专利名称：制备和纯化α-干扰素的方法
技术领域：
本发明涉及通过细菌表达制备α-干扰素(IFNα)的方法及其分离，还涉及用于此目的的表达载体，及纯化IFNα的方法。
通过细菌表达制备IFNα的方法是已知的。常规方法基于大肠杆菌(E.Coli)中蛋白质的细胞质表达，其中被表达的IFNα或以所谓的内含体以不溶的形式存在于细胞中，或在细胞壁打开后被发现于可溶的部分(Thatcher et Panayotatos，1986;Goeddel等人，1980;Dworkin-Rastl等，1983)。但是，细胞质表达具有一些缺陷。合成的蛋白不能正确折叠且因为在细胞质中还原性条件占优势，使其不含有必要的二硫桥键。因此形成的IFNα不得不在制备过程中被氧化然后再折叠。这一方法是低效的且导致不需要的副产物。(全部或部分的还原形式，由分子间二硫桥键产生的低聚物，通过假二硫桥键的形成而错误折叠的形式)，这些副产物难于分离去除。另一个问题是作为转录起点的N-末端蛋氨酸只能部分地从细胞内合成的IFNα上裂解掉。所得的N-Met-IFNα几乎不能从原来的IFNα上除去。
该常用方法的另一个缺点是需用启动子，其在非诱导状态不能完全关闭，必须通过添加化学试剂诱导且在诱导状态表达速度不理想。比如来自Serratia marcescens的色氨酸启动子(trp-promotor)。
为了克服上述的一些缺点，并利用经济的E.coli系，Breitling等试图利用能使干扰素分泌通过细胞膜至外周胞粒空间中的载体表达IFNα1和IFNα1/2杂种。他们利用来自一种菌体的启动子、核糖体结合位点(RBS)和链激酶基因(sak42D)的信号序列。所产物的60%～80%的IFNα被分泌到外周胞粒空间中。然而，由于载体结构的原因，该蛋白质含有N-末端氨基酸，而这些氨基酸在相对应的原IFNα中不出现。这一表达系统的严重缺陷是转化成该结构的菌株不能保持遗传上的稳定;表达盒通过IS1的自发插入而失活。在现有技术中E.Coli提供表达/分泌系统来制备人IFNα的目标尚未实现。
已知成功地在E.Coli中表达人生长因子受体的表达/分泌盒是来自碱性磷酸激酶(PhoA)启动子和热稳定的肠毒素II(STII)信号序列的结构。(Fuh等，1990)。
在E.Coli上生产重组体IFNα的另一个问题是细菌溶菌产物中蛋白质的纯化。已知有一些方法(Thatcher和Panayotatos，1986;EP-A 203 382)。为了得到蛋白质的原始折叠，优选使用不要求变性或沉淀步骤的方法。这种方法描述于EP-A 396 555中。它包括如下步骤免疫亲和层析、反相层析(RPC)、阳离子交换层析、超滤浓缩及凝胶过滤层析。该方法与其它已知方法相似的是基于第一步骤的免疫亲和层析的高度选择性。对于制备高纯度的IFNα1，特别是IFNα2，尚没有不用变性/沉淀步骤和免疫亲和层析的方法。同时，该种方法因经济和技术原因是理想的。因为免疫亲和层析需要单克隆抗体，所以费用很高，并且，因为抗体-偶联的基质的存活期有限，需要不断供应这些抗体。
本发明的目标是建立一种更经济更有效的方法，通过在E.Coli中的重组体表达，用来制备干扰素α，特别是干扰素α2。同时，需要建立一有效且稳定的系统用于蛋白质到外周胞粒空间或培养基的表达/分泌。进而，建立一种温和地高度纯化被表达的蛋白质的方法，该方法不包括变性/沉淀步骤且不需用免疫亲和层析。
本发明已解决了这个问题。本发明通过构成一种载体来建立从E.Coli制备IFNα的稳定的表达/分泌系统。该载体含有E.Coli的热稳定肠毒素II(STII)信号序列(先导序列)，其与成人干扰素-α，优选与干扰素-α2的密码序列连接。表达控制优选用E.Coli的碱性磷酸激酶(phoA)启动子的方式影响。本发明另一优点是整合STII基因的核糖体连接位点。本发明另一个令人惊异的进步是建立了纯化α干扰素的方法，包括以下步骤硅胶吸附层析，疏水相互作用层析(HIC)，阳离子交换层析和阴离子交换层析。
本发明的一方面涉及通过用转化细菌细胞的细菌表达及分离被表达的IFNα来制备IFNα的方法。该转化细菌细胞中含有一种表达载体，其中的STII信号序列与一种IFNα基因连接。本发明的另一方面，涉及用于制备IFNα的细菌表达载体及该载体制备IFNα的用途，该载体包含来自STII基因和一种IFNα基因的构成。本发明的第三个方面涉及通过硅胶吸附层析，疏水相互作用层析，阳离子和阴离子交换层析的层析步骤制备IFNα的方法。
构成载体的起始点可以是E.coli中可复制的质粒，比如质粒pAT153(Twigg等，1980)，其特别适合用于此目的。为STII基因的信号肽编码的核苷酸序列是本领域已知的(Picken等，1983;Lee等，1983)。本领域的普通技术人员用突变(替代、缺失、插入、添加)手段制备这一序列的变型，但并不改变其基本性质，特别是制备核酸序列，该序列因为基因密码的简并而给信号肽的相同氨基酸序列编码(Sambrook等，1989，特别是第15章)。用于IFNα族(IFNα family)成员编码的完整序列是已知的(Mantei等，1980;Streuli等，1980;Goeddel等，1981);编译它们的同源基因多于70%。这些序列的其它变型天然存在或从已知序列用已知的方法通过突变基因法来制备(Sambrook等，1989，特别是第15章)。本发明中“IFNα”一词除已知序列外，还包括其它一些变型，它们的特征在于与已知序列高度同源，且为生物活性的IFNα编码。特别优选的是IFNα 2c编码序列(Dworkin等，1983;Bodo和Fogy，1985)。特别优选使用phoA-启动子进行控制表达而且整合STII基因的核蛋白体结合位点是有利的。phoA-启动子的序列(Chang等，1986;Shuttleworth等，1981)和STII核蛋白体结合位点的序列(Picken等，1983;Lee等，1983)是已知的。本领域的普通技术人员从这些序列也能容易地制成相当的变型。载体的构建、合适E.coli菌株的转化、发酵和提取可用已知方法进行。参见(Sambrook等，1989)。例如，E.coli菌株W3110(E.coli k12野生型f，λ，IN(rrnD-rrnE)1)非常适合用于表达。基础培养物可以令人满意地在LB培养基中产生，并通过控制氧和营养物的供给，可制备主培养物，OD546至多为250～280。一种被证明是合适的提取方法，包括借助匀浆器，将酸-失活的生物物质(biomass)悬浮于稀醋酸中，加入聚乙烯胺，优选浓度为0.25%(w/v)，调节混合物至碱性pH，优选pH10，搅拌混合物并通过离心除去菌体。纯化可以用已知方法进行，参见(Thatcher和Panayotatos，1986;EP-A 203 382)。但是，一种包括四个层析步骤的方法，即硅胶吸附层析、疏水相互作用层析、阳离子和阴离子交换层析，被证明是特别有利的。由Grace出品的953W型硅胶特别适用于硅胶层析的凝胶层，同时，缓冲液500～1500mM四甲基铵氯化物(TMAC)，优选800mM TMAC，利于用作洗脱液。对于疏水相互作用层析，苯基琼脂糖作为凝胶支持物被证明是适合的。优选在20%硫酸铵存在下上样，柱用含30%硫酸铵的缓冲液饱和。IFNα用最终浓度为30%乙二醇的线性梯度洗脱。阳离子交换层析可以用磺丙基离子交换树脂。在pH3～5时，优选pH3时上样，柱预先饱和至pH5。使用加10%乙二醇的线性梯度的食盐洗脱IFNα。阴离子交换层析中优选含有DEAE-琼脂糖的支持物且上样和洗脱在pH5.5至6.0时进行，优选pH5.8。加0.1%吐温20的线性梯度的食盐特别适于作洗脱剂。本领域的普通技术人员基于相同分离原则用相当的材料替代一种或多种凝胶材料是可能的，并不具有创造性，而且这样做是采用与本发明方法等同的方法。
令人惊异的是，通过将STII信号序列和IFNα基因连接，可以建立一稳定的表达/分泌系统，这对利用前述的sak42D先导/IFNα重组是不可能的。已证明在phoA启动子控制下对这一序列进行表达是特别成功的。在这一点上，STII基因的核蛋白体结合位点的整合也证明是有优势的。通过控制培养基中的磷酸浓度可以控制表达(磷酸缺乏可激活phoA启动子);在不活泼状态下不存在能检测到的基本表达(basal expression)。不需要加入其它化学物品将其激活，在活化状态表达率很高。合成的蛋白质大量分泌到外周胞粒空间中。分泌的蛋白质正确折叠，其含有真正的N-末端和正确的二硫桥键。在E.coli W3110中表达的SDS凝胶分析表明30～50%的合成的IFNα被正确加工，这相当于所有被分泌的蛋白质。
使用实施例3所描述的提取方法，可以提取到生物物质中检测到的所有IFNα 2C的29.3±5.9%。这相当于操作水平的30～50%(这可被观察到)。基于蛋白质的总量自生物物质中提取的物质含有4.5±1.8%IFNα 2c。硅胶吸附层析形成IFNα 2c池，平均纯度为16.7±4.4%。苯基琼脂糖层析收率为93.3±7.3%，得到的IFNα 2c纯度是71.2±15.5%。磺丙基离子交换层析收率为70.9±14.8%，纯度为97.6±4.6%。最后一步，即DEAE离子交换层析，得到纯度100%的IFNα 2c，收率为86.9±9.2%(详细阐述见下文)。6种不同纯化方法的数据列于表1(产率)和表2(IFNα 2c含量)中。图3表明每一纯化步骤的层析特征。
从1Kg的生物物质中，得到340±100mg的纯化的IFNα2c。纯化过程的收率是56.1±22.2%。基于生物物质中IFNα2c的含量，总收率是14.4%。这些数据列于表3中。图4表明纯化的IFNα 2c的一个典型SDS-PAGE，在最后层析步骤中洗脱。IFNα2c的18kDa带是唯一可见的带。未观察到污染带。图5A表明一个典型的反相HPLC层析。纯化的IFNα2c在 24.8分钟作为一单峰洗脱。当这种物质用平缓的乙腈梯度(图5B)洗脱时，在主峰的两侧各观察到2个污染峰。这些含有IFNα2c总量1.8%左右的肩峰，表示蛋氨酸111被氧化的形式(第一个肩峰)或N-末端乙酰化的形式(第二个肩峰)。
表1以不同纯化步骤后所得的IFNα2的百分比表示不同纯化步骤的收率。表中显示的是6种不同生物物质的6种不同纯化过程(P1～P6)。最后两栏是平均值(M)和标准偏差(sd)。
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M Sd萃取物 37.9 24.0 34.3 30.7 29.1 20.0 29.3 5.9硅胶 62.0 95.8 88.2 99.5 74.1 81.0 83.4 12.8苯基 100.0 82.2 85.9 100.0 100.0 91.0 93.2 7.3磺丙基 64.0 54.3 76.5 100.0 60.0 71.0 70.9 14.8DEAE 95.0 100.0 83.5 88.2 84.0 71.0 86.9 9.2表2:不同纯化步骤的IFNα2的含量。如同表1,这些数据是以基于在该纯化步骤中得到的蛋白质总含量的IFNα2含量的百分比来表示。
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M Sd萃取物 8.0 2.1 4.1 4.7 3.6 4.4 4.5 1.8硅胶 12.9 11.6 15.7 15.7 19.4 15.6 16.7 4.4苯基 76.6 43.3 62.9 62.9 80.0 93.5 71.2 15.5磺丙基 98.5 87.3 100.0 100.0 100.0 100.0 97.6 4.6DEAE 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 100.0 0.0表3纯化过程的总收率。生物物质中IFNα2c的含量以每千克生物物质中IFNα2的克数(g)表示。加工和萃取以IFNα2总量的百分比表示。纯化的收率以IFNα2c相对于萃取物的IFNα2含量的百分比表示。总收率以每千克(kg)生物物质中获得的IFNα2的毫克数(mg)表示并基于萃取物的IFNα2c含量，以纯化后的IFNα2c的百分比表示。
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M Sd生物物质 1.4 1.0 1.1 1.5 1.1 1.8 1.3 0.2[g/kg]加工[%] 50 40 40 40 20 40 38.3 8.9萃取[%] 37.9 24.0 34.3 30.7 29.1 20.0 29.3 4.7纯化[%] 39.7 42.7 57.9 90 44.5 52.3 56.1 22.2总产率[mg] 538 206 366 480 280 258 340 120总产率[%] 14.3 20.3 16.6 23.9 10.9 7.4 14.4 6.9
图1ApCF2的基因图。pAT153的EcoRI-BamHI片段被IFN-ω1表达盒代替。
图1BEcoRI(被损坏的)-BamHI部分的序列，其包含phoA-启动子，STII先导子+IFNω1基因。
图2A质粒pDH13的基因图。pAT153的SspI-PstI片段被IFNα2c表达盒(2B的EcoRI-PstI片段)代替。β-内酰胺酶基因被损坏。
图2B插入pDH13的EcoRI-HindⅢ的核酸序列。
图3A至图3D从生物物质提取的IFNα2c的层析纯化。
图3A硅胶吸附层析。箭头指明用800mM氯化四甲基铵洗脱。
图3B苯基琼脂糖疏水相互作用层析。用0～100%的线性梯度的溶剂B洗脱，如虚线(----)所示。
图3C磺丙基阳离子交换层析。用0～100%梯度的溶剂B进行洗脱，如虚线所示。
图3DDEAE琼脂糖阴离子交换层析。用0～100%梯度的溶剂B洗脱，如虚线所示。
在图3A至图3D的每一层析图主峰下面的横线表明含有IFNα2的池，IFNα2被收集并用于后续步骤。
图4纯化的IFNα2c的SDS-PAGE(用考马斯亮蓝染色)。左边的数字表示标准蛋白质的分子量。
痕迹1标准IFNα2c，痕迹23μg IFNα2c，痕迹36μg IFNα2c，痕迹M分子量标准。
图5A和图5B用反相HPLC纯化的IFNα2c的特征。
图5A在24分钟内，用20～68%的线性梯度溶剂B洗脱IFNα2c。
图5B在30分钟内，用45～53%的线性梯度溶剂B洗脱IFNα2c。
实施例1表达载体pDH13的制备及细胞的转化一般方法按Sambrook等描述的方法(1989)进行下列标准操作用限制性核酸内切酶对DNA限制性消化，填充反应，苯酚提取及DNA沉淀，琼脂糖凝胶电泳及从琼脂糖凝胶洗脱DNA，DNA分子的连接，细菌的转化及从细菌分离质粒。
质粒pCF2 pCF2是从质粒pAT153制备的(Twigg等，1980)。它包含来自E.coli的碱性磷酸酯酶的启动子(phoA，Chang等，1986;Schuttleworth等，1986)，及STII先导肽的编码区(Picken等，1983;Lee等，1983)和人体基因IFNω1(Hauptmann等，1985)。图1A和图1B表示pCF2的基因图和相关部分的序列。
pER21/1 pER21/1是用于IFNα2c的一种细菌表达载体(European Patent Specification 0 115613)。
低聚糖(5′→3′)EBI-2787: CGTCTTCAAGAATTCGAGATTATCGEBI-2799: GGCAGATCACATGCATAGGCATTTGTAGCAATAGEBI-2798: ATGCCTATGCATGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCEBI-2797: GACTTCAGAAGCTTCTGCAGTTACGATCGATCGTTATCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC在一个二步PCR中，通过phoA启动子、IFNα2c序列及STII先导序列进行表达盒的制备pER21/1DNA用HindⅢ进行线性化，pCF2-DNA用PvuI线性化。所用方法在下文称为SOE-PCR(“Splicing by overlap extension(通过重叠延伸进行拼接)”，Ho等，1989)。
PCR1a(IFNα2c基因的放大)100ng线性化的pER21/1 DNA，25pmol(EBI-2797和25pmol EBI-2798在50μl的缓冲液中用Perkin Elmer Cetus热循环仪TC-1进行热循环，该缓冲液包括50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，1.5mM MgCl2，0.01%明胶，0.2mM dATP，0.2mM dGTP，0.2mM dGTP，0.2mM dTTP和1.25单位的Taq聚合酶。94℃下培养3分钟后，进行10次循环(第1阶段在94℃下40秒，第2阶段在55℃下30秒，第3阶段在72℃下90秒)。
PCR1b(phoA启动子放大后加上STII先导序列)100ng的线性化的pCF2-DNA，25pmol EBI2787和25 pmol EBI2799按PCR1a项下所描述的相同的缓冲液及相同条件下，进行热循环。
所得到的PCR1a(540bp)和PCR1b(374bp)的DNA片段用凝胶纯化(在TBE缓冲液中，1.2%低凝胶型琼脂糖，1XTBE10.8g Tris/1，5.5g硼酸/1，0.93g EDTA/1)。含有该DNA片段的琼脂糖段被切下，通过加入100μl的H2O并加热至70℃将琼脂糖熔化。
PCR2将琼脂糖/DNA溶液各5ml混合，并在100μl含有50pmol的EBI-2787和EBI-2797的溶液中进行热循环。缓冲液与PCR1a项下的相同。热循环装置受程序控制，以便在94℃下5分钟的延迟期后接20个循环(第一步在94℃下40秒，第二步在55℃下30秒，第三步在72℃下5分钟;第三步在每一新的循环中延长5秒钟)。放大的DNA通过苯酚/氯仿抽提及乙醇沉淀进行纯化。将该PCR产物溶解并在相应的缓冲液中用HindⅢ和EcoRI剪切。
PCR产物(pDH9)的克隆Bluescribe M13+(Stratagene，圣地亚哥，CA，USA)用HindIII和EcoRI双剪切，大的片段用1.2%的琼脂糖凝胶进行凝胶纯化。10ng的Bluescribe M13+DNA和用EcoRI/HindⅢ剪切的50ng的PCR产物在10μl的溶液中连接，该溶液包含50mM Tris-HCl，pH7.6，10mM MgCl2，20mM二硫苏糖醇，1mM ATP，50μg/ml牛血清白蛋白(BSA)，及2个单位的T4-DNA-连接酶(NEN)，在0℃下进行1小时，室温下进行3小时。8μl的该溶液用于JM101菌株(E.coli K12，SupE，thi，△(lac-proAB)，[F′，traD36，proAB，lacIZ△M15])的感受态的E.coli细胞的转化。
选择一个克隆，分离出DNA，并将表达盒进行序列化。该序列与理论上期望的序列严格一致(图2A和B)，质粒指定为pDH9。表达质粒pDH13的构建pAT153用SspI和PstI双剪切，分离出大的片段。pDH9用EcoRI剪切，末端用DNA聚合酶1的Klenow片段和4dNTPs填充，线形pDH9-DNA经苯酚抽提和沉淀后，该DNA用PstI剪切，含有phoA启动子的片段、STII先导序列及IFNα 2c基因从1%琼脂糖凝胶分离。
10ng的pAT153×SspI×PstI和30ng的含有表达盒的片段在10μl溶液中连接，室温下进行5小时。5μl的该混合物用于使菌株HB101的感受态的E.coli菌转化，转化的菌体的选择在含用10μg/ml四环素的LB琼脂板上进行(10g胰蛋白胨/1，5g酵母抽提物/1，5g NaCl/1，15g适于菌体生长的琼脂/1。pDH13的基因图和相关区域的序列示于图2A和B中。
从如此制得的各种克隆中分离质粒DNA，并通过限制分析确认其正确组成。选择出一种质粒并指定为pDH13。质粒pDH13用于转化E.coli W3110(E.coli K12野生型，f，r，IN(rrnD-rrnE)1)。
实施例2发酵初级培养从储存的培养物中取出700ml含有5mg/1四环素的高压灭菌后的LB培养基(10g适于菌体生长的胰蛋白胨/1，5g适于菌体生长的酵母抽提物/1，10g NaCl/1，pH7.0)在2升玻璃容器中培养，以得到OD546为0.01。培养物在37℃下培养10小时，伴随剧烈搅拌(800rpm)及通气(每分钟5个发酵罐体积[vvm])主培养培养基的组成在发酵罐中1.21g/l(NH4)2HPO43.96g/l(NH4)2SO46.53g/l K2HPO41.23g/l MgSO4×7H20.32g/l NaCl0.25g/l NH4Cl1.0g/l 柠檬酸三钠×2H21.0ml/l 痕量元素浓缩物12.5g/l 葡萄糖20mg/l 盐酸硫胺50mg/l L-色氨酸100mg/l L-亮氨酸50mg/l L-蛋氨酸5mg/l 四环素痕量元素浓缩物(每100ml的量)3.35g FeCl3×6H21.09g ZnSO4×7H20.267g CoCl2×6H20.267g Na2MoO4×2H2O
0.221g CuSO4×5H20.333g H3BO31.37g MnSO4×H210ml浓HCl加水至100ml在发酵过程中的补料(基于发酵罐体积的量)350g/l 葡萄糖3.70g/l MgSO4×7H2175mg/l 盐酸硫胺0.50g/l L-色氨酸4.0g/l L-亮氨酸2.0g/l L-蛋氨酸发酵过程中消泡剂的计量加入(基于发酵罐的体积)1.0mg/l UCON LB625盐类((NH4)2PO4、(NH4)2SO4、K2HPO4、NaCl、NH4Cl及柠檬酸钠)在发酵罐中灭菌。冷却后，无菌操作加入痕量元素、MgSO4、葡萄糖、硫胺、L-色氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸及四环素，得到7升起始体积。600ml的基础培养物被自动接种至发酵罐。发酵条件是搅拌速率为1000rpm，通气1vvm，罐压为0.3巴，温度为37.0±0.1℃，pH值用NH3和H2SO4保持在6.7±0.1。必要时溶解氧的浓度可通过通入富氧空气(在罐压为0.3巴时)使之保持在15%空气饱和度以上。当起始存在的葡萄糖消耗完后，开始补料过程，该过程通过氧浓度和所含的葡萄糖、硫胺、MgSO4、L-色氨酸、L-亮氨酸及L-蛋氨酸来自动引发。补料速率开始为2.5g/l/h，随后在24小时内连续增至5.0g/l/h，并保持稳定至发酵过程结束。
当350g/l总量的葡萄糖全部被加入后，发酵终止。此时在546nm具有250至280的特征光密度。
为了使生物物质失活，混合物冷至约10℃，同时，pH用H2SO4调至2.0，通过离心分离出生物物质并于-70℃冷藏。
实施例3萃取酸-失活生物物质(约0.5kg)用Polytron匀浆机使之混悬于500ml的1%醋酸中，该混合物在0℃搅拌1小时。加入聚乙烯亚胺(50%储备溶液，Serva，Heidelberg)至最终浓度为0.25%(w/v)。用5N NaOH将混悬液pH值调至10.0，在0℃再搅拌2小时。用5N HCl将pH值调至7.5后，通过离心17000×g(Beckmann J2-21离心机)分离出菌体。平均萃取收率达IFNα2c总量的29.3±5.9%。
实施例4层析纯化硅胶吸附层析将实施例3中的菌体微粒除去后，将含有IFNα的上清液上硅胶柱(Grace，硅胶型号953W;每ml柱材料含35mg蛋白，流速25ml/min)，该硅胶柱已用pH7.5的20mM Tris-HCl饱和。该柱用30倍柱体积的起始缓冲液冲洗，随后再用20mM Tris-HCl，100mM的氯化四甲基铵(TMAC)，pH7.5冲洗。通过增加TMAC的浓度至800mM TMAC洗脱下IFNα2c(图3A)。
疏水相互作用层析从硅胶柱洗脱出的物质通过加入固体(NH4)2SO4将硫酸铵浓度调至20%(w/v)，随后上苯基琼脂糖柱(苯基toyopearl，650S，Tosohaas)，该柱预先用20mM Tris-HCl，30%硫酸胺饱和。IFNα2c用从100%上样条件至100%的20mM Tris-HCl，30%乙二醇，pH7.5的线性梯度洗脱，流速为15ml/min，IFNα2c池的纯度是71±15%。阳离子交换层析疏水相互作用层析的洗脱物通过全面透析至20mM琥珀酸钠，pH5.0。在样品上磺丙基离子交换树脂前，最终pH用HCl调至3.0，该树脂(Toyopearl TSK SP 5PW，Tosohaas)预先用20mM琥珀酸钠，pH5.0饱和。IFNα2c用从100%的上样条件至100%的20mM琥珀酸钠，500mM NaCl，10%乙二醇，pH5.5(溶剂B)的线性梯度洗脱，流速为6ml/分。从该柱洗脱出的IFNα 2c通常具有高于95%的纯度。
阴离子交换层析IFNα池用10mM bisTris，pH5.8透析，然后上DEAE琼脂糖柱(DEAE琼脂糖，FastFlow，Pharmacia)，该柱预先用相同的缓冲液饱和。用10mM bisTris，500mM NaCl，0.1%吐温20，pH5.8(溶剂B)的线性梯度洗脱IFNα2c，流速为5ml/分。
实施例5IFNα2c制备物的分析反相HPLC原IFNα2c在30℃用Baker Bond-WP-C18柱[250×4.5mm，颗粒大小5μm]进行分析。使用Merck Supersphere 120-4 C-18柱[125×4.5mm，颗粒大小4μm]在37℃分离胰蛋白肽。样品用溶剂A，即0.1%的三氟醋酸水溶液和溶剂B即0.1%的三氟醋酸乙腈溶液及图中相关部分所述的梯度进行层析。
SDS-聚酰胺凝胶电泳IFNα2c样品在标准条件下在16%SDS聚酰胺凝胶上分析。电泳前，样品用二硫苏糖醇还原。蛋白带用考马斯亮蓝染色可见。
用ELISA定量IFNα2c纯化过程中得到的各种样品的IFNα2c的浓度通过Sandwich ELISA使用单克隆抗体OMG-2和MG-7(Adolf等，1990)测定。
文献目录Adolf，G.R.，Virology175，410-417(1990)Bodo，G.&Maurer-Fogy，I.，inThe Biology of the Interferon System 1985(Hrsg Stewart.W.E.，Ⅱ& Schellekens.H.)，S 59-64，Elsevier Scientific Publishing Co.，Amsterdam(1985)Breitling R.，Gerlach D.，Hartmann M.，Behnke D.，Mol.Gen.Genet.217，384-391(1989)Chang C.N.，Kuang W.-J.and E.Y.Chen，Gene 44，121-125(1986)Dworkin-Rastl E.，Swetly P.，Dworkin M.B.，Gene 21，237-248(1983)Fuh G.，Mulkerrin M.G.，Bass S.，McFarland M.，Brochier M.，Bourell J.H.，Light D.R.，Wells J.A.，J.Biol.Chem.265，3111-3115(1990)Goeddel D.V.，Yelverton E.，Ullrich A.，Heynecker H.L.，Miozarri G.，Holmes W.，Seeburg P.H.，Dull T.，May L.，Stebbing N.，Crea R.，Maeda S.，McCandliss R.，Sloma A.，Tabor J.M.，Gross M.，Familletti P.C.，Pestka S.，Nature 287，411-416(1980)Goeddel D.V.，Leung D.W.，Dull T.J.，Gross M.，Lawn R.M.，McCandliss R.，SeeburgP.H.，Ullrich A.，Yelverton E.，Gray P.，Nature 290，20-26(1981)Hauptmann R.and P.Swetly，Nucl.Acids Res.13，4739-4749(1985)Ho S.N.，Hunt S.N.，Horton R.M，Pullen J.K.and L.R.Pease，Gene 77，51-59(1989)Lee C.H.，Mosely S.L.，Moon H.W.，Whipp S.C.，Gyles C.L.and M.So，Infection and Immunity 42，264-268(1983)Mantei N.，Schwarzstein M.，Streuli M.，Panem S.，Nagata S.，Weissmann C.，Gene 10，1-10(1980)Picken R.N.，Mazaitis A.J.，Maas W.K.，Rey M.and H.Heyneker，Infection and Immunity 42，269-275(1983)Sambrook J.，Fritsch E.F.，Maniatis T.，"Molecular cloning-a laboratory manual"，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor(1989)Shuttleworth M.，Taylor J.and N.Minton，Nucl Acids Res 14，8689(1986)Streuli M.，Nagata S，Weissmann C.，Sciencc 209，1343-1347(1980)Thatcher D.R.，Panayotatos N.，Methods Enzymol 119，166-177(1986)Twigg A.J and D Sherratt，Nature 283，216-218(1980)
权利要求
1.通过在E.coli中表达制备α-干扰素的方法，其特征在于a)α-干扰素在含有载体的细胞中被表达，载体中E.coli的热稳定肠毒素II(STII)的基因的信号序列与为成人α-干扰素编码的序列相连接；b)分离被表达的α-干扰素。
2.权利要求1的方法，其特征在于该载体还包含来自E.coli的碱性磷酸酯酶(phoA)启动子。
3.权利要求1至2的方法，其特征在于该载体还包括STII基因的核蛋白体连接位点的序列。
4.权利要求1至3的方法，其特征在于该干扰素的分离包括下述步骤a)硅胶吸附层析;b)疏水相互作用层析;c)阳离子交换层析;d)阴离子交换层析。
5.权利要求4的方法，其特征在于疏水相互作用层析在苯基琼脂糖凝胶上进行。
6.权利要求4的方法，其特征在于阳离子交换层析在磺丙基离子交换剂上进行。
7.权利要求4的方法，其特征在于阴离子交换层析在DEAE-琼脂糖凝胶上进行。
8.权利要求1至7的方法，其特征在于α-干扰素是干扰素-α2。
9.权利要求8的方法，其特征在于干扰素-α2包含如下氨基酸序列Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg ThrLeu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe SerCys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu GluPhe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val LeuHis Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr LysAsp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys PheTyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala CysVal Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met LysGlu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg IleThr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala TrpGlu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu SerThr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
10.纯化α-干扰素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤a)硅胶吸附层析;b)疏水相互作用层析;c)阳离子交换层析;d)阴离子交换层析。
11.权利要求10的方法，其特征在于该疏水相互作用层析是在苯基琼脂糖凝胶上进行。
12.权利要求10的方法，其特征在于该阳离子交换层析是在磺丙基离子交换剂上进行。
13.权利要求10的方法，其特征在于该阴离子交换层析在DEAE-琼脂糖凝胶上进行。
14.权利要求10至13的方法，其特征在于该α-干扰素是细菌表达的。
15.权利要求10至14的方法，其特征在于该α-干扰素是α2-干扰素。
16.权利要求15的方法，其特征在于该α2-干扰素包含如下氨基酸序列Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Ser Arg Arg ThrLeu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe SerCys Leu Lys Asp Arg Arg Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu GluPhe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val LeuHis Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr LysAsp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys PheTyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala CysVal Ile Gln Gly Val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met LysGlu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg IleThr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala TrpGlu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu SerThr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
17.用于在E.coli中表达α-干扰素的载体，其特征在于该载体包含与为成人α-干扰素编码的序列相连的STII基因的信号序列。
18.权利要求17的载体，其特征在于该载体还含有phoA启动子。
19.权利要求17至18的载体，其特征在于该载体还含有STII基因的核蛋白体结合位点。
20.权利要求17至19的载体，其特征在于该干扰素-α是干扰素-α2。
21.权利要求17至19的载体，其特征在于它含有如下的核苷酸序列TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACCTTG ATG CTC CTG GCA CAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCCTGC TTG AAG GAC AGA CGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAGTTT GGC AAC CAG TTC CAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTCCAT GAG ATG ATC CAG CAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAGGAC TCA TCT GCT GCT TGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTCTAC ACT GAA CTC TAC CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGTGTG ATA CAG GGG GTG GGG GTG ACA GAG ACT CCC CTG ATG AAGGAG GAC TCC ATT CTG GCT GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATCACT CTC TAT CTG AAA GAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGGGAG GTT GTC AGA GCA GAA ATC ATG AGA TCT TTT TCT TTG TCAACA AAC TTG CAA GAA AGT TTA AGA AGT AAG GAA或是与该序列具有70%以上同源的序列，且用于干扰素-α的编码。
22.权利要求21的载体，其特征在于该载体含有如下的核苷酸序列GAATTCGAGATTATCGTCACTGCAATGCTTCGCAATATGGCGCAAAATGACCAACAGCGGTTGATTGATCAGGTAGAGGGGGCGCTGTACGAGGTAAAGCCCGATGCCAGCATTCCTGACGACGATACGGAGCTGCTGCGCGATTACGTAAAGAAGTTATTGAAGCATCCTCGTCAGTAAAAAGTTAATCTTTTCAACAGCTGTCATAAAGTTGTCACGGCCGAGACTTATAGTCGCTTTGTTTTTATTTTTTAATGTATTTGCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTTATG AAA AAG AAT ATC GCA TTT CTT CTT GCA TCT ATG TTC GTTTTT TCT ATT GCT ACA AAT GCC TAT GCA TGT GAT CTG CCT CAAACC CAC AGC CTG GGT AGC AGG AGG ACC TTG ATG CTC CTG GCACAG ATG AGG AGA ATC TCT CTT TTC TCC TGC TTG AAG GAC AGACGT GAC TTT GGA TTT CCC CAG GAG GAG TTT GGC AAC CAG TTCCAA AAG GCT GAA ACC ATC CCT GTC CTC CAT GAG ATG ATC CAGCAG ATC TTC AAT CTC TTC AGC ACA AAG GAC TCA TCT GCT GCTTGG GAT GAG ACC CTC CTA GAC AAA TTC TAC ACT GAA CTC TACCAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT GTG ATA CAG GGG GTGGGG GTG ACA GAG ACT CCC CTG ATG AAG GAG GAC TCC ATT CTGGCT GTG AGG AAA TAC TTC CAA AGA ATC ACT CTC TAT CTG AAAGAG AAG AAA TAC AGC CCT TGT GCC TGG GAG GTT GTC AGA GCAGAA ATC ATG AGA TCT TTT TCT TTG TCA ACA AAC TTG CAA GAAAGT TTA AGA AGT AAG GAA TGATAACGATCGTAACTGCA
23.应用权利要求17至22之一的载体于制备干扰素-α。
全文摘要
本发明涉及制备重组IFN-α的一个新方法。表达在PhoA起动子控制下在E.Coli中进行。通过使IFN-α基因和STII信号序列连接，使蛋白质分泌到外周胞粒空间且得到正确加工的N-末端。并通过以下方法进行蛋白质纯化，即硅胶吸附层析法、疏水交换层析法、阳离子和阴离子交换层析法。
文档编号C12N15/70GK1099799SQ94105930
公开日1995年3月8日 申请日期1994年5月26日 优先权日1993年5月26日
发明者鲁道夫·豪普特曼, 埃德加·福克纳, 格哈特·博多, 蒂尔曼·沃斯, 莫格里德·莫勒-福吉 申请人:贝林格尔-英格海姆国际有限公司