专利名称：生产维生素b的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产维生素B12的方法。维生素B12已广泛用作药剂来治疗恶性贫血、神经疾病、甲基丙二酸尿等以及用作家禽和/或家畜的饲料添加剂。
由于维生素B12的结构复杂，所以通过化学合成法来进行工业生产是很困难的。微生物发酵法已经用于其生产中。
据报道，维生素B12通过属于下列各属的微生物来生产，所述的微生物属是链霉菌属、诺卡氏菌属、小单孢菌属、气杆菌属、土壤杆菌属、产碱杆菌属、固氮菌属、杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属、埃希氏杆菌属、黄杆菌属、分枝杆菌属、假单孢菌属、丙酸杆菌属、变形杆菌属、沙雷氏菌属、链球菌属、黄单孢菌属、精蛋白杆菌属、甲烷杆菌属(E.J.Vandamme，Biotechnology of Vitamins，Pigments and Growth Factors，Elsevier Science Publisher LTD，1989，261-263)、节细菌属(JP-A 52-94498)、克雷伯氏菌属(JP-A 50-132186)、红极毛杆菌属(JP-A 60-16597)、丁酸杆菌属(JP-A 62-44197)、假诺卡氏菌属(JP-A 55-96091)、Methanosarcina(JP-A 1-257490)、真细菌(JP-A 62-44172)、醋杆菌属(JP-A62-122593)等。此外，据报道，维生素B12由属于下列各属的微生物累积，所述微生物属是苜蓿根瘤细菌、菜豆根瘤细菌、大豆根瘤细菌、三叶草根瘤细菌和豌豆根瘤细菌(Plant Physiology，38，99-104(1963))。
上述属于根瘤菌属的微生物中，菜豆根瘤细菌和三叶草根瘤细菌已被重新命名为豌豆根瘤细菌(参见Institute for Fermentation Osaka，Japan，List of Cultures 1992Microorganisms，9th edition，p.169)。大豆根瘤细菌中的一部分已被重新命名为豌豆根瘤细菌，而其余部分已被重新分类到Bradyrhizobium japonicum中(参见Iustitute for Fermentation，Osaka，Japan，List of Cultures 1992 Micro-organisms，9th edition，P.169)。
然而，通常，微生物方法生产维生素B12的产率很低。此外，一些微生物可利用的碳源有限(同化甲醇的细菌等)，需要特殊的培养条件如无氧条件(丙酸杆菌、属于醋杆菌属的微生物、产甲烷细菌等)，由于其生长速度低而需要长期培养(产甲烷细菌、丙酸杆菌等)，因此，只可在有限的条件下用于工业生产。这样，就需要改进的生产维生素B12的工业方法。
本发明的主要目的是提供工业上可用的、经济的和有效的生产维生素B12的方法。
本发明的该目的以及其它目的和优点从下面的描述对本领域的技术人员将变得显而易见。
为了发展用已经普遍并广泛地用于发酵方法中的葡萄糖、蔗糖等作为碳源并用普遍并广泛地使用的发酵条件即通气和搅拌培养来生产维生素B12的有效发酵方法，本发明人已从日本兵库县的土壤中分离出一种新的具有高维生素B12生产能力的菌株产钴胺根瘤细菌(Rhizobium cobalaminogenum)27B74。进一步研究后，基于这样获得的发现，已经完成了本发明。
本发明提供了一种生产维生素B12的方法，其中包括在培养基中培养能产生维生素B12的属于产钴胺根瘤细菌的微生物来产生维生素B12，并回收所产生的维生素B12。
本发明还提供了能产生维生素B12的属于产钴胺根瘤细菌的微生物。
本发明还提供了微生物产钴胺根瘤细菌27B74(FERM BP-4429)。
本发明所用的术语“维生素B12”包括所有类型的维生素B12如辅酶型维生素B12(腺苷钴胺、甲基钴胺(甲基型钴胺))、氰基型维生素B12(氰钴胺)和羟基型维生素B12(羟钴胺)。
从土壤中分离的、具有优良的产生维生素B12的能力的产钴胺根瘤细菌27B74(IFO 15543，FERM BP-4429)的形态特征、在各种培养基中的生长以及生理特征如下。
(A)形态特征(在肉汤琼脂培养基中于28℃生长24小时的情况下)1.细胞形状杆状2.细胞大小0.5-0.8μm×1-2.8μm3.孢子无4.游动性可观察到(在肉汤液体培养基中于28℃生长16小时后观察)5.革兰氏染色阴性6.抗酸性无(B)在各种培养基中的生长1.肉汤琼脂平皿培养基(在28℃生长48小时的情况下)形状环状突起中部隆起光泽无边缘完整色调米色粘性无分散性色素无
2.肉汤液体培养基(在28℃生长24小时的情况下)生长伴随着浑浊化液体表面膜状的，无环形成沉淀可观察到色调米色3.肉汤琼脂斜面培养基生长粘性色调米色光泽可观察到分散性色素无4.石蕊牛乳培养基(在28℃生长24-96小时的情况下)反应不变化产气 无(C)生理特征硝酸盐的还原+脱氮作用-VP试验-吲哚形成-MR试验-脲酶+氧化酶+过氧化氢酶+柠檬酸的利用(Koser-Christensen培养基)+水解淀粉-酪蛋白-
DNA-Tween 80-色素的形成-脱羧试验赖氨酸-精氨酸-鸟氨酸-无机氮的利用铵盐+硝酸盐+3-酮乳酸的形成-对氧的反应需氧O-F试验氧化生长pH值最佳 6.0-8.0最大 11.0最小 3.5生长温度最佳28-35℃最大41.0℃最小10.0℃(D)各种糖的利用L-阿拉伯糖-D-木糖-D-葡萄糖+D-甘露糖+D-果糖-
D-半乳糖+麦芽糖+蔗糖+乳糖+海藻糖+D-山梨糖醇+D-甘露糖醇+肌醇+甘油+淀粉-阿东糖醇+纤维二糖+L-鼠李糖+卫矛醇+L-山梨糖-氯化胆碱+D-甘露糖醇+D-甘露糖+在培养14天后没有观察到由上述糖产气或产酸。
上述特征是基于Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology，1st ed.(1984)中的描述分类的。结果发现这些细菌属于根瘤菌属细菌。测定细菌DNA中GC含量，发现为63.4%。醌化合物的提取和分析表明，所有这些细菌具有辅酶Q-10。脂肪酸组成的分析表明，细菌细胞作为羟基脂肪酸含有3-羟基脂肪酸14∶0、16∶0和18∶0(碳原子数目∶双键数目)，其比率为66∶17∶7。此外，所述细胞含有直链脂肪酸16∶0、18∶0和18∶1，其中18∶1含量最多。已经知道，许多属于根瘤菌属的微生物具有上述的细菌细胞脂肪酸组成。然而，上述经过特征鉴定的菌株具有与属于根瘤菌属的已知微生物的特征不同的特征，即该经过特征鉴定的菌株不含有直链脂肪酸21∶1或19∶0，观察不到从L-阿拉伯糖产酸。按照Ezaki等人的方法(Ezaki et al.，International Journal of Systematic Bacteriology，39，224-229(1989))，分析DNA同源性，并与根瘤菌属的已知原种菌株进行比较。结果见下面表。
表4菌株与27B74菌株的同源性Rhizobium fredii IFO 147806.7Rhizobium galegae IFO 1496517.8Rhizobium huakuii IFO 152437.9豌豆根瘤细菌 IFO 1478427.7Rhizobium loti IFO 133365.9苜蓿根瘤细菌 IFO 1478216.4Rhizobium tropici IFO 1524711.827B74菌株与这些菌株中的任何菌株都没有相同物种间的同源性。因此，结论是，该菌株是一种属于根瘤菌属的新菌株，该物种被命名为cobalaminogenum。IFO编号是Institute for Fermentation，Osaka(IFO，2-17-8，Juso-honmach，Yodogawa-ku，Osaka-shi，Osaka-fu，Japan)的保藏号，而FERMBP编号是National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Science and Technology(FRI，1-3，Higashi 1 chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)的按照布达佩斯条约的规定给出的保藏号。
产钴胺根瘤细菌27B74以保藏IFO 15543于1993年9月2日保藏在IFO，并以保藏号FERMBP 4429于1993年9月29日保藏在FRI。
这样得到的产生维生素B12的细菌可以按照与培养普通微生物的方式相似的方式进行培养。即，所用的培养基含有碳源、氮源、无机物、金属盐、酵母提取物、酵母细胞、核糖核酸，必要时还含有营养源如各种氨基酸和各种维生素。碳源的实例包括碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖醇、淀粉、糖化的淀粉溶液和糖浆;各种有机酸如丙酮酸、富马酸、苹果酸和琥珀酸;醇类如乙醇和甲醇;以及胺类如三甲铵内酯类、胆碱类和单乙醇胺。氮源的实例包括有机氮源如胨、玉米浸液、大豆粉和脲;以及无机氮源如硫酸、硝酸、碳酸等的铵盐，氨气和氨水。这些碳源和氮源可以单独使用或作为混合物使用。从下列物质中可以适当地选择其它营养源，所述物质是酵母提取物、酵母细胞、核糖核酸、无机盐(如钙盐、镁盐、钾盐、磷酸盐等)、氨基酸和维生素，它们可以单独使用或结合使用。此外，如果必要，可以加入防沫剂如硅油、表面活性剂如聚二醇醚等。此外，培养基优选含有钴化合物或5，6-二甲基苯并咪唑类化合物。这些化合物在培养基中产生高产量的维生素B12。可以使用任何钴化合物，只要它们是钴源或钴前体。钴化合物的实例包括卤化钴类(如氯化钴、溴化钴等)、硝酸钴、硫化钴、乙酸钴、硫酸钴铵、碳酸钴、4-环已基丁酸钴、2-乙基已酸钴、氢氧化钴、磷酸钴、氧化钴和硫氰酸钴。可以使用任何5，6-二甲基苯并咪唑类化合物，只要它们是5，6-二甲基苯并咪唑源或其前体。5，6-二甲基苯并咪唑类化合物的实例包括5，6-二甲基苯并咪唑、烟酰胺、烟酸腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NaAD)、烟酸单核苷酸(NaMN)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和烟酸。
培养通常在通气条件下进行，例如通过振荡培养、通气和搅拌深层培养等来进行。培养基的pH值优选在大约4-9的范围内。当在培养期间观察到pH值变化时，可以适当地加入酸(如硫酸、盐酸、乙酸等)、碱(如碳酸钙、氢氧化钠、氨气、氨水等)以维持优选的pH值范围。适合于所用微生物生长和维生素B12累积的培养温度通常选自大约20-45℃。培养继续到累积了基本上最大量的维生素B12。通常，培养大约2-10天足以达到此目的。
像其它细菌一样，属于产钴胺根瘤细菌的产维生素B12细菌可以通过紫外光、辐射等的照射、单细胞分离、各种诱变处理等以常规方式进行诱变。鉴于其分类性状与原始细菌的性状比较的结果，这样得到的突变株和天然存在的突变株不需要分类成不同的群体。能产生维生素B12的任何这些微生物都可用于本发明中。
这样得到的维生素B12及其各组分可以通过已知的常规分离和纯化手段，如用苯酚、丁醇等的溶剂萃取、沉淀法、用离子交换树脂、硅胶、活性炭等的层析方法，从培养液中分离并收集(J.Florent and L.Ninet，Vitamin B12Microbial Technology，edited by H.J.Peppler and D.Perlman，Academic Press，N.Y.，p.497-519(1979))。
例如，将培养液离心，得到细菌细胞。用无机酸(如盐酸、硫酸等)或有机酸(如乙酸、酒石酸等)将pH值调至大约5.0。然后，加入氰离子。接着加热，得到氰型维生素B12，然后提取到水相中。为了得到甲基型或辅酶型维生素B12，在暗处通过常规方法用醇类(如乙醇、丙醇等)、酮类(如丙酮、甲乙酮等)从细菌细胞中提取。从细菌细胞中提取维生素B12最好是通过按常规方法任意地将细菌细胞破碎来进行。
根据本发明，可以经济有效地生产维生素B12。
下列实施例进一步详细地具体说明本发明，但不构成对本发明范围的限制。实施例中的所有百分率(%)和比率都是按体积计的，除非另有说明。
实施例1将含1%(重量)蔗糖的肉汤液体培养基(5ml)分装到带棉塞的各试管中，加热灭菌。用一铂环量的在肉汤琼脂培养基中预先于30℃生长了3天的产钴胺根瘤细菌27B74(IFO15543，FERM BP-4429)接种后，于30℃振荡培养24小时。将具有表5中的组成的培养基(20ml)置于200ml培养瓶中，加热灭菌，用上述培养物(1.0ml)接种，在转速为230rpm的旋转震荡器上于30℃培养6天。
将按与上述相似的方法得到的培养液(1升)离心，收集细菌细胞，将所得细胞悬浮在乙酸缓冲液中，将悬浮液的pH值调至5.0。向其中加入KCN至最终KCN浓度为100μg/ml，然后将混合物在100℃加热15分钟。冷却后，离心除去产生的沉淀，得到维生素B12提取液。通过高效液相色谱(HPLC)测定溶液中的维生素B12，高效液相色谱是以ODP-50，4.6×150mm(由Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.，Japan制造)作为柱，用40mM乙酸铵∶乙腈＝88∶12从柱上洗脱维生素B12，通过测定361nm处的吸光度来测定流出液中的维生素B12含量。结果表明在上述培养液中形成了22μg/ml维生素B12。
然后，将上述维生素B12提取液用活性炭柱处理，吸附维生素B12。用蒸馏水洗柱后，用40%丙酮洗脱被吸附的物质。收集含维生素B12的各部分流出液，减压浓缩，用Dowex(商品名)50柱层析。用水洗柱后，用50mM乙酸钠缓冲液(pH6.5)洗脱被吸附的物质，收集含维生素B12的各部分，中和，然后再次进行活性碳柱层析。用蒸馏水洗柱后，用40%丙酮洗脱被吸附的物质，收集含维生素B12的各部分，减压浓缩。向残留物中加入丙酮对维生素B12进行结晶，得到维生素B12(氰型)的晶体(16.5mg)。
表5蔗糖30.0gKH2PO40.2g玉米浸液30.0gMgSO4·7H2O 0.2g氯化胆碱10.0g5,6-二甲基苯并咪唑0.025gCoCl2·6H2O 0.1g自来水1升pH7.0实施例2为了获得各辅酶型维生素B12，将实施例1中得到的培养液(1升)离心，得到细菌细胞，在暗处将乙醇(不含氰根离子)的浓度调至80%，并在80℃加热下提取细胞20分钟。减压下蒸发提取物中的乙醇，得到含水溶液。用Sep-Pack C 18(由Waters制造)将溶液脱盐，然后通过用Lichrospher RP 18(5×250mm)(由Merck生产)作为柱的高效液相色谱鉴定辅酶型维生素B12。用85mM磷酸(pH3.0)和乙腈通过梯度方法进行洗脱。乙腈的浓度变化范围为0%(洗脱开始时)～50%(洗脱开始后25分钟)。通过测量361nm处的吸光度来测定流出液中辅酶型维生素B12的含量。结果表明，在上述培养液中形成了腺苷钴胺(Ado-B12)(18μg/ml)、甲基钴胺(CH3-B12)(2.5μg/ml)和羟钴胺(OH-B12)(1.0μg/ml)。
比较例用属于根瘤菌属的典型细菌菌株生产维生素B12按照与实施例1所述相似的方法，将下列菌株在30℃培养6天。所述菌株是苜蓿根瘤细菌IFO 14782、Rhizobium galegae IFO 14965、Rhizobium huakuii IFO 15243、豌豆根瘤细菌IFO 13337、豌豆根瘤细菌IFO 14784、Rhizobium loti IFO 13336和Rhizobium tropici IFO15247。用实施例1中所述方法测定所得培养物的提取物中维生素B12的含量。结果列在表6中。
表6菌株 IFO号维生素B12(μg/ml)Rhizobium galegaeIFO 149650.03Rhizobium huakuiiIFO 152430.06豌豆根瘤细菌IFO 133370.7豌豆根瘤细菌IFO 147840.7Rhizobium lotiIFO 133360苜蓿根瘤细菌IFO 147820.01Rhizobium tropiciIFO 152470
权利要求
1.一种生产维生素B12的方法，该方法包括，在培养基中培养能产生维生素B12的属于产钴胺根瘤细菌的微生物来产生维生素B12，并回收产生的维生素B12。
2.根据权利要求1的方法，基中培养基含有钴化合物。
3.根据权利要求2的方法，其中钴化合物是卤化钴。
4.根据权利要求1的方法，其中培养基中含有5，6-二甲基苯并咪唑类化合物。
5.根据权利要求1的方法，其中产钴胺根瘤细菌是产钴胺根瘤细菌27B74(FERM BP-4429)。
6.能产生维生素B12的属于产钴胺根瘤细菌的微生物。
7.微生物产钴胺根瘤细菌27B74(FERM BP-4429)。
全文摘要
提供了一种经济的、有效的并且工业上有用的生产维生素B
文档编号C12P19/42GK1106018SQ9411621
公开日1995年8月2日 申请日期1994年10月6日 优先权日1993年10月6日
发明者朝日知, 矢野孝彦, 土居宗晴 申请人:武田药品工业株式会社