专利名称：酶抑制剂存在下酶法合成β-内酰胺抗生素的方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的制备式(I)和式(II)的青霉素和头孢菌素的酶学方法 式中X为S或CH2，R为被任意取代的6元烃环，R1为氢原子、卤原子、甲基、甲氧基、C1-C4链烯基或通过氧、硫或氮原子与有机基结合的亚甲基。
US-A-3816253公开了一种制备青霉素或头孢菌素的方法，该方法是在+5℃至+50℃的温度下，优选+20℃至+40℃下，在水溶液中有活性微生物或酶的存在下将α-取代的α-氨基酸与7-氨基头孢烷酸或7-氨基去乙酸基头孢烷酸的衍生物反应。已发现按照之后的美国专利中所述的方法操作，由于平行的伴随反应生成了难以从反应混合物中分离的副产物，因此所期望的最终产率大为降低。
EP-A-0473008提供了一种生产式(I)或式(II)的青霉素及头孢菌素的方法，其目的在于克服或至少减少上述缺点。在该方法中，在固定化青霉素酰化酶的存在下将6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸与式R-CH(NH2)COOH的α-取代的α-氨基酸或其活性衍生物反应，反应在水介质中进行，温度为-5℃至+20℃，优选约+4℃。
EP-A-0473008中清楚地描述了反应条件，其中还详细描述了25个制备实施例，所需最终产物的产率很高(90％或更高)。
在这一方面应注意到，只有产率足够高(约90％)且最终产物易于纯化该方法才能工业应用。
EP-A-0473008提到通常以α-取代的α-氨基酸或其活性衍生物作为原料，具体提及的氨基酸只有D-苯基甘氨酸甲酯。
本申请人按照EP-A-0473008中给出的实施例中所述步骤进行了许多精心的实验。但所得结果完全不尽人意。
在这一方面已证实，如果反应介质中所述氨基酸的摩尔比小于4摩尔每摩尔所用的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸，所需最终产物的产率则很低(小于约60％)，并且因此是工业上不能接受的。
只有反应中D-苯基甘氨酸甲酯的量为4至6摩尔每摩尔所用的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸的比例时才能获得工业上可接受的高产率。
但在这种情况下不仅难以接受成本的增加(D-苯基甘氨酸甲酯的价格很高)，而且还生成了难以或不可能从反应的所需最终青霉素或头孢菌素中除去的副产物。
已尝试使用不同的D-苯基甘氨酸酯或不同氨基酸的酯。但这些尝试都失败了。
使用各种活性氨基酸衍生物得到了同样消极的结果。
德国专利申请号2214444报道了头孢菌素(具体地说是头孢氨苄)的酶法合成，该方法是在青霉素酰化酶的存在下将7-ADCA与苯基甘氨酰胺反应。所得产率很低。
PCT/DK91/00188(WO92/01061)和PCT/DK92/00388(WO93/12250)报道了通过酶法酰化作用制备β-内酰胺抗生素的方法，根据该方法在固定化青霉素酰化酶的存在下将式(III)的酰胺 与6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸进行反应。
这些方法是适用的。但发现可估测量的酰胺(III)被酶本身水解，因此在所需的最终产物中增加了杂质的数量。还有少量最终产物被同样的酶水解。
早在青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11)的最初应用时就已知，当存在苯乙酸、苯氧基乙酸和/或其它抑制剂时该酶被抑制，在抑制剂的存在下酶丧失活性并且催化趋于停止。这是酰化含有痕量苯乙酸、苯氧基乙酸或其它抑制剂的β-内酰胺环时的一个问题。
寻求不表现这类抑制的酶时常常面临这一问题(参见D.D.Y.Ryu等人，Biotechnology and Bioengineering 1985，Vol.XXVIIp.953-960；A.M.Blinkowsky等人，Enzyme Microbial Technol-ogy 1993，Vol.15，p.965-973)。从各种微生物来源(醋杆菌，黄单孢菌)选择出酶(常见的有氨苄青霉素酰化酶或酰胺酶、头孢菌素酰化酶或酰胺酶，头孢氨苄合成酶等)。但是，这些酶均不能商购，也不能大规模制备，而这是工业应用所必需的。由于需要大量研究投资来改进合成β-内酰胺抗生素的特异性催化剂，因此不赞成使用这种方法。
另一种克服酶抑制作用的方法是在进行酶法酰化之前除去所说的抑制剂，例如PCT/DK91/00188中所述的用有机溶剂进行提取。准确地说，该方法的主要缺点就是有机溶剂的使用。引入β-内酰胺环的酶法酰基化就是为了省去所述溶剂的使用从而获得对环境无害的方法，因此这种方法到目前为止尚未给出令人满意的结果。
在专门研究青霉素酰化酶催化的反应的过程中，本申请人惊奇地发现上述抑制作用是可以避免的，在即使有大量上述抑制剂存在的情况下也能反应合成β-内酰胺抗生素。如下文所述，通过加入一定量的起初未存在的或仅少量存在的抑制剂，在某些情况下甚至可以利用对合成有益的酶抑制作用。
因此，本发明提供了一种改进的分别制备按前面所述的式(I)和式(II)的青霉素和头孢菌素的酶学方法，其中，在-5℃至+35℃的温度下，在呈游离或固定化形式的青霉素酰化酶的存在下，将式(IV)或(V)的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸 其中X和R1具有上面所述的含义，与式(III)的酰胺反应 其中R具有上面所述的含义，R2和R3分别独立地为氢原子或者直链或支链C1-C3烷基，或其盐，摩尔比为1至6摩尔所述酰胺(III)每摩尔酸(IV)或(V)，其特征在于向反应混合物中加入式(VI)的酶抑制剂 其中R4为直链或支链C1-C5烷基、被取代或未被取代的芳环、卤素或质子，Y可以不存在，或者如果存在则为O、S、CH2、苯基或卤素；R5为羧基、直链或支链C1-C4酯或-CONH2基团；R6为H、OH、OCHO或CH3；抑制剂以0.0001至0.5的摩尔浓度存在。
具体地说，所述抑制剂(VI)以0.0005至0.2的摩尔浓度存在并且选自苯乙酸、苯氧基乙酸和扁桃酸、以及这些酸的(直链或支链)C1-C5酰胺和酯。
本发明还涉及含有按本发明所述方法制备的青霉素或头孢菌素、以及药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。
一般用常规方法制备含青霉素或头孢菌素的药物组合物并以适宜的药学形式给药。
参照式(I)和(II)，R可以为例如苯基、环己二烯基或者为未被取代的或被羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、硝基或氨基取代的环己烯基。
R1可为氢原子、卤原子、甲基或者与有机基团相结合的亚甲基，具体地说是与烷氧基或烷氧羰基或含有1至4个选自O、S和N的杂原子的5元或6元杂环基团相结合，杂环基团通过O、S或N原子与亚甲基结合并且可被选自羟基、卤素、烷基、烷氧基、羰基、羧基、腈基、氨基等基团的一个或多个基团任意取代。
此处所用术语“烷基和烷氧基”是指含有1至6个碳原子，优选1至4个碳原子的基团。
具有式(III)酰胺的α-氨基酸包括例如D-苯基甘氨酸、D-对羟基苯基甘氨酸和D-1，4-环己二烯-1-基-甘氨酸。
适宜的酰胺的盐是其诸如氢氯酸、氢氟酸、氢溴酸、硫酸或硝酸这样的无机酸的盐，或者是其诸如乙酸、甲酸或马来酸这样的有机酸的盐。
下述酸特别适合于式(IV)和(V)的化合物6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7-ADCA)、7-氨基头孢烷酸、7-氨基-3-氯头孢烷酸、7-氨基-3-甲氧基头孢烷酸、7-氨基苯乙酰基去乙酸基头孢烷酸、7-氨基苯氧基乙酰基去乙酸基头孢烷酸、7-氨基-3-氯碳头孢菌烷(7-amino-3-chlorocarbacephem)，青霉素G和青霉素V。
一般用青霉素G或V以及7-氨基苯乙酰基-去乙酸基头孢烷酸分别作为制备6-APA和7-ADCA的原料，然后用后者制备氨苄青霉素、羟氨苄青霉素、头孢氨苄和头孢羟氨苄。目前为止必需从这些中间体(6-APA和7-ADCA)中除去苯乙酸或苯氧基乙酸以便能将中间体用于酶的酰化反应，如PCT/DK91/00188所述。能在抑制剂存在下合成这些化合物是指不需要纯化中间体便可有利地进行合成，获得一种节省并避免使用有机溶剂的重要方法。
酶抑制剂可存在于合成开始时的反应混合物中，也可以在反应期间任一时刻加入。通常也可以在酶反应结束时加入所述抑制剂以便于产物分离和后继加工。
在现有方法中用作催化剂的酶是青霉素酰胺水解酶，其分类为E.C.3.5.1.11(也被称为青霉素酰化酶、青霉素水解酶、氨苄青霉素酰化酶等)，该酶是从任意微生物来源产生的，特别是从黄单胞菌、假单胞菌、节杆菌、Kluyvera、醋杆菌、埃希氏菌、芽孢杆菌或单胞菌菌杆产生的。特别优选从大肠埃希氏菌的天然或工程菌株产生的酶。其中有些酶是可以大量并以固定化形式商购的。
该酶可以游离形式(即溶解)使用，或者可被固定在固体基质上。对于后者来说，特别优选那些专门用于生物分子固定化的支持物，如合成环氧脂或吖内酯树脂。
实施例1通过7-ADCA与D(-)苯基甘氨酰胺的酶法酰化作用合成头孢氨苄将9g(42毫摩尔)7-氨基去乙酸基头孢烷酸和15.7g(100毫摩尔)D(-)苯基甘氨酰胺溶于水中(终体积300ml)。将溶液冷却至约4℃并调节至pH 6.8，然后转入与控制系统(如下文所称的恒-pH-槽)相连的冷却反应器中，通过自动加入4N硫酸保持pH恒定。
将5400IU固定化形式(在吖内酯或环氧树脂上)的青霉素酰胺水解酶加入上述溶液中，在恒定的4℃及pH 6.8温育。
约75分钟后从溶液中过滤分离出酶。将溶于稀苛性苏打溶液的约4g β-萘酚加入该溶液中。回收了16.6g以头孢氨苄/β-萘酚复合物形式存在的产物，摩尔产率为初始环的74％。然后(按已知方法)从β-萘酚复合物获得高品质的头孢氨苄一水合物。实施例2苯乙酸存在下合成头孢氨苄将17g(0.077摩尔)含1.18％苯乙酸和1.63％7-氨基苯乙酰基去乙酸基头孢烷酸杂质的不纯的7-氨基去乙酸基头孢烷酸、以及42.68g(0.28摩尔)D(-)苯基甘氨酰胺溶于水中，至终体积为600ml。
将恒-pH-槽调至pH 7.6并将恒温槽调至2℃，用7560 IU固定化酶并按照实施例1中所述进行反应。5小时30分钟后中断反应并滤去青霉素酰化酶。用6gβ-萘酚沉淀产物，所得摩尔产率为87.5％。然后如实施例1所述获得了头孢氨苄一水合物。实施例3从7-氨基苯乙酰基去乙酸基头孢烷酸和D(-)苯基甘氨酰胺合成头孢氨苄将16g(0.048摩尔)7-氨基苯乙酰基去乙酸基头孢烷酸溶于水中，并加入足量稀NaOH至pH 8.0，然后将溶液加热至28℃并用水稀释至终体积为320ml，然后转入与恒-pH-槽相连的适宜的反应器中并浸于温度控制浴中。
将约14000 IU固定化形式的青霉素酰化酶加入该溶液(溶液A)，然后保持恒定pH(通过加入2N NaOH)和恒定温度。
另外制备浓度约为180g/l的D(-)苯基甘氨酰胺水溶液(溶液B)。
反应约2小时后，将约190ml溶液B加入溶液A，如需要，调整pH和温度。通过加入4N硫酸保持pH恒定。
7小时后真空过滤除去酶。通过沉淀头孢氨苄/β-萘酚复合物从所得溶液中回收头孢氨苄，产量相当于摩尔产率为80.8％。按已知步骤从头孢氨苄/β-萘酚复合物中回收质量满足市售的头孢氨苄一水合物。实施例4在7-氨基-3-氯头孢烷酸的酶法酰化中抑制剂的用途如实施例1中的方法进行反应，但用9.85g(0.042摩尔)7-氨基-3-氯头孢烷酸。反应结束时加入1.5g溶于稀NaOH的苯乙酸，然后如实施例1-3中所述针对头孢氨苄的方法沉淀头孢氯/β-萘酚复合物。
以7-氨基-3-氯头孢烷酸计的摩尔产率为70％。通过分解头孢氯/β-萘酚复合物获得头孢氯一水合物(按已知方法)。实施例5抑制剂存在下6-氨基青霉烷酸的酶法酰化用已知方法通过酶解从青霉素G获得6-氨基青霉烷酸(此后称之为6-APA)，并通过酸沉淀从水溶液中得以分离。按此方法获得的产物含有苯乙酸杂质。
将20.8g浓度为80％(0.0077摩尔)的潮湿的不纯的6-APA溶于水中，并按实施例2中所述方法与D(-)苯基甘氨酰胺混合，得到含有约0.7g/l苯乙酸的溶液。加入6670单位青霉素酰化酶，并如实施例2中所述方法进行反应。获得82.4％的6-APA转化率。实施例6苯乙酸存在下合成头孢氨苄过程中青霉素G酰化酶的水解抑制作用将13g(60.75毫摩尔)7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7-ADCA)、46.5g(230.84毫摩尔)D-苯基甘氨酸甲酯.HCl和140mg(1.03毫摩尔)苯乙酸溶于水中至终体积为1000ml。
由17.5g(3000 IU)青霉素G酰化酶进行酰化反应，条件是起始pH为7.25且温度为3℃。约3小时后已有93％的7-ADCA转化成头孢氨苄。
93％的7-ADCA转化成头孢氨苄后，合成的头孢氨苄产物与水解形成的D-苯基甘氨酸的比率为2.15，而没有抑制剂时其比率为1.44。
权利要求
1.一种制备式(I)或(II)的青霉素或头孢菌素的方法 式中X为S或CH2，R为被选择性取代的6元烃环，R1为氢原子、卤原子、甲基、甲氧基、C1-C4烷基或通过氧、硫或氮原子与有机基结合的亚甲基，在该反应中，在-5℃至+35℃的温度下，在呈游离或固定化形式的青霉素酰化酶的存在下，将式(IV)或(V)的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸 其中X和R1具有上面所述的含义，与式(III)的酰胺反应 其中R具有上面所述的含义，R2和R3分别独立地为氢原子或者直链或支链C1-C3烷基，或其盐，摩尔比为1至6摩尔酰胺(III)每摩尔酸(IV)或(V)，其特征在于向反应混合物中加入式(VI)的酶抑制剂 其中R4选自直链或支链C1-C5烷基、被取代或未被取代的芳环、卤素、质子；Y可以不存在，或者如果存在则为O、S、CH2、苯基或卤素；R5选自羧基、直链或支链C1-C4酯或-CONH2基团；R6选自H、OH、OCHO，CH3；抑制剂以0.0001至0.5的摩尔浓度存在。
2.一种根据权利要求1的方法，其特征在于所述抑制剂的摩尔浓度优选为0.0005至0.2。
3.一种根据权利要求1和2的方法，其特征在于该抑制剂(VI)选自苯乙酸、苯氧基乙酸、扁桃酸以及这些酸的(直链或支链)C1-C5酰胺和酯。
4.一种根据权利要求1和2的方法，其特征在于所述酰胺(III)选自D-苯基甘氨酸及其与有机或无机酸的盐。
5.一种含有按权利要求1至4中所要求的方法获得的青霉素或头孢菌素的药物组合物。
全文摘要
一种通过将β-内酰胺环与酰胺反应制备青霉素和头孢菌素的方法。该反应由青霉素酰化酶催化并且是在酶抑制剂的存在下进行的。
文档编号C12N9/86GK1137568SQ9610255
公开日1996年12月11日 申请日期1996年2月27日 优先权日1995年2月28日
发明者M·真奥尼, A·R·塔格里尼, E·卡纳斯, A·温图列里 申请人:艾斯·多伯法股份公司