改进的维生素b12的生产方法

专利名称：改进的维生素b12的生产方法
技术领域：
本发明涉及改进的生产维生素B12的方法，其中利用至少一种赛罗血红素(siroheme)合成酶。
背景技术：
20世纪30年代，由于维生素B12对人体的作用，George Minot和William Murphy间接地发现维生素B12(Stryer，L.，1988，Biochemie[Biochemistry]，第4版，528-531页，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg，Berlin，New York)。1948年，第一次纯化和分离了维生素B12，1956年Dorothy Hodgkin阐明了它的复杂三维晶体结构(Hodgkin，D.C.等，1956，维生素B12的结构，Nature 176，325-328和Nature 178，64-70)。自然界中发现的维生素B12生物合成的终产物是5’-脱氧腺苷钴胺素(辅酶B12)和甲基钴胺素(MeCbl)，而定义的维生素B12表示氰钴胺素(CNCbl)，其构成了工业上主要生产和销售的形式。除了特别说明外，本发明中所有3种类似分子通一称作维生素B12。
100多年前(1884)，De Bary第一次描述了物种巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。尽管巨大芽孢杆菌一般被分类为土壤细菌，但是在多种其它栖息地诸如海水、沉积物、水稻、干肉、奶和蜂蜜中也可以检测到它。其常常伴随假单胞菌属(Pseudomonas)和放线菌纲(actinomycetes)存在。巨大芽孢杆菌类似它的近亲枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性细菌，其区别特征尤其在于相对显著的合乎其名称的2×5μm大小、大约38％G+C含量和非常显著的孢子形成能力。生长培养基中只要有非常少量的锰就足够该物种完成完整的孢子形成，这种能力仅可比拟一些嗜热细菌的孢子形成效率。由于它的大小和它的孢子形成和萌发非常有效的事实，对巨大芽孢杆菌中这些过程的分子基础已经进行了广泛的调查研究，结果现在已经描述了巨大芽孢杆菌中参与其孢子形成和萌发的150多种基因。对巨大芽孢杆菌进行的生理学调查研究(Priest，F.G.等，1988，芽孢杆菌属的数种分类，J.Gen.Microbiol.134，1847-1882)将这个物种分类为专性需氧性、形成孢子的细菌，其是脲酶阳性和伏波试验(Voges-Proskauer)阴性，并且不能还原硝酸盐。巨大芽孢杆菌最明显的特性之一是它能利用多种碳源。因此，它可以利用种类非常多的糖，并且，例如已经在玉米浆，肉类工业的废物中，甚至在石油化学废物中发现了它的存在。在极其广谱的碳源代谢能力方面，巨大芽孢杆菌完全等同于假单胞菌(Vary，P.S.，1994，Microbiology，40，1001-1013，巨大芽孢杆菌的黄金时间)。多种微生物诸如芽孢杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)或丙酸杆菌属(Propionibacterium)适用于生物技术生产维生素B12。

发明内容
本发明的目的是利用微生物进一步优化维生素B12的生物技术生产。
申请人通过改进的维生素B12生产方法达到该目的，该方法包括发酵含有微生物的培养物，其中所述微生物中与相应的内源性酶活性比较，至少参与赛罗血红素合成的尿卟啉原III甲基转移酶和前咕啉-2(precorrin-2)脱氢酶的酶活性增加。
本发明同样涉及如下维生素B12的改进生产方法，该方法包括发酵含有微生物的培养物，其中所述微生物中与相应的内源性酶活性比较，至少参与赛罗血红素合成的尿卟啉原III甲基转移酶，赛罗氢绿素(sirohydrochlorin)铁螯合酶和前咕啉-2脱氢酶的酶活性增加。
本发明还涉及这样的维生素B12改进生产方法，该方法包括发酵含有微生物的培养物，其中所述微生物中与相应的内源性酶活性比较，至少参与赛罗血红素合成的尿卟啉原HI甲基转移酶和前咕啉-2脱氢酶和参与钴胺素合成的赛罗氢绿素钴螯合酶的酶活性增加。
发酵后，可以从发酵培养基回收已经形成的维生素B12。进行该回收的方法是标准实验室实践的一部分，这里不作任何进一步说明。
本发明的一个变通方案涉及这样的方法，其中与相应的内源性酶活性比较，至少如SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶和如SEQ IDNO.6中所示的前咕啉-2脱氢酶或它们的同工酶的酶活性增加。
另一个变通方案包括这样的方法，其中与相应的内源性酶活性比较，至少如SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶、如SEQ ID No.4中所示的赛罗氢绿素铁螯合酶和如SEQ ID No.6中所示的前咕啉-2脱氢酶或它们的同工酶的酶活性增加。
本发明还包括一种方法变体，其中与相应的内源性酶活性比较，至少如SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶、如SEQ ID NO.6中所示的前咕啉-2脱氢酶和赛罗氢绿素钴螯合酶(CbiX)或它们的同工酶的酶活性增加。
因此，本发明涉及改进的维生素B12生产方法的变体，包括发酵含有微生物的培养物，其中所述微生物中与相应的内源性酶活性比较，至少参与赛罗血红素合成的尿卟啉原III甲基转移酶(sirA)、前咕啉-2脱氢酶(sirC)和赛罗氢绿素铁螯合酶(sirB)的酶活性，和参与钴胺素合成的赛罗氢绿素钴螯合酶(cbiX)的酶活性单独地或相联合地增加。
“内源性酶活性”应理解为指由(天然存在的)细胞或生物体的结构(基本遗传元件)引起的活性，该活性并非由外部影响或外来供应所造成，即其是生物体被遗传操作前相应酶的活性水平。
“同工型”应理解为指具有相同或相似的底物和作用特异性，但具有不同的一级结构的酶。
本发明还涉及所述酶的修饰形式。
本发明所包括的“修饰形式”，应理解为指这样的酶，其序列中例如在多肽N末端和/或C末端或在保守氨基酸区域中存在改变，而该改变不损害酶的功能。可以利用本身已知的方法以氨基酸置换的形式进行这些改变。
本发明一个特定的实施方式包括本发明多肽的变异体，其与相应的原始蛋白质比较，活性由于例如，氨基酸置换而减弱或增加。这同样适用于细胞中本发明酶的稳定性，该酶例如，对于蛋白酶的分解更敏感或更不敏感。
在本发明的范围内，因此应理解“内源性酶活性”指微生物中赛罗血红素合成酶或钴胺素合成酶的天然活性。赛罗血红素从前体尿卟啉原III合成。本领域技术人员熟悉尿卟啉原III转化为赛罗血红素所需的反应步骤和参与这些步骤的生物催化剂。大体上，这些生物催化剂是具有下面活性的生物催化剂尿卟啉原III甲基转移酶、赛罗氢绿素铁螯合酶和前咕啉-2脱氢酶。对于向钴胺素(维生素B12)的转化，可提到的一种重要催化剂是具有赛罗氢绿素钴螯合酶活性的酶。在这方面，基因cbiX编码赛罗氢绿素钴螯合酶。
在野生型，即未基因修饰的巨大芽孢杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株中，内源性尿卟啉原III甲基转移酶、赛罗氢绿素铁螯合酶、前咕啉-2脱氢酶和赛罗氢绿素钴螯合酶活性十分的低以至于几乎不能检测到它们。
在粗细胞提取物中，尿卟啉原III甲基转移酶和前咕啉-2脱氢酶的活性分别是小于0.25单位/mg粗细胞提取物及大约0.002单位/mg粗细胞提取物，而螯合酶的活性大约是0.01单位/mg粗细胞提取物。在该方面，1单位分别相当于每小时产生1nM前咕啉-2，每分钟产生1nM赛罗氢绿素，以及在螯合酶情况下，相当于每分钟消耗(即，消失)1nM赛罗氢绿素。
通过比较，转化的菌株显示增加的活性(参见下文)。
在这方面，所有所述的酶在每种情况下都可以由一个基因编码，或者例如一个基因可以编码一个多功能基因产物，该多功能基因产物自身联合了上述2种酶或所有3种酶的活性或任何其它可能想到的组合。
在大量微生物中，编码参与赛罗血红素和钴胺素合成的酶的基因是已知的。这些基因和相应的基因产物的命名不同。因此，例如大肠杆菌(Escherichia coli)中多功能蛋白质赛罗血红素合酶催化赛罗血红素合成，该多功能蛋白质的基因命名为cysG。在酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，2种酶(尿卟啉原III甲基转移酶和脱氢酶/螯合酶)特异地参与赛罗血红素合成，它们的基因命名为met1和met8。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，对它而言，已知编码上述赛罗血红素合成酶的3种基因，即ylnD，ylnE和ylnF。
大量钴胺素合成酶也是已知的。例如，可以提到的是赛罗氢绿素螯合酶，其是位于赛罗血红素合成和钴胺素合成的分支点的酶。在沙门氏菌属(Salmonella)中，它被命名为CbiK或CbiL。在巨大芽孢杆菌中，其被称为CbiX(Raux，E.等，1998，Biochem.J.，335159-166)。
根据本发明，已知的赛罗血红素基因和它们编码的赛罗血红素合成酶，及本发明的核苷酸序列和它们编码的酶，和已知的钴胺素合成基因和它们编码的酶也适于用在本发明生产维生素B12的方法中。
本发明还涉及如SEQ ID No.1中所示的分离的核苷酸序列，其包含编码赛罗血红素合成酶的巨大芽孢杆菌sirABC操纵子。
本发明包括如SEQ ID No.1中所示编码完整sirABC操纵子的核苷酸序列，或者包括SEQ ID No.1中所示核苷酸序列的部分。“部分”应理解为意指SEQ ID No.1中所示序列的各编码区域，根据本发明，这些区域可以在每种情况下单独或以所有可以想到的联合形式，诸如sirA，sirB，sirC，sirAB，sirAC，sirBC或sirABC使用。在这方面，还可以想到与钴胺素合成酶基因，有利地与编码赛罗氢绿素螯合酶的基因(cbiX)或其部分进行所有可能的联合。
本发明的一种变化形式包括编码SEQ ID No.2中所示尿卟啉原III甲基转移酶(sirA)的如SEQ ID No.1中所示的分离核苷酸序列或它的等位基因，即核苷酸1到780位。同样地，本发明涉及编码SEQ ID No.4中所示赛罗氢绿素铁螯合酶(sirB)的如SEQ ID No.1或3中所示的分离的核苷酸序列或它的等位基因，即核苷酸761到1561位，此外本发明也涉及编码SEQ ID No.6中所示前咕啉-2脱氢酶(sirC)的如SEQ ID No.1，3或5中所示的分离的核苷酸序列或它的等位基因，即核苷酸1542到2150位。
本发明另一变化形式包括所述赛罗血红素合成基因与编码赛罗氢绿素螯合酶的cbiX基因的任何联合及相应等位基因的任何联合。
根据本发明，“分离的核酸或分离的核酸片段”应理解为意指由RNA或DNA组成的聚合物，其可以是单链或双链的，并且任选地，其可以包含天然的、化学合成的、修饰的或人工的核苷酸。在这方面，术语DNA聚合物还包括基因组DNA和cDNA或其混合物。
根据本发明，“等位基因”应理解为功能等同的核苷酸序列，即其基本具有相同的作用。功能等同的序列是尽管例如由于遗传密码的简并性而具有不同核苷酸序列，但是仍然具有期望功能的序列。因此，功能等同物包括这里所描述的序列的天然变异体，及例如通过化学合成方法获得的人工核苷酸序列，并且当适当时，该人工核苷酸序列可以适应于宿主生物体的密码子使用。此外，功能等同序列包括具有修饰的核苷酸序列的序列，该修饰的核苷酸序列可以例如赋予该酶对抑制剂的脱敏作用或抗性。
特别地，“功能等同”也应理解为意指继续显示期望功能的原始分离的序列的天然或人工突变体。突变包括一个或多个核苷酸残基的置换、添加、缺失、取代或插入。它们也包括这样的有义突变，该突变可以，例如在蛋白质水平引起保守性氨基酸置换，但是不会引起蛋白质活性的任何基本改变，因此该突变在功能性上是中性的。此外，也包括这样的核苷酸序列的改变，该改变在蛋白质水平上影响蛋白质N末端或C末端，但是不明显地损害蛋白质的功能。这些改变甚至可以对蛋白质的结构发挥稳定性影响。
此外，本发明还包括例如通过修饰核苷酸序列产生相应的衍生物而获得的核苷酸序列。这种修饰的目的可以是例如对其中存在的编码序列的进一步界定或者例如也可以是另外限制酶切割位点的插入。与原始基因或基因片段比较，功能被减弱或增强的那些变异体也是功能等同物。
此外，只要人工DNA序列表现上述期望的特性，本发明也涉及人工DNA序列。例如，可以通过反翻译利用计算机辅助程序(分子建模)产生的蛋白质或通过体外筛选的方法鉴定这些人工DNA序列。根据宿主生物体特异的密码子使用，通过反翻译多肽序列获得的编码DNA序列是特别适宜的。熟悉分子遗传学方法的本领域技术人员通过对待要转化的生物体的其它已知基因进行计算机分析，可以容易地确定具体的密码子使用。
根据本发明，“同源序列”应理解为与本发明核苷酸序列互补和/或与本发明核苷酸序列杂交的序列。在本发明的范围内，“杂交核苷酸序列”应理解为在标准杂交条件下结合本发明相应核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸。术语“标准杂交条件”作广义理解，并且意指严格杂交条件或不太严格的杂交条件。特别地，在Sambrook等(1989，分子克隆，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)中描述了这些条件。根据本发明，术语杂交序列包括来源于基本上相似的DNA或RNA的核苷酸序列，它们在本身已知的标准杂交条件下与本发明核苷酸序列发生特异性相互作用(结合)。杂交序列也包括长度是例如10到30，优选地12到15个核苷酸的短核苷酸序列。根据本发明，其尤其也包括引物或探针。
本发明也包括编码区(结构基因)之前(5’-或上游)和/或之后(3’-或下游)的序列区。具体地，这包括具有调节功能的序列区。它们可以对转录、RNA稳定或RNA加工和翻译发挥作用。调节序列的例子是如启动子、增强子、操纵基因、终止子或翻译放大器(translation amplifier)。
本发明还涉及上述类型的方法，在该方法中，编码赛罗血红素合成酶的基因sirA(SEQ ID No.1中所示核苷酸1到780位)和sirC(SEQ ID No.1，3或5中所示核苷酸1542到2150位)得以更强地表达和/或以增加的拷贝数存在。
在本发明方法优选的变化形式中，编码赛罗血红素合成酶的基因sirA(SEQ ID No.1中所示核苷酸1到780位)、sirB(SEQ ID No.1或3中所示核苷酸761到1561位)和sirC(SEQ ID No.1，3或5中所示核苷酸1542到2150位)得以更强地表达和/或以增加的拷贝数存在。
本发明特别有利的变化形式包括这样的方法，在该方法中，编码赛罗血红素合成酶的基因sirA(SEQ ID No.1中所示核苷酸1到780位)和sirC(SEQ ID No.1，3或5中所示核苷酸1542到2150位)及编码钴胺素合成酶的基因cbiX获得更强的表达和/或以增加的拷贝数存在。
优选地，通过发酵含有巨大芽孢杆菌的培养物实现上述变通方案。
本发明也涉及巨大芽孢杆菌sirABC操纵子或其部分编码的酶，即，SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶、SEQ ID No.4中所示的赛罗氢绿素铁螯合酶和SEQ ID No.6中所示的前咕啉-2脱氢酶。
本发明还涉及所述酶的修饰形式。
本发明所包括的“修饰形式”应理解为指这样的酶，在该酶的序列中，例如在多肽N末端和/或C末端或在保守氨基酸区域中存在改变，而该改变不损害酶的功能。可以利用本身已知的方法以氨基酸置换的形式进行这些改变。
本发明一个特定的实施方式包括本发明多肽的变异体，其活性与相应原始蛋白质的活性比较，例如，由于氨基酸置换而减弱或增加。这同样适用于细胞中本发明酶的稳定性，该酶例如对蛋白酶的分解更敏感或更不敏感。
如SEQ ID No.4中所示的本发明赛罗氢绿素铁螯合酶可进一步由其还具有钴螯合酶活性的事实加以区分。
如SEQ ID No.4中所示具有螯合酶活性的本发明酶，除了铁和钴外，还接受镍离子、锌离子和铜离子。
对含有这些金属离子的反应混合物进行的适当分光光度分析表明SirB可以在体外作为铁螯合酶及钴螯合酶起作用，并且，除此之外，其也可以合成多种其它金属异构菌绿素(metalloisobacteriochlorin)。
当比较SirB和CbiX的氨基酸序列时，发现了广泛的一致性。SirB和CbiX的活性相似。然而，与SirB比较，CbiX在C末端显示了不寻常的组氨酸残基聚积。而且，利用半胱氨酸营养缺陷型突变体进行的互补性研究表明已知来源于巨大芽孢杆菌由基因cbiX编码的赛罗氢绿素螯合酶对钴比对铁具有更高的亲和性。
因此，为了根据本发明通过生物技术方法生产维生素B12，至少可以想到在适宜的生物体中将赛罗氢绿素铁螯合酶和/或赛罗氢绿素钴螯合酶与参与赛罗血红素合成或钴胺素合成的其它酶联合使用，并且可以利用适宜的发酵条件引导有利于钴胺素的代谢流。
发酵条件可以包括在需氧、半厌氧或厌氧条件下培养微生物。此外，本发明包括从需氧向厌氧条件转移(或反之亦然)的所有可以想到的变化形式。
在本发明方法中，为了生物技术生产维生素B12的目的，发酵含有芽孢杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属或丙酸杆菌属的微生物或这些微生物的混合物的培养物。例如，作为丙酸杆菌属，可以利用谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)。
根据本发明，在前述类型的维生素B12生产方法中，优选地，发酵含有鼠伤寒沙门氏菌或大肠杆菌或巨大芽孢杆菌的培养物。
巨大芽孢杆菌的应用具有很大的经济利益，因为该生物体当用在多种目的工业产品的生物技术生产中时具有大量的优点。
例如，巨大芽孢杆菌不具有任何碱性蛋白酶，这意味着当产生异源蛋白质时，几乎不会观察到任何降解。而且，已知巨大芽孢杆菌可以有效地分泌商业性目的产物，例如在α-淀粉酶和β-淀粉酶生产中利用了该特性。此外，当利用巨大芽孢杆菌时，由于此生物体的大小，在由于种群密度太高而引起细菌死亡之前，可以积累高生物量。此外，该物种能够从废材料和低级物质产生高价值和最高量的产物，而这一有利条件证明在利用巨大芽孢杆菌的工业生产中具有极大意义。从巨大芽孢杆菌做为甚至能分解氰化物，除草剂和持久性杀虫剂的土壤解毒剂的应用中也反映了该物种可以代谢非常广泛的底物。最后，巨大芽孢杆菌是完全不致病的，并且不产生任何毒素，这一事实尤其在食品和化妆品的生产中非常重要。因为这些多样的优点，今天巨大芽孢杆菌已经应用于多种工业用途，诸如α-淀粉酶和β-淀粉酶和青霉素酰胺酶的生产，有毒废物的再生和维生素B12的需氧生产(综述见Vary，P.S.，1994，Microbiology，40，1001-1013，巨大芽孢杆菌的黄金时间)。
原则上，与相应野生型比较，至少增加了赛罗血红素合成酶和适当时钴胺素合成酶的活性的芽孢杆菌属、沙门氏菌属、丙酸杆菌属、埃希氏菌属或假单胞菌属菌株或者它们的混合物可以用于本发明目的。特别地，这些菌株包括基因修饰的微生物，所述基因修饰的微生物与相应野生型比较，至少显示出具有表达增加的和/或拷贝数增加的编码赛罗血红素合成酶及适当时编码钴胺素合成酶的核苷酸序列。
优选地，使用生产维生素B12的菌株。特别优选的沙门氏菌属菌株是(基因修饰的)菌株AR3612(Raux等，1996；J.Bacteriol.，178，(3)753-767)。在丙酸杆菌属生物体的情况下，已经证明谢氏丙酸杆菌特别适合。非常特别优选的是巨大芽孢杆菌菌株DSMZ 509和适于用做维生素B12生产菌株的所有通常的巨大芽孢杆菌菌株。
在本发明范围内，优选地“维生素B12生产菌株”应理解为意指已经利用经典和/或分子遗传学方法修饰过的微生物菌株，这样该菌株的代谢流在维生素B12或它的衍生物的生物合成方向上得以增加(代谢工程)。例如，在这些生产菌株中，位于关键位置(瓶颈)的一个或多个基因和/或相应酶的调节被改变(所述关键位置即在代谢途径中至关重要并因此通过复杂方式进行调节的位置)，或者甚至解除对这些基因和/或酶的调节。在这方面，根据本发明可以利用的微生物包括所有已知的维生素B12生产菌株，优选芽孢杆菌属菌株或同源生物体。根据本发明有利的菌株包括尤其是巨大芽孢杆菌菌株DSMZ509和DSMZ2894。
然而，为了生产维生素B12，也可以利用在实施本发明前不能生产维生素B12的菌株，例如大肠杆菌菌株ER185或ER171(参见下面的表1)。因为大肠杆菌(E.coli)缺少例如在沙门氏菌属或芽孢杆菌属中存在的一些酶(这些酶在进化过程中已经被遗失)，所以大肠杆菌不能从头合成维生素B12。然而，可以通过用含有这些基因的适宜质粒进行转化来重新引入这些丢失的酶。在这方面如果使用cysG菌株，那么转化尿卟啉原III为钴胺素的酶也存在于大肠杆菌中。已经证明(参考下文和表4)根据本发明增加尿卟啉原III甲基转移酶、赛罗氢绿素铁螯合酶和前咕啉-2脱氢酶的酶活性或在这种情况下引入上述这些酶活性可以改进大肠杆菌(E.coli)中维生素B12的合成或相应地使得大肠杆菌中维生素B12的合成成为可能。
本发明也包括遗传修饰的细菌菌株，其可以利用经典诱变或选择性分子生物学技术和相应的筛选方法制备。选择性基因操作攻击的目的点包括导致维生素B12的生物合成途径的分支点，通过该点，可以朝着使维生素B12达到最大产量的方向，以选择性方式引导代谢流。对参与代谢流调节的基因的选择性修饰也包括结构基因上游和下游调节区的研究和改变，诸如启动子、增强子、终止子、核糖体结合位点等的优化和/或置换。本发明也包括通过例如减少或防止核酸酶或蛋白酶分解，改进DNA或mRNA或它们所编码的蛋白质的稳定性。
本发明也包括基因构建体，该基因构建体含有来源于前述类型的sir操纵子或其部分的分离的核苷酸序列，以及可操作地与之连接并具有调节功能的核苷酸序列。根据本发明，编码赛罗氢绿素钴螯合酶(cbiX)的核苷酸序列或其部分也可以存在于前述类型的基因构建体中。
“可操作的连接”应理解为意指例如启动子、编码序列、终止子，以及适当时其它调节元件的顺序排列，这样在表达编码序列时，每个调节元件都能完成它所预期的功能。这些调节性核苷酸序列可以是天然来源的，或者可以通过化学合成获得。原则上，任何能调节基因在相应宿主生物体中表达的启动子都适合用做启动子。在这方面，本发明的启动子也可以是化学诱导型启动子，其可以调节宿主细胞中其控制下的基因在特定的时间点表达。例如，这里可以提到β-半乳糖苷酶系统或阿拉伯糖系统。
可以通过利用例如在Sambrook，J.等，1989，《分子克隆实验室指南》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York中所述的常规重组和克隆技术制备基因构建体以将适合的启动子与至少一个本发明核苷酸序列融合在一起。
可以将衔接子和接头连接到DNA片段上以便使后者互相连接。
本发明也包括载体，该载体含有来源于前述类型的sir操纵子或其部分的分离的核苷酸序列或者前述类型的基因构建体，以及用于筛选、用于在宿主细胞中复制和/或用于整合进入宿主细胞基因组中的另外核苷酸序列。在文献中描述了大量这样的另外序列的例子，这里不做进一步评述。
因此，本发明也包括载体，该载体除了包含来源于sir操纵子或其部分的所述核苷酸序列外，还包含编码赛罗氢绿素钴螯合酶或其部分的核苷酸序列。
转化和超表达所述基因的适宜系统的例子是质粒pACYC184(NewEngland Biolabs)和pKK8668(Pharmacia)及pWH1510和pWH1520和无质粒的超表达菌株巨大芽孢杆菌WH320，参见Rygus，T.等(1991，巨大芽孢杆菌中异源基因的诱导型高水平表达，Appl.Microbiol.AndBiotechnol.，35，5594-599)中的描述。然而，这些系统对本发明不是限制性的。
本发明也涉及可以在前述类型的维生素B12生产方法中使用的转基因微生物，其中该微生物的特征在于它显示出具有升高表达和/或增加拷贝数的编码尿卟啉原III甲基转移酶和前咕啉-2脱氢酶的核苷酸序列。
本发明也同样涉及可以在前述类型的维生素B12生产方法中使用的这样的转基因微生物，其中该微生物的特征在于它显示出具有升高表达和/或增加拷贝数的编码尿卟啉原III甲基转移酶、赛罗氢绿素铁螯合酶和前咕啉-2脱氢酶的核苷酸序列。
同样地，本发明也涉及可以在前述类型的维生素B12生产方法中使用的这样的转基因微生物，该微生物显示出具有升高表达和/或增加拷贝数的编码尿卟啉原III甲基转移酶，赛罗氢绿素钴螯合酶和前咕啉-2脱氢酶的核苷酸序列。
在这方面，升高的表达和/或增加的拷贝数可以，例如与编码多功能酶的核苷酸序列相关。同样地，例如，由于含有操纵子或基因簇而编码几种赛罗血红素合成酶的核苷酸序列也可以在转基因微生物中进行增强表达和/或以增加的拷贝数存在。
优选地，本发明转基因微生物包含至少一个如SEQ ID No.1中所示含有巨大芽孢杆菌sirABC操纵子的核苷酸序列或其部分。同样是有利的是包含升高表达和/或增加拷贝数的至少一个如SEQ ID No.1中所示的分离的核苷酸序列或其等位基因的转基因微生物，其中，所述分离的核苷酸序列或其等位基因编码SEQ ID No.2中所示尿卟啉原III甲基转移酶(sirA)(即，核苷酸1到780位)、编码SEQ ID No.4中所示赛罗氢绿素铁螯合酶(sirB)(即，核苷酸761到1561位)和/或编码SEQ ID No.6中所示前咕啉-2脱氢酶(sirC)(即，核苷酸1542到2150位)。同样是有利的是，转基因微生物含有升高表达的和/或增加拷贝数的至少一个如SEQ IDNo.1中所示的分离核苷酸序列或其部分或其等位基因并显示出具有升高表达和/或增加拷贝数的至少一个编码钴胺素合成酶、有利地赛罗氢绿素钴螯合酶的核苷酸序列。
在本发明的一个变化形式中，这包括利用含有SEQ ID No.1中所示核苷酸序列的部分的转基因微生物，这些部分优选被更强烈地表达和/或优选以增加的拷贝数存在。在这方面，优选所述部分是上述详细定义的具有编码功能的组成区域(sirA，sirB或sirC)。在这方面，所述组成序列可以单独地或者以任意组合存在，也可以可操作地与调节序列诸如启动子、增强子、终止子等连接。本发明同样包括来源于sir操纵子的所述序列和编码钴胺素合成途径的酶的序列，例如cbiX基因或其部分的联合。
本发明还涉及包含复制形式的本发明基因构建体或本发明载体的转基因微生物。有利地是芽孢杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属或丙酸杆菌属转基因微生物。优选的本发明转基因微生物是巨大芽孢杆菌、大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
本发明方法的一个有利变化形式涉及发酵巨大芽孢杆菌菌株或大肠杆菌菌株，菌株中，sirA、sirB或sirC基因或其部分(单独或联合的)和/或cbiX基因或其部分(以任何可以想到的联合)得以更强地表达，与内源(天然)存在的赛罗血红素合成酶或钴胺素合成酶的活性比较，酶活性获得了增加。在这方面，有利的是sirAB，sirAC或sirABC或sirABcbiX，sirACcbiX或sirABCcbiX基因联合。特别优选sirACcbiX基因联合。
同样有利的一个本发明变化形式包括这样一种方法，该方法涉及发酵基因修饰的巨大芽孢杆菌菌株或大肠杆菌菌株，其中与遗传未修饰的生物体比较，所述菌株中(单独或联合的)sirA，sirB或sirC基因或其部分和/或cbiX基因或其部分(以任何可以想到的联合)以增加的拷贝数存在于细胞中。拷贝数可以在2至几百之间变化，并且可以通过将含有前述赛罗血红素合成基因和适当时钴胺素合成基因的载体或质粒引入转基因细胞并在其中复制它们而获得该拷贝数。本发明也包括利用同源重组将所述赛罗血红素合成基因的另外拷贝，及适合时钴胺素合成基因的另外拷贝插入转基因生物体的基因组中。
增加天然(内源)酶活性、增加基因表达、增加基因拷贝数和将本发明基因或其部分单独或联合地引入微生物，优选地维生素B12生产菌株，特别优选地巨大芽孢杆菌中，这几种方式联用将有利于增加维生素B12的生产力。
为了获得基因表达的增加，可以增加相应基因的拷贝数。而且，可以相应地修饰位于结构基因上游的启动子区和/或调节区和/或核糖体结合位点，以使表达速率升高。在结构基因上游掺入表达盒子具有相同的作用。此外，可以利用诱导型启动子以增加维生素B12生产期间的表达。
通过延长mRNA寿命的方式同样可以改进表达。基因或基因构建体可以存在于具有不同拷贝数的质粒中，或者可以在染色体中整合或扩增。而且，通过阻止酶蛋白质被分解也可以增加酶本身的活性或增加活性。
而且，通过改变培养基的组分和培养的实施条件也可以增加流向维生素B12的代谢流。
此外，根据本发明，通过在关键位置引导代谢流更强地流向维生素B12或相应前体也可以改进维生素B12的生产。可以通过涉及发酵的本发明方法的变化形式，如在厌氧条件下发酵达到该目的。做为可替代方案，可以最初在需氧条件下进行发酵，然后在厌氧条件下进行发酵。对于该目的，优选利用芽孢杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属、埃希氏菌属或丙酸杆菌属微生物。特别优选巨大芽孢杆菌，大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
巨大芽孢杆菌能厌氧地生长。此外，在这些条件下维生素B12生产比在有氧条件下高。将巨大芽孢杆菌在需氧和厌氧生长条件下的维生素B12生产相比较，表明在所有研究的菌株中，厌氧维生素B12生产与需氧维生素B12生产比较增加了至少3到4倍(参考图1到3，特别地是图4)。通过系统地优化生长条件和培养基组成及所利用的细菌菌株可以获得进一步的增加。
在本发明另一个变化形式中，还可以考虑最初需氧发酵巨大芽孢杆菌，然后进行厌氧发酵。在一个有利的变化形式中，从需氧发酵到厌氧发酵的转变发生在需氧发酵的细胞的指数生长期。在这方面，有利的是，需氧发酵到厌氧发酵的转变发生在需氧生长的细胞的指数生长期的中间或末期，优选末期。
在巨大芽孢杆菌的此一步和两步发酵中，“厌氧条件”应理解为需氧生长后将细菌转移到厌氧烧瓶中并且在这些烧瓶中发酵时相随的条件。具体地，在两步法的情况下，需氧生长的细菌细胞一处于指数生长阶段，即为转移到厌氧烧瓶的时间。即，细菌被转移到厌氧烧瓶中后，细菌消耗烧瓶中存在的氧，并且不再补给氧。这些条件也可以描述为半厌氧性。相应的方法是通常的实验室做法，并且是本领域技术人员已知的。
当最初在发酵罐中需氧培养细菌，然后逐渐减少氧供应，以致及时随后出现半厌氧条件时，相似的条件也普遍适用。在发酵的一个具体变化形式中，通过例如向培养基添加还原剂，也可以产生严格厌氧条件。
一般地，细菌的需氧生长(初步培养)对于厌氧条件(无论这些厌氧条件是半厌氧还是严格厌氧条件)下的发酵并非绝对必需。即，细菌也可以在厌氧条件下生长，然后进一步在半厌氧或严格厌氧条件下发酵。也可以考虑直接从原种培养物挑取接种物，并且用它在厌氧条件下生产维生素B12。
在本专业知识的范围内，在其它菌株的情况下也可以使用相应的条件和方法。
而且，也可以想到例如通过向培养基至少添加钴，能够增加巨大芽孢杆菌或大肠杆菌的维生素B12生产。添加例如，甜菜碱、甲硫氨酸、谷氨酸、二甲基苯并咪唑或胆碱，或它们的联合对维生素B12的生产也有有利的作用。这些化合物(单独或它们的联合)也可以有利地与钴联合。可以考虑到通过添加物质诸如钴，可以达到这样的一种状况，即，例如与铁离子或镁离子比较，钴掺入到此生物合成途径的共同前体中的程度增加，而且以这种方式将使例如，钴胺素(维生素B12)的合成相对于赛罗血红素、血红蛋白或叶绿素的合成得到更大的促进。
在本发明另一种变化形式中，可以考虑在需氧条件下，在含有至少钴和/或至少钴和5-氨基乙酰丙酸的培养基中进行发酵。
根据本发明，也可以在含有葡萄糖做为C源的培养基中进行发酵。也可以考虑本发明方法的变化形式，其中在含有甘油做为C源的培养基中进行发酵。
一般地，当用甘油做为碳源发酵巨大芽孢杆菌时比用葡萄糖做为碳源时获得更高的细胞密度。有意义的是，在这方面，在需氧发酵条件下，钴和5-氨基乙酰丙酸的联合添加与没有任何添加的相应培养基相比导致更高的维生素B12生产。
而且，通过将发酵的巨大芽孢杆菌从需氧生长条件转移到厌氧生长条件可以进一步提高这种改进的维生素B12生产。有利地，利用含有甘油、钴和5-氨基乙酰丙酸的培养基。通过将培养物从需氧条件转移到厌氧条件，可以同时获得高维生素B12含量和高细胞密度。
有利地，分批地进行培养。本发明同样包括其中实施补料分批发酵或连续发酵的变化形式。
本发明也涉及编码酶尿卟啉原III甲基转移酶、赛罗氢绿素铁螯合酶、赛罗氢绿素钴螯合酶和前咕啉-2脱氢酶的核苷酸序列单独或联合地用于生产维生素B12的用途。
本发明还涉及编码赛罗血红素合成酶的如SEQ ID No.1中所示核苷酸序列或其部分用于生产维生素B12的用途。同样地，本发明涉及编码赛罗血红素合成酶的如SEQ ID No.1中所示核苷酸序列或其部分单独地或与编码赛罗氢绿素钴螯合酶的核苷酸序列联合用于生产维生素B12的用途。在这方面，本发明也包括本发明基因构建体或本发明载体用于生产维生素B12的用途。
本发明还涉及如SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列或其部分(单独地或与编码赛罗氢绿素钴螯合酶的核苷酸序列或其部分联合地)，或者本发明基因构建体，或者本发明载体用于制备前述转基因微生物的用途。这也包括本发明核苷酸序列，基因构建体或载体用于制备维生素B12生产菌株的用途，优选地，所述维生素B12生产菌株是芽孢杆菌属或埃希氏菌属菌株，特别优选是巨大芽孢杆菌或埃希氏菌属物种。
同样地，本发明包括转基因微生物(优选芽孢杆菌属，特别优选巨大芽孢杆菌)用于生产维生素B12的用途。
下面的实施例起到解释本发明的作用。但是它们对本发明没有任何限制作用。
1.化学试剂和分子生物学试剂从Amersham-Pharmacia获得化学试剂、试剂、抗生素和DEAESephacels，而从Oxoid获得生长培养基。从Promega，Bioline或InvitrogenLife Technologies获得酶。
2.细菌菌株、质粒和引物在表1，2和3中列出了本项工作中所使用的所有细菌菌株、质粒和引物。
3.缓冲液和溶液3.1.基本培养基大肠杆菌基本培养基K2HPO460.3mMKH2PO433.1mM(NH4)2SO47.6mM柠檬酸钠 1.7mMMgSO41.0mMD-葡萄糖 10.1mM硫胺素3.0μM酪蛋白氨基酸 0.025％(w/v)在固体培养基的情况下添加15g琼脂/l。
Mopso基本培养基Mopso(pH7.0)50.0mMtricine(pH7.0) 5.0mMMgCl2520.0μMK2SO4276.0μMFeSO450.0μMCaCl21.0mMMnCl2100.0μMNaCl50.0mMKCl 10.0mMK2HPO41.3mM(NH4)6Mo7O2430.0pMH3BO34.0nMCoCl2300.0pMCuSO4100.0pMZnSO4100.0pMD-葡萄糖20.2mMNH4Cl 37.4mM滴定试剂是KOH溶液。
鼠伤寒沙门氏菌基本培养基NaCl8.6mMNa2HPO433.7mMKH2PO422.0mMNH4Cl 18.7mMD-葡萄糖20.2mMMgSO42.0mMCaCl20.1mM在固体培养基的情况下添加15g琼脂/l。
3.2.用于巨大芽孢杆菌原生质体转化的溶液SMMP缓冲液抗生素介基3号(Difco) 17.5g/l蔗糖 500.0mM马来酸钠(pH6.5) 20.0mMMgCl220.0mM滴定试剂是NaOH溶液。
PEG-P溶液PEG-6000 40.0％(w/v)蔗糖 500.0mM马来酸钠(pH6.5) 20.0mMMgCl220.0mM滴定试剂是NaOH溶液。
cR5顶层琼脂蔗糖 300.0mMMops(pH7.3) 31.1mMNaOH 15.0mML-脯氨酸 52.1mMD-葡萄糖 50.5mMK2SO4 1.3mMMgCl2×6H2O45.3mMKH2PO4313.0μMCaCl213.8mM琼脂 4.0g/l酪蛋白氨基酸 0.2g/l酵母提取物 10.0g/l滴定试剂是NaOH溶液。
4.培养基和培养基添加物4.1.培养基除非有特别说明，本工作利用Sambrook，J.等，(1989，分子克隆实验室指南，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，New York)中所述Luria-Bertani肉汤(LB)完全培养基进行。
4.2.添加物将添加物诸如碳源、氨基酸或抗生素添加到培养基中并且一起高压灭菌。或者将添加物在水中制备成浓缩的母液并灭菌或者通过过滤灭菌。然后将这些物质添加到已经高压灭菌并且冷却到50℃以下的培养基中。在光敏性物质如四环素的情况下，要小心确保在暗处进行温育。常用的最终浓度如下氨苄青霉素 296μM四环素 21μMALA 298μM血红素 153μMX-Gal 98μM甲硫氨酸335μM半胱氨酸285μM硝酸钠 10mM亚硝酸钠10mM延胡索酸二钠10mM葡萄糖 10mM氯化铵 37mM木糖33mM溶菌酶 10μg/ml酪蛋白氨基酸0.025％(w/v)5.微生物学技术5.1.灭菌除非有另外的说明，所有培养基和缓冲液都在1巴正压力下和120℃蒸汽灭菌20分钟。温度敏感性物质通过过滤灭菌，而玻璃器皿在180℃加热灭菌至少3小时。
5.2.一般的生长条件在37℃和以最小转速180rpm在带挡板的烧瓶中培养需氧细菌培养物。培养时间随着期望的细菌培养物光密度而变化。
5.3.巨大芽孢杆菌的生长条件为了最好地可能通风，以250rpm，在带挡板的烧瓶中温育需氧培养物，并且除非另外说明，在30℃进行该温育。在30℃和100rpm，以100ml体积在小厌氧烧瓶中发酵厌氧培养物。在这两种情况下，都要小心以确保使用质量恒定的培养基，用过夜培养物以1∶100的比率进行接种，使用恒定的条件进行过夜培养。
5.4.测定细胞密度假定一个OD578相当于1×109个细胞数，通过测定在578nm的光密度确定细菌培养物的细胞密度。
5.5.比较生长研究对不同巨大芽孢杆菌菌株的需氧和厌氧生长行为进行比较研究，如图1，2和3中所示。所使用的菌株是巨大芽孢杆菌DSMZ 32(野生型)菌株或者适于在需氧条件下生产维生素B12的“生产菌株”DSMZ 509和DSMZ 2894。然而，本发明不限于这些菌株的使用。也可以考虑适于生产维生素B12的其它菌株，包括可以用经典诱变或定向分子生物学技术和相应的筛选方法制备的基因修饰的细菌菌株。
5.6.维生素B12生产的比较研究此外，对需氧和厌氧生长条件下巨大芽孢杆菌的维生素B12生产进行了分析。根据本发明，作为实例，巨大芽孢杆菌菌株DSMZ 32、DSMZ 509和DSMZ 2894在厌氧条件下，在含有葡萄糖的(完全LB)培养基中生长，并且在指数生长期末测定维生素B12含量，用pmol/OD578表示。平行研究了需氧生长期间，指数生长期中期的维生素B12的生产。结果如图4中所示。
可以看出在厌氧条件下生长的巨大芽孢杆菌(2，4和6)产生了更多数量的维生素B12。获得了高2到3倍的值。可以用本领域技术人员已知的方法分离维生素B12。
5.7.定量维生素B12分析测定OD578后，通过在5000rpm离心15分钟(5403离心机，Eppendorf)，在指数生长期的中期收集需氧巨大芽孢杆菌培养物，而在指数生长期末收集厌氧培养物。用40ml盐溶液洗细菌后，再一次在5000rpm离心15分钟(5403离心机，Eppendorf)。最后，冻干由此得到的细菌沉淀。在37℃，在含有甲硫氨酸和半胱氨酸的基本培养基上过夜培养鼠伤寒沙门氏菌metE cysG双突变体(Raux，E.等，1996，J.Bacteriol.，178753-767)，从平板上刮取鼠伤寒沙门氏菌并且用40ml等渗盐溶液洗涤。离心沉淀后，在等渗盐溶液中再一次重悬浮细胞沉淀。洗过的细菌培养物小心地和400ml 47-48℃温热、含半胱氨酸的基本培养基琼脂混合。向冷却的平板添加在去离子无菌水中重悬浮并在水浴中煮沸15分钟的10μl巨大芽孢杆菌样品，然后在37℃温育平板18小时。生长的鼠伤寒沙门氏菌菌落的直径与所应用的巨大芽孢杆菌样品中的维生素B12含量成比例。通过与标准曲线比较推出所研究样品中维生素B12的含量，其中从添加0.01，0.1，1，10和40pmol维生素B12获得的结果建立该标准曲线。该标准方法使得生物材料中的小量维生素B12能够被快速高重复地被检测到。
5.8.测定酶活性根据尿卟啉原III到前咕啉-2的转化，测定尿卟啉原III甲基转移酶的活性。通过利用商购荧光计监测在380nm激发和在610nm发射时前咕啉-2的荧光，跟踪前咕啉-2的生产。通过用已知量的前咕啉-2校准，即通过产生标准曲线定量测定。定义一个酶活性单位为每小时产生1nM前咕啉-2。
向1ml的2μM尿卟啉原III溶液添加大约50到200μg粗细胞提取物，所述尿卟啉原IH溶液在pH8的50mM Tris-HCl缓冲液中含有0.1mMS-腺苷-L-甲硫氨酸，在厌氧条件下进行30分钟的反应。
在野生型菌株中发现每毫克粗细胞提取物0.2单位尿卟啉原III甲基转移酶活性。这刚在可检测值之上。在转化的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的情况下获得了每毫克粗细胞提取物50单位尿卟啉原III甲基转移酶的活性。在转化的巨大芽孢杆菌的情况下获得了每毫克粗细胞提取物20单位的水平。
在螯合酶sirB和cbiX的情况下，利用2.4×105M-1cm-1的消光系数，通过测定在λmax376nm时赛罗氢绿素荧光减少的速率，确定用于将钴插入到赛罗氢绿素中的螯合酶反应的活性。预定义一个单位酶活性为每分钟1nM赛罗氢绿素的减少。
为了测定活性，在pH8的50mM Tris-HCl缓冲液存在的情况下，使含有大约50到200μg蛋白质的粗细胞提取物与赛罗氢绿素(50μM)和钴(10μM)反应。
在野生型菌株的情况下，确定了每毫克粗细胞提取物大约0.01单位的活性。在转化的大肠杆菌和转化的鼠伤寒沙门氏菌中SirB和CbiX的活性几乎相同；在这两种情况下，测得的活性是每毫克粗细胞提取物3单位。
为了测定前咕啉-2脱氢酶(Syro C)活性，利用2.4×105M-1cm-1的消光系数，通过在λmax376nm时赛罗氢绿素的形成测定脱氢酶反应。在这方面，预先确定一个单位酶活性为每分钟1nM赛罗氢绿素的产生。
为了测定此酶活性，在含有pH8的50mM Tris-HCl缓冲液的1ml反应体积中，使含有50到200μg蛋白质的粗细胞提取物与前咕啉-II(5μM)和NAD(100μM)反应。
在野生型菌株中，测得每毫克粗细胞提取物0.002单位的活性。在转化的大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌菌株中，前咕啉-2脱氢酶活性是每毫克粗细胞提取物0.3单位。
从上述显而易见，转化的生物体显示的酶活性在一些情况下比野生型菌株中测定的活性高100多倍。
6.分子生物学技术一般的技术诸如DNA制备、DNA的限制性消化、连接、PCR、测序、功能性互补、蛋白质表达等是常规实验室实践的一部分，并且如Sambrook，J.等(1989，分子克隆实验室指南，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)中所述。
6.1.巨大芽孢杆菌原生质体的转化原始质体制备用1ml巨大芽孢杆菌的过夜培养物接种50ml LB培养基，并且在37℃温育。在1OD578时，在15000rpm和4℃离心沉淀细胞15分钟(RC 5BPlus，Sorvall)，并且在5ml SMMP缓冲液中重悬浮。在SMMP缓冲液中加入溶菌酶后，在37℃温育悬浮液60分钟，并且在显微镜下检查原生质体形成。通过在3000rpm和室温(5403离心机，Eppendorf)离心收集细胞后，在5ml SMMP缓冲液中小心重悬浮细胞沉淀，并且进行第二次离心和洗涤步骤。在添加10％(v/v)甘油后，可以等份分出原生质体悬浮液，并且在-80℃进行冷冻。
转化向500μl原生质体悬浮液添加SMMP缓冲液中的0.5到1μg DNA，之后，添加1.5ml PEG-P溶液。在室温温育2分钟后，添加5ml SMMP缓冲液，小心混合整个混合物；然后在3000rpm和室温离心悬浮液10分钟(5403离心机，Eppendorf)。之后立即移除上清液，在500μl SMMP缓冲液中重悬浮几乎看不到的沉淀。在37℃温育悬浮液90分钟，同时轻轻地振荡。之后，50-200μl转化的细胞与2.5ml cR5顶层琼脂混合，添加到含有抗生素的LB琼脂平板上，其中该抗生素适用于筛选。在37℃温育2天后，转化的菌落变得可见。
6.2.鉴定和测序巨大芽孢杆菌sirABC操纵子通过PCR方法克隆sirABC操纵子。如Sambrook等，1989所述制备巨大芽孢杆菌基因组DNA，并且利用表3中列出的引物，利用该基因组DNA分离sirA，sirB和sirC基因，具体过程如下根据已知的cobA基因序列，制备与此基因序列3’末端互补的引物，所述cobA基因编码将尿卟啉原III转化为前咕啉-2的甲基转移酶(Robin等，1991，J.Bacteriol.，172(15)4893-6)。在Sigma-Genosys vectorette系统中使用这些引物及利用Lilleberg等(1998.Genosys Origins 1(2))的方法，扩增未知的巨大芽孢杆菌sirA序列。用相应的方法扩增sirB和sirC基因。此外，测序完整的sirABC操纵子。鉴定了编码sirABC操纵子的2150bp的DNA片段。在SEQ ID No.1中给出了相应的核苷酸序列，而在SEQ ID No.2，4和6中给出了从它推导出的氨基酸序列。在这方面，SEQID No.1，3和5中所示序列是相同的，产生它们仅仅是为了制作出Patentin序列表的目的，因为Patentin不接受任何重叠编码区，并且要求每个蛋白质都具有它自己的核苷酸序列。
之后，合成引物，用这些引物将此3种基因分别及联合地克隆至2个单独表达载体中。
对于互补研究，制备sirA，sirAB，sirABC和sirAC PCR产物，并且将其克隆到pKK8668(质粒pKK223.3的修饰形式)的EcoRI/BamHI切割位点中处于tac启动子控制下。将sirC做为BamHI-PstI片段克隆到pKK8668中。将sirA，sirB和sirC分别做为NdeI/BamHI片段克隆到pET14b(T7表达载体)中。这使得相应的蛋白质能够被超表达，同时具有N-末端His尾巴。
6.3.转化和表达系统用于将基因转化到巨大芽孢杆菌中并且在其中超表达它们的适宜质粒是pWH1510和pWH1520，以及无质粒的超表达菌株巨大芽孢杆菌WH320(Rygus，T.等，1991，巨大芽孢杆菌中异源基因的诱导型高水平表达，Appl.Microbiol.And Biotechnol.，35，5594-599)。
对照质粒pWH1510在中断的xylA读框中含有spoVG-lacZ融合物。在这方面，spoVG-lacZ表示枯草芽孢杆菌孢子形成蛋白质(spoVG)的非常强的核糖体结合序列与大肠杆菌β-半乳糖苷酶编码基因(lacZ)的融合物。因此，该质粒显著地适于研究巨大芽孢杆菌中的转化效率和超表达条件。
质粒pWH1520做为实际的克隆和表达载体起作用。这两个载体都具有四环素和氨苄青霉素抗性和对大肠杆菌和芽孢杆菌属中的复制重要的元件。因此，它们可以在建立用于大肠杆菌质粒pBR322衍生物的所有技术中应用。两个载体都含有巨大芽孢杆菌xyl操纵子的xylA和xylR基因及它们的调节序列(Rygus，T.等，1991，分子克隆及结构巨大芽孢杆菌编码的用于木糖应用的调节子单元的启动子和转录调节元件，Arch.Microbiol.155，535-542)。XylA编码木糖异构酶，而xylR编码对xylA发挥强转录控制的调节蛋白质。在缺乏木糖的情况下，XylA被抑制。当添加木糖时，由于xylA脱阻抑，产生大约200倍的诱导。可以在xylA读框中使用多接头以将基因与xylA融合，然后这些基因同样受XylR的强转录控制。在这方面，因为xylA读框在多接头上游仍旧是完全完整的，所以可以在形成转录融合物或翻译融合物两种备选方案之间进行选择。
6.4.互补研究为了互补大肠杆菌赛罗血红素突变体，将含有上述sir基因联合的pKK8668衍生物转化到大肠杆菌菌株cysG-302Δa(ER171)(Raux等，1997，J.Bacteriol.，179(10)3202-12)，该菌株缺乏转化尿卟啉原III为赛罗血红素所需的所有酶活性。该菌株不能合成赛罗血红素，因此不能合成半胱氨酸。在有和无半胱氨酸的基本培养基上筛选转化的大肠杆菌(E.coli)菌株。而且，在有(1mg CoCl2/l)和无钴的基本培养基上研究了钴对赛罗血红素合成的影响。在37℃温育基本培养基平板24小时。质粒pKK8668sirAB和pKK8668sirABC都能互补大肠杆菌ER171。这意味着SirA(尿卟啉原III甲基转移酶)和SirB(赛罗氢绿素铁螯合酶)是赛罗血红素生产所绝对必需的。现在，转化的大肠杆菌能合成维生素B12。它们分别产生4.25和72.5pM维生素B12/OD。可以看到利用SirABC基因编码的所有三种酶的优点。
为了研究SirB编码铁螯合酶还是钴螯合酶，使用有和无钴的培养基。添加外源钴不抑制pKK8668sirAB和pKK8668sirABC对大肠杆菌ER171的互补(表4)。这表明SirB是特异性赛罗氢绿素铁螯合酶。
在平行测定中，将含有单独或联合的sir基因的pKK8668衍生物转化到大肠杆菌菌株ER185中，该菌株除了cibk外，含有所有鼠伤寒沙门氏菌用于合成B12的基因(cibk，钴螯合酶；Raux等，1997，J.Bacteriol.，179(10)3202-12)。通过用矿物油覆盖厌氧地生长转化的菌株(在37℃，6小时)。添加IPTG和ALA，接着再生长培养物18小时。然后通过超声处理破坏细胞，并且利用鼠伤寒沙门氏菌cysGmetE(AR3621)生物测定平板(Raux等，1996，J.Bacteriol.，178(3)753-67)，通过标准方法，定量测定粗提取物的维生素B12。
如表4中可以看到的，SirB可以做为赛罗氢绿素钴螯合酶起作用，因为在cbik缺乏的情况下，它可以恢复维生素B12的生物合成。如果SirC也存在，那么形成的维生素B12的量增加。
因此，根据本发明转化的大肠杆菌菌株适于生产维生素B12。
仅可以用质粒pAR8766(含有巨大芽孢杆菌cbiX加大肠杆菌cysG的pKK223.3衍生物，Pharmacia；Raux，E.等，1998，Biochem.J.，1998，335167-173)或质粒pER179(含有脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)cobA基因和巨大芽孢杆菌cbiX基因的pKK223.3衍生物，Pharmacia；Raux，E.等，1998，Biochem.J.，1998，335167-173)，而不能单独用cysG或cobA互补大肠杆菌302Δa(没有功能性赛罗血红素合酶的cysG-缺陷型菌株，只能当添加外源半胱氨酸时，在基本培养基上生长)。这表明cbiX做为赛罗氢绿素螯合酶起作用。关于铁特异性，已证明当向基本培养基添加外源钴(5μM)时，不互补半胱氨酸营养缺陷型的突变大肠杆菌302Δa。即，用钴置换铁，导致钴胺素的生物合成。在这方面，Cbix具有和SirB相同的赛罗氢绿素螯合酶活性，因为这个，其可以用于生物合成赛罗血红素和生物合成钴胺素。然而，CbiX对钴比对铁具有更高的亲和性。
6.5.超量生产和纯化SirA，SirB，SirC和CbiX蛋白质为了快速纯化SirA，SirB和SirC编码的酶，将基因分别克隆到载体pET14b中于IPTG-诱导型T7启动子控制之下。将这些载体转化到大肠杆菌菌株BL21 DE3 pLysS后，当超表达相应基因时，组氨酸尾巴被加到相应蛋白质上。离心超声的细胞提取物。利用标准方法和制造商的说明书，通过层析(金属螯合物形成)从上清液纯化蛋白质。然后，通过SDS凝胶电泳分级样品。结果如图5中所示。
从质粒pAR8766分离做为SspI/SnaBI片段的巨大芽孢杆菌cbiX基因，其含有完整的cop操纵子(Raux，E.等，1998，Biochem.J.，1998，335167-173)，然后将其克隆到质粒pKK223.3(Pharmacia)中，产生质粒pAR8882。在转化到大肠杆菌302Δa中和添加IPTG后，以与SirA，SirB和SirC情况下类似的方式实现表达和纯化。
6.6.转化菌株中体内积累的产物的分光光度分析将含有不同sir基因联合的pKK8668衍生物转化到大肠杆菌菌株cysG-302ΔaER171(Raux等，1997，J.Bacteriol.，179(10)3202-12)中，该菌株缺乏转化尿卟啉原III为赛罗血红素所需的所有酶活性。该菌株不能合成赛罗血红素，因此不能合成半胱氨酸。
将相应的转化菌株接种到200ml基本培养基中，并且在有钴和无钴的情况下进行培养。培养物生长到0.1OD，并且在添加IPTG和ALA后，接着生长4小时。通过超声处理破坏收集的细胞后，将每种情况下的粗提取物加到DEAE-Sephacol柱子上。在300和600nm之间分光光度分析洗脱物。结果如图6中所示。在大肠杆菌pKK8668sirAC提取物上测定到在378nm对应于赛罗氢绿素的最大吸收值。大肠杆菌pKK8668sirA的光谱在354nm显示了最大值并且对应于非生理性的化合物trimethylpyrrocorphin，其来源于尿卟啉原III的过甲基化。在大肠杆菌pKK8668sirABC情况下不可能清楚地检测赛罗血红素光谱。赛罗氢绿素和赛罗血红素的UV-Vis光谱中有许多相似性，在378nm具有最大值，这意味着明确的区分是困难的。然而，由于在410和590nm具有最大值，钴赛罗氢绿素的光谱清楚地不同于赛罗氢绿素的光谱。
6.7.测定前咕啉-2脱氢酶对改进的钴胺素生产的必要性如前所述，由于大肠杆菌缺乏将前咕啉-2转化为钴啉醇酰胺所需的一些酶，所以它不能从头合成维生素B12。但是，通过利用适宜的质粒引入丢失的钴胺素生物合成基因，可以恢复大肠杆菌的这种能力。如果在此还使用cysG菌株，用于转化尿卟啉原III为钴啉醇酰胺的所有酶再一次存在于相应的大肠杆菌菌株中。
这种知识被用于研究钴胺素生物合成中合成前咕啉-2和其氧化产物——赛罗氢绿素所需的酶。随后的结果表明根据本发明，在前咕啉-2脱氢酶存在的情况下，改进了维生素B12的生产。
利用含有转化尿卟啉原III为钴啉胺酸所必需基因的大肠杆菌菌株，首先研究了在巨大芽孢杆菌钴胺素生物合成途径中对前咕啉-2脱氢酶的需要，这通过用质粒pER270转化大肠杆菌cysG菌株(大肠杆菌302Δa)实现，所述质粒pER270含有巨大芽孢杆菌基因cbiW，-H，-X，-J，-C，-D，-ET，-L，-F，-G，-A，cysGA，-Y，-btuR和cbiP。而且，含有cysG，met8P或sirC的第二适宜质粒被用于转化此大肠杆菌菌株。cysG，met8P和sirC都编码具有前咕啉-2脱氢酶活性的酶。用相应的两个质粒共转化后，钴胺素生产增加了至少30倍，结果如下所示

cysGG21D转化的菌株没有任何脱氢酶活性，因为其由于NAD结合位点被破坏而不能结合NAD。CbiK是Salmonella enterica钴螯合酶。
从这些结果可以得出，前咕啉II脱氢酶的存在对获得改进的维生素B12生产是必需的。
为了对这些结果提供支持，研究了Salmonella enterica(鼠伤寒沙门氏菌)途径中对脱氢酶的需要。对此，用质粒pER185KD转化大肠杆菌cysG菌株，该质粒含有Salmonella enterica的所有cbi基因，但是cbiK基因中存在缺失。此外，用另一个质粒共转化大肠杆菌细菌，该质粒使得能够研究对前咕啉-2脱氢酶编码基因的需要。获得了下面的结果

这些结果证实在Salmonella enterica生物合成途径中维生素B12的咕啉环的生物合成中前咕啉-2脱氢酶的必需性或优点。当脱氢酶(在SirC情况下)存在时，可再现地获得更好的钴胺素生产结果，从检测到的钴啉胺酸，明显地获得的钴胺素产量增加约10倍。
6.8.确定SirB和SirC的作用超表达SirA的细胞在UV光下显示了特征性轻微荧光(Warren等，1994，Biochem，J.，302(Pt3)837-44)，但没有对其进行任何进一步的酶分析。
为了测定SirB做为螯合酶的作用和SirC做为脱氢酶的作用，纯化这些蛋白质并在体外反应试验中用于检测赛罗氢绿素和钴赛罗氢绿素的形成。0.5mg CobA，0.1mg HemC，0.15mg HemD，0.75 SAM和0.05mg PBG用于该目的。如Raux等(1999，Bioorganic.Chem.，27100-118)所述纯化CobA(代表SirA)，HemC和HemD。在1ml的50mM Tris/HCl，pH8中混合试样样品。然后添加0.1mg SirB，0.1mg SirC，0.5mg NAD+和21μM CoCl2×6H2O。然后在37℃温育该试验样品30分钟，随后进行分光光度分析。对于对照而言，没有SirB和SirC时测定光谱。
图7a显示在NAD+存在或缺乏的情况下温育20分钟后，在含有PBG，HemC，HemD，CobA和SAM的偶联试验中合成的前咕啉-2显示了与前咕啉-2特异性光谱相似的光谱。添加SirC产生了在378nm具有最大值的对应于赛罗氢绿素的光谱，该光谱与图6中所示大肠杆菌pKK8668sirAC粗提取物的光谱相似。
通过添加SirB和SirC同样获得了在378nm具有最大吸收值的光谱(图7b)。然而，添加钴产生了在410和590nm具有最大吸收值的光谱，其相当于钴赛罗氢绿素的光谱。这意味着SirB做为钴螯合酶起作用。
此外，在偶联反应试验中使用硫酸铜(II)，六水氯化镁，氯化锌和七水硫酸铁代替六水硫酸钴镍(II)。记录300和700nm之间的相应光谱。图8显示由此获得的赛罗氢绿素金属复合物的最大吸收值显著不同。这表明SirB在体外可以做为铁螯合酶和做为钴螯合酶，并且除此以外，它能合成多种其它金属异构菌绿素。
6.9.超表达sirA用含有sirA的质粒pKK8668(pKK8668sirA)转化大肠杆菌ER171后，如实施例5.3中所述培养以这种方式转化的微生物。做为对照，在相同条件下培养相应未转化的大肠杆菌菌株。用IPTG和ALA，在10mg/l的浓度诱导基因表达。然后通过测定形成的前咕啉-2测定尿卟啉原III甲基转移酶(sirA)的比活。前咕啉-2发荧光，并且在340nm激发试验样品后，可以在600nm检测荧光前咕啉-2的明显发射(消光系数8×105M-1L-1)。底物尿卟啉原III不发荧光。
在该实验中，在未转化的大肠杆菌菌株中几乎不能检测到尿卟啉原III甲基转移酶活性。相反，在转化的大肠杆菌菌株中，可以检测到超量的sirA编码的酶尿卟啉原III甲基转移酶，每升培养基至少10mg蛋白质，具有每升培养基约15000单位的酶活性。1单位相当于每小时1nmol前咕啉-2的产生。利用基于Bradford方法(Anal.Biochem.，1989，178，263.268)的蛋白质检测试剂盒(BioRad，德国)测定蛋白质。
类似地，也用含有sirA的质粒pKK8668(pKK8668sirA)转化巨大芽孢杆菌菌株DSMZ 509，并且如实施例5.3.所述进行培养。在这种情况下，用相应方法培养的相应未转化的巨大芽孢杆菌菌株用做对照。
在转化的巨大芽孢杆菌中更强地产生了sirA编码的蛋白质，这由基因表达后的细胞荧光读数定性地证实。用10mg/l的IPTG和ALA诱导基因表达。
也测定了此尿卟啉原III甲基转移酶的比活。在这种情况下，在未转化的菌株中也很少能检测到此特异性酶活性。在转化的巨大芽孢杆菌菌株中检测到约15000单位/l培养基的比活性。
如实施例6.5.中所述，纯化sirA编码的蛋白质后，测定形成的尿卟啉原III甲基转移酶的比蛋白质含量(Bradford；Anal.Biochem.，1989，178，263.268)。这产生了超量的SirA，每升培养基10mg蛋白质。
6.10.超量表达SirA和SirC用质粒pKK8668sirAC(含有sirA和sirC)转化大肠杆菌ER171后，如实施例5.3.所述培养用这种方法转化的微生物。在相同的条件下培养相应未转化的大肠杆菌菌株做为对照。用10mg/l浓度的IPTG和ALA诱导基因表达。然后通过测定形成的前咕啉-2测定尿卟啉原III甲基转移酶(sirA)的比活性。在340nm激发试验样品后，可以在600nm测定荧光性前咕啉-2明显的发射(消光系数8×105M-1L-1)。底物尿卟啉原III不发荧光。在该实验中，未转化的大肠杆菌菌株很少有任何可检测得到的酶活性。在转化的大肠杆菌菌株中，测定尿卟啉原III甲基转移酶(sirA)的比酶活性是每升培养基2500单位，而测得前咕啉-2脱氢酶(SirC)的比酶活性是每升培养基4000单位赛罗氢绿素。
此外，如实施例6.6中所述检测培养基中产物赛罗氢绿素。
6.11.研究赛罗氢绿素的作用例如，如6.9中所述在转化的细胞中产生赛罗氢绿素。
利用赛罗氢绿素或前咕啉-2作为底物(在每种情况下，pH8的1ml0.05M Tris-HCl缓冲液中2.5μM底物)，分别利用纯化的sirB和cbiX编码的酶(在每种情况下25μg)进行体外酶试验，发现中间物赛罗氢绿素同时做为sirB编码的赛罗血红素合成酶(赛罗氢绿素铁螯合酶)和cbiX编码的钴胺素螯合酶的底物。在这方面，两种所述的酶，即赛罗氢绿素铁螯合酶(sirB)和钴胺素螯合酶(cbiX)分别将金属离子(20μM)掺入到赛罗氢绿素中，其效率比它们将金属离子掺入到还原的前咕啉-2中间体中的效率高100倍以上。即，赛罗氢绿素铁螯合酶(sirB)仅以低效率(＜1％)催化金属离子掺入到前咕啉-2中。另一方面，钴胺素螯合酶(cbiX)根本不支持铁离子掺入到前咕啉-2中。
本申请使用了如表1、2和3中所示的下述细菌菌株、质粒和引物。
表1使用的细菌菌株

*DSMZ德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)，Brunswick。
表2所用的质粒


表3所用的引物

表4表示大肠杆菌ER171和ER185用含有不同sir基因联合的pKK8668衍生物进行互补的研究结果。下表给出与细胞光密度(OD)相关的生长(+＝互补；-＝不互补)和B12含量。



参考下面的附图进一步解释本发明。
图1表示比较30℃在需氧和厌氧条件下巨大芽孢杆菌DSMZ32(野生型)的生长。在添加10mM硝酸盐(空心菱形)，10mM亚硝酸盐(空心三角形)和10mM延胡索酸盐(十字形)的情况下，测定厌氧生长。在没有添加物的LB培养基中进行了发酵生长(空心圆形)和需氧生长(实心的菱形)。在所示的时间，取样并且在578nm测定光密度。
图2表示比较30℃需氧和厌氧条件下巨大芽孢杆菌DSM509的生长。在添加10mM硝酸盐(空心菱形)，10mM亚硝酸盐(空心三角形)和10mM延胡索酸盐(十字形)的情况下，测定厌氧生长。在没有添加物的LB培养基中发酵生长(空心圆形)和需氧生长(实心的菱形)。在所示的时间，取样并且在578nm测定光密度。
图3表示比较30℃需氧和厌氧条件下巨大芽孢杆菌DSM2894的生长。在10mM硝酸盐(空心菱形)，10mM亚硝酸盐(空心三角形)和10mM延胡索酸盐(十字形)添加物存在的情况下，测定厌氧生长。在没有添加物的LB培养基中发酵生长(空心圆形)和需氧生长(实心的菱形)。在所示的时间，取样并且在578nm测定光密度。
图4表示在需氧和厌氧生长条件下，巨大芽孢杆菌维生素B12的生产。针对需氧生长(1)和厌氧生长(2)的野生型菌株巨大芽孢杆菌DSM32，需氧生长(3)和厌氧生长(4)的巨大芽孢杆菌DSM509和需氧生长(5)和厌氧生长(6)的巨大芽孢杆菌DSM2894，测定以pmol/OD578表示的每细胞质量的维生素B12含量。
图5显示纯化的组氨酸标记的SirA，SirB和SirC的SDS聚丙烯酰胺凝胶。泳道1中加样的是分子量标准，而纯化的组氨酸标记的蛋白质SirA，SirB和SirC分别加样于泳道2，3和4中。
图6显示从大肠杆菌ER171细菌菌株分离的积累色素的UV-Vis光谱，该菌株超量表达pKK8668SirA，pKK8668SirAB，pKK8668SirABC和pKK8668SirAC，并且在ALA存在下培养。
图7表示体外积累的色素的UV-Vis光谱，该色素来源于含有SirB和SirC的前咕啉-2酶偶联试验。
7(a)含有前咕啉-2(PC-2)的前咕啉-2偶联试验的光谱和添加SirC后含有前咕啉-2(在钴存在和缺乏时)的前咕啉-2偶联试验的光谱。最大吸收值相应于赛罗氢绿素的吸收值。
7(b)PC-2加上SirB和SirC的光谱。最大吸收值(410nm和590nm)相当于钴赛罗氢绿素。
图8显示在添加非钴的金属，即Ni2+，Zn2+，Cu2+和Fe2+的情况下，从含有SirB和SirC的前咕啉-2酶偶联试验中获得的体外积累的色素的UV-Vis光谱。Ni2+，Zn2+，Cu2+和Fe2+的最大吸收值是395nm，405nm和402nm。
序列表<110>巴斯福股份公司<120>改进的维生素B12的生产方法<130>1<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>2150<212>DNA<213>巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)<220>
<221>CDS<222>(1)..(780)<223>sirA；尿卟啉原III甲基转移酶<400>1atg ggg aaa gta tat cta gtc ggt gca gga ccg gga gat cca gat tta48Met Gly Lys Val Tyr Leu Val Gly Ala Gly Pro Gly Asp Pro Asp Leu1 5 10 15att aca tta aaa ggg ttg aaa gca att cag caa gca gat gtt atc tta96Ile Thr Leu Lys Gly Leu Lys Ala Ile Gln Gln Ala Asp Val Ile Leu20 25 30tat gat cgt tta gtg aat aag gac ctg ctg gag tat gct aaa agt gat144Tyr Asp Arg Leu Val Asn Lys Asp Leu Leu Glu Tyr Ala Lys Ser Asp35 40 45gca gat atc att tac tgc gga aag ctt ccg aac tac cat acc ctc aag192Ala Asp Ile Ile Tyr Cys Gly Lys Leu Pro Asn Tyr His Thr Leu Lys50 55 60caa gaa aca atc aac aac ttt tta gtg aaa ttc gct aaa aaa gga aaa240Gln Glu Thr Ile Asn Asn Phe Leu Val Lys Phe Ala Lys Lys Gly Lys65 70 75 80att gta acg cgc tta aag ggc gga gat cca ttt gtt ttc gga cgc gga288Ile Val Thr Arg Leu Lys Gly Gly Asp Pro Phe Val Phe Gly Arg Gly85 90 95ggg gaa gaa gca gaa gct ctc gtg cag cag ggc att tca ttt gaa att336Gly Glu Glu Ala Glu Ala Leu Val Gln Gln Gly Ile Ser Phe Glu Ile100 105 110
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<221>引物<222>(1)..(29)<223>BMcobAspe<400>8gcactagtca tatggggaaa gtatatcta29<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>BMsirAstop2<400>9caggatccaa cctctttagt aagcttc27<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>BMsirBATG<400>10cgcatatgca caagaagctt actaaag27<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(25)<223>BMsirBstop<400>11ctggatccga acgacccttt aaatc25
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<221>引物<222>(1)..(24)<223>BMsirCATG<400>12gtcatatgta taccgttatg cttg24<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>BMsirCstop<400>13ctggatccag cggtattcgaagcattg27<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(27)<223>BMsirCATG-Bam<400>14cggatccaaa ggaaatcaat acgatga27<210>15<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>引物<222>(1)..(28)<223>BMsirCstop-Pst<400>15gactgcagca gcggtattcg aagcattg28
权利要求
1.一种改进的维生素B12生产方法，该方法包括发酵含有微生物的培养物，在所述微生物中，至少参与赛罗血红素合成的尿卟啉原III甲基转移酶和前咕啉-2脱氢酶的酶活性，与相应的内源性酶活性比较增加。
2.如权利要求1所述的方法，该方法包括发酵含有微生物的培养物，在所述微生物中，至少参与赛罗血红素合成的尿卟啉原III甲基转移酶和前咕啉-2脱氢酶以及cbiX编码的参与钴胺素合成的赛罗氢绿素钴螯合酶的酶活性，与相应的内源性酶活性比较增加。
3.如权利要求1所述的方法，该方法包括发酵含有微生物的培养物，在所述微生物中，至少参与赛罗血红素合成的尿卟啉原III甲基转移酶、赛罗氢绿素铁螯合酶和前咕啉-2脱氢酶的酶活性，与相应的内源性酶活性比较增加。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中与相应的内源性酶活性比较，至少如SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶和如SEQID No.6中所示的前咕啉-2脱氢酶或它们的同工酶的酶活性被增加。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中与相应的内源性酶活性比较，至少如SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶、如SEQ ID No.6中所示的前咕啉-2脱氢酶和赛罗氢绿素钴螯合酶(CbiX)或它们的同工酶的酶活性被增加。
6.如权利要求1或3所述的方法，其中与相应的内源性酶活性比较，至少如SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶、如SEQ ID No.4中所示的赛罗氢绿素铁螯合酶和如SEQ ID No.6中所示的前咕啉-2脱氢酶或它们的同工酶的酶活性被增加。
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其中，编码赛罗血红素合成酶的基因sirA--SEQ ID No.1中所示核苷酸第1到780位和sirC--SEQ ID No.1，3或5中所示核苷酸第1542到2150位具有增强的表达和/或增加的拷贝数。
8.如权利要求1至6任一项所述的方法，其中，编码赛罗血红素合成酶的基因sirA--SEQ ID No.1中所示核苷酸第1到780位、sirB--SEQ ID No.1或3中所示核苷酸第761到1561位和sirC--SEQ ID No.1，3或5中所示核苷酸第1542到2150位具有增强的表达和/或增加的拷贝数。
9.如权利要求1，2，5和7中任一项所述的方法，其中，编码赛罗血红素合成酶的基因sirA--SEQ ID No.1中所示核苷酸第1到780位和sirC--SEQ ID No.1，3或5中所示核苷酸第1542到2150位，以及编码钴胺素合成酶的基因cbiX具有增强的表达和/或增加的拷贝数。
10.如权利要求1至9任一项所述的方法，该方法包括发酵含有芽孢杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属或丙酸杆菌属的微生物或这些微生物的混合物的培养物。
11.如SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶。
12.如SEQ ID No.4中所示的赛罗氢绿素铁螯合酶。
13.如SEQ ID No.6中所示的前咕啉-2脱氢酶。
14.如SEQ ID No.1中所示的分离的核苷酸序列，其含有编码赛罗血红素合成酶的巨大芽孢杆菌sirABC操纵子。
15.如SEQ ID No.1中所示的分离的核苷酸序列或其等位基因，其从核苷酸第1到780位编码如SEQ ID No.2中所示的尿卟啉原III甲基转移酶(sirA)。
16.如SEQ ID No.1或3中所示的分离的核苷酸序列或其等位基因，其从核苷酸第761到1561位编码如SEQ ID No.4中所示赛罗氢绿素铁螯合酶(sirB)。
17.如SEQ ID No.1，3或5中所示的分离的核苷酸序列或其等位基因，其从核苷酸第1542到2150位编码如SEQ ID No.6中所示前咕啉-2脱氢酶(sirC)。
18.一种基因构建体，其含有如权利要求14至17任一项所述的分离的核苷酸序列或其部分及与之可操作连接并具有调节功能的核苷酸序列。
19.如权利要求18所述的基因构建体，其还含有编码赛罗氢绿素钴螯合酶的核苷酸序列。
20.一种载体，其含有如权利要求14至17任一项所述的分离的核苷酸序列或其部分、或者如权利要求18或19所述的基因构建体，且还含有用于筛选、用于在宿主细胞中复制和/或用于整合进入宿主细胞基因组中的另外核苷酸序列。
21.用于如权利要求1至10任一项所述的维生素B12生产方法的转基因微生物，其显示出具有表达升高的和/或拷贝数增加的编码尿卟啉原III甲基转移酶和前咕啉-2脱氢酶的核苷酸序列。
22.如权利要求21所述的转基因微生物，其显示出具有表达升高的和/或拷贝数增加的编码尿卟啉原III甲基转移酶、赛罗氢绿素钴螯合酶或赛罗氢绿素铁螯合酶和前咕啉-2脱氢酶的核苷酸序列。
23.如权利要求21或22所述的转基因微生物，其显示出具有表达升高的和/或拷贝数增加的如权利要求14至17任一项所述的分离的核苷酸序列或其部分。
24.如权利要求21至23任一项所述的转基因微生物，其含有复制形式的如权利要求18或19所述的基因构建体或如权利要求20所述的载体。
25.如权利要求21至24任一项所述的转基因微生物，其是芽孢杆菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属或丙酸杆菌属的微生物。
26.如权利要求21至25任一项所述的转基因微生物，其属于巨大芽孢杆菌物种。
27.编码酶尿卟啉原III甲基转移酶、赛罗氢绿素铁螯合酶、赛罗氢绿素钴螯合酶和前咕啉-2脱氢酶的核苷酸序列单独地或联合地用于生产维生素B12的用途。
28.单独的或与编码赛罗氢绿素钴螯合酶的核苷酸序列相联合的如权利要求14至17任一项所述的核苷酸序列或其部分、或如权利要求18或19所述的基因构建体、或如权利要求20所述的载体用于生产维生素B12的用途。
29.单独的或与编码赛罗氢绿素钴螯合酶的核苷酸序列相联合的如权利要求14至17任一项所述的核苷酸序列或其部分、或如权利要求18或19所述的基因构建体、或如权利要求20所述的载体用于制备如权利要求21至26任一项所述的转基因微生物的用途。
30.如权利要求21至26任一项所述的转基因微生物用于生产维生素B12的用途。
全文摘要
本发明涉及改进的生产维生素B12的方法，根据该方法发酵含有微生物的培养物，其中，在所述微生物中，至少参与赛罗血红素合成的尿卟啉原III甲基转移酶和前咕啉－2脱氢酶与相应的内源性酶活性比较具有增加的酶活性。
文档编号C12P19/42GK1643157SQ03807317
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月24日 优先权日2002年3月28日
发明者M·J·沃伦, E·迪瑞, H·利奇 申请人:巴斯福股份公司