专利名称：重组美杀菌素及其生产方法
技术领域：
本发明特别涉及肽抗生素美杀菌素(mersacidin)的结构基因顺序。顺序分析表明，前美杀菌素由非常长的48个氨基酸的前导顺序和20个氨基酸的原部分肽组成。
肽原部分在生物合成中被修饰为成熟的羊毛硫氨酸抗生素(lantibiotic)。
Mersacidin属于一类杀菌肽，为表明这些肽含有稀有氨基酸羊毛硫氨酸和/或3—甲基羊毛硫氨酸，称之为羊毛硫氨酸抗生素。通常还含有一些被修饰的氨基酸如脱氢丙氨酸和脱氢酷脂，而仅在一些羊毛硫氨酸抗生素中发现有S—氨基乙烯基半胱氨酸和赖氨酸丙氨酸缩合物(G.Jung(1991)，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.301051-1068)羊毛硫氨酸抗生素由革兰氏阳性细菌产生.从核糖体合成的前肽得到。发现羊毛硫氨酸抗生素的结构基因或者在细菌染色体上(例如枯草杆菌素和肉桂霉素)，或者与可移动成分如易位子(如，乳酸链球菌肽)或大质粒(如，表皮纤维和Pep5)有关。前肽由一个N末端前导顺序(自生产细胞排出之后被切掉和一个C末端前肽组成，前肽翻译后被修饰为成熟的羊毛硫氨酸抗生素(G.Jung(1991)，上述文章在修饰的第一步，将丝氨酸和苏氨酸残基脱水分别成脱氢丙氨酸(Dha)或脱氢酪脂(Dhb)(H.-P.Weil)等。(1990)，Eur.J.Biochem.194217-223)，随后，半胱氨酸残基的巯基与Dha或Dhb残基的双键反应，分别形成羊毛硫氨酸或甲基羊毛硫氨酸。
美杀菌素被从枯草杆菌HLY—85,54728培养液的上清液中分离出来而且由于它对于抗二甲氧基苯青霉素的金黄色葡萄菌(MRSA)有显著的体内活效，引起了人们的兴趣(S.Chatteruee等人(1992)，J.Antibiotics 45839-845)它是迄今为止分离出的最小的羊毛硫氨酸抗生素(1825道尔顿)，由含20个氨基酸的肽原合成，含有三个甲基羊毛硫氨酸残基、一个脱氢丙氨酸和一个S一氨基乙烯基—2—甲基半胱氨酸(附图1A)(S.Chatterjee(1992)，J.Antibiotics 45832-838)。美杀菌素不带净电荷，总体上具有疏水性。，近期结果表明，美杀菌素阻碍肽聚糖的生物合成。这最可能通过与目前便用的抗MRSA的抗生素不同的机制在转糖基作用水平上发生。
因此，本发明涉及具有附图2中所示从第1至第68个氨基酸的氨基酸顺序的前美杀菌素和具有附图2中所示从第49至第68个氨基酸的氨基酸顺序的美杀菌素原。
本发明的另一实施方案是编码前美杀菌素或美杀菌素原的DNA，尤其是具有附图2中所示第22至255核苷酸顺序的编码前美杀菌素原的DNA或第166至225核苷酸顺序的编码美杀菌素原的DNA；含有所述DNA的载体和含有所述载体的宿主细胞。
另一个实施方案是一种利用所属技术领域技术人员所公知的基因技术手段生产前美杀菌素、美杀菌素原或成熟的美杀菌素的方法，即在适宜条件下，培养含有所述编码前美杀菌素或前杀菌素原的DNA的合适的宿主细胞，然后分离出由所述宿主细胞表达的前美杀菌素、美杀菌素原或成熟的美杀菌素。宿主细胞优选革兰氏阳性细菌，例如杆菌属、链霉菌属或链球菌属。
最后，例如象WO90/00558所述的那样，本发明的前美杀菌素或美杀菌素原肽或者其基因能够用于成熟美杀菌素的生产。
作为实例，成熟的美杀菌素作为肽抗生素对食品的保存(尤其对于抗二甲氧基苯青霉素的金黄色葡萄球菌)或作为治疗由金黄色葡萄球菌引起的人或动物感染的抗生素是有用的。本发明可进一步用于获得具有突出的抗菌谱或不同功效的美杀菌素衍生物(氨基酸顺序上进行了修饰)。另外，本发明为通过遗传工程大量表达美杀菌素或其衍生物开辟了道路。
附图1A)羊毛硫氨酸抗生素美杀菌素的结构B)推断的前肽顺序和用于结构基因鉴定的51个碱基的推测子(guessmer)的顺序。附图2羊毛硫氨酸抗生素美杀菌素的结构基因mrsA的核苷酸顺序和推断的前肽的氨基酸顺序。ATG起始密码子前的核糖体结合部位用方框标出，加工部位用箭头标出。推断的P—独立终止区在其下划线标出。附图3几种羊毛硫氨酸抗生素的前导顺序的比较。
共有顺序已用黑体字标出。
实施例1.美杀菌素结构基因的克隆推测的美杀菌素肽原顺序(附图1B)是从美杀菌素的结构推断的，并以羊毛硫氨酸抗生素有关生物合成的一般信息为依据。所述探针是根据在PCR—MateR(Applied Biosystems，Weiterstadt，FRG)上优选便用的芽孢杆菌密码子，被合成为51个碱基的推测子并用异羟基洋地黄毒甙元(Boehringer Mannheim，Mannheim，FRG)(附图1B)加以标记。氨基丁酰残基(Abus-甲基羊毛硫氨酸的一半)从苏氨酸得到，而丙氨酸残基(Alas—甲基羊毛硫氨酸的一半)在肽原中被编码为半胱氨酸。形成末端环形结构的S—氨基乙烯基—2—甲基半胱氨酸可能是由甲基羊毛硫氨酸形成的。象所示的含有C末端S—氨基乙烯基半胱氨酸的表皮纤维一样，这种甲基羊毛硫氨酸已被氧化脱羧(T.Kupke等人(1992)，J.Bcateriol.1745354-5361).
由于不能在生产菌株中检测出质粒，所以用Marmur所述的方法(.J.Marmur(1961)，J.Mol.Biol.3208-218)制备染色体DNA，不同的是仅进行一种氯仿提取和沉淀，随后将DNA溶解于平稀缓冲液中，在Qiagen-tipR100柱(Diagen，Hilden，FRG)上纯化。在51℃下，用HindIII限制性酶切染色体，其2kb带与Southern印迹的探针杂交(E.M.Souther(1975)，J.Mol.Biol.98503-517)。大小范围为1.9至2.3kb的片段从凝胶上切下来，用BIOTRAPR(Schleieher and Schiill，DQssel，FRG)洗脱，在大肠杆菌的PUC18(C.Yanisch-Perron等人(1985)，Gene33103-109)中再克隆。用Birnboim和Doly方法(H.C.Bimboim and J.Doly(1979)，Nucl.Acids Res.71513-1523)制备几种重组菌落的质粒，用HindIII酶切并用推测子探查。通过用多种酶限制性酶切和随后的Southern印迹可进一步分析其中段一种产生.阳性信号的克隆。最后，将1.3kb的EcoRI-HindIII片段再克隆至大肠杆菌的pEMBL18和pEMBL19(I.Dente等人(1983)，Nucleic Acids.Res.111645-1655)中。进而，在用性别转换基因位点定向诱变药盒(Clontech，Palo.Alto，USA)进行EcoRI位点到EcoRIV位点的位点定向诱变后，在载体pCUI(J.Augustin等人(1992)，Eur.J.Biahem.2041149—1154)中克隆0.6kb的EcoRV片段。2.美杀菌素结构基因mrsA的核苷酸顺序利用双脱氧链终止法(F.Sanger等(1977)，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA 745463-5467)在A.L.F自动DNA顺序分析仪上(Pharmocia，Brussels，Belgium)测出了双链DNA的0.6kb片段的DNA顺序。为了引发Auto Read顺序分析药盒(Pharmaciq，Brussels，Belgiun)的通用和逆转引物，使用了两种合成的寡核苷酸5’—(TCTCTTCCAATTTTTTTG)3’和5’—(AAAT-(AAATTAACAAATAC)3’。美杀菌素结构基因mrsA的核苷酸顺序示于附图2。在开放读码的起始密码子ATG上游8个碱基对处发现了潜在的核糖体结合部位(AGGGGG)。该顺序的C末端部分与已发表过的美杀菌素一级结构(S.Chatterjee等人(1992)，J.Antibiotics45832—838)和其推荐的肽原顺序一致。N末端部分由48个氨基酸的前导顺序组成(附图2中的箭头)。美杀菌素原含有20个氨基酸。因此，前肽的全长为68个氨基酸，计算的分子量为7728道尔顿。在(赭石型)终正密码子TAA的上游8个碱基对处发现了一个自由能值为-86.7KJ.mol-1柄尺寸为14个碱基对的发夹结构。由于它后面是紧接着TTTATT这一顺序，故可在转录过程中作为P—独立终止区(附图2)。3.美杀菌素前肽的表征羊毛硫氨酸抗生素已被细分为两类(G.Jung(1991)，上述文章。A类羊毛硫氨酸抗生素是能在敏感性细菌的膜中形成瞬时孔的延伸的两亲性肽(H.-G.Sahl(1991)，Pore formation in bac-terial nernbranes byCationic lantibiotics，P.347-358.ln G.Jungand H.-G.Sahl(ed.)，Nisin and novel lantibiotics，Escom，Leiden)。B类羊毛硫氨酸抗生素是由链霉菌属产生的球状肽，其分子量小于2100道尔顿，至于它们的氨基酸顺序和包括头尾缩合的环状结构是高度同源的(G.Jung(1991)上述文章。迄今美杀菌素不能归入任何一类(G.Bierbaum and H.-G.Sahl(1993)，zbl.Bakt.2781-22)。鉴于此，比较美杀菌素与A类和B类羊毛硫氨酸抗生素的前肽顺序具有特殊意义。
美杀菌素中保留了羊毛硫氨酸抗生素前导顺序的两个共同特征i)在前导顺序中没有半胱氨酸(G.Jung(1991)，上述文章)；ii)推测出前导顺序的C末端部分具有2—螺旋倾向。通过在三氟乙醇/水混合物中的圆二色性测定，预测并表明了A类羊毛硫氨酸抗生素具有这样的结构单元(A.G.Beck-Sickinger and G.Jung.Synthesis and conrormational analysis oflantibiotic leader-，Pro-and prepeptides.P.218-230.In G.Jung and H.-G.Sahl(ed)，Nisin and novel lamtibiotics，Escom，Leiden 199)。在其它任何方面，美杀菌素前导顺序与迄今所述的A类羊毛硫氨酸抗生素前导顺序不同。如附图3中所示，它在长度和电荷分布上(48个氨基酸/口个电荷)更类似于B类羊毛硫氨酸抗生素肉桂霉素的非常长的59个氨基酸的前导顺序(11个电荷)(C.Kaletta等人(1989)，Pep5，a new lantibioticStructural gene isolation andPrepeptide sequence.Arch.Microbiol.15216-19)。与此相反，典型的带高电荷的A类羊毛硫氨酸抗生素前导顺序，例如，Pep5前导肽，总共只有26个氨基酸却含有10个带电荷的残基(C.Kaletta等人(1989)，上述文章。A类羊毛硫氨酸抗生素的保留顺序(例如，FD/N LD/E motif)在美杀菌素的前导肽中并未发现。美杀菌素前导顺序的蛋白酶切点(-4M--3E--2A--1A-+1C)不同于A类羊毛硫氨酸抗生素的共同切点(附图3)。这里，我们找到乳酸链球菌肽型切点(-1，带正电荷的氨基酸；-2，脯氨酸；-3，带负电荷的或极性的；-4，疏水的)或含有乳酸菌素(lacyticin)481(J.-C.Piard等人(1993)，J.Biol.Chem.，268.16361-16368)或链球菌A—FF22(W.L.Hynes等.(1993)，Appl.Env.Microblol.591969-1971)切点的疏水性甘氨酸。肉桂霉素的(-3A--2F--1A)切点(C.Kaletta等人(1989)，上述文章符合通过Sec途径分泌的蛋白质的(-3A--2X--1A)规则。总之，美杀菌素前肽对A类羊毛硫氨酸抗生素前导顺序的保留顺序不显示同源性。在长度和电荷分布上与肉桂霉素的前肽有相似之处，但在氨基酸水平上没有明显的顺序同源性。美杀菌素比A类羊毛硫氨酸抗生素小，不带正电荷，不能使膜极化，但能抑制肽聚糖的生物合成。除了前导肽的特性之外。这也表明美杀菌素与B类羊毛硫氨酸抗生素比与A类羊毛硫氨酸抗生素更相关。最近，另一种也能抑制细胞壁生物合成的羊毛硫氨酸抗生素—actagardine的顺序和桥连类型已被阐明(S.Sommo等人，Antimi-crob.Agents Chemother.11396-401，1977)。与美杀菌素的比表明，在两种羊毛硫氨酸抗生素中几乎完全保留一个环。鉴于至今表征的B类羊毛硫氨酸抗生素—耐久霉素A.B.C.ancovenin和肉桂霉素的高度同源性，就象观察到的表皮纤维和gallidermin或乳酸链球菌肽A和Z一样，这些肽也可被视为结构变异体。因此，我们建议，美杀菌素和actagardine应被归入B类羊毛硫氨酸抗生素，B类羊毛硫氨酸抗生素的名称不应专门留给耐久霉素的结构变异体，而应包括带低电荷且能抑制酶活力的小球状羊毛硫氨酸抗生素。
顺序一览表(1)一般信息(i)申请人(A)名称赫彻斯特股份公司(B)街—(C)城市美因河畔法兰克福(D)州—(E)国家德国(F)邮政编码(zip)65921(G)电话069—305—6031(H)传真069—35 7175(I)电传41234700 hod(ii)发明名称重组美杀菌素及其生产方法(iii)顺序的数目4(iv)机读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM—PC兼容机(C)操作系统PC—DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Release#1.0，version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)顺序特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸
(C)链况单链(D)拓扑学直线(ii)分子类型DNA(基团组的)(iii)假设的是(iii)反义是(vi)特点(A)名称/关键外显子(B)位置1…17(ix)顺序描述SEQ ID NO 1TCTCTTCCAT TTTTTTG(2)SEQ ID NO 2的信息(i)顺序特征(A)长度19个碱基对(B)类型核酸(C)链况单链(D)拓扑学直线(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假设的是(iii)反义是(vi)特点(A)名称/关键外显子(B)位置1…19(ix)顺序描述SEQ ID NO 2A AATCAAATT AACAAATAC(2)SEQ ID NO 3的信息(i)顺序特征(A)长度288个碱基对(B)类型核酸(C)链况单链(D)拓扑学直线(ii)分子类型DNA(基因组的)(iii)假设的否(iii)反义是(vi)原始来源(A)学名美杀菌素(B)菌株芽孢杆菌(C)个体分离菌HIL Y85，54728(ix)特点(A)名称/关键RBS(B)位置1…21(ix)特点(A)名称/关键CDS(B)位置22…225(ix)特点(A)名称/关键终止区(B)位置208…288(xi)顺序描述SEQ ID NO 3CTTAATAAGG GGGTGAATAC A ATG AGT CAA GAA GCT ATC ATT CGT TCA TGG51Met Ser Gln Glu Ala Ile Ile Arg Ser Trp1 5 10AAA GAT CCT TTT TCC CGT GAA AAT TCT ACA CAA AAT CCA GCT GGT AAC99Lys Asp Pro Phe Ser Arg Glu Asn Ser Thr Gln Asn Pro Ala Gly Asn15 20 25CCA TTC AGT GAG CTG AAA GAA GCA CAA ATG GAT AAG TTA GTA GGT GCG 147Pro Phe Ser Glu Leu Lys Glu Ala Glu Met Asp Lys Leu Val Gly Ala30 35 40GGA GAC ATG GAA GCA GCA TGT ACT TTT ACA TTG CCT GGT GGC GGC GGT 195Gly Asp Met Glu Ala Ala Cys Thr Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gly Gly45 50 55GTT TGT ACT CTA ACT TCT GAA TGT ATT TGT TAATTTGATT TATATAGGCT 245Val Cys Thr Leu Thr Ser Glu Cys Ile Cys60 65GTTTCCCTTC AGAAGGAACA GCCTATATTT TATTATATAA ACT 288(2)SEQ ID NO 4的信息(i)顺序特征(A)长度68个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑学直线(ii)分子类型蛋白质(xi)顺序描述SEQ ID NO 4Met Ser Gln Glu Ala Ile Ile Arg Ser Trp Lys Asp Pro Phe Ser Arg1 5 10 15Glu Asn Ser Thr Gln Asn Pro Ala Gly Asn Pro Phe Ser Glu Leu Lys20 25 30Glu Ala Gln Met Asp Lys Leu Val Gly Ala Gly Asp Met Glu Ala Ala35 40 45Cys Thr Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gly Gly Val Cys Thr Leu Thr Ser50 55 60Glu Cys Ile Cys6权利要求
1.具有附图2中所示从第1至第68个氨基酸的氨基酸顺序的前美杀菌素。
2.具有附图2中所示从第49至第68个氨基酸的氨基酸顺序的美杀菌素原。
3.编码根据权利要求1的前美杀菌素的DNA。
4.具有附图2中所示从第22至第225个核酸的核酸顺序的编码前美杀菌素的DNA。
5.编码根据权利要求2的美杀菌素原的DNA。
6.具有附图2中所示从第166至第255个核酸的核酸顺序的编码美杀菌素原的DNA。
7.含有根据权利要求3，4，5，或6之一的DNA的载体。
8.含有根据权利要求7的载体的宿主细胞。
9.生产前美杀菌素，美杀菌素原或成熟美杀菌素的方法，包括如下步骤(a)在适宜条件下，培养含有根据权利要求3—6的DNA顺序的合适的宿主细胞；以及(b)分离出前美杀菌素，美杀菌素原或成熟美杀菌素。
10.根据权利要求1或2的前美杀菌素或美杀菌素原用于成熟美杀菌素的生产的用途。
全文摘要
本发明特别涉及肽抗生素美杀菌素的结构基因顺序。顺序分析表明，美杀菌素原由非常长的48个氨基酸的前导顺序和20个氨基酸的肽原部分组成。肽原部分在生物合成中被修饰为成熟的羊毛硫氨酸抗生素。
文档编号C12N15/63GK1131192SQ9511623
公开日1996年9月18日 申请日期1995年9月8日 优先权日1994年9月12日
发明者K·P·考勒, H·G·萨尔, G·比尔伯姆 申请人:赫彻斯特股份公司