专利名称：热耐受性肌醇六磷酸酶的制作方法
肌醇六磷酸酶(肌醇六磷酸酯磷酸水解酶；EC 3.1.3.8)是一种将肌酸六磷酯水解成肌醇和无机磷酸的酶，并且已知是有价值的饲料添加剂。
1907年首次描述了稻糠中的肌醇六磷酸酶[Suzuki et al.，Bull.Coll.Agr.Tokio Imp.Univ.I，495(1907)]，并在1911年描述了从曲霉得到的肌醇六磷酸酶[Dox and Golden，J.Biol.Chem.10，183—186(1911)]。还在麦麸、植物种子、动物小肠和微生物中发现了肌醇六磷酸酶[Mowsen and Davis，Enzyme Mierob.Technol.5，377—382(1983)，Lambrechts et al.，Niotech.Lett.14，61—66(1992)，Shine and Ware，Appl.Microbiol.16，1348—1351(1968)]。
Van Hartingsveldt等人在Gene，127，87—94(1993)和欧洲专利申请No.420 358中描述了得自黑曲霉的肌醇六磷酸酶的克隆和表达，并且Piddington等人在Gene，133，55—62(1993)中描述了得自黑曲霉变种(var awamori)之肌醇六磷酸酶的克隆和表达。
因为迄今用于农业中的肌醇六磷酸酶有某些缺点，所以本发明因为迄今用于农业中的肌醇六磷酸酶有某些缺点，所以本发明的目的是提供新的肌醇六磷酸酶，或者更一般地说是大量提供具有改良属性的包括肌醇六磷酸酶在内之抗肌醇磷酸酯(肌醇六磷酸酶活性)的肌醇六磷酸酶活性的多肽。因为已知迄今使用的肌醇六磷酸酶在饲料成粒加工期间受到热处理会失去活性，所以本发明的肌醇六磷酸酶应有改善热耐受性的性质。
除烟曲霉(Aspergillus fumigatus)[Dox and Golden et al.，J.Biol.Chem.10，183—186(1911)]和米根霉(Rhizopus oryzae)[Howsonand Davies，Enzyme Microb.Technol.5，377—382(1993)]外，迄今尚未报导过耐热真菌中的肌醇六磷酸酶。已报导了来源于土曲霉(Aspergillus terreus)菌株9A—1[最适温度70℃；Yamada et al..Agr.Biol.Chem.，32，1275—1282(1968)]和卡斯坦氏许日王氏酵母(Schwanniomyces castellii)[最适温度77℃；Segueilha et al.，Bioeng.74，7—11(1992)]的耐热肌醇六磷酸酶。但这些用于农业时，必须大量得到之。因此，本发明的目的是提供编码热耐受性肌醇六磷酸酶的DNA序列。可用本领域已知的检测法，如用于饲料造粒的方法或例如由Yamada等人(文献同上)描述的检测酶促活性的热依赖性的方法，检测由这些DNA序列编码的改良的肌醇六磷酸酶的热耐受性。
本发明的再一个目的是筛选用于肌醇六磷酸酶生产时显示有某种程度热耐受性的真菌。可按实施例1中所述方法进行这种筛选。以这种方法，已第一次鉴定了实施例1中所列的生产肌醇六磷酸酶的热耐受性真菌菌株。
可按本领域已知的方法，例如用热耐受性真菌(参见实施例1)菌株提供者，如American Tissue Type Culture Collection(ATCC)、Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)、Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)和Cen-tralbureau voor Schimmelcultures(CBS)等所指定的方法，或者，如实施例2中指出的方法培养这样的菌株。
进一步的改良的性质是例如改善了对植物和种子中的磷的主要储存形式的肌醇六磷酸[肌醇(1，2，3，4，5，6)六磷酸]底物特异性。为了从肌醇六磷酸中完全释放出六个磷酸基团，需要有足够活性的针对肌醇六磷酸和所有其它肌醇磷酸酯分子的酶。为了这种完全释放，需要使用例如黑曲霉肌醇六磷酸酶，加上pH2.5酸性磷酸酶。只有一种具所需活性的酶显然是一个进步。例如，国际专利申请No.94/03072中公开了以所需比例表达肌醇六磷酸酯降解酶之混合物的表达系统。然而，更期望在单一多肽中具有两种上述活性。因此本发明的目的还包括提供编码这种多肽的DNA序列。可用本领域已知的或实施例9中描述的方法检测肌醇六磷酸酶和磷酸酶。
另一个改良的性质是例如所谓改善的pH曲线。这就意味着例如两种肌醇六磷酸钙镁降解活性最大，例如一种是在大约pH2.5，其可能是某些动物胃中的pH；另一种在大约pH5.5，其可能是某些动物之胃以下组织中的pH。可用本领域已知的方法，例如实施例9中描述的方法确定这样的pH曲线。因此本发明还提供编码这些改良之多肽的DNA序列。
总的说来，本发明的目的是提供编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且该DNA序列是衍生于选自拉维氏短梗孢(Acrophialophora levis)、土曲霉(Aspekgillus terreus)、烟曲霉(As-pergillus，fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、酱油曲霉(As-pergillus sojae)、Calcarisporiella thermophila、Chaetomium rectopilium、Corynascus thermophilus、腐质霉菌种(Humicola sp.)、Mycelia sterilia、Myrococcum thermophilum、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、Rhizomucor Miehei、Sporotrichum cellulophilum、嗜热侧孢(Sporotrichumthermophile)、Scytalidium indonesicum和嗜热踝节菌(Talaromyces ther-mophilus)，或提供编码这样的多肽的仍具有肌醇六磷酸酶活性之片段的DNA序列，或更具体地说是这样一个DNA序列，即其中所说的真菌选自拉维氏端梗孢、烟曲霉、构巢曲霉、土曲霉、Calcarisporiellathcrmophila、Chaetomium rectopilium、Corynascus thermophilus、Sporotrichum cellulophilum、嗜热侧孢、Mycelia sterilia、嗜热毁丝霉和嗜热踝节菌，或者更具体地说的这样的DNA序列，即其中所说的真菌选自于土曲霉、Myceliophthora thermophilus、烟曲霉、构巢曲霉和Talaromyces thermophilus。编码本发明多肽之片段的DNA序列长度例如可在1350至900、较好在900至450，更好在450至150个核苷酸之间，并可基于完整多肽的DNA序列用本领域技术人员熟知的重组方法或化学合成方法制备之。
本发明的再一个目的是提供编码有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且其DNA序列选自(a)
图1的DNA序列或其互补链；(b)在标准条件下与(a)所限定的序列，或较好与这些序列的编码区，或更好这些DNA序列之491至1856位间的区域，或最好与使用如实施例12中描述的土曲霉9Al的DNA进行随机探查所得到的基因组探针相杂交的DNA序列。
(c)因为遗传密码的简并性而不与(a)或(b)的序列杂交，但编码与由这些DNA序列所编码的多肽有同样氨基酸序列之多肽的DNA序列；以及(d)作为(a)、(b)或(c)中所指定的DNA序列之片段的DNA序列。
杂交的“标准条件”在本文中是指本领域技术人员确定特异性杂交信号所通常使用的，并由Sambrook等人(“Molecular Cloning”，2th cds，Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989，N.Y.)所描述的条件，或较好是本领域技术人员熟悉的并在Sambrook等人的上述文献中描述的所谓严格杂交和非严格洗涤条件，或更好是所谓的严格杂交和严格洗涤条件，或者更好是如实施例12中给出的严格杂交条件和非严格或严格洗涤条件。“DNA序列的片段”在本文中是指编码仍具有如上所述肌醇六磷酸酶活性多肽的片段。
本发明的再一个目的是提供编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且该DNA序列选自(a)图2的DNA序列或其互补链；(b)在标准条件下与(a)中限定的序列，或较好是与扩展到大约至少占编码区80％，包括这些DNA序列之非编码区5’端的约l00到150位核苷酸的区域，或者更好是与这些DNA序列的2068至3478位核苷酸区域，或者最好与使用如实施例12中所述嗜热毁丝霉(Myccliophthora thermophila)的DNA进行随机探查所得到的基因组探针相杂交的DNA序列。
(c)因为遗传密码的简并性而不与(a)或(b)的序列杂交，但编码与由这些DNA序列编码的多肽有完全相同氨基酸序列之多肽的DNA序列；以及(d)作为(a)、(b)或(c)中指定是DNA序列的片段的DNA序列。
所述术语“片段”和“标准条件”具有如上给出的同样含义。
本发明的再一个目的是提供编码具有肌醇六磷酸酶活性的DNA序列，且所述DNA序列选自(a)含有图4、5、6或10所示DNA序列的DNA序列或其互补链
(b)在标准条件下与(a)中限定的序列杂交，或较好与含有可分离自嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilu)的图4之DNA序列，或可分离自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的图6的DNA序列、或可分离自土曲霉(Aspergillus terreus)(CBS 220.95)的图10的DNA序列之一或两者的上述序列杂交，或更好与至少跨越编码区的80％之这样的DNA序列的一个区域的序列杂交，或最好与使用的嗜热踝节菌或烟曲霉(A.fumigatus)或构巢曲霉(A.midulans)或土曲霉(A.terreus)(CBS 220.95)的DNA，以实施例12所述方法进行随机探查所得到的基因组探针杂交的DNA序列；(c)因为遗传密码的简并性，不与(a)或(b)的序列杂交，但编码与由这些DNA序列编码的多肽有完全相同之氨基酸序列的多肽的DNA序列；以及(d)作为(a)、(b)或(c)中指定的DNA序列的片段的DNA序列。
本发明的再一个目的是提供编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽的DNA序列，且所说DNA序列选自包含可分离自嗜热踝节菌的图4之DNA序列、可分离自烟曲霉的图5之DNA序列可分离自巢构曲霉的图6之DNA序列、或可分离自土曲霉(CBS 220.95)的图10之DNA序列的DNA序列，或具简并变异体或等同物。
术语“片段”和“标准条件”具有如上给出的同样含义。“简并变异体”在本文中是指因为遗传密码的简并性而与所指序列有不同的核苷酸序列，但编码有同样氨基酸序列之多肽的DNA序列。“等同物”在本文中是指编码具有肌醇六磷酸酶活性且氨基酸序列因缺失、取代和/或加入1个或多个氨基酸，较好多至50个，更好多至20个，进一步多至10个或最好多至5、4、3或2个氨基酸而不同于内其所指等同序列的DNA序列编码之多肽的氨基酸序列。一般不改变比活性的氨基酸取代是本领域中已知的，并且例如已由H.Neurath和R.L.Hill在“The Proteins”(Academic Press，New York，1976，特别是参见第14页图6)描述过。最常见的互换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly以及相反的交换(用于代表氨基酸的三字母缩写是本领域已知的标准缩写字)。
可用本领域已知的和Sambrook等人(文献同上)描述的方法生产这些等同物。可用本领域已知的或实施例9中所述的方法检定由这些等同物序列编码的多肽是否仍具有肌醇六磷酸酶活性。
本发明的再一个目的是提供编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的上述DNA序列之一，所说DNA序列衍生于真菌，或具体地说衍生于选自上文提到的特定组中的真菌之一。
本发明的再一个目的是提供编码肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且所说DNA序列在标准条件下与作为与分离自上述一组真菌之一的DNA和下列PCR引物对进行PCR反应产物的探针杂交＂ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA＂作为有意义引物，和＂TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA＂作为反义引物。
“标准条件”的含义同上所述。“PCR反应的产物”较好是指可通过参照实施例11的实施例12中所述反应可得到的，或更好是通过该反应所得到的产物。
本发明的再一个目的是提供编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，所说DNA序列在标准条件下与作为与分离自土曲霉(Aspergillus terreus)(CBS 220.95)的DNA和下列两个PCR引物对进行PCR反应所得产物的探针杂交)，(a)＂ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA＂作为有意义引物和＂TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA＂作为反义引物；(b)＂TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA＂作为有意义引物和＂CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C＂作为反义引物。
“标准条件”的含义同上所述；术语“PCR反应的产物”较好是指按实施例11中所述反应可得到的或更好是指按该反应得到的产物。
本发明的再一个目的是提供编码具有肌醇六磷酸酶活性之嵌合构建体的DNA序列。所述嵌合构建体包含如上文指定之DNA序列的片段，或较好这样的DNA序列中嵌合构建体在其N末端包含一个黑曲霉肌醇六磷酸酶的片段，并融合到其C末端的一个土曲霉肌醇六磷酸酶的片段上，或更好包括这样一个具有图7中所示特定核苷酸序列的DNA序列，和其简并变异体或等同物，其中“简并变异体”和“等同物”具有如上给出的意义。
本发明的再一个目的是提供如上文指定的DNA序列，其中所编码的多肽是肌醇六磷酸酶。
可按本领域已知的方法[如参见Yelton et al.，Procd.Natl.Acad.Sci.USA，1470—1474(1984)或Sambrook et al.，文献同上)，或按实施例2中所述方法从真菌菌株制备基因组DNA或eDNA。
然后例如使用已知的聚合酶链反应(PCR)方法从这样的基因组DNA中克隆到本发明的DNA序列。例如White等人(1989)描述了该方法的要点，而Innis等人[PCR ProtocolsAguid to Methods and Ap-plicalions，Academic Press，Inc.(1990)]则描述了改良的方法。PCR是一种体外大量生产有一定长度的特定DNA，和来自不同DNA序列之混合物的序列的方法。因此，PCR是基于酶促扩增感兴趣的特定DNA片段，所说的片段侧冀接有两个对该片段特异的，且杂交到靶序列之相反链上的寡核苷酸引物。引物是以它们的彼此指向的3’末端来定位的。对模板重复进行热变性循环，使引物退火到它们的互补序列上并用DNA聚合酶延伸退火的引物而导致在PCR引物间扩增该片段。因为每个引物的延伸产物均可用作另外者的模板，所以上每次循环基本上使前次循环中产生的DNA片段扩增双倍量。利用从嗜热细菌水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离的热稳定性TaqDNA聚合酶，已有可能避免在每个热变性步骤后必须加入的聚合酶发生变性。这一发展已导致可使用不同的单纯的温度循环装置自动进行PCR反应。另外，因为允许使用较高温度进行引物退火和链延伸，从而增加扩增反应的特异性。增加的特异性则通过减少非靶片段对酶和引物的竞争而改善了扩增产物的总得率。以这种办法有用的特异性序列得以高度扩增，并能很容易地借助已知方法，如在琼脂糖凝胶上分离将其与非特异性序列分离开，并使用例如Holten和(Craham[Nucleic Acid Res.19，1956(1991)]、Kovalic等人[NucleicAcid Res.19，4560(1991)]、Marchuk等人[Nucleic Acid Res.19，1154(1991)]或Mead等人[Bio/Technology 9，657—663(1991)]所描述的载体，按本领域已知的方法克隆之。
可用本领域已知的和例如Sambrook等人(1989，“Molecularcloning”2nd edt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Har-bor)所描述的方法制备用于PCR程序的寡核苷酸引物。
已根据对黑曲霉(A，niger)肌醇六磷酸酶、黑曲霉酸性磷酸酶、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酸性磷酸酶和梨形裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)酸性磷酸酶之已知序列的比较(有关序列信息参见European Bioinformatics Institute，Hinxton Hall，Cambridge，GB)，设计了在本发明实践中用作简并引物的特异性引物。根据基于黑曲霉的已知序列制备的黑曲霉的密码子使用表选择某些密码子，以降低引物的简并性。此外，已发现用于限定特异性探针的氨基酸序列的C末端上的氨基酸，应是在包括如上指定的肌醇六磷酸酶在内的所有酸性磷酸酶中所保留的氨基酸，但其余氨基酸应是肌醇六磷酸酶比磷酸酶更为特异。
然后可按本领域已知的或具体地说用实施例5—7中描述的方法，用如此扩增的DNA序列筛选例如真菌来源之DNA的DNA文库。
一旦得到了本发明的完整DNA序列，即可用本领域已知的并按Sambrook等人的上述文献中描述的方法将它们整合到载体中，以在适当的宿主系统中过表达所编码的多肽。但本领域技术人员都知道，也可用DNA序列本身转化本发明的适当的宿主系统，以过表达所编码的多肽。适当的宿主系统例如可以是真菌、如曲霉属的黑曲霉[ATCC 9142]或无花果曲霉(A.ficuum)[NRRL 3135]，或例如木霉等的黑宿木霉(Trichoderma reesei)，或酶母如酿酒酵母或毕赤酵母，如巴斯德毕赤酵母—所有这些微生物均可从ATCC得到。可使用的细菌可以是大肠杆菌、芽胞杆菌如枯草芽胞杆菌或链霉菌，如变青链霉菌(Streptomyces lividans)[参见Anne and Mallaert，FEMS Microbi-ol.Letters 114，121(1993)]。可使用的大肠杆菌是大肠杆菌K12菌株如M15[如Villarejo等人在J.Bacteriol.120，466—474(1974)中描述为DZ 291的菌株]、HB 101[ATCC No.33694]或大肠杆菌SG13009[Gottesman et al.，J.Bacteriol.148，265—273(1981)]。
可用于在真菌中表达的载体是本领域已知的并且是在EP 420358中，或Cullen等人[Bio/Technology 5，369—376(1987)]、或Word[Molecular Industrial Mycolgy，Systems and Applications for FilamentousFungi，Marcel Dekker，New York(1991)]、Upshall等人[Bio/Technology5，1301—1304(1987)]、Gwynne等人[Bio/Technology 5，71—79(1987)]、Punt等人[J.Biotechnology 17，19—34(1991)]描述过的，用于在酵母中表达的载体则是由Sreekrishna等人[J.Basic Micro-biol.28，265—278(1988)；Biochem.28，4117—4125(1989)]、Hitze-mann等人[Nature 293，717—722(1981)]或在EP 183 070、EP183071、EP 248 227、EP 263 311中描述过的。用于在大肠杆菌中表达的适当载体是例如Sambrook等人(文献同上)或Fiers等人[Procd.8th lnt.Biotechnology Symposium；Soc.Franc.de Microbiol.Paris(Durand et al.，eds.)pp.680—697(1999)]或Bujord等人[Methodsin Enzymology，eds.Wu and Grossmann，Academic Press，Inc.Vol.155，416—433(1987)]和Stuber等人[Immuno.Methods，eds.Lefkovitsand Pernis，Academic Press，Inc.，Vol.IV，121—152(1990)]所提列的。可用在芽胞杆菌中表达的载体是已知的并且是已在EP405370中，或Yansura[Proc.Natl.Acad.Sci VSA 81，439(1984)]和Memer[Meth.Enzym.185，199—228(1990)]或EP 207 459中描述过的。
这些载体已经携带调节元件如启动子，或可工程化改造本发明的DNA序列使之含有这些元件。可使用的适当启动子元件是本领域中已知的，并且适用于里赛木霉(Trichoderma reesei)的启动子元件是cbhl[Haarki et al.，Biotechnoloy 7，596—600(1989)]或Pkil启动子[Schindler et al.，Gene 130，271—275(1993)]，用于米曲霉的是amy启动子[Christersen et al.，Abstr.19th Lunteren Lectures onMolccular Genetics F23(1987)，Christensen et al.，Biotechnology 6，1419—1422(1988)、Tada et al.，Mol.Gen.Genet.229，301(1991)]、用于黑曲霉的是glaA-[Cullen et al.，Bio/Technology 5，369-376(1987)，Gwynne et al.，Bio/Tecbnlogy5，713-719(1987)，Ward in Molecular Industrial Mycology，Systems and Applications forFilamentous Fungi，Marcel Dekker，New York，83-106(1991)]，alcA-[Gwynneet al.，Bio/Technology 5，71-719(1987)]，sucl-[Boddy et al.Current Genetics24.60-66(1993)]，aphA-[MacRae et al.，Gene 71，339-348(1988)，MacRae et al.，Gene 132.193-198(1993)]，tpiA-[McKnight et al.，Cell 46.143-147(1986)，Upshall et al.，Bio/Technology 5，1301-1304(1987)]，gpdA-[Punt et al.，Gene69.49-57(1988)，Punt et al.，J.of Biotechnology 17，19-37(1991)]和pkiA-启动子[de Graaff et al.，Curr.Genet.22.21-27(1992)]。可用于在酵母中表达的适当启动子元件是本领域已知的并且可以是pho5启动子[Vogel et al.，Molecular and Cellular Biology，2050—2057(1989)Rudolf and Hinnen，Proc.Natl.Acad.Sci.84，1340—1344(1987)]，或用于在酿酒酵母中表达的gap启动子，及用于在巴斯德华赤酵母中表达的例如aox启动子[Koutz et al.，Yeast 5，167—177(1989)；Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.28，265—278(1988)]。
因此，包含本发明的DNA序列，较好是适于在细菌或真菌或酵母宿主中表达所说DNA序列的载体，以及这些被转化的细菌或真菌或酵母宿主也是本发明的主题。
一旦在存在于适当培养基中的适当宿主细胞中表达了这些DNA序列，即可用已知的蛋白质纯化方法或例如EP420 358中描述的方法从培养基中(在肌醇六磷酸酶产物被分泌到培养基中的情况下)或从宿主生物体中(在肌醇六磷酸酶存在于细胞内的情况下)分离其所编码的肌醇六磷酸酶。因此，制备本发明之多肽的方法的特征在于在适当培养条件下培养上述被转化的细菌或宿主细胞，并从中回收多肽；用这样的方法产生的多肽或由本发明的DNA序列编码的多肽也是本发明的主题。
一旦得到本发明的多肽，即可用本领域已知的或如Engelen等人[J.AOAC Intern.77，760—764(1994)]或实施例9中所述的方法鉴定其活性。就检测用于农业的本发明多肽的性质来说，可使用本领域已知的和Simons等人[British J.of Nutrition 64，525—540(1990)]、Schner等人[J.Anim.Physiol.a.Anim.Nutr.6.248—255(1991)]、Vogt[Arch，Geflügelk.56.93—98(1992)]、Jongbloed等人[J.Anim，Sci..70.1159—1168(1992)]、Rerney等人[PoultryScience 72.2106—2114(1993)]、Farrell等人[J.Anim.Physiol.a.Anim.Nutr.69，278—283(1993)]、Broz等人[British Poultry Science35，273—280(1994)]、Düngelhoef等人[Animal Feed Science and Tech-nology 49，1—10(1994)]所述的检测法。就它们的热耐受性而言可使用本领域已知的和例如Yamada等人(文献同上)所描述的检测法检测，并可用本领域已知的和实施例9中描述的或Yamada等人(文献同上)描述的任何检测法检测它们的pH和底物特异性曲线。
一般说来，可不限于特定的应用领域，将本发明的多肽用于使肌醇六磷酸转化成肌醇和无机磷酸。
另外，本发明的多肽可用于制备复合食品或饲料的方法中，其中这种组合物的成分是与一种或多种本发明的多肽相混合的。因此，包括一种或多种本发明之多肽的化合物食品或饲料也是本发明的主题。本领域技术人员熟知它们的制备方法。这类复合食品或饲料还可含有添加剂或用于这种目的的成分，并且是本领域已知的。
本发明的再一个目的是提供一种降低动物粪肥中肌醇六磷酸水平的方法，其特征在于给动物饲喂有效量的这种饲料组合物，以将饲料中所含的肌醇六磷酸转化成肌醇和无机磷酸。实施例所用的特定培养基和溶液完全培养基(Clutterbuck)葡萄糖 10g/l—CN溶液10ml/l硝酸钠 6g/l细菌蛋白胨(Difco Lab.，Detroit，MI，USA)2g/l酵母浸膏1g/l酪蛋白氨基酸(Difco) 1.5g/l改良的微量元素溶液 1ml/l维生素溶液 1ml/lM3培养基葡萄糖 10g/l—CN溶液10ml/l改良的微量元素溶液 1ml/l硝酸铵 2g/l
M3培养基—磷酸盐M3培养基，其中用—CNP代替—CNM3培养基—磷酸盐＋肌醇六磷酸M3培养基—磷酸盐加上5g/l Na12肌醇六磷酸(Sigma#P—3168；Sigma，St.Louis，MO，USA)改良的微量元素溶液CuSO40.04％FeSO4·7H2O 0.08％Na2MoO4·2H2O 0.08％ZnSO4·7H2O 0.8％B4Na2O7·10H2O0.004％MnSO4·H2O 0.08％维生素溶液核黄素 0.1％尼克酰胺0.1％对位氨基苯甲酸 0.01％吡哆醇/HCl0.05％维生素B1/HCl 0.05％
生物素 0.001％—CN溶液KH2PO4140g/lK2PO4·3H2O90g/lKCl10g/lMgSO4·7H2O 10g/l—CNP溶液HEPES 47.6g/200mlKCl2g/200mlMgSO4·7H2O 2g/200ml实施例1筛选产生肌醇六磷酸酶活性的真菌使用下列三种培养基在三个平板系统上筛选真菌“M3”(一种含有磷酸盐的限定的培养基)，“M3—P”(缺少磷酸盐的M3培养基)和“M3－P＋肌醇六磷酸”(缺少磷酸盐但含有肌醇六磷酸作为单一磷源的M3培养基)。用琼脂糖制备平极以降低磷酸盐的本底水平。
使真菌在培养基上和提供者推荐的温度下生长。将孢子和菌丝体转移到试验平板上并在推荐的温度下保温直到观察到生长。
发现下列耐热菌株表面有这种生长嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)[ATCC 48 102]嗜热裸节菌(Talaromyces thermophilus)[ATCC 20 186]烟曲霉[ATCC 34 625]实施例2真菌的生长和基因组DNA的制备使嗜热毁丝霉、嗜热裸节菌、烟曲霉、构巢曲霉、土曲霉9A—1和土曲霉CBS 220.95生长在马铃薯右旋糖培养液(Difco Lab.，De-troit.MI，USA)或完全培养基(Clutterbuck)中。土曲霉9A—1和构巢曲霉已按用于专利目的的布达佩斯条约规定分别于1994年3月7日和1995年2月17日保藏在DSM(Braunschweig，BRD)，登记号为DSM 9097和DSM 9743。
按下述方法制备基因组DNA用孢子和生长的O/N在振荡下以高密度接种培养基。如此产生一小的真菌团的厚层培养物。过滤回收菌丝体，吸干并称重。每份制品达2.0g。在液氮中将菌丝体研成丝粉末，直接加到10ml提取缓冲液(200mM Tris/HCl、250mM NaCl、25mM EDTA、0.5％SDS、pH8.5)并混匀。向浆液中加入苯酶(7ml)，混合后再加入氯仿(3ml)并再次混匀。离心混合物(20,000g)并回收液相。加入RNaseA到终浓度250μm/ml并于37℃保温15分钟。然后用1体积氯仿提取混合物并离心(10,000g，10分钟)。回收液相并用0.54体积RT异丙醇在室温下沉淀DNA 1小时。将DNA浇在玻棒上回收之并重新悬浮在水中。
按下述方法进一步纯化所得DNA在37℃用蛋白质K将一部分DNA消化2小时，然后重复(2至3次)用等体积苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀，再重新悬浮在水中达到浓度约1μg/μl。
实施例3简并PCR基本上按照Perkin Elmer Cetus[(PEC)；Norwalk，CT，USA]的方法进行PCR。使用下列两个引物(括号中指出的碱基是两者/或之一)Phyt85’ATG GA(CT)ATG TG(CT)TCN TT(CT)GA3’简并度＝32温度高＝60℃/温度低52℃Phyt95’TT(AG)CC(AG)GC(AG)CC(GA)TGNCC(GA)TA3’温度高＝70℃/温度低58℃
典型反应按下述方法进行H2O 24.5μl10XPEC GeneAmp缓冲液 5μlGeneAmp dNTP’s(10mM) 8μl引物1(Phyt8，100μM) 5μl引物2(Phyt9，100μM) 5μlDNA(～1μg/ml) 1μlTaq聚合酶(PEC) 0.5μl50μl除Taq聚合酶外，所有成分均在95℃保温10分钟，再在50℃保温(10)分钟，然后放在冰上反应。之后加入Taq聚合酶(Amplitaq，Hoffmann—La Roche，Basel，CH)并按下述循环程序在Triothermoblock(Biometra，Gottingen，DE)中进行35次PCR循环95℃/60″50℃/90″72℃/120″在1.5％琼脂糖凝胶上分析一等分的反应混合物。
实施例4PCR片段的亚克隆和序列测定从低熔点琼脂糖中切下预期大小的PCR产物(得自黑曲霉的DNA序列推测约146bp)并基本上按照制造者推荐的方法从NACS—PR EPAC柱(BRL Life Technologics Inc.，Gaithersburg，MD，USA)上纯化之。于37℃在50μl 100mM卡可酸钠pH6.6、12.5mM Tris/HClpH7.0、0.1mM二硫苏糖醇、125μg/ml牛血清白蛋白、1mM CoCl2、20μM dATP、10单位末端脱氧转移酶(Boehringer Mannheim，Mannheim，DE)使片段聚腺苷酸化5分钟，并克隆到p123T载体[Mitchell et al.，PCR Meth.App.2，81—82(1982)]另外，可纯化PCR片段并使用“Sure Clone”连接药盒(Pharmacia)按制造商提供的说明书克隆之。
按照制造商推供的方法，使用二脱氧方法和Pharmacia T7药盒(Pharmacia，LKB Biotechnology AB，Uppsala，SE)对在Quiagen柱(Diagen GmbH，Hilden，DE)上纯化的ds DNA进行序列测定。
实施例6λFix II文库的构建和筛选使用得自土曲霉菌株9A—1和嗜热毁丝酶的片段进行BamHI和BglII Southerns探查，以确定用于在λFix II载体(Strategene，La Jol-la，CA，USA)中构建基因组文库的适当限制性酶。λFix II可能只接受来自9—23 kb的插入段。按下述方法进行Southern分析。以200μl的最终体积消化基因组DNA(10μg)。准备进行无酶参加的反应并在水上保温2小时。加入酶(50单位)并在适当温度下将反应混合物保温3小时。然后用等体积苯酚/氯仿提取并用乙醇沉淀。将在装填缓冲液中重新悬浮的DNA加热到65℃并保持15分钟，然后在0.7％琼脂糖凝胶(O/N 30V)上分离之。在转移前将凝胶在0.2MHCl中室温下洗两次，然后在1M NaCl/0.4M NaOH中室温下洗两次(15’)。将转移到0.4M NaOH中的DNA在毛细管中经4小时转移到Nytran 13N尼龙膜(Scileicher and Schuell AG，Feldbach，Zurich，CH)上。转移后使膜暴露于紫外线下[Auto cross—link，UV Stralinker2400，Stratagene(La Jolla，CA，USA)]。
在杂交缓冲液[50％甲酰胺、1％十二烷基硫酸钠(SDS)、10％硫酸葡聚糖、4XSSPE(180mM NaCl、10mM NaH2PO4、1mM EDTA，pH7.4)]，将膜于42℃预杂交4小时，再加入变性的探针后于42℃下O/N。洗涤印迹1XSSPE/0.5％SDS/室温/30分钟0.5XSSPE/0.1％SDS/室温/30分钟0.1XSSPE/0.1％SDS/65℃/30分钟结果表明，用Bam HI消化的土曲霉菌株9A—1基因组DNA和用Bgl II消化的嗜热毁丝霉基因组DNA产生适于克隆到λFixII载体中的片段。
按照制造商提供的方法(Stratagene在λFixII中构建土曲霉菌株9A—1和嗜热毁丝菌的基因组文库。
将λ文库铺敷在每文库10个137mm平板上。将噬斑挖出移至Nytran 13N圆形滤膜上并在0.5M NaOH/1.5M NaCl中处理1分钟，然后在0.5M Tris—HCl pH8.0/1.5M NaCl中处理5分钟。再将滤膜在2XSSC中处理5分钟进行空气干燥。然后用紫外线将其固定(1分钟，UV Stratalinker 2400，Stratagene)。滤膜按上述方法杂交并洗涤。记录推测的阳性噬斑并在SM缓冲液(180mM NaCl、8mM MgSO4·7H2O、20mM Tris/HCl pH7.5，0.01％明胶)浸出噬菌体。稀释该材料并铺敷在137mm平板上。移出复制滤膜并按上述方法处理。从各平板中排出清楚的单个阳性噬斑并在SM缓冲液中稀释之。排出三个阳性噬斑。两个来自土曲霉菌株9A—1(9Alλ17和9Alλ22)，一个来自嗜热毁丝霉(MTλ27)。
实施例6λDNA的制备和克隆的验证从阳性噬斑制备λDNA。使用“Magic Lambda Prep”系统(PromegaCorp.，Madison，WI，USA)并按照制造商推拱的说明书进行制备。为证实克隆确实性，用PstI和SalI消化λDNA并用PCR产物探查所得印迹。在所有情况下，该被证实的克隆均被含有互补于探针之序列的克隆。
实施例7肌醇六磷酸酶基因的亚克隆和序列分析用PstI消化得自9Alλ17的DNA，将所得的片段混合物连接到用PstI切割的pBluescript IISK+(Stratagene)上，并用河虾碱性磷酸酶(United State Biochemical Corp.，Cleaveland，OH，USA)处理。在15℃对连接混合物进行O/N。将连接混合物转化到XL—1 Blue Supercompetent细胞(Stratagene)中，并铺敷在含0.5mM异丙醇—β—D—硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、40μg/ml 5—溴—4—氯—3—吲哚基—β—D—半乳糖苷(Xgal)、50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。
用Bgl II和Xba I消化得自9Aλ17的DNA并将所得混合物连接到用Bam HI/Xba I消化的pBluescript II Sk+中。按上述方法连接、转化和筛选。
用Sal I消化得自MTλ27的DNA，将所得片段的混合物连接到用SalI切割的pBluescript II SK+中，并用河虾碱性磷酸酶处理。连接混合物在16℃下O/N。将连接混合物转化到XL—1 Blue Supercompe-tent细胞中并铺敷在含有XgaI/IPTG和氨苄青霉素的LB平板上。
挑出上述转化所得的集落并“栅格定位”约75个集落到单一平板。37℃O/N保温后，将集落挖出移到尼龙滤膜(“Hybond—N”，Amersham Corp.，Arlington Heights，IL，USA)上，并用0.5M NaCl处理1分钟，用1M Tris/HCl pH7.5处理两次各1分钟，然后用0.5Tris/HClpH7.5/1.5M NaCl处理5分钟。空气干燥滤膜后用紫外线固定之(2分钟，UV Stratalinker 2400，Stratagene)，将滤膜与实施例5的PCR产物杂交。选择阳性集落并制备DNA。按实施例4中所述方法测定亚克隆序列。测得的土曲霉菌株9Al的肌醇六磷酸酶及其编码DNA的序列示于图1中，图2则显示来自嗜热毁丝霉的肌醇六磷酸酶的序列及其编码DNA序列。图3A显示土曲霉DNA的限制图(其中箭头为编码区，条纹为编码区之外所测定序列的区域，且图3B显示来自嗜热毁丝菌的DNA的限制图；图4显示来自嗜热裸节菌之肌醇六磷酸酶的一部分及其编码DNA序列；图5显示来自烟曲霉之肌醇六磷酸酶的一部分及其编码DNA序列；图6显示来自构巢曲霉之肌醇六磷酸酶的一部分及其编码DNA序列。按照实施例2—7中所述涉及土曲霉菌株9Al和嗜热毁丝霉肌醇六磷酸酶的同样方法，制得来自嗜热裸节菌、烟曲霉和构巢曲霉之肌醇六磷酸酶的序列及它们的编码DNA序列。用惯用的一字母代码缩写字以小写字母给出两条链的碱基。在相应DNA序列下方用惯用的一字母代码以大写字母给出衍生的肌醇六磷酸酶的氨基酸序列。
实施例8黑曲霉和土曲霉肌醇六磷酸酶DNA序列间嵌合构建体的构建使用Sambrook等人(1989)(Molecular cloning，ALaboratory Man-nual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)所述的标准分子生物学方法进行所有的构建。
将EP 420 356中所述的黑曲霉肌醇六磷酸酶的前146个氨基酸融合到土曲霉9Al基因的320末端氨基酸上。在用PCR克隆了黑曲霉肌醇六磷酸酶基因时，在ATG起始密码子处引入NcoI位点。使用下列引物(其中竖短线指示向其左侧的序列与第一个外显子的3’端杂交，向其右侧的序列与第二个外显子的5’端杂交)，以位点针对性诱变法(Bio—Rad药盒，Cat Nr170—3581；Bio—Rad.Richmond，CA，USA)除去见于黑曲霉肌醇六磷酸酶中的内含子。
为了构建黑曲霉和土曲霉之肌醇六磷酸酶的嵌合构建体，在黑曲霉编码序列中导入Eco 4711位点以帮助克隆之。使用以诱变引物(5’CGA TTC GTA GCG CTG GTA G3’)含用T3引物进行的PCR产生用Bam HI和Eco RI裂解的DNA片段。将Bam HI/Eco47III片段插入经p9AlPst切割的Bam HI/Eco47III中实施例7。图7显示该融合构建体的氨基酸序列和其编码DNA序列。
实施例9肌醇六磷酸酶的表达表达载体的构建为了在黑曲霉中表达融合构建体，选择其中融合基因处于可诱导的黑曲霉葡糖淀粉酶(glaA)启动子控制下的表达暗盒。
对于完整土曲霉9Al基因，制得带有结构性构巢曲霉甘油醛—3—磷酸脱氢酶(gpd A)启动子的表达暗盒。
用于在黑曲霉中表达的所有基因均携带自已的分泌信号序列。
载体pFPANl的构建从质粒pDH33[Smith et al.(1990)，Gene 88259—262]中分离出作为1960bpXhoI/Cla I片段的黑曲霉葡糖淀粉酶(gla A)启动子，并克隆到含有构巢曲霉trp C终止子之710 bp BamHI/Xba I片段的pBluescript SK+载体(pBS)[Stratagene，La Jolla，CA，USA]中。带有此暗盒的质粒被定名为pGLAC。通过将切成平头的NcoI/EcoRI片段连接到质粒pGLAC的切成平头的ClaI位点和EcoRV位点上，使实施例8中所述的融合基因处于黑曲霉gla A启动子的控制下。经限制性酶消化验证正确方向。将整个暗盒作为KpnI/XbaI片段转移到pUC19(New England Biolabs，GmbH，Schwalbach，BRD)中，其携带粗糙链孢霉(Neurospora crassa)pyr4基(pUC19—phr4)—一种在尿苷营养缺陷型曲霉中的选择标志，得到载体pFPANl(参见附有所指出的限制性位点和编码区的图8；横线划出的位点指示平端连接的位点)。
载体pPATl的构建从质粒pAN52—1[Punt et al.(1987)，Gene 56117—124]中分离作为～2.3kb EcoRI/NcoI片段的构巢曲霉甘油醛—3—磷酸脱氢酶(gpdA)启动子，克隆到pUC19—NcoI(具有被NcoI位点取代之SmaI位点的pUC19)中，再作为EcoPI/BamHI片段分离之并克隆到带有上述trpC终止子的pBS中。所得到的暗盒称为pGPDN。分离作为NcoI/EcoRi片段的土曲霉基因，其中填入EcoRI位点以产生平头。用BamHI和NcoI切割质粒pGPDN。填入Bam HI位点以产生平头。将土曲霉基因的NcoI/EcoRI(平头)片段克隆到gpdA启动子和trpC终止子之间。分离作为KpnI/XbaI片段的表达暗盒并克隆到pUC19—pyr4中，得到质粒pPATl(参见图9；对缩写字的解释见图8)。
在黑曲霉中表达融合蛋白质A)转化使用Ballance等人[(1983)，Biochem，Biophys.Res.Commun.112，284—289]的作如下改动的转化方法用质粒pFPANl转化黑曲霉—用每毫升106个孢子接种YPD培养基(1％酵母浸膏，2％蛋白胨、2％右旋糖)，并在30℃和250rpm条件下培养24小时；—使用Wero—Lene N组织(No.8011.0600 Wernli AG Verbandstof-fabrik，4852 Rothrist，CH)收获细胞，并用缓冲液(0.8M KCl、0.05M CaCl2，在0.01M琥珀酸盐缓冲液中，pH5.5)；—只使用溶解酶(SIGMA L—2265，St.Louis，MO，USA)进行原生质体制备；—在30℃和100rpm条件下将细胞保温90分钟，并经过滤(Wero—Lene N组织)分离原生质体；—用STC(1M山梨醇、0.05M CaCl2、0.01M Tris/HCl，pH7.5)将原生质体洗一次并重新悬浮在同样缓冲液中；—将150μl原生质体(～108个/ml)与10—15μg质粒DNA轻轻混合并于室温下(RT)保温25分钟；—分三步加入聚乙二醇(60％PEG 4000，50mM CaCl2、10mM Tris/HCl，pH7.5)，每次各150μl，200μl和90μl，并在室温再将样品保温25分钟；—加入5ml STC，离心并将原生质体重新悬浮在2.5ml YGS(0.5％酵母浸膏、2％葡萄糖、1.2M山梨醇)；—将样品于30℃(100rpm)保温2小时，离心并将原生质体重新悬浮在1ml 1.2M山梨醇中；—将转化的原生质体与20ml基本再生培养基(0.7％无氨基酸酵母氮碱、2％葡萄糖、1M山梨醇、1.5％琼脂、20mM Tris/HCl(pH7.5)，其中每升溶加0.2g精氨酸和10ug尼龙酰胺)；—将平板于30℃保温3—5天。B)表达分离单个转化体、纯化并试验其融合蛋白质的过量产生。100mlM25培养基(每升含70g麦芽糖糊精(Glucidex 17D，Sugro Basel，CH)、12.5g酵母浸膏、25％酪蛋白水解物、2g KH2PO4、2gK2SO4、0.5gMgSO4·7H2O、0.03g ZnCl2、0.02g CaCl2、0.05g MnSO4·4H2O、0.05gFeSO4，ph5.6)分别接种得自转化体FPANl#11、#13、#16、#E25、#E30和E31的106个孢子/ml，并于30℃和270rpm条件下保温5天。收集上清并检测活性。该融合蛋白质用肌醇六磷酸作为底物于pH2.5条件下显示有最高活性，而用4—硝基苯基磷酸酯作为底物则在pH2.5和5.0显示两个最佳活性(表1)。
c)活性检测法a)肌醇六磷酸1ml酶反应混合物含有0.5ml透析的上清液(如必要须稀释)和5.4mM肌醇六磷酸(SIGMAP—3168)。分别在0.2M乙酸钠缓冲液(pH5.0)、0.2M甘氨酸缓冲液(pH2.5)中进行反应。样品于37℃保温15分钟。加入1ml 15％TCA(三氯乙酸)终止反应。
为进行颜色反应，用0.9ml蒸馏水稀释0.1ml终止反应的样品，并与1ml试剂溶液(3体积1M H2SO4、1体积2.5％(NH4)6Mo7O24、1体积10％抗坏血酸)。样品于50℃保温20分钟并于820nm处以分光光度法检测所呈现的兰色。因为该检测法是基于磷酸的释放，故使用磷酸准曲线来(每毫升11—14nmol)确定样品的活性。
b)4—硝苯基磷酸酯1ml酶反应混合物含有100μl透析的上清液(如必要时须稀释)和1.7mM4—硝基苯基磷酸酯(Merck，6850，Darmstadt，BRD)。分别在0.2M乙酸钠缓冲液pH5.0和0.2M甘氨酸缓冲液pH2.5中进行酶反应。样品于37℃保温15分钟。加入1ml 15％TCA终止反应。
使用如上所述的方法检测酶活性。
表1
>*每毫升单位数1单位＝31℃下每分钟释放1umol磷酸1未转化在黑曲霉中表达土曲霉9Al基因用上述质粒pPAT1转化黑曲霉NW205。分离单个转化体，纯化并根据土曲霉蛋白质的过产生量筛选之。用分别得自转化体PATl#3、#10、#11、#13和#16的106个孢子/ml接种50ml YPD培养基并于30℃和270rpm条件下保温3天。收集上清液并大致按上述方法检测活性，只是酶反应的pH不同。用肌醇六磷酸作底物，酶在pH5.5时显示有其最大活性，而用磷酸硝基苯酯作底物则在pH3.5时表现有最大活性(表2)。
表2
* 每毫升单位数1单位＝37℃下每分钟释放1umol磷酸1未被转化实施例10黑曲霉NW205转化体的发酵A)转化体FPANl#11用加在振荡瓶中的106个孢子/ml接种预培养基[每升含30g麦芽糖糊精(GlucideX170)、5g酵母浸膏、10g酪蛋白水解物、1gKH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、3g Tween 80；pH5.5]，并在34℃和250rpm条件下保温24小时。
用预培养物接种10升发酵罐以将预培养物最终稀释到1∶100。在30℃进行分批发酵，自动控制的溶解氧浓度最小为25％(pO2≥25％)。用5M NaOH自动滴定以使pH保持3.0。
用于发酵的培养基是每升含35g麦芽糖糊精、9.4g酵母浸膏、18.7g酪蛋白水解物、2g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、2gK2SO4、0.03gZnCl2、0.02g CaCl2、0.05g MnSO4·4H2O、0.05g FeSO4；pH5.6。
在这些条件下发酵3天后，如用肌醇六磷酸作底物，pH2.5时所达到的酶活性为35单位/ml，pH5.0时为16单位/ml；如用4—磷酸硝基苯酯作底物，pH2.5时为295单位/ml，pH5.0时为90单位/ml。B)转化体PATl#11预培养，发酵罐的接种和发酵培养基均同上所述，不同的是经用5M NaOH自动滴定使pH保持在4.5。
在这些条件下4天后所达到的酶活性分别是，用肌醇六磷酸作底物且在pH5.5时为17.5单位/ml，用4—硝基苯基磷酸酯作底物且在pH3.5时为2单位/ml。
实施例11土曲霉(CBS 220.95)肌醇六磷酸酶基因PCR片段分离使用土曲霉(CBS 220.95)的DNA，用两个不同的引物进行片段的PCR扩增。所用引物如下表所示。
黑体字DNA序列显示有意义引物，斜体字则显示反义引物。引物相当于黑曲霉基因之编码序列的所指出部分。使用的组合是引物8加9和10加11。按照制造商推荐的方法使用由Clontech(Palo Al-to，CA，USA)提供的Tag—Start抗体药盒。引物8加9的浓度为0.2mM，引物10加11的浓度为1mM。使用Touch—down PCR进行扩增[Don，R.H.et al.(1991)，Nucleic Acids Res.19，4008]。首先于95℃使DNA变性3分钟。然后是两次循环，每次使用下列退火温度60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃、52℃和51℃，退火时间各1分钟。退火之前，加热至95℃保温1分钟；退火后于72℃进行延伸反应30秒。如下程序进行21至35次循环95℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃链延伸30秒钟。
得到两个不同的PCR片段。所得到的DNA序列和它们与土曲霉9Al之肌醇六磷酸酶基因相关部分的比较如图10中所示[土曲霉9Al肌醇六磷酸酶基因的相关部分“9Al”(上引)(1)；土曲霉CBS220.95的PCR片段“aferr 21”(下引)。其中A图用引物对8加9得到的片段(aterr 21)。B图用引物对10加11得到的片段(aterr58)。土曲霉CBS 220.95的DNA序列(上引)与土曲霉9Al的DNA序列(1)(下引)]相比较。A图aterr 21片段中的黑体字gc序列(碱基16加17)可能是cg(DNA序列测定的不确定性)。B图aterr58 PCR片段26位的X可能代表四种核苷酸的任何一种]。
实施例12在非严格和严格洗涤条件下交叉杂交将表3中所列各菌株的各5pg基因组DNA分别与每μgDNA 4单位的Hind III或Pst I于37℃保温4小时。消化后，用苯酚提取该混合物并用乙醇沉淀DNA。然后在0.8％琼脂糖凝胶上分析样品。使用含有1M NaCl的0.4M NaOH作为转移溶液将DNA转移到Nytran膜(Schleicher&Schuell，Keene，NH，USA)上。于42℃杂交18小时。杂交溶液每毫升含有50％甲酰胺、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、4XSSPE(1XSSPE＝0.18M NaCl，1mM EDTA、10mM NaH2PO4、pH7.4)、0.5％blotto(干牛奶粉加在水中)和0.5mg鲑鱼精子DNA。在使用最后的和最严格洗涤条件的非严格条件下，在含有0.1％SDS的0.1XSSPE中室温保温30分钟洗膜。所使用的探针(以大约109dpm/μg DNA)的比活性标记的)是使用嗜热毁丝霉(Myceli.ther-mo.)构巢曲霉(Asperg.midul.)烟曲霉(Asperg.fumig.)、土曲霉9Al(Asperg.terreus 9Al)、嗜热裸节菌(Talarom.thermo.)的基因组DNA用引物8加9产生的PCR片段(参见实施例11)。经随机引导(按照Pharmacia，Uppsala，Sweden给出的方法)得到MT2基因组探针，并跨越1410 bp，即从嗜热毁丝霉肌醇六磷酸酶基因之N末端的BspEI位点上游到C末端中的PvuII位点(位置2068至3478)。经随机引导得到AT2基因组探针并跨越1365bp，即从土曲霉9Al肌醇六磷酸酶基因的Apal位点到NdeI位点(位置491至1856)。经随机引导得到AN2 DNA探针并跨越黑曲霉基因(EP 420 358)的完整编码序列(1404bp)。结果在表3中给出。[“*”除外相当于非特异性20kb片段的弱信号；在很弱交叉杂交信号的情况下，使用来自嗜热裸节菌的PCR片段在20kb处见有来自黑曲霉的DNA，因为它明显不同于含有肌醇六磷酸酶基因的预期的10kb Hind III片段，所以该片段是非特异性的；“**”只因DNA的部分消化所产生的信号]。
为了用严格洗涤条件进行交叉杂交，进一步于65℃在含有0.1％SDS的0.1XSSFE中洗涤30分钟。结果示于表4中[(1)只是仍测到10.5kb HindIII片段，而未出现6.5kb Hind III片段(参见表3)]。
权利要求
1.编码具有肌醇六磷酸酶活的DNA序列，该DNA序列衍生于选下列一组中的真菌拉维氏端梗孢((Acrophialophora levis)、土曲霉(Aspergillus terreus)、烟曲霉(Aspergillus，fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、Calcarisporiellathcrmophila、Chaetomium rectopilium、Corynascus thermophilus、腐质霉菌种(Humicola sp.)、Mycelia sterilia、Myrococcum thermophilum、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、Rhizomacor Miehei、Sporotrichumcellulophilum、嗜热侧孢(Sporotrichum thermophile)、Scytalidium in-donesicum和嗜热踝节菌(Talaromyces Thermophilus)，或编码这样一个仍具有肌醇六磷酸酶活性之片段的DNA序列。
2.根据权利要求1的DNA序列，其中真菌选自下列的一组中拉维氏端梗孢(Acrophialophora levis)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、上曲霉(A.terreus)、构巢曲霉(A.nidulans)、Calcarisporiella thermophi-la、Chaetomium rectopilium、Corynascus thermophilus、Sporotrichum cell-dophilum、Sporotrichum thermophile、Mycelia sterilia、嗜热毁丝霉(Myce-liophthora thermophila)和嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)。
3.根据权利要求2的DNA序列，其中真菌选自土曲霉、嗜热毁丝霉、烟曲霉、构巢曲霉和嗜热踝节菌。
4.编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，所说的DNA序列选自(a)图1所示的DNA序列和其互补链；(b)在标准条件下与(a)中限定的序列杂交的DNA序列；(c)因为遗传密码的简并性，不与(a)或(b)的序列杂交，但编码与由这些DNA序列编码的多肽有确切相同氨基酸的多肽的DNA序列；和(d)作为(a)、(b)或(c)中指定的DNA序列之片段的DNA序列。
5.编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，该DNA序列选自(a)图2所示的DNA序列和其互补链；(b)在标准条件下与(a)所限定的序列杂交的DNA序列；(c)因为遗传密码的简并性，在与(a)或(b)的序列杂交，但编码与由这些DNA序列编码的多肽有确切相同的多肽的DNA序列；和(d)作为(a)、(b)或(c)中指定的DNA序列之片段的DNA序列。
6.编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，该DNA序列选自(a)包括图4、5、6或10的DNA序列之一的DNA序列或其互补链；(b)在标准条件下与(a)所限定的序列杂交的DNA序列；(c)因为遗传密码的简并性，不与(a)或(b)的序列杂交，但编码与由这些DNA序列编码的多肽有确切相同的多肽的DNA序列；和(d)作为(a)、(b)或(c)中指定的DNA序列之片段的DNA序列。
7.编码具有肌醇六磷酸酶活性的DNA序列，该DNA序列选自包括可从嗜热踝节菌中分离的图4 DNA序列、可从烟曲霉中分离的图5之DNA序列、可从构巢曲霉中分离的图6之DNA序列、可从上曲霉(CBS 220.95)中分离的图10之DNA序列的DNA序列，或该DNA序列是其简并变异体或等同物。
8.根据权利要求4至6中任何一项的DNA序列，其编码具有肌醇六磷酸酶活性的多肽，且该DNA序列衍生于真菌。
9.根据权利要求8的DNA序列，其中真菌选自如权利要求1、2或3所限定的组中。
10.编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且该DNA序列在标准条件下与作为与分离自如权利要求1至3中任一项中所限定之真菌的DNA和下列PCR引物对之PCR反应产物的探针相杂交“ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA”作为有意义引物，和“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”作反义引物。
11.编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，且该DNA序列在标准条件下与一探针杂交，所说的探针是与分离自土曲霉(CBS220.95)的DNA和下列PCR引物对的PCR反应的产物(a)“ATGGA(C/T)ATGTG(C/T)TC(N)TT(C/T)GA”作为有意义引物和“TT(A/G)CC(A/G)GC(A/G)CC(G/A)TG(N)CC(A/G)TA”作为反义引物；以及(b)“TA(C/T)GC(N)GA(C/T)TT(C/T)TC(N)CA(C/T)GA”作为有意义引物和“CG(G/A)TC(G/A)TT(N)AC(N)AG(N)AC(N)C”作为反义引物。
12.编码具有肌醇六磷酸酶活性之嵌合构建体的DNA序列，该嵌合构建体包括如权利要求1至11中任何一项所限定的DNA序列的片段。
13.编码如权利要求12中限定的嵌合构建体的DNA序列，该嵌合构建体包括在其C末端融合到土曲霉肌醇六磷酸酶片段上的在其N末端的黑曲霉肌醇六磷酸片段。
14.如权利要求13中限定的具有如图7所示特异性核苷酸序列的DNA序列，和其简并变异体或等同物。
15.如权利要求1至14中任何一项所限定的DNA序列，其中所编码的多肽是肌醇六磷酸酶。
16.由如权利要求1至15中任何一项所限定的DNA序列编码的多肽。
17.包括如权利要求1至15中任何一项中所限定的DNA序列的载体。
18.如权利要求17中所限定的适于在细菌或真菌或酵母宿主中表达所说的DNA序列的载体。
19.被如权利要求1至15中任何一项中限定的DNA序列或如权利要求17或18中限定的载体转化的细菌或真菌或酵母宿主。
20.包含如权利要求16中限定之一种或多种多肽的复合食品或饲料。
21.制备如权利要求16中限定的多肽的方法，其特征在于在适当培养条件下培养如权利要求19中限定的被转化的细菌或宿主细胞，并从中回收该多肽。
22.按权利要求21中限定的方法生产的多肽。
23.制备复合食品或饲料的方法，其中组合物的成分与如权利要求16中限定的一种或多种多肽混合。
24.降低动物粪肥中肌醇六磷酸酶水平的方法，特征在于以可有效地将饲料中所含肌醇六磷酸转化成肌醇和无机磷酸盐的量给动物喂饲如权利要求20中限定的复合饲料。
25.使用根据权利要求16的多肽转化肌醇六磷酸成磷酸肌醇酯和无机磷酸盐。
26.如本文前述的发明。
全文摘要
本发明目的在于得到一种能编码具有肌醇六磷酸酶活性之多肽的DNA序列，其中DNA序列衍生自特异的真菌组，由这类DNA序列编码多肽，而载体含有这类DNA序列，由这类DNA序列或载体来转化细菌或真菌或酵母寄主。即通过培养这类转化性寄主而制备多肽的一种方法，以及制备含一种或多种这类多肽的复合饲料的方法。
文档编号C12N1/15GK1126243SQ95104559
公开日1996年7月10日 申请日期1995年4月24日 优先权日1994年4月25日
发明者A·范·卢恩, D·米切尔 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司