol.Gen.Genet.(1985)201370-374)复制源而且它使得在宿主土壤杆菌细胞中的植物表达载体更加稳定。
优选地是利用如上所述可在土壤杆菌中复制的载体。在该方法中不需要质粒重组，而且宿主土壤杆菌Vir区可以提供将T-DNA邻接序列转移到植物宿主细胞中所需要的执行因子。为了转化芸苔细胞，可采用土壤杆菌转化法。例如，Radke等人(Theor.Appl.Genet.(1988)75685-694)描述了一种该方法。
此外，现在已对本发明进行了概括性的描述，而参考以下实施例将使发明更加易懂。提供这些实施例的目的仅仅是为了说明而并非打算对发明进行限制(除非另有所注)。
实例实例1-蜡合酶试验下列将描述在微粒体膜制剂或溶解的蛋白质制剂中进行蜡合酶活性试验的方法。
A、放射性标志材料一般在蜡合酶试验中使用的底物，[1-14C]棕榈酰基-辅酶A，是从Amersham(Arlington Heights，IL)购得的。为了进行链长度特性研究其它链长度底物则也被合成。长链[1-14C]脂肪酸(比活性为51-56Ci/mole)，即11-顺式-二十碳烯酸、13-顺式-二十二烯酸和15-顺式-二十四碳烯酸是通过将相应的醇甲磺酰酯与[14C]氰化钾反应随后将醇腈加碱水解变成游离脂肪酸而制成的。该游离脂肪酸用醚重氮甲烷转化成它们的甲酯，且用制备性硝酸银薄层色谱法(TLC)纯化。将该脂肪酯甲酯水解回到游离脂肪酸。其放射化学纯度是用三种TLC方法来鉴定的常规相二氧化硅TLC、硝酸银TLC、和C18反相TLC。用这些方法测得的放射化学纯度92～98%。长链[1-14C]酰基-辅A从其相应的[1-14C]游离脂肪酸制得，制备方法采用Young和Lynen所述的方法(J.Bio.Chem.(1969)244377)其比活性为10Ci/mole.[1-14C]十六醛(hexadecanal)是通过将[1-14C]十六-1-醇进行重铬酸盐氧化作用而制成的，它是按照Pletcher和Tate所述的微量修饰法(Amiczo-scalemodification)进行的。(Tet.Lett.(1978)1601-1602)将该产品用制备性二氧化硅TLC进行纯化，且以一种己烷溶液形式在-70℃条件下贮存直至使用。
B、对在微粒体膜中的蜡合酶活性的试验制备在微粒体膜制剂中的蜡合酶活性是通过将该样品与40m[1-14C]酰基-A(一般为棕榈酰基-辅A，比活性为5.1-5.6mCi/mmol)和200mM油醇一起培养而测量出的，其中试样的总体积为0.25ml。该培养混合物含有20%(w/v)甘油、1mM DTT、0.5M Nacl并且用25mM HEPES(4-[2-羟基乙基]-1-哌嗪乙烷-磺酸)来进行缓冲。HEPES(这里和下面所提及的)是从一个被调至pH为7.5的1M储液中加入的。
在玻璃管瓶中制备一种底物混合物，在使用前快速加入油醇，且将其加入到样品中。在30℃条件下进行1小时培养。通过将试管放置在冰上且立刻加入1.25ml异丙醇，乙酸(4∶1 V∶V)来终止该试验。将未标记的蜡酯(0.1mg)和油醇(0.1mg)作为载体加入。将[14C]类酯用Hara和Radin所述的缩减方法来萃取(Anal.Biochem.(1978)90∶420)。将4ml的己烷/异丙醇(3∶2V/V)加入到该终止的试验中。将该样品旋转搅拌，加入2ml硫酸钠水溶液(6.6%W/V)，且再次旋转搅拌该样品。
C、对溶解的蜡合酶活性进行试验对溶解的蜡合酶活性进行试验，需要重组该蛋白质。通过将磷脂(SigamP-3644，～40%L-磷脂酰胆碱)加入到0.75%CHAPS-溶解的样品中(其浓度为2.5mg/ml)，随后将洗涤剂稀释到0.3%(低于CMC)而实现重组。估计活性的重组取决于把蜡合酶引入磷脂泡中的情况。人们应该认识到在蜡合酶重组之后检测的蜡合酶的活性值会受到许多因素的影响(如磷脂与蛋白质的比率，和蜡合酶蛋白物理状态(如聚集和分散的))。
D、试验产物的分析为了对微粒体膜制剂蜡合酶试验产物或溶解的蜡合酶试验产物进行分析，两种方案均已得到发展。第一种方案(下面将称之为“广泛试验”)较为耗时，但可产生大量的定量结果。而另一方案(下面将称之为“快速试验”)也能提供蜡合酶活性测量，且速度更快，更方便，但是不太定量。
1、广泛分析加入硫酸钠在将样品旋转搅拌之后去掉上部的有机相，并用4ml己烷/异丙醇7∶2V/V)洗涤下部的水溶液相。把其有机相收集且在氮气条件下蒸发至干燥状。该类脂剩余物在少量己烷中重新悬浮，且对一份等分试样通过液体闪烁计点进行放射活性检验。其余样品可用于对标记的种类进行TLC分析，从而对所产生的总蜡量给出测量结果。
为了进行液体种类分析，要将样品放在一块二氧化硅TLC板，将该板在己烷/二乙基醚/乙酸(80∶20∶1V/V/V)中培养。在类指种类、大量的蜡酯、游离脂肪酸、脂肪酯和原生处的极性类脂之间的放射活性分布将使用AMBIS放射分析图象系统(ABISSystemsInc.，SanDiego，CA)来进行测量。若需要，可以将个别类脂种类从TLC板上回收以进行进一步分析。采用在甲醇中培养成的C18板的反相TLC系统也已用于该分析。
2、快速分析在加入硫酸钠并旋转搅拌样品之后，将给定百分比的有机相去掉，且通过液体闪烁计点法来计数。这种计算用于估计在该有机相中的总计数。然后去掉其有机相的另一部分，在氮气条件下干燥，在己烷中将其再次溶解且点溅在TLC板上，且用对详细试验所述的方法进行显示和扫描。以此方式来确定与蜡相关的总计数的百分比。
实例2-放射性标志蜡合酶蛋白质将用放射性标记过的[1-14C]棕榈酰基-辅酶A(Amersham)加入到一种蜡合酶制剂中，该制剂既可以是溶解的也可以是一种微粒体膜部分，其比率为5μl标记对40μl蛋白质样品。该样品在进一步处理之前至少在室温条件下培养15分钟。为了进行SDS-PAGE分析，该样品可以用SDS样品缓冲液直接进行处理且将其放在凝胶上进行电泳。
实施例3-为使蜡合酶活性特性化而作的进一步研究A、种子的生长和蜡合酶活性图在地处Davis，CA的5种植物上对胚胎生长过程跟踪两个夏天以上。发现新鲜胚胎和干胚胎的重量在约80天至约130天中以相当平稳的比率增加。类脂萃取结果表明当新鲜胚胎重量达到约300mg(约80天)时，类脂重量与干胚胎重量的比率达到50%的最高水平。
如实施例1中所述的那样在生长的胚胎中测量蜡合酶活性。当希蒙德木属种子表皮被确定为是抑制因子的源时，在用液氮冷冻该胚胎并贮存于-70℃下之前去掉该种子表皮。
正如在无细胞匀浆或在膜部分中测得的蜡合酶活性的生长图所示，它表明有一个大的活性诱导，基峰值处在开花期之后约110-115天的时候。因此，要在开花期后约90至110天之间收获用于酶学研究的胚胎，在这个时期内蜡合酶的活性很高，类脂沉积还未达到最大水平，且该种子表皮易于去掉。蜡合酶活性的最高增加速度是出现在开花期后80天至90天之间。因此，用于cDNA库构建的胚胎要在花开期后80至90天之间收获，这时估计蜡合酶蛋白质的合酶比率是最高的。相对应地，编码蜡合酶的mRNA水平估计在这个阶段也是最高的。
B、底物的特异性将具有不同碳链长度和不饱和度的酰基-辅酶A和醇底物加入到具有蜡合酶活性的微粒体膜部分中，从而确定通过希蒙德木属蜡合酶所识别的底物的范围。按照实施例1中所述的测量蜡合酶，使用80μM的酰基-辅酶A底物和100μM经过放射性标记的油醇来测定酰基特异性。使用100μM的醇底物和40μM的用放射性标记的二十碳酰基-辅酶A来测量醇特异性。这些实验结果列于下面的表1中。
表1希蒙德木蜡合酶的酰基和醇底物的特异性底物蜡合酶活性(pmoles/min)结构酰基基团醇基团12:01210014:09514516:08110718:0515620:0492122:04617
表1(续)希蒙德木蜡合酶的酰基和醇底物的特异性底物蜡合酶活性(pmoles/min)结构酰基基团醇基团18:12211018:2712320:11227222:1394124:13524以上结果表明该希蒙德木蜡合酶可利用广泛范围的脂肪酰基-辅酶A和脂肪醇底物。
另外，对于各种酰基-硫代酯底物的蜡合酶活性可以进行类似的测试，此时使用棕榈酰基-辅酶A、棕榈酰基-ACP和λ-乙酰基-S-棕榈酰基半胱胺作酰基底物。用酰基辅酶A底物可以观察到最大的活性。用酰基-ACP可以观察到明显活性(是用酰基辅酶A的活性的～10%)，但用N-乙酰基-S-棕榈酰基半胱胺则看不到活性。
C、活性的效应物根据对蜡合酶活性的影响对各种硫氢试剂进行筛选。有机汞制剂显示出能强烈地抑制活性，碘乙酰胺和N-乙基马来酰胺则不太有效。对-羟基汞基苯甲酸酯的抑制作用可以观察到，但这种抑制可通过随后加入的DTT而被逆转。这些结果表明对-羟基汞基苯甲酸酯的抑制作用涉及阻滞一种主要的硫氢基基团。
D、尺寸排它性色谱法用Sephacry1-200(Pharmacia，粒度范围5，000～250，000道尔顿)填充一种柱(1.5cm×46cm)且用含有0.5M Nacl的柱缓冲液(25mM HEPES，20%甘油，0.75%CHAPS，1mM EDTA)将其平衡。将约2ml通过用1.5Nacl洗脱一次BlueA柱(参见实例4C)而收集的浓缩液装入，且以0.5mg/min的速度从柱中流过。将该洗脱部分按照实施例1中所述的重组方法进行蜡合酶活性分析。蜡合酶活性在空白部分显示出很宽的峰值而在其余部分则全部下降。将具有蜡合酶活性的部分在室温下用1-14C16∶O-辅酶A(0.0178μM)处理15分钟。加入SDS至2%且将该凝胶点溅到Problott上(Applied Biosystems，Foster City，CA)且通过放射自显影仪分析其干燥的斑点膜。此外，还可对该斑点使用一种自动扫描系统(AMBIS，San Diego，Ca.)进行放射活性扫描。以这种方式，可观察到57KD经过放射性标记的带跟踪着分析部分中的蜡合酶活性。
将与蜡合酶活性有关的蛋白质通过在第二种尺寸排它性介质上进行色谱而进一步特征化。将一部分含有蜡合酶活性的通过用1.5MNacl洗脱(而后用1.0MNall洗脱)BlueA柱而获得的10×浓缩的洗脱液(100μl)放在Superose12HR10/30柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)上进行色谱分析，并且通过在一个用分子重量标准(MWGF-70和MWGF-1000，Sigma)校准的柱上进行快速蛋白质液体色谱分析(FPLC)而对其进行分析。在洗脱的部分上完成活性测试。在空白部分中回收的蜡合酶活性最多为53%，但按照校准曲线在位于～55Kd处的洗脱液中发现一个容易检测到的活性。这些数据表明活性天然蜡合酶蛋白质的最小尺寸与标记带的57KD的尺寸非常相近，由此可以证实蜡合酶的活性是由一种多肽提供的。在空白部分中观察到的蜡合酶活性部分估计是一种酶的聚集形式。
E、棕榈酰基-辅酶A琼脂糖色谱法用16∶0-辅酶A琼脂糖(Sigma P-5297)填充一种柱(1.0×3cm)且用含有0.2MNacl的柱缓冲液(参见实施例1，D)将其平衡。将从Blue A柱上通过用1.5M Nacl洗涤而收集到的约4ml浓缩物融化，且在用0.2M Nacl柱缓冲液平衡的一种PD-10(Pharmacia)脱盐柱上通过该浓缩物以减少该盐的浓度。将该降低的盐样品(5ml)以0.15ml/min的流速装入160 CoA琼脂糖柱中。该柱用0.5M Nacl柱缓冲液洗涤，然后用1.5M Nacl柱缓冲液洗涤。虽然一些蜡合酶活性流过该柱或在0.5M Nacl洗涤时被去掉，但大部分所回收的活性(装载活性的21%)在1.5M Nacl洗脱中被回收。将证明蜡合酶活性的那部分如实例2中所述的那样用[14C]棕榈酰基-辅酶A来进行放射性标记，且通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Laemmli，Nature(1970)227680-685)来进行分析。再一次观察到约57KD经过放射性标记的蛋白带跟踪着蜡合酶活性。
实例4希蒙德木蜡合酶的纯化本实例描述了一些方法，它们可用在具有蜡合酶活性的希蒙德木膜制剂的分离过程、蜡合酶活性的溶解过程和进一步的蜡合酶蛋白的纯化过程中。
A、微粒体膜制剂通过对希蒙德木胚胎中的水含量进行测量(45～70%)，在花期之后约90-100天时收获希蒙德木胚胎。去掉外壳和种子表皮，且将该叶子在液氮中快速冷冻，在-70℃条件下贮存以备用。为了制备初始蛋白，在液氮温度下在一个钢臼中把冷冻胚胎捣成粉末，在典型的实验中，要用70g胚胎。
将该粉末以每70克胚胎对280ml溶液的比率加至下列高盐溶液中3MNaCl、0.3MM蔗糖、100mMHEPES、2mMDTT、和蛋白酶抑制剂、1mMEDTA、0.7μg/ml亮肽素、0.5μg/ml胃酶抑制素和17μg/mlPMSF。一种无细胞匀浆(CFH)通过用一种组织均化器(Kinematica，Switzerland，modelPT10/35)在缓冲液中将该粉末胚胎分散约39秒钟然后使其通过三层Miracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)过滤而形成。将该滤液在100，00xg下离心1小时。
所得到的样品中包括粒丸、上清液、和一种漂浮脂肪层。去掉该脂肪层且收集该上清液部分且对一种含有1MNacl、100mMHEPES、2mMDTT和0.5MEDTA的溶液进行一整套渗析(换三次缓冲溶液)。将该渗液在200，000xg条件下离心1个半小时，从而得到一种粒丸，DPZ。将该粒丸在25mMHEPES和10%甘油中悬浮，其体积是原始CFH的1/20，以此得到微粒体膜制剂。
按实例1中所述的那样进行活性测试。所回收的蜡合酶活性估计是无细胞匀浆中原活性的34%。当将其贮存在-70℃条件下时这种制剂中的蜡合酶活性是稳定的。
B、蜡合酶蛋白质的溶解过程将CHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基)-二甲基-氨溶的]-1-丙烷磺酸酯)和NaCl加入到微粒体膜制剂中，从而使其最终浓度分别为2%和0.5M。将该样品在冰上培养约1小时，然后用25mMHEPES、20%甘油、0.5MNacl稀释，从而降低CHAPS的浓度至0.75%。然后将该样品在200，000xg条件下离心作用1小时，收集其上清液，且如实施例1、C、中所述那样对蜡合酶活性进行试验。通常，在其上清液部分回收的蜡合酶活性是从微粒体膜制剂中回收到的活性的11%。溶解的蜡合酶活性当贮存在-70℃时是稳定的。
C、BlueA柱色谱制备床体积约30ml的柱(2.5×8cm)，其中含有BlueA(CibacromBlueF3GA;AmiconDivision，W.R.Grace&CO.)，且用含有0.4MNaCl的柱缓冲液(25mMHEPES，20%甘油，0.75%CHAPS1mMEDTA)对柱进行平衡。向溶解的蜡合酶制剂中加入柱缓冲液(25mMHEPES、20%甘油、0.75%CHAPS、1mMEDTA)使之稀释到0.4MNaCl，且将其装入BlueA柱。
该柱用含有0.5MNacl的柱缓冲液进行洗涤，直到在流过柱的缓冲液中没有蛋白质能被检测出来(通过在280nm处的吸收率来测量)。大于93%的蜡合酶活性附着于柱上，而大于83%的其它蛋白质则通过。一般，通过洗脱可回收约20%的装载的蜡合酶活性。将一部分回收的活性(17%)用1.0MNacl柱缓冲液洗液洗脱，而将约75%的回收活性用1.5MNacl柱缓冲液在150ml洗涤液中洗脱(以很宽的峰值)。从1.5M洗液中回收5ml部分，且如实例1中所述的那样对其蜡合酶进行测试。将含有蜡合酶活性的部分收集起来，且使用一种Amicon搅拌细胞单元和YM30膜将其浓缩十倍。这种浓缩的蜡合酶制剂可在-70℃条件下储存。
D、SDSPAGE分析将从活性Blue A柱部分中得到的样品在SDS PAGE样品缓冲液中(1×缓冲液＝2%SDS、30mM DTT、0.001%溴酚蓝)稀释，且通过将它在来自NOVEX(San Diego，CA)的12%tris/甘氨酸预制凝胶上进行电泳来对其进行分析。将凝胶于恒压150V下进行约1.5小时。通过银着色法(Blum等人，Electrophoresis(1987)8∶93-99)检测蛋白质。对该凝胶进行仔细检测，结果发现只有少数几种多肽，其中包括的57KD中的一种，它们在各个部分中的着色强度能够与在那些部分中检测到的蜡合酶活性的量相互关联。进一步，若将经过放射性标记[1-14C]棕榈酰基-辅酶A在进行SDS PAGE分析之前加入到该蛋白制剂中，则该凝胶的放射自显影将显示该57KD标记带跟踪着这些部分中的蜡合酶活性。其它蛋白质在该制剂中也存在，其中包括56和54KD还原酶蛋白，该蛋白质描述于未决申请USSN 07/767，251申请案中。
E、连续相洗脱将蜡合酶蛋白质分离以进行氨基酸排序，此时使用一种SDS-PAGE设备，Model491PrepCell(Bio-RadLaboratories，Inc.，Richmond，CA)，且按照制造者的说明书来进行。将从BlueA柱的1.5MNacl洗脱液中得到的蜡合酶活性的一部分(15ml)在Centricon30(AmiconDivision，W.R.Grace&CO;Beverly，MA)中浓缩10倍，且在PharmaciaPD-10脱盐柱上用柱缓冲液去盐。将该样品用2%SDS和少量的溴酚蓝示踪染料处理，并将其放在5ml、4%丙烯酰胺叠层凝胶上(该凝胶位于在PrepCell设备中的20ml，12%丙烯酰胺运行凝胶上)。将该样品在10W下电泳，且在从凝胶中洗脱时通过PrepCell连续收集其蛋白。然后用一种部分收集器以7.5～10ml部分收集该洗脱的蛋白质。将在所述区域(取决于所预测的蜡合酶蛋白的57KD尺寸)内的每种部分的1μl在Centricon30中浓缩至40μl，且用2%SDS处理。在12%丙烯酰胺小型凝胶(Novex)上处理该样品，并用银将其着色。为了使蜡合酶的回收达到最佳可以对连续相洗脱工艺进行多种修改。这些修改包括调整在凝胶体积中的丙烯酰胺百分比，和对用于凝胶的蜡合酶的量进行调整。例如，为了分离更多的蜡合酶蛋白，该BlueA柱分馏物可以以每20ml凝胶约1mg蛋白的浓度施加到更大体积的、22-55ml丙烯酰胺凝胶上。然后可以将从这些凝胶中洗脱的蛋白部分施加到10-15%梯度的丙烯酰胺凝胶上以增加带分离。
对每个部分的蛋白含量用肉眼进行估算，且将含有蜡合酶蛋白的部分收集起来并将其浓缩以用于氨基酸排序。为了最大量地收集蜡合酶，在收集的制剂中包括含有56KD还原酶蛋白带的部分。由于还原酶蛋白的序列是已知的(参见图1)故在应用氨基酸序列技术(参见实例5)之前没有必要对收集制剂中的蜡合酶蛋白进行进一步纯化。
G、将蛋白点溅到膜上此外，该蜡合酶蛋白可以通过转移到PVDF膜上(在SDS-PAGE之后，该膜可以是Immobilon-P(Millipore;Bedford，MA)也可以是ProBlott(AppliedBiosystems;FosterCity，CA)而获得，进一步分离以进行氨基酸排序。虽然转移到硝化纤维素上也是有用的，但初始研究表明只有很少一些蛋白会转移到硝纤维素膜上，这很可能是由于这种蛋白的疏水性能。优选地是在不同方法中使用PVDF膜，如ProBlott和Immobilon-P，这取决于所用的氨基酸排序技术。例如，转移到ProBlott上对于N-末端排序方法是有用的，而对于从溴化氰化过程中得到肽的过程的来说，最好是用ImmobiIon-P。
1、点溅到硝化纤维素上当蛋白质被电溅射到硝化纤维素上时，该溅射时间在一种缓冲液中(如在5～20%甲醇中的25mMTris，192mM甘氨酸)一般是1-5小时。电溅射后，将膜在0.1%(W/V)的PorceauS(在1%(V/V)乙酸中)进行2分钟着色，且在0.1%(V/V)乙酸中进行2-3次退色，每次进行2分钟。然后这些膜在热封塑料袋中在-20℃条件下湿法储存。若时间允许，该斑点可不用冷冻，而是立即用于消化以产生肽，从而按下面所描述的进行氨基酸排序。
2、点溅到PVDF上当将蛋白质电溅射到ImmobilonPPVDF上时，该溅射时间在一种缓冲液中(如在20%(V/V)甲醇中的25mMTris/192mM甘氨酸)一般为1-2小时。在电溅射到PVDF上之后，膜在0.1%(V/V)CoomassieBlue(在50%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸中)中进行5分钟着色，且在50%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸中，进行2-3次退色，每次进行2分钟。然后让PVDF膜进行30分钟空气干燥，随后在热封塑料袋中在-20℃条件下干燥储存。点溅到PVDF膜(如ProBlott)上的蛋白可以直接用于确定完整蛋白质上的N-未端顺序。对于将蛋白质点溅到ProBlott的一种方法将在下列实例5A中描述。
实例5-氨基酸顺序的确定在这个实例中，所描述的是与蜡合酶有关的植物蛋白质的氨基酸顺序的确定方法。
A、蛋白质的溴化氰裂解和肽分离溴化氰裂解是在所述的蛋白质上进行的，其中所用的方法已描述于Probe-DesignPeptideSeparationSystemTechmicalManual(出自Promega，Inc、(Madison，WI)中。将蜡合酶蛋白质(若不能在纯化的液体样品中得到)如上述所述点溅到PVDF膜。将来自PVDF斑点的纯化的蜡合酶蛋白或蜡合酶带放置在溴化氰在70%(V/V)甲酸中的溶液中，且在室温下培养过夜。培养之后去掉溴化氰溶液，收集并用一种Reacti-VapEvaporator(Pierce，Rockfond，IL)在连续氮气流条件下干燥。将来自PVDF的溴化氰肽进行再一次洗脱，以确保完全去除，其中使用的肽洗脱溶剂例如为70%异丙醇、0.2%(V/V)三氟乙酸、0.1mM赖氨酸、和0.1mM巯基乙酸。然后去除洗脱溶剂，且加到含有干溴化氰溶液的试管中，并如上所述进行干燥。该洗脱过程可用新鲜的洗脱溶液重复进行。然后将50μl的HPLC级水加到该干燥的肽中，且在Speed-Vac(Savant，Inc.，Farmingdale，NY)中通过蒸发去掉上述水。
将通过溴化氰裂解而产生的肽分离，其中使用的是与Schaegger和VonJagow(Anal.Biochem.(1987)166368-379)所述相同的一种Tris/TricineSDS-PAGE系统。将凝胶在恒压125-150V的条件下处理约1小时或直到示踪染料已开始流出凝胶的底部边缘。将凝胶在转移前在转移缓冲液(125mMTris，50mM甘氨酸、10%(V/V)甲醇)中浸泡15-30分钟。将凝胶在恒压50V条件下向ProBlott排序膜(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)溅射2小时。该膜用Coomassie蓝(在50%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸中，0.1%)着色，且在50%(V/V)甲醇/10%(V/V)乙酸中退色3×2分钟。在-20℃干燥贮存之前，将该膜用空气吹干。
被溅到ProBlott上的肽无需加入到涂有Polybrene的玻璃纤维过滤器，就可直接装到蛋白质顺序器的顺序盘上。利用由AppliedBiosystems提供的经过稍微改进的反应环，BLOT-I对肽进行排序。另外将溶液53(丁基氯)用S1和S2(正庚烷和乙酸乙酯)50∶50的混合物取代。只要对溅射到ProBlott上的样品进行排序，均需使用这两种修饰。
B、蛋白酶消化和肽分解在液体溶液中提供的纯蜡合酶蛋白或溅射到硝化纤维素上的蜡合酶蛋白为了获得排序用的肽均需用蛋白酶进行消化。所用的方法是Aebersold等人的方法(PNAS(1987)846970)。
对于在硝化纤维素上所提供的蛋白质，从硝化纤维素膜上切下蜡合酶蛋白质带以及作为对照物的等量的空白硝化纤维素，用HPLC级水将其洗涤几次，以便去除PonceauS。在洗涤之后，将1.0ml，0.5%聚乙烯基吡咯烷酮(PVP-40，Aldrich，Milwaukee，WI)在0.5%乙酸中加到该膜片中，且将这种混合物在37℃条件下培养30分钟。为了完全去除PVP-40将硝化纤维素片用大量HPLC级水(8×5ml)洗涤，在光谱仪上214nm处检测该洗涤物的吸收值。同样，如果在PVP-40处理和洗涤之后蛋白带尚未被切成小片，则PVP-40仍较容易被除去。
然后，将在溶液或硝化纤维片中的蛋白质悬浮在一适当的消化缓冲液中，例如胰蛋白酶消化缓冲液、100mM碳酸氢钠，pH8.2、或由蛋白酶gluC缓冲液、25mM碳酸铵/1mMEDTA，pH7.8。将乙腈加到该消化混合物中，使其浓度为5～10%(V/V)。在消化缓冲液中稀释蛋白酶，且将其加到该消化混合物中，一般蛋白酶与蛋白质的比率为1∶10(W/W)。将消化缓冲液培养18-24小时。例如，将胰蛋白酶消化液在37℃条件下培养，且将内蛋白酶gluC消化液在室温下培养。同样，其他蛋白酶也可用于消化蜡合酶蛋白质，其中包括lysC和aspN。尽管各个消化缓冲液条件可以不同，但用于消化、肽分解、纯化和顺序排列的方法基本上与用胰蛋白酶和gluC进行消化时所述的方法相同。
过夜培养之后，将消化反应通过加入10μl10%(V/V)的三氟乙酸(TFA)或1μl100%TFA而停止。当在硝化纤维上提供蛋白质时，该硝化纤维素片要用1-5100μl具有5～10%乙腈的消化缓冲液进行洗涤，且将这些体积在Speed-Vac中浓缩至小于100μl体积。
将从消化过程中得到的肽用安装在AppliedBiozystems(FostCity，CA)Model130HyghPezfozmerccLiquidChromatogzaph(HPLC)中的一种Vydac反相C18柱(2.1mm×100mm)分离。用于洗脱肽的流动相是缓冲液A0.1mM磷酸钠，pH2.2;缓冲液B在0.1mM磷酸钠中的70%乙腈，pH2.2。使用3级梯度即两小时内为10-55%缓冲液B，5分钟内的为55～75%缓冲液B，和用75%缓冲液B同溶剂进行15分钟，其流速为50μl/分钟。在214nm处对肽进行检测，用手将其收集，然后贮存在-20℃条件下。
由于蜡合酶蛋白质的疏水性能，在酶消化缓冲液中添加一种洗涤剂将是有用的。例如，将从上述连续相洗脱过程中得到含有希蒙德木蜡合酶的部分在100mM NaHCO3/1.0%CHAPS溶液中、在Centricon30装置中浓缩至最终体积为110μl。将在5μl、100mMNaHCO3/10%CHAPS中的2μg胰蛋白酶加到该蛋白溶液中，且在37℃条件下过夜培养该混合物，并通过加入三氟乙酸(TFA)终止该消化过程。稍微离心该样品，且在Vydac C18柱上分离该肽并如上所述对其进行洗脱。在此过程中，CHAPS在～40-53%缓冲液B条件下洗脱，并遮住了该肽在这个区域中的峰。
当初级分离产生一种复合肽图，例如使用过量的蛋白质或存在着污染(如希蒙德木还原酶蛋白质)时，肽峰可使用一种柱进一步进行色谱分析，但是此时采用不同的梯度系统。对于上述的希蒙德木蜡合酶制剂，亲水峰分离所使用的梯度是60分钟的0～40%缓冲液B，35分钟的40-75%B和10分钟的75～100%B。疏水峰分离使用的梯度是40分钟的0-40%缓冲液B、60分钟的40-80%B和10分钟的80-100%B。对于这些分离过程，缓冲液A是0.1%TFA而缓冲液B是在乙腈中的0.1%TFA。
C、蛋白质和肽的N-末端顺序排列所有的顺序排列是通过埃德曼(Edman)降解来完成的，其中使用了一台AppliedBiosustams477A脉冲-液相蛋白质排序器(AppliedBiosystems477APulsed-LiquidPhaseProteinSequencer);由该排序器产生的乙内酰苯硫脲(PTH)氨基酸将通过一台联机的AppliedBiosystems120APTH分析器(AppliedBiosystems120APTHAnalyjer)来进行分析。数据的收集和储存使用了一种在AppleMacintosh机上的AppliedBiosystems牌号610A数据分析系统以及一台DigitalMicrovax，它使用从PENELSON，Inc.(Cupertino，CA)得到的ACCESS☆CHROM软件。序列数据从一种图表记录器中读出，该记录器是从上述PTH分析器中接收输入的，并且用从上述牌号610A软件中获得的定量数据来确认。所有的序列数据由两个操作员通过其数据分析系统独立地读出。
对于从HPLC上的峰值而获得的肽样品，可以将该样品放入一个涂有Polykrene的玻璃纤维过滤器上(AppliedBiosystems，FosterCity，CA)，该过滤器已在排序器中进行了3次预循环。对于已还原和己烷基化了的肽，将从每个顺序器循环中获得的PTH-氨基酸产物材料的一部分在一台液体闪烁计数器中进行计数。对于已电溅射到Immokiton-P上的蛋白质样品，将有用的带切下来，然后放在涂有Polykrene的玻璃纤维过滤器上，如上所述进行安装。对于已电溅射到ProBlott上的蛋白质样品，则不需要使用玻璃纤维过滤器。
为了从少量样品(5-30pmoles)中获得蛋白质序列，可以使用由Tempst和Riviere所描述的477A转换环和120A分析器(Anal.Biochem.(1989)183290)。
通过如上所述的胰蛋白酶消化获得的希蒙德木蜡合酶肽的氨基酸序列在下列表2中列出。
表2希蒙德木蜡合酶胰蛋白酶肽的氨基酸序列SQ1114ETYVPESVTKKSQ1084VPXEPSIAAXSQ1083ETYVDEFvtkSQ1120DLMAVAGEAlkSQ1125MINVKPYIPDFSQ1129FLPXXVAiTGeSQ1131FGNTSSXXLyxelayakSQ1137AEAEEVMYGAIDEVLEK
蜡合酶肽的氨基酸序列用单个字母编码来表示。“X”表示一个不能确定的氨基酸的位置，并通过小写的字母所代表的氨基酸表示识别可信度较低残基。
实例6-辅加的蜡合酶的纯化本例所描述的是使希蒙德木蜡合酶的溶解和纯化方法适用于从其他有机体中获得部分纯化的蜡合酶制剂的情况。
A、不动杆菌属将乙酸钙不动杆菌株BD413的细胞(ATCC＃33305)在ECLB(大肠杆菌luriab rowth)上生长，将其在对数生长期过程中收集且在含有Hepes，pH7.5、0.1M NaCl、1mM DTT和蛋白酶抑制剂的一种缓冲液中洗涤。将洗涤过的细胞在新鲜缓冲液中重新悬浮且通过将其经过一个French压力单元(在～16000p.s.i条件下经过两次)将其破碎。未被打破的细胞通过在5000xg条件下进行10分钟离心作用而被去掉，而膜通过在100.000xg条件下进行1小时离心作用来收集。将该膜粒丸在储存缓冲液中(25mM Hepes，pH7.5，10%(W/V)甘油)拌匀。在这些膜中检测蜡合酶活性，此时使用在实例1B中所述的对于希蒙德木酶的试验条件，用[1-14C]棕榈酰基-辅酶A和181的醇作为底物。
如在实例4B中对希蒙德木酶所述的那样，通过在0.5MNaCl存在的条件下用2%CHAPS对膜进行培养而溶解蜡合酶活性。通过在200，000g条件下进行1小时的离心作用之后在上清液部分中对蜡合酶酶活性进行检测，以及通过尺寸排它性色谱法而证实该活性的溶解(即该活性是在其所剩余的部中从柱上作为一个对称峰而洗脱的，该溶解的酶的活性是通过简单地将CHAPS浓度稀释至～0.3%(即，低于其自身的CMC)而检测的。检测溶解的活性时无需将酶导入磷脂泡中。
为了进行纯化，需将溶解的不动杆菌蜡合酶活性进行色谱法纯化，其方法与对希蒙德木酰基-辅酶还原酶所述的一样。将可溶的蛋白质制剂在低盐条件下(在含有0.75%CHAPS、10%甘油、25mMHepes、pH7.5的柱缓冲液中的150mMNaCl)装到BlueA琼脂糖上，且用在该柱缓冲液中的1.0MNaCl将其从柱中洗脱。
在Superosel2(Pharmacia，Piscataway，NJ)介质上进行的尺寸排它性色谱被用于对天然的酶的尺寸获得一个估计值并帮助确定待定的多肽。与在相同条件下由色谱法获得的分子量标准作比较，结果得到对于天然蜡合酶活性的估计值为～46KD。具有表观分子量的45KD、58KD、和64KD的三种多肽被识别出来，它们跟踪着蜡合酶活性。蜡合酶最强的候选物，45KD多肽的N-末端序列被确定为XDIAIIGSGsAGLAQaxilkdag，这里仅用一个字母编码代替氨基酸，“X”代表一个不能被确定的氨基酸的位置，且由小写字母代表的氨基酸代表识别可信度较小的残基。
B、裸藻属(Euglena)将股薄肌裸藻属(Euglenagracilis)，菌株Z(ATCCNo、12716)在～26℃条件下以适度的振动在黑暗中异地生长(Tani等(1987)Agric.Biol.CHem.51225-230)。将细胞收集，且在含有25mMBis-Tris-Propane、pH7.0、0.25MNaCl和1mMEDTA的缓冲液中重新悬浮，且通过经过一个French压力单元(在～16，000p.s.i条件下经过2次)而使其破裂。未破裂的细胞、细胞碎片和核通过在20，000xg条件下进行1小时的离心作用而收集微粒体膜。将该膜粒在储存缓冲液(25mMBis-Tris-Propane，pH7.0、0.25M NaCl、10%(W/V)甘油和1mM EDTA)中拌匀。使用对希蒙德木酶所描述的试验条件在这些膜中检验蜡合酶活性。经放射性标记的底物与希蒙德木例子的相同(即，[1-14C]棕榈酰基-辅酶A)，然而，使用的醇受体是160而不是181，且采用pH7.0的Bis-Tris-Propane。
裸藻属蜡合酶的活性是通过在0.5mMNaCl存在的条件下使用2%CHAPS将膜进行培养而溶解的。其蛋白质的溶解是通过在200，000xg条件下进行1小时离心作用之后在上清液部分中对酶活性进行检测而证实的。该溶解的酶的活性是通过将CHAPPS浓度稀释至～0.3%(即，低于它自身的CMC)而进行检测的。就象对溶解希蒙德木蜡合酶所述的那样，此时不需要把酶导入磷脂泡中。
为了进行部分纯化，将该溶解的裸藻属蜡合酶活性在BlueA琼脂糖介质上进行色谱法分离。在一柱缓冲液中用0.1MNaCl平衡该柱，其中该缓冲液含有25mMBis-Tris-Propane，pH7.0、20%(W/V)甘油、0.75%CHAPS和1mMEDTA。将含有溶解的蜡合酶活性的样品稀释至0.1MNaCl且装到一个1×7cm的柱上(5.5ml床体积)。将该柱用平衡缓冲液洗涤且在柱缓冲液中使它遭受一种线性NaCl梯度(0.1M至1.0MNaCl)。蜡合酶活性在该盐梯度的后半部分中以一种很宽的峰被洗脱。
柱部分的SDS-PAGE分析结果表明相对于其装到柱上的材料而言，从其柱上洗脱的活性的多肽的复杂性得到了极大的降低。可以发现一种～41KD表观分子量的多肽跟踪着该柱部分中蜡合酶活性。使用进一步纯化技术(如对希蒙德木和不动细胞属所描述的)可以证实～41KD肽与蜡合酶活性的联系。
为了对在裸藻属中的蜡合酶活性进行进一步分析，按下面所介绍的进行尺寸排它性色谱。从在黑暗中在液体异地培养基上生长的裸藻属细胞中获得一种微粒体膜制剂。通过在冰上用在缓冲溶液(25mMBis-Tris，pH7.0、1mMEDTA和10%(W/V)甘油)中的2%(W/V)CHAPS和500mMNaCl对膜进行1小时的处理而溶解蜡合酶活性。在通过添加稀缓冲液使CHAPS稀释至0.75%和使NaCl稀释至200mM之后，将该样品在～200，000xg条件下进行1.5小时的离心作用。将该上清液部分装到一个用柱缓冲液(25mMBis-TrispH7.01mMEDTA，10%甘油，0.75%CHAPS)预平衡了的BlueA染色柱上，该缓冲液还含有200mMNaCl。该柱用含有200mMNaCl的柱缓冲液来洗涤，直到流出液中的A280回到其预装填值。已粘连到柱上的蜡合酶活性通过增加柱缓冲液中NaCl的浓度至1.5M而将其释放。将含有用1.5MNaCl(～20ml总体积)释放的蜡合酶活性的部分(来自BlueA柱)收集在一起经过超滤作用(配有YM30膜的Amicon压力单元)将其浓缩约30-倍。将从BlueA柱中得到的浓缩物质用作通过在Superose12培养基上(Pharmacia)进行尺寸排它性色谱而进行分离的样品。
将约200μl样品装到一个Superosel2柱(HR10/30)上，该柱用含有0.5MNaCl的柱缓冲液进行了预平衡，且是在1ml/min的流速下进行的。将该蜡合酶活性从该柱中以一种光滑峰的形式洗脱。用分子量标准蛋白质的洗脱图与该蜡合酶活性的洗脱体积相比，结果得出对于该酶的表观分子量估计值为166KD。含有蜡合酶活性的部分通过用SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳然后再银染色来进行分析，对各种部分的多肽图进行的初步分析没有观测到任何具有100KD或更大分子量且染色强度与活性图相匹配的蛋白质。蜡合酶多肽可以在样品混合物中以次要成分存在，使其不易在银染色凝胶上检测到。另一方面，该酶可以由SDS-PAGE过程分裂的亚单位来组成。
实例7-蜡合酶核酸序列的分离本例描述的是从希蒙德木胚胎cDNA库中或从基因组DNA中分离蜡合酶核酸序列的过程。
A、希蒙德木cDNA库的构建采用一种多肽糖体分离方法从在开花期后80-90天时从采集到的希蒙德木胚胎中分离出RNA，该分离方法起初由Jackson和Larkins(PlantPhysiol.(1976)575-10)所描述，而后由Goldkezg等人(DevelopmentalBiot.(1981)83201-217)进行了改进。在这个过程中，所有步骤(除非特别说明)均在4℃条件下进行。将10gm组织在一台韦林氏搀合器(WaringBlender)中在液氮中进行研磨，直到该组织变成细颗粒粉末。当液氮蒸发之后，加入170ml的萃取缓冲液(200mMTrispH9.0、160mMKCL、25mMEDTA、70mMMgC12，1%TritonX-100、0.5%脱氧胆酸钠、1mM亚精胺、10mMβ-巯基乙醇、500mM蔗糖)且搅匀该组织约2分钟时间。将该匀浆通过无菌的纤维布(miracloth)进行过滤且在12，000xg条件下离心20分钟。将该上清液轻轻倒进一个500ml无菌烧瓶中，且在室温下加入1/19体积的20%洗涤剂溶液(20%Brij35，20%Tween40，20%Noidetp-40W/V)。将该溶液在4℃条件下以适当的速度搅拌30分钟，然后在12，000xg条件下将其上清液离心30分钟。
约30ml的上清液等分到无菌Ti60离心管中且用7ml的一种溶液铺在底下，其中该溶液含有40mM Tris pH9.0、5mMEGTA，20mM KCl，30mM MgCl2，1.8M蔗糖，5mM β-巯基乙醇。该管用萃取缓冲液填满至顶部，且在一台Ti60旋转器上在4℃条件下以60，000rpm的转速旋转4小时。离心作用之后，将该上清液吸出，向每支管子中加入0.5ml再悬浮缓冲液(40mM Tris pH9.0，5mM EGTA，200mM KCl，30mM MgCl2，5mM β-巯基乙醇)。将该管放置在冰上10分钟，然后将小粒重新完全悬浮和收集起来。然后将该上清液在120xg的条件下离心10分钟，以去除不溶物质。将20mM Tris pH7.6，200mM EDTA、2%N-月桂基-肌氨酸酯中的一个体积的自消化的1mg/ml蛋白酶K加到该上清液中，且在室温条件下培养该混合物30分钟。
RNA通过加入1/10体积的乙酸钠和2体积的乙醇来进行沉淀。在-20℃下几小时之后通过在12，000xg和4℃条件下离心作用30分钟使RNA粒化。将该粒丸在10mlTE缓冲液中(10mMTris、1mMEDTA)重新悬浮且用等体积的TrispH7.5饱和酚萃取。该相通过在4℃、10，000xg条件下离心作用20分钟来分离。去掉水溶液相，并用1体积的TE缓冲液再萃取该有机相。然后收集该水溶液相且用1体积的氯仿来萃取。通过离心作用再一次分离该相，且如前所述用乙醇沉淀其水相，从而得到聚核糖体RNA。
在该聚核糖体RNA制剂中的多糖杂质是通过将该RNA在高盐缓冲液(0.5MBNaCl，20mMTrispH7.5，1mMEDTA，0.1%SDS)中在纤维素柱(Sigma-cell50)上进行处理而去除的。该污染物粘附在该柱上，而RNA在洗脱液中收集。将洗脱液部分收集在一起，且用乙醇将该RNA沉淀。然后所有沉淀的RNA在一个更小体积中再悬浮，并提供到一种寡d(T)纤维素柱上以分离多腺苷化的RNA。
将多腺苷化的RNA用于在质粒克隆载体pCGN1703中构建一个cDNA库，该克隆载体出自市售克隆载体BluescribeM13-(Stratagene.CloningSystem;SanDiego，CA)，且在下面将描述其制备过程。将BluescribeM13-的多接头通过用BamHI进行消化，用绿豆核酸内切酶进行处理，以及进行纯端连接而改性使其产生一种缺失BamHⅠ-的质粒、pCGN1700。将pCGN1700用EcoRⅠ和SstⅠ(相邻的限制位点)消化，并用带有BamHⅠ、PstⅠ、XbaⅠ、ApaⅠ、和SamⅠ限制位点、AATT的5′悬突，和TCGA的3′悬突的人工接头将其退火。该接头插入到PCGN1700中消去了EcoRⅠ位点，产生了在Bluescribe中找到的SstⅠ(有时在本文也叫做“SacⅠ”)位点，并将新的在衔接物上含有的限制位点加入其中。将所得到的质粒pCGN1702用HindⅢ消化，且用Klenow酶将其未端纯化;将该线性DNA部分地用PvuⅡ消化且与在稀释溶液中的T4DNA蜡合酶连接。从中选出具有缺失的1ac启动子区域的转化体(pCGN1703)且用作质粒克隆载体。
以下简单地描述用于cDNA合成的克隆方法。将质粒克隆载体用SstⅠ消化，且均聚物T-尾端在所得的3’-悬突粘着端上产生，此时，使用未端脱氧核苷酸基转移酶。有尾部的质粒通过寡(dA)-纤维素色谱法从未消化的或无尾质粒中分离。所得载体可用作合成cDNA第一股(与该载体质粒的一端共价相连)的引物。将cDNA-mRNA-载体络合物在三磷酸脱氧鸟苷酯存在的条件下用未端转移酶来处理，在cDNA股的未端产生G-尾部。将外部的cDNA-mRNA络合物(相邻于BamHⅠ位点)，通过用BamHⅠ消化来去除，只留下BamHⅠ粘着端在一端而G-尾部在另一端的cDNA-mRNA-载体络合物。将这种络合物用一种退过火的人工环接接头环接起来，该环接接头具有一个5'BamHⅠ粘着末端，限制酶NotⅠ、EcoRⅠ和SsiⅠ的识别序列，和一个3'C-尾部末端。在连接和修补之后，将该环形络合物转移到大肠杆菌株DH5α(BRL，Gaithersburg，MD)中，从而产生其cDNA库。该希蒙德木cDNA库含有约1.5×106克隆，其平均cDNA插段尺寸为约500碱基对。
另一方面，还可将希蒙德木多腺苷化的RNA用于在克隆载体λZAPⅡ/EcoRⅠ(Stratagene，San Diego，CA)中构建一种cDNA库。该库按照由制造商提供的构建方案由DNA和细菌菌种进行制备。克隆的封装使用Gigapack Gold封装提取物(Stratagene)，这也要按照制造商的建议去做。该cDNA库以这种方式来建造，则含有约1×106克隆和平均尺寸约400碱基对的cDNA插段。
B、聚合酶链反应使用如实例5中所描述的那样获得的氨基酸序列信息，蜡合酶蛋白质的核酸序列通过聚合酶链反应(PCR)来获得。将合成寡核苷酸合成，它对应于所选定的蜡合成酶肽片段的氨基酸序列。若在蜡合酶蛋白质中的片段的顺序是已知的，例如当其中的一种肽是来自N-末端或所选定的肽包含在一种长肽片段上，则对于每一种所选定的肽仅需要一种低核苷酸引物。用于多个N-末端肽的寡核苷酸引物，前导引物包含有该肽的编码序列。用于多个C-末端肽的寡核苷酸引物，反向引物是互补于所选定的肽的编码序列。另一方面，当所选择的肽的序列是未知的，则对于每种肽需要两种低核苷酸引物，一种引物编码所选择的氨基酸序列，而另一种互补于所选择的氨基酸的序列。任何序列确定的蜡合酶肽均可选择用于寡核苷酸的构建，尽管更令人满意的肽是那些含有由最少数量的密码编码的氨基酸，例如蛋氨酸、色氨酸、半胱氨酸和其他由少于四个的密码编码的氨基酸的肽。因此，当寡核苷酸是所选定的肽的所有可能序列的混合物时，退化的寡核苷酸的数目可以是很低的。
利用这些寡核苷酸引物进行PCR，此时采用本领域技术人员已知的技术。希蒙德木核酸序列，如反向转录的cDNA(该DNA从上述cDNA库或基因组DNA中分离)，在这些反应中用作模板。以这种方式，产生蜡合酶DNA的片段。对该PCR产品进行凝胶电泳，以从中选出那些能产生令人满意的蜡合酶片段的反应。
C、对库中的蜡合酶序列进行筛选将通过PCR所获得的蜡合酶DNA片段标记且用作探针对从上述cDNA库中获得的克隆进行筛选。DNA库筛选技术是本领域中所已知的，例如参见Maniatis等人所描述的(MolecularCloningALaboratoryManual，SecondEditiion(1989)ColdSpringHarborLaboratoryPress)。以这种方式，可以获得蜡合酶核酸序列，它可以用于对核酸顺序进行分析，并可用于在各种宿主中表达蜡合酶，其宿主既可是原核的也可是真核的。
以此方式获得的1500核苷酸cDNA克隆。通过与表2中所提供的蜡合酶肽片段进行比较可以发现除SQ1129之外在转译的序列中这些肽的每一种都存在着。对希蒙德木胚胎RNA的Northern分析结果表明蜡合酶mRNA的长度约是2Kb。其它一些蜡合酶核酸序列还可以通过进一步的PCR而获得，如5'RACE(Frohman等人，Proc.Nat.Acad.Sci(1988)858998-9002)。另一方面，附加的序列可通过再筛选cDNA库或从基因组DNA中获得。希蒙德木蜡合酶基因的DNA序列在图2中列出。含有在pCGA1703中的完整的蜡合酶序列的质粒表示为pCGN7614。
D、蜡合酶在大肠杆菌中的表达将从pCGN7614中得到的蜡合酶基因放在大肠杆菌表达载体pCDR540(Pharmacia)的Tac启动子的控制下(下面将要描述)。将pCGN7614DNA在载体SalⅠ位点处消化，且使用DNA聚合酶Ⅰ的Klenaw片段和核苷酸TTP和dCTP填入其末端中。pDR540载体通过用BamHⅠ消化和部分地将dCTP和dATP填进末端而制备。将1.8Kb从pCGN7614得到的片段和消化了的pDR540载体使用低熔化温度的蔗糖进行凝胶纯化，并且用T4DNA连接酶将其连接到一起。将含有在相对于大肠杆菌启动子具有意义的取向中的蜡合酶的菌落表示为pCGN7620，而含有在反向取向中的蜡合酶基因的菌落为pCGN7621。为了对蜡合酶活性进行测试，将50mlpCGN7620和pCGN7621培养物在液体培养物中对数地生长，并通过添加IPTG至1mM的浓度将其诱导2小时。通过离心作用收集细胞，且对蜡合酶活性进行如对希蒙德木提取物所述的测试。TLC分析表明从pCGN7620中得到的细胞提取物指导蜡酯的合成，而从pCGN7621中得到的对照提取物指导蜡酯合成。
实例8-用于植物表达的蜡合酶和还原酶结构下面描述的是用于在植物细胞中表达蜡合酶还原酶序列的结构的制备过程。
A、表达盒(ExpressionCassettes)表达盒含有来自种子组织中优先表达的基因的5'和3'调节区域，它可以如在WO92/03564中所述的那样从napin、Bce4和ACP基因制得。
例如，napin表达盒可如下所述进行制备。napin表达盒pCGN1808，它可以用于表达蜡合酶或还原酶基因结构，其制备方法如Kridl等人所述(SeedScienceResearch(1991)1209-219)，该文在此列为参考文献。
另一方面，pCGN1808可被改进，使其含有侧面限制位点，从而仅允许表达序列而不允许抗生素抗性标记移动到双重载体，如pCGN1557(McBride和Summerfelt上文)中。将含有KpnⅠ、NotⅠ和HindⅢ限制位点的合成寡核苷酸退火，且在pCGN1808中唯一的HindⅢ位点处将其连接，使其仅有一个HindⅢ位置被恢复。所得的质粒pCGN3200在napin3'-调节序列的3'末端处具有唯一的HindⅢ、NotⅠ和KpnⅠ限制位点，其顺序通过顺序分析来确定。
大多数napin表达盒是通过用HindⅢ和SacⅠ进行消化和与经过HindⅢ和pIC19R消化的(Marsh，等人(1984)Gene32481-485)的SacⅠ连接而从pCGN3200中亚克隆，从而制得pCGN3212。napin启动子区域的极端5'-顺序是通过PCR从pCGN1808结构重新构成的，在该PCR中，采用PCGN3200作模板和两种在SacⅠ位点和napin5'启动子与pCGN3200的pUC主链的接合处侧生的引物。前导引物含有ClaⅠ、HindⅢ、NotⅠ、和KpnⅠ限制位点以及napin5'-序列(来自EcoRV位点)的核苷酸408-423，而反向引子具有与napin序列718-739互补的序列，其中包括在5'-启动子中的唯一的SacⅠ位置。按照制造商的说明进行PCR，其中使用一台PerkinElmer/Cetus热循环机。将PCR片段亚克隆成为一种纯端片段而进入pUC8(Vieira和Messing(1982)Genel9259-268)中，且用HincⅡ进行消化，从而得到pCGN3217。在napin插段中穿过的pCGN3217的序列证实没有不恰当的核苷酸通过PCR引入。将在pCGN3217中的napin5-顺序通过用ClaⅠ和SacⅠ进行消化和与用ClaⅠ和SacⅠ消化过的pCGN3213连接而与napin表达盒的剩余部分连接。将所得到的表达盒pCGN3213用HindⅢ消化，将该napin表达序列凝胶纯化，且与用HindⅢ消化过的pIC20H(Marsh，上文)连接。最终的表达盒是pCGN3223，它在一个氨苄青霉素抗性背景中包括和在pCGN1808中所发现的基本相同的1.725napin5'和1.2653'调节顺序。该调节区域的侧面有HindⅢ，NotⅠ和KpnⅠ限制位点，且唯一的SalⅠ，BglⅡ、PstⅠ、和XhoⅠ克隆位点处于5'和3'非编码区域之间。将蜡合酶基因序列插入到这种盒中，从而为植物转移方法提供表达结构。例如，为了进行下面要描述的以土壤杆菌作介质的转化过程可以将这类结构插入两重载体中。
B、用于植物转化过程的蜡合酶结构将蜡合酶基因质粒pCGN7614用AflⅢ进行消化，且与接合体接合从而将BclⅠ位点加到AflⅢ粘性末端上，随后用SalⅠ和BclⅠ进行消化。将含有蜡合酶基因的片段凝胶纯化并克隆到经过SalⅠ/BamHⅠ(一种napin表达盒)消化的pCGN3223中。所得到的质粒在napin表达盒中在有意取向上含有蜡合酶基因，将它表示为pCGN7624。将从pCGN7624中分离出的DNA用Asp718(一种KpnⅠ同裂酶)消化，且将napin/蜡合酶融合基因克隆到经过Asp718消化的双重载体pCGN1578中(McBride和Summerfelt，同上)。将所得到的双重载体(表示为pCGN7626)转化到土壤杆菌菌株EHA101中，且用于拟南芥属和菜子外植体(rapeseedexplants)的转化。
C、用于植物转化过程的还原酶结构制备用于在植物细胞中表达还原酶的结构，其中使用来自napin基因的5'和3'调节区域。
将一种还原酶cDNA(在上述的pCGN1703载体中，表示为pCGN7571)用SphⅠ(在碱基1594-1599处的3'未转译的序列位点中)进行消化，且在这个位点上插入一个SalⅠ接物。将所得的质粒用BamHⅠ和SalⅠ进行消化，且将该含有还原酶cDNA的片段凝胶纯化和克隆到用BglⅡ/XhoⅠ消化了的pCGN3223(napin盒，如上所述)中从而得到pCGN7585。
将含有napin5'/还原酶/napin3'结构的pCGN7585的HindⅢ片段克隆到经过HindⅢ消化的pCGN1578(McBride和Summerfelt，同上)，得到pCGN7586，它是一种用于植物转化过程的双重载体。
植物转化结构pCGN7589(在一种napin启动子的表达下还含有希蒙德木还原酶基因)的制备过程如下。在体外将pCGN7571诱变从而在还原酶编码序列的第一个ATG处引入一个NdeⅠ位点，而在紧接着NdeⅠ位点的上游引入一个BglⅡ位点。将BamHⅠ接物引入到位于还原酶编码区域下游的SphⅠ位点中。将1.5KbBglⅡ-BamHⅠ片段凝胶纯化并克隆到用BglⅡ-BamHⅠ消化的pCGN3686(见下面)中，结果得到pCGN7582。
pCGN3686是一种从BluescriptKS+产生的克隆载体(StratageneCloningSystem;SanDiego，(A)，但它具有一个氯霉素抗性基因和一个经过修饰的接物区域。氯霉素抗生基因，pCGN565的源是一个基于pUC12-cm上的克隆载体(K.BuckleyPh.D.Thesis，Regulationandexpressionofthephi×174lysisgene，UniversityofCalifornia，SanDiego，1985)，但是它含有pUC18接物(Yanishch-Perron等人，Gene(1985)53103-119)。将pCGN565用HhaⅠ进行消化，且将该含有氯霉素抗性基因的片段切除并通过使用绿豆核将其纯化、且将其插入到BluescriptKS-的EcoRV位点中(StratageneLaJolla，CA)，从而产生pCGN2008。该pCGN2008氯霉素抗性基因通过用EcoRⅠ/HindⅢ消化而去除，在用Klenow酶处理使未端纯化之后，将该片段与用DraⅠ消化的BluescriptKS+连接。从中选出具有Dral片段(其中所含的氨苄青霉素抗性被氯霉素抗性取代)的克隆，且命名为pCGN2015。将pCGN2015的接物区域修饰，从而产生pCGN3686，其中含有下列限制消化位点，在lacZ接物区域中5'至3'PstⅠ、BglⅡ、XhoⅠ、HincⅡ、SalⅠ、HindⅢ、EcoRⅤ、EcoRⅠ、PstⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、XbaⅠ和SacⅠ。
将XhoⅠ接物插入在pCGN7582的XbaⅠ位点处。将含有还原酶基因的BglⅡ-XhoⅠ分离且克隆到经过BglⅡ-XhoⅠ消化的pCGN3223中。将所得到的质粒(它缺少从希蒙德木基因中得到5’未转译的前导序列)表示为pCGN7802。将从pCGN7802中得到的napin/还原酶片段用HindⅢ切断，且克隆到用HindⅢ消化的pCGN1578中，从而得到pCGN7589。
将pCGN7886和pCGN7589转化到土壤杆菌细胞，如菌株EHA101中(Hood等人，J.Bacteriol(1986)1681291-1301)，其方法采用是的Holsters等人的方法(Mol.Gen.Genet(1978)163181-187)，且如下所述将其用于植物转化过程中。
实例9-植物转化方法在本例中发展了多种方法，用于将所要的DNA序列插入到植物宿主的基因组中，从而获得该序列的转录或转录和转译，以使表型发生变化。
芸苔转化将高芥子酸的种子，如载培品种Reston，或各种Canola类蔓菁，在95%乙醇中浸泡2分钟，在含有一滴Tween20的次氯酸钠的1.0%溶液中消毒其表面45分钟，并且无菌的蒸馏水中漂洗3次。然后，把种子放置在Magenta盒子中，盒中放入1/10浓度的Murashige微型有机介质中(Gibco;GrandIsland，NY)，并用吡哆素(50μg/l)、烟酸(50μg/l)、甘氨酸(200μg/l)、和0.6%Phytagar(Gibco)pH5.8来补充。将种子在一个Percival室中于22℃下，用冷荧光和红光(其强度约为65μ爱因斯坦每平方米每秒(μEm-2s-1))光照16小时，使其发芽。
从5-7天的种子中切下胚轴，将其切成约4mm长的碎片，装入一个料盘上(Horsch等人，Sciene(1985)2271229-1231)。装料盘在使用前一天准备好，此时在盘(100×25mm)上放进1.0ml的蕃茄悬浮培养液，其中含有约30ml MS盐基(Carolina Biological，Burlington，NC)100mg/l肌醇、1.3mg/l维生素B1-HCl、具有3%蔗糖的280mg KH2PO4、2、4-D(1.0mg/l)，0.6%W/V Phytagar、并在高压消毒之前把pH调至5.8(MS 0/1/0介质)。在使用前把无菌过滤纸盘(3mm)放置在边料层的顶部。通过转移10ml培养液进入100ml新鲜MS介质中，将蕃茄悬浮培养液再培养一周，此时如对装料盘所述的那样(带有2.4-D(0.2mg/l)、Kinetin(0.1mg/l))。在没有使用装料器单元的实验中，将胚轴外植体切下且放置在MS 0/1/0介质的顶部上的过滤纸盘上。将所有的胚轴外植体在装料盘上预培育24小时，培养温度为22℃，连续光照强度为30μEm-2s-1至65μEM-2s-1。
将A.tumefaciens株EHA101的单个菌落(其中含有带有所需基因结构的双重质粒)转移至5ml MG/L肉汤中并在30℃生长一整液。将胚轴外植体浸在7-12ml MG/L肉汤(其中含有稀释至1×108细菌/ml浓度的细菌)且在10-25分钟之后将其放置在装料盘上。每升MG/L肉汤含有5g甘露糖醇、1gL-谷氨酸或1.15g谷氨酸钠、0.25g KH2PO4、0.10g NaCl、0.10g、MGSO4·7H2O、1mg维生素H、5g胰化胨、和2.5酵母抽提物，将该肉汤调节至pH7.0。在与土壤杆菌共同培养48小时之后，将胚轴外植体转移至B50/1/0胼胝培养介质上，其中含有过滤夹菌的羧苄青霉素(500mg/l，在高压消毒之后加入)和卡那霉素硫酸盐(BuehringerMaunheim;Indianapolis，IN)其浓度为25mg/l。
在培养液中65μEM-2S-1连续光下经过3-7天之后，胼胝组织在切割表面上肉眼可见，且将胚轴外植体转移至发芽诱导介质B5BZ上(B5盐和补充的维生素，其中有3mg/l苄基氨基嘌呤、1mg/l玉米素、1%蔗糖、0.6%Phytagar，并将pH调节5.8)。该介质中还含有羧苄青霉素(50mg/l)和卡那霉素硫酸盐(25mg/l)。将胚轴外植体在新鲜的苗诱导介质上每两个星期重新培养。
一至三个月以后从胚轴胼胝组织中新苗重新长出。将至少1cm绿苗从胼胝中切下来，且放置在介质中，其中该介质含有B5盐和维生素、1%蔗糖、羧苄青霉素(300mg/l)、卡那霉素硫酸盐(50mg/l)和0.6%W/VPhytagar)。在2-4星期之后，将保持绿色的苗从根部上切下来，且转移至Magenta盒中，该盒中含有根部诱导介质(B5盐和维生素、1%蔗糖、2mg/l吲哚基丁酸、50mg/l)卡那霉素硫酸盐和0.6%Phytagar)。对绿色的带根苗进行硫酯酶活性测试。
Arabidposis转化转基因的拟南芥植物可通过以土壤杆菌为介质的转化过程来获得，如由Valverkens等人所述的那样(Proc.NatAcad.Sci(1988)855536-5540)。将组构转化到土壤杆菌细胞，如株EHA101(Hood等人，J.Bacteriol(1986)1681291-1301)中，其中用的是Holsters等人的方法(Mol.Gen.Genet.(1978)163181-187)。
花生转化将所要的DNA序列以表达盒形式通过粒子轰击而导入植物基因组中，该表达盒包括至少一种启动子区域、一个所需的基因、和一个终止区域。
简单地说，在钨和金粒子(其粒度范围在0.5mM-3mM之间)上涂覆一种表达盒的DNA。这种DNA可以是一种水溶液的形式或一种干的DNA/粒子沉淀物。
用作轰击靶的组织可以来自猪耳草外植体、苗分生组织、未成熟的叶或花药。用Biolistics粒子枪对涂覆DNA的粒子的组织进行轰击(Dupont;Wilmington，DE)。将粒子放进枪筒中，其距离范围是从枪筒口至粒子1cm-14cm不等。将待轰击的组织放在停止板下，试验是在距离不超过20cm的组织上进行的。在发射的时候，组织通过尼龙网或网孔在10mM至30mM范围内的尼龙的结合来进行防护。
轰击之后，将植物按照Atreya等人的方法(PlantScienceLetter(1984)34379-383)重新生长。简单地说，将胚胎轴组织或子叶片段放置在MS介质上(Murashige和Skoog，Physio.Plant(1962)15473)(MS加2.0mg/16-苄基腺嘌呤用于子叶片段)且将其在黑暗中在25±2℃条件下培养1周，然后将其转移到连续地冷荧光(6.8W/m2)下。在培养的第10天，将该植物转移至含有无菌土的盆中，在阴暗处保持3-5天，最后移至暖房。假定的转基因苗生根固定。把外源DNA整合到植物基因组中可通过多种本领域技术人员已知的方法来确定。
实例10-对用于蜡制备的转化的植物进行分析对粗转化植物的种子和其它植物材料进行蜡合酶活性分析，其中使用在实例1中所述的蜡合酶测试方法。
对既有还原酶又有蜡合酶结构的植物也进行检测以测量蜡制备过程。这类植物可通过如上所述土壤杆菌转化方法来制备。具有两种所需基因结构的植物可通过与还原酶和蜡合酶结构共同转化，或通过将蜡合酶和还原酶结构结合在单个植物转化双重载体上而制备。另外，用编码其他所需基因序列的结构来再次转化蜡合酶表达植物或还原酶表达植物的过程也可以用来提供这类还原酶和蜡合酶表达植物。另一方面，还可以将通过本文所述的方法产生的表达还原酶的转基因植物与已经同样地产生的表达蜡合酶的植物进行杂交。以这种方式，可以将已知的植物繁育方法用于产生表达还原酶和蜡合酶的转基因植物。
对这些植物是否存在蜡酯进行测试，例如通过从蜡酯中分离TAG，就象由Tani等人(上文)所述的那样。GC分析方法可以用于进一步分析所得的蜡，例如就象由Pina等人(Lipids(1987)22(5)358-361)所述的那样。
以上结果证明能够获得部分纯化的蜡合酶蛋白质，它在由脂肪醇和脂肪酰基酶底物中形成蜡酯的过程中是活性的。本文提供了获得蜡合酶蛋白质和其氨基酸序列的方法。另外，还提供了从氨基酸序列获得的蜡合酶核酸序列。可以将这些核酸序列进行处理以使该序列发生转录和/或在宿主细胞中表达蜡合酶蛋白质，这些蛋白质可用于各种应用中。这些应用包括当蜡合酶在具有脂肪醇底物的宿主细胞中使用时制备蜡酯化合物，所述的底物对该宿主细胞有活性，或者它是通过使用重组结构而提供的，其中该结构编码一种脂肪酰基还原酶蛋白质的，该蛋白质在由脂肪酰基底物形成醇的过程中是有活性的。
在本说明书中引用的所有出版物和专利申请在此列为参考文献，就象每一份出版物或专利申请物均特别和单独地表明了是作为参考文献的那样。
虽然出于清晰和明了的目的，上面通过说明书和实施例的方式已详细地描述了本发明，但是不超出本发明精神和权利要求书范围的一些变化和修改在本发明的指导下是很容易由本领域技术人员作出的。
权利要求
1.一种重组DNA结构，该结构包含一种核酸序列，该序列编码至少一部分蜡合酶蛋白，以及一种异源的DNA序列，该序列与所说的蜡合酶编码序列无天然联系。
2.按照权利要求1的结构，其中所说的蜡合酶对脂酰辅酶A底物具有活性。
3.按照权利要求1的结构，其中所说的蜡合酶对具有式C2X碳链的脂肪醇底物具有活性，其中X选自6-12。
4.按照权利要求1的结构，其中所说的蜡合酶对具有式C2X碳链的脂肪醇底物具有活性，其中X选自6-12。
5.按照权利要求1的结构，其中所说的蜡合酶编码序列来源于一种种子植物。
6.按照权利要求1的结构，其中所说的蜡合酶编码序列来源于希蒙德木属。
7.按照权利要求1的结构，它还含有一种启动子，该启动子至少在宿主细胞中能使所说的蜡合酶编码序列发生转录。
8.按照权利要求7的结构，其中所说的启动子在植物细胞中使所说的蜡合酶编码序列发生表达。
9.按照权利要求8的结构，其中所说的植物细胞是植物胚芽种子细胞。
10.按照权利要求7的结构，其中所说的启动子在细菌细胞中使所说的蜡合酶编码序列发生表达。
11.按照权利要求8的结构，其中所说的启动子来源于在植物种子胚芽细胞中优先表达的基因。
12.一种细胞，该细胞包含按照权利要求1的结构。
13.一种植物细胞，该植物细胞包含按照权利要求1的结构。
14.一种宿主细胞，该细胞包含一种重组结构，该结构包含编码脂肪酰基还原酶蛋白的核酸序列;以及一种重组结构，该结构包含一种编码蜡合酶蛋白的核酸序列，其中所说蜡合酶编码序列对所说的宿主细胞来说是异源的，而且其中所说的还原酶和蜡合酶编码序列处于在所说的宿主细胞中起作用的启动子的调节控制下。
15.按照权利要求14的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是植物细胞。
16.按照权利要求15的植物细胞，其中所说的植物细胞是芸苔属植物细胞。
17.一种芸苔属植物细胞，该细胞包含权利要求1所述的结构。
18.一种原核生物细胞，该细胞包含一种种子植物蜡合酶。
19.一种在宿主细胞中制备蜡合酶的方法，该方法包括以下步骤培养包含一种重组结构的宿主细胞，所说的结构包含编码蜡合酶的核酸序列，其中所说的蜡合酶编码序列处于在所说细胞中起作用的启动子的调节控制下，所述的培养在可以引起所说的蜡合酶编码序列发生表达的条件下进行。
20.按照权利要求19的方法，其中所说的宿主细胞是一种原核生物。
21.按照权利要求19的方法，其中所说的宿主细胞是种子植物胚芽细胞。
22.按照权利要求21的方法，其中所说的种子植物是芸苔属。
23.按照权利要求19的方法，其中所说的蜡合酶编码序列来源于一种种子植物。
24.一种在宿主细胞中制备蜡酯的方法，该方法包括以下步骤培养包含一种重组结构的宿主细胞，所说的结构包含一种编码蜡合酶的核酸序列，其中所说的蜡合酶编码序列处于在所说的宿主细胞中起作用的调节部分的控制，所述的培养在可以引起所说的蜡合酶编码序列发生表达的条件下进行。
25.按照权利要求24的方法，其中所说的蜡合酶的脂肪醇底物是在所说的宿主细胞中产生的，它是来自异源重组结构的脂肪酰基还原酶编码序列表达的结果。
26.按照权利要求24或25的方法，其中所说的宿主细胞是一种植物细胞。
27.按照权利要求26的方法，其中所说的植物细胞是种子植物胚芽细胞。
28.按照权利要求27的方法，其中所说的植物是芸苔属。
29.一种宿主细胞，该细胞包含按照权利要求24或25所述方法制成的蜡酯。
30.按照权利要求29的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是一种植物细胞。
31.按照权利要求30的宿主细胞，其中所说的植物细胞是芸苔属种子胚芽细胞。
32.一种芸苔属种子细胞，其中所说的种子细胞的内脂储备物包含蜡酯。
33.按照权利要求32的芸苔属种子细胞，其中所说的蜡酯是长链蜡酯。
全文摘要
本发明提供了一种部分纯化的脂酰辅酶A脂肪醇酰基转移酶(蜡合酶)，其中所说的蛋白在由脂肪醇和脂肪酰基底物形成蜡酯的过程中具有活性。其中的一个特例是表观分子量约为57KD的希蒙德木属胚芽蜡合酶。本发明涉及到可以从蜡合酶蛋白获得的氨基酸和核酸序列，并且利用这些序列产生能生产蜡酯的转基因宿主细胞。
文档编号C12N5/00GK1078492SQ9211482
公开日1993年11月17日 申请日期1992年11月20日 优先权日1991年11月20日
发明者J·G·美茨, K·D·拉迪扎巴尔, M·W·拉思乃 申请人:卡尔金公司