糖皮质素对基因表达的增强作用的制作方法

专利名称：：糖皮质素对基因表达的增强作用的制作方法
背景技术：
：发明领域本发明一般地涉及药物作用、细胞调控和基因治疗领域。更具体地，本发明涉及新发现，即当用阳离子脂质或脂质体转染时，糖皮质素可增强报道基因活性。相关技术的描述在最近2年中，将基因治疗作为遗传缺陷或基因调节异常所导致疾病的治疗方法而进行的人类临床试验，已经显示了其前途并获得了动力。几种在肺中表现出主要症状的疾病已经被定为可使用基因治疗，其中包括囊性纤维变性和肺癌。这些试验或者使用重组的逆转录病毒载体，或者使用腺病毒载体以及阳离子脂质来将基因运输和传送给细胞。然而，细胞转化及随后的基因表达低，因而会达不到治疗水平的基因表达。此外，针对病毒载体产生的免疫应答会限制其使用。尽管阳离子脂质在输送方面比腺病毒载体的效率低，但是更新的化学设计已产生了比最初设计大为改善的阳离子脂质。多个动物和人类试验已表明，在阳离子脂质的典型转染浓度下，不产生有害的副作用或免疫应答。用气溶胶将基因治疗直接输送给肺，可以使基因被直接输送给靶组织。几个研究小组已表明了，可用偶联于阳离子脂质体的报道基因DNA，在体内进行气溶胶输送并转染动物肺。在这些研究中提及的突出特征是没有毒性，而且基因表达的时间可约为1个月。基因表达仍然较低；在小鼠肺中即使是适中的转染也需要至少0.5-12毫克高纯度的DNA。正如报道的那样，用这些方法进行的基因治疗对人是不可行的。另一种提高转染效率的方法，是对质粒摄入以及影响转染基因在靶组织中表达的各因素有更好的理解。在最近的有关炎症在肺细胞基因转染中所起作用的研究中，已表明，在用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE进行转染之前，将A549人肺癌细胞暴露于免疫刺激物脂多糖或细胞因子IL-1β，可使β-gal蛋白质的水平降低到低于仅用培养基处理的细胞中所观察到的水平。已有技术中缺乏将转染基因在治疗水平上进行输送的有效手段。本发明填补了本领域的这一长期需求。发明概述对于阳离子脂质-DNA复合体被细胞摄入的机制，以及这些复合体在细胞中的命运如何，所知甚少。对于在原位影响DNA摄入、或持续输送以及一旦进入组织DNA表达的各种因素，知道得更少，尤其是在患慢性肺炎疾病或其他免疫情况的病人中。本发明显示了2个发现，这些发现对细胞培养物的转染有重要影响，而且在体内是平行相关的。首先，本发明表明，细胞因子IL-1β和免疫刺激物脂多糖(LPS)会抑制通过阳离子脂质进行的转染或转染入A549人肺癌细胞系或原代大鼠肺细胞的pCMVβ-gal的表达。其次，局部抗炎的糖皮质素如倍氯米松双丙酸酯(BEC)可逆转IL-1β和脂多糖的抑制效应，而且甚至可以增强报道基因的表达，使其高于或超过在未处理的感染细胞(即未用脂多糖或IL1β等处理的细胞)中所见的表达。这种效应对糖皮质素是特异性的，这与其他类型的类固醇相反，但是也不是对特定的糖皮质素特异。这一效应对糖皮质素如抗炎药也是特异的，因为用另一免疫抑制剂环孢菌素A进行预处理的细胞时没有观察到该效应。糖皮质素介导的转基因活性的增强情况与所用的启动子、报道基因和阳离子脂质无关。糖皮质素增强报道基因的表达的机制，并不涉及更高的质粒-脂质摄入，相反涉及一种不牵涉新蛋白质合成的细胞内机制。此外，在无脂多糖或IL-1β的情况下，在转染之前用合成的局部用糖皮质素对原代大鼠肺细胞进行预处理，可使β-gal蛋白质的水平高于未处理的对照。本发明描述了有关研究，这些研究涉及质粒DNA的糖皮质素-增强转染的机制。因此，本发明直接涉及基因治疗的体内应用。在本发明的一个例子中，提供了一种在将合适载体中的基因输送给动物之后，提高该基因在生物组织中细胞表达的方法，该方法包括步骤给该动物施用药理有效量的、足以提高该基因细胞表达的糖皮质素。在本发明的另一个例子中，提供了一种治疗人病理状态的方法，它是通过在将基因输送给需要这种治疗的人的生物组织之后，提高该基因的细胞表达，其中该方法包括步骤给人施用药理有效量的、足以提高该基因细胞表达的糖皮质素。本发明其他的和进一步的方面、特征和优点，通过下列有关本发明目前的优选实施例的描述，会变得很明显。这些实施例是为了说明而给出的。附图简述因此，可以获得并详细理解上述的本发明特征、好处和目的以及其他明显之处，并可结合其某些在附图中阐述的实施例对上面简要概述过的本发明作更具体的描述。这些附图是本说明书的一部分。然而，应理解，附图阐述用于阐述本发明的优选实施例而不应认为用于限制本发明范围。图1显示，在用pCMVβ-gal-阳离子脂质转染的A549细胞中，脂多糖和IL-1β会抑制β-半乳糖苷酶(β-gal)活性。A549细胞用培养基、0.5微克/毫升脂多糖或100U/毫升重组的人IL-1-β处理4小时。在处理之后，用1微克/毫升pCMVβ-gal-4微克DMRIE/DOPE转染细胞。β-gal活性用可特异性地测量β-半乳糖苷酶活性的(CPRG)比色计微量滴定分析法加以测得。结果为3次试验的平均值及标准差。倍数-变化＝脂多糖或IL-1样品中的β-gal活性/用培养基处理的样品中的β-gal活性。图2显示，在转染的A549细胞中，糖皮质素可增强β-gal活性。A549细胞用糖皮质素处理4小时。图2A显示转染细胞对倍氯米松的剂量反应，其中剂量为10-7-10-6M。图2B显示几种其他的局部用糖皮质素在10-6M时也能诱导提高β-gal的活性布地奈德，BUD；氟尼缩松，FLUN；倍氯米松-双丙酸酯-二月桂酰磷脂酰胆碱，倍氯米松-DLPC。在处理之后，用1微克/毫升pCMVβ-gal-4微克DMRIE/DOPE转染细胞。β-gal活性用微量滴定分析法加以测得。结果为3次试验的平均值及标准差。倍数-变化＝糖皮质素处理的细胞中的β-gal活性/用培养基处理的细胞中的β-gal活性。图3显示，在转染的A549细胞中，倍氯米松可逆转脂多糖和IL-1β对β-gal活性的抑制效应。A549细胞仅用培养基、或用倍氯米松(10-6M)、IL-1β(100U/毫升)或脂多糖(0.5微克/毫升)处理4小时。在第一个4小时之后，去除上清液然后按指定用培养基、IL-1β、脂多糖，或用倍氯米松再处理4小时(即，倍氯米松，脂多糖；用倍氯米松先处理第一个4小时，然后用脂多糖处理第二个4小时)。在第二次处理之后，用1微克/毫升pCMVβ-gal-4微克DMRIE/DOPE转染细胞。β-gal活性用微量滴定分析法加以测得。结果为2次试验的平均值及标准差。倍数-变化＝倍氯米松、脂多糖、IL-1处理的或混合处理的细胞中的β-gal活性/用培养基处理的细胞中的β-gal活性。图4显示，在原代大鼠肺细胞中，倍氯米松可增强β5-gal活性。从用酶消化的大鼠肺中分离出原代大鼠肺细胞，然后以1.0×10-5细胞/孔置于细胞孔组织培养皿中。细胞用10-7-10-6M浓度范围内的倍氯米松、脂多糖(0.5微克/微升)或倍氯米松+脂多糖(4小时倍氯米松+4小时脂多糖)处理4小时。然后，用3微克DNA和12微克DMRIE/DOPE进行转染。48小时之后，β-gal活性用CPRG微量滴定分析法加以测得。结果为3(*2)次试验的平均值及标准差。倍数-变化＝倍氯米松、脂多糖、倍氯米松+脂多糖处理的细胞中的β-gal活性/用培养基处理的细胞中的β-gal活性。图5显示，倍氯米松介导的增强作用并不限制于阳离子脂质、载体启动子或载体报道基因，这种增强作用对糖皮质素是特异的。A549细胞用倍氯米松或其他类固醇(图5B，类固醇雌激素，E2；黄体酮，PROG；胆固醇，CHOL)处理4小时。在处理之后，细胞用下列物质进行转染在图5A中用1微克/毫升pCMVβ-gal和3微克/毫升DOSPA/DOPE；在图5B中用1微克/毫升pSVβ和4微克/毫升DMRIE/DOPE或1微克/毫升pCMVβ-gal和4微克/毫升DMRIE；以及在图5C中用1微克/毫升pCMVHICAT和4微克/毫升DMRIE/DOPE。β-gal活性用微量滴定分析法加以测得。氯霉素乙酰转移酶(chloramphicolacetyltransferase，CAT)活性用TLC氯霉素乙酰转移酶分析法进行测定，其中同位素14C乙酰化的氯霉素被TLC所分辨，然后用设定于检测14C的贝塔扫描器测定14C的掺入量。图5A和图5C中的结果是3次试验的平均值及标准差。图5B中的结果表示了3次试验。倍数-变化＝倍氯米松或类固醇处理的细胞中的β-gal活性或CAT活性/用培养基处理的细胞中的β-gal或氯霉素乙酰转移酶的活性。图6显示，倍氯米松并不增加A549细胞中质粒的摄入量。用培养基或固定剂量的倍氯米松预处理A549细胞4小时，然后用3H-胸苷标记的pCMVβ-gal进行转染。在转染2小时后，细胞被洗涤、稍用胰蛋白酶消化，并离心沉淀。然后裂解沉淀物，再悬浮，然后加入液闪混合液。测定每个样品的3H-胸苷标记的pCMVβ-gal的摄入量(CPM)。结果为4次试验的平均值及标准差，其中每个试验点重复一次。倍数-变化＝倍氯米松预处理样品中的CPM/用培养基预处理的样品中的CPM。图7显示了受倍氯米松增强的报道基因表达过程的动力学。A549细胞用10-6M倍氯米松或培养基处理不同时间。用1微克/毫升pCMVβ-gal-4微克DMRIE/DOPE转染细胞。β-gal活性用CPRG微量滴定分析法加以测得。结果为2次试验的平均值及标准差。倍数-变化＝倍氯米松处理的细胞中的β-gal活性/用培养基处理的细胞中的β-gal活性。图8显示，倍氯米松介导的对β-gal活性的增强作用并不需要蛋白质的合成。细胞用培养基或CHX(10微克/毫升)处理30分钟。用培养基预处理过的细胞，随后用培养基或10-6M倍氯米松处理4小时。用CHX预处理过的细胞，随后用CHX或10-6M倍氯米松+CHX处理4小时。用1微克/毫升pCMVβ-gal和4微克/毫升DMRIE/DOPE转染细胞。β-gal活性用CPRG微量滴定分析法加以测得。结果为2次试验的平均值及标准差。使用BEC时的倍数-变化＝倍氯米松处理的细胞中的β-gal活性/用培养基处理的细胞中的β-gal活性。使用倍氯米松+CHX时的倍数-变化＝倍氯米松+CHX处理的细胞中的β-gal活性/用CHX处理的细胞中的β-gal活性。图9显示，在A549细胞中，倍氯米松提高了稳定态的mRNA水平。A549细胞用10-6M倍氯米松或培养基处理4小时。用1微克/毫升pCMVβ-gal和4微克/毫升DMRIE/DOPE转染细胞。在转染后指定的时间(小时)，收获总RNA，并将其转变为cDNA，而特异性的β-gal信使RNA用如下所述的RS-PCR进行扩增。RS-PCR样品在1％TAE琼脂糖凝胶上分离，并转移至尼龙滤膜上。将滤膜与32P-标记的β-gal探针杂交。用贝塔扫描器分析滤膜，并且对适当大小的条带进行计数。倍数-变化＝倍氯米松处理的细胞中β-gal的CPM/用培养基处理的细胞中β-gal的CPM。发明详述在本发明中，使用下列缩写，脂多糖鼠伤寒沙门氏杆菌脂多糖；IL-1β白细胞介素-1-β；GC糖皮质素；E2雌二醇；PROG黄体酮；CHOL胆固醇；BUD布地奈德；BEC倍氯米松双丙酸酯；FLUN氟尼缩松；DLPC二月桂酰磷脂酰胆碱；β-gal大肠杆菌β-半乳糖苷酶CAT氯霉素乙酰转移酶DMRIE/DOPEN-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷氧基(tetradecytoxy))-1-丙铵溴化物/二油酰磷脂酰乙醇胺；DOSPA/DOPE2，3-二油酰氧N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸二油酰磷脂酰乙醇胺DMEMDulbecco′s极限必需培养基；FBS胎牛血清；CHX环己酰亚胺；RS-PCRRNA-特异性聚合酶链反应；CPRG氯酚-β-D-吡喃半乳糖苷；cAMP环腺苷一磷酸；CREBcAMP应答元件结合蛋白。本发明涉及一种在将基因输送给动物之后，提高该基因在细胞中细胞表达的方法，该方法包括步骤给该动物施用药理有效量的、足以提高该基因细胞表达的糖皮质素。在本发明还涉及一种治疗人病理状态的方法，它是通过在将基因输送给需要这种治疗的动物的生物组织之后，提高该基因的细胞表达，其中该方法包括步骤给该动物施用药理有效量的、足以提高该基因细胞表达的糖皮质素。一般，任何的糖皮质素都可用于本发明方法，但是很明显不是任何的消炎药都适用，因为在环孢菌素A处理的细胞中没有观察到这种效应。代表性的糖皮质素包括氢可的松、泼尼松、泼尼松龙、曲安西龙、倍他米松、布地奈德、氟尼缩松和地塞米松。糖皮质素可以是合成的或非合成的糖皮质素。一般，糖皮质素的施用量约为0.6-50毫克/千克，这取决于所输送的糖皮质素种类(因为存在药效差异)以及输送的是生理剂量还是药理剂量。在本发明方法中，糖皮质素可以是液体可溶形式、醇可溶形式或水可溶形式，其中任何一种都可被掺入到脂质体中。一般，糖皮质素的给药方式是使糖皮质素的增强所输送基因活性的能力最优化。例如，糖皮质素的给药可以与该基因的输送同时进行，或者在该基因的输送之前或之后进行。给药途径可以是任何本领域中合适的途径，其中包括气溶胶、静脉内、腹膜内给药等。不论将基因输送到哪种生物组织，本发明方法是有效的。例如，如果将基因输送到诸如肝、白细胞、肺、肠胃道、肾、骨骼肌肉、平滑肌、神经组织、皮肤细胞、癌细胞、眼、骨髓和肿瘤之类的组织中，那么基因活性可以被增强。基因的输送可以用任何途径进行。例如，可以通过注射、口服给药、皮肤给药或气溶胶给药来输送基因。在另一例子中，糖皮质素被包裹在中性的或带电荷的脂质体中，如本领域中已知的那样。或者，基因被溶解在溶剂如乙醇中。本发明在任何动物中都有效，不论在人还是非人的动物中。即，尽管本发明方法主要用于人，但是对于那些本领域的一般技术人员而言可以在各种兽医上的应用是显而易见的。在本发明方法中，基因可以用已知方法进行转染。将基因转染入生物组织的代表性方法例子包括病毒转染、阳离子脂质转染、以及采用受体和阳离子胺如聚-L-赖氨酸的靶向基因治疗。事实上，不论是重组基因、天然基因、cDNA还是寡聚体，用本方法可以增强任何基因的活性。糖皮质素增强在翻译前的启动子阶段或某个细胞调控阶段中载体的活性。下列实施例的给出是用于阐述本发明的各种例子，而不是用于以任何方式限制本发明。实施例1细胞和细胞培养物A549细胞得自ATCC。A549被维持在Dulbecco′s极限必需培养基(DMEM，GIBCO-LifeTechnologies)中，其中加有10％含低脂多糖的确定的胎牛血清(FBS，Hyclone)、200mML-谷氨酰胺和50微克/毫升庆大霉素。对于大多数转染，细胞以3×10-4细胞/毫升接种于12孔簇培养皿上(Corning)。这一浓度的细胞，在细胞转移24小时后，会形成汇合度约30％的单细胞层。原代大鼠肺细胞是如下制备的。从成年的Sprague-Dawley雌性大鼠获得肺，并充分粉碎。粉碎后的肺被再悬浮于0.5×胰蛋白酶在Hank′s平衡盐溶液中的溶液1小时，然后悬浮于含100U/毫升胶原酶(C.Perfringens，IV，SigmaChemical)、100U/毫升DNaseI(Sigma)、添加有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′s极限必需培养基(DMEM)中。组织在摇床上于37℃温育1.5小时。解离的细胞通过几层无菌纱布而过滤，然后以1.0×106细胞/孔被置于含DMEM+10％FBS的6孔簇培养皿(Corning)中。细胞在37℃，潮湿和5％CO2的培养箱中温育13-24小时，然后进行转染。实施例2化学物质和试剂环己酰亚胺、脂多糖(鼠伤寒沙门氏杆菌的脂多糖)、布地奈德(BUD)和氟尼缩松(FLU)也是从SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO购买的。所有的糖皮质素被溶解在无水乙醇中。倍氯米松双丙酸酯是OrionPharmaceuticals，Kuopio，Finland的赠品。倍氯米松(在中性脂质体中)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC，AvantiPolarLipids，Birmingham，AL)的制备是通过将0.5毫克倍氯米松和25毫克DLPC，溶在37℃的叔丁醇中。然后将样品在乙醇和干冰中急速冷冻，并冻干。脂质体在无菌的、没有内毒素的水中重新构成。人重组IL-1β是从GenzymeCorp.(Carbridge，MA)购得。实施例3cDNApCMVβ-gal和pCMVHICAT是从GenzymeCorp.获得的，pSVβ是从Clontech(CA)购买的。用Qiagen柱纯化系统(Qiagen，Chatsworth，CA)抽提和纯化质粒DNA。用E-TOX柱(Sterogene，CA)将大多数脂多糖从质粒制剂中去除。用Biowhitaker/MicrobiologicalAssociates(Bethesda，MD)的LAL试剂盒评估质粒的内毒素。DNA浓度的确定是通过A260读数并将类似浓度的质粒纯化DNA与用氯化铯纯化的DNA进行比较而得出的。在260纳米下1个OD单位吸光度对应于50微克/毫升DNA。实施例4脂质2，3-二油酰氧N-[2-(精胺羧酰胺)乙基]-N，N-二甲基-1-丙铵三氟乙酸(DOSPA)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)(DOSPA/DOPE，Lipofectamine)是从GIBCO/BRL购买的。N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(十四烷氧基(tetradecytoxy))-1-丙铵溴化物(DMRIE)/DOPE是从GenzymeCorp.(Framingham，MA)获得的。实施例5DNA-阳离子脂质体制剂DNA-脂质比是如下进行优化的。将质粒cDNA(2.5微克)与水中的各种浓度的阳离子脂质进行混合，以产生一系列的DNA脂质比率。让DNA-脂质混合物在室温下温育15分钟，然后在1％琼脂糖凝胶上，于1×Tris-乙酸盐(40mM)-EDTA(2mM)(TAE)缓冲液中，通过电泳而将复合物分离出。最佳比率被认为是这样的DNA脂质浓度，在该浓度下，所有的DNA都被脂质所结合，从而被保留在凝胶起始处。如下所述，通过转染A549细胞而对比率进行验证。对每种脂质和质粒组合，以及各批DNA和脂质之间，都对最佳的DNA脂质比率进行验证。对于DOSPA/DOPE，最佳的DNA脂质重量比为1微克DNA3微克脂质，而对于DMRIE/DOPE为1微克DNA4微克脂质。实施例6转染所有的转染都在OPTIMEM(GIBCO-LifeTechnologies)中进行。将1微克pCMVβ-gal与在1毫升OPTIMEM中的4微克DMRIE/DOPE或3微克DOSPA/DOPE合并，然后在室温下温育15分钟。单细胞层在无血清的培养基中洗涤2次，然后用1毫升转染混合物加以覆盖，并在37℃，于潮湿、5％CO2的条件下温育2.5小时。用DMEM+10％FBS替换DNA-脂质体覆盖物，然后再温育细胞48小时。收获细胞裂解物，并根据制造商的说明(BCA分析，PierceChemical，Rockfield，IL)测定总蛋白，而且将氯酚(chlorophenored)-β-D-吡喃半乳糖苷(galactopyranoside)比色微量滴定法作为所述的(CPRG)分析法(Boerhinger-Mannheim，Germany)，测定β-半乳糖苷酶活性。具体而言，单细胞层用PBS洗涤，然后用2％甲醛-0.2％戊二醛固定，然后在20mM氰铁酸钾、20mM氰亚铁酸钾和2mM氯化镁中，用X-gal(40微克/毫升，5′-3′Inc.Boulder，CO)进行染色。实施例7DNA-脂质的摄入研究通过将1mCi3H-TdR(3H-TdR，74GBq/mmol，Amersham)加入到25毫升用pCMVβ-gal-转化的大肠杆菌DH5α菌株的过夜培养物中，从而制得3H-胸苷标记的pCMVβ-gal质粒。用Qiagen吸嘴柱(tipcolumn)(100微克大小，Chatsworth，CA)，按制造商的说明，将标记的质粒分离出。如下确定标记DNA的饱和结合。将1微克-0.125微克3H-TdR标记DNA的、一系列稀释物加至A549细胞中，然后温育2、6或24小时。单细胞层被洗涤，用1×胰蛋白酶漂洗，稍被胰蛋白酶消化，然后通过离心使细胞沉淀。沉淀物在100微升裂解缓冲液(0.1MTRIS和0.5％TritonX-100)中裂解，加入液闪混合物(BCS，Amersham)，然后通过液闪测定3H-质粒标记的数量。对于摄入试验，用糖皮质素或培养基对A549细胞预处理4小时。用饱和浓度的3H-标记的质粒+脂质处理细胞2.5小时。如上测定摄入情况。实施例8RNA-特异性PCR(RS-PCR)按本领域熟知的那样进行RS-PCR。简而言之，用10-6M倍氯米松预处理细胞，然后如上进行转染。在温育结束之后，用酸化的、含0.75M柠檬酸钠和1％十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)的异硫氰酸胍(FlukaChemical)进行裂解。用RNAeasy系统(Qiagen，Chatsworth，CA)收获RNA。用A260测定总RNA量，然后将0.5微克RNA在凝胶上进行电泳以确定RNA的完整性。用0.3微克总RNA，采用MMLV逆转录酶(GIBCO，LifeTechnologies)、寡聚dT的置换引物T30D20-gal(GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATACACCTCGCGGAAACCGACAT)而制得cDNA。该引物含有20个与mRNA3′端互补的碱基对和30个不相关的碱基。此外，每个反应掺人2.5μCi32Pα-dCTP作为示踪物。反应在37℃温育1小时。当温育结束时，用Qiaquick离心(spin)PCR纯化试剂盒(Qiagen，Chatsworth，CA)收获DNA-RNA杂合体，从而去除引物和未掺入的同位素。将1微升cDNA滴在2个相同的硝酸纤维素膜上并通过LSC进行计数。对于PCR，每个样品用25,000CPM。除此之外，按下述进行PCR。PCR混合物含有500mM氯化钾、50mMTris-HCl，pH9.0、50mM氯化钠，10mM氯化镁、20μMdNTP和1单位TaqDNA聚合酶(Promega，MadisonWI)。引物是5β-gal(GAGAATACCGACGGGTTGTTACT)和T30-gal(GAACATCGATGAACAAGCTTAGGTATCGATA)，它为T30D20-gal寡聚体末端的30个核苷酸。引物的使用浓度为1.25μM。针对引物和模板的组合，对PCR循环进行优化(33个循环)。在PCR结束之后，将产物在1％TAE琼脂糖凝胶进行分离，然后印迹至尼龙滤膜上。滤膜用32P-标记的pCMVβ-gal探针进行杂交过夜，然后洗涤以除去未杂交的计数。用Betagen贝塔扫描器评估印迹，然后测定正确大小的条带的CPM。实施例9细菌脂多糖和白细胞介素-1β对转染效率的影响细菌细胞中的脂多糖是一种有力的免疫调节物质，它能够引发级联事件，其中包括细胞因子的产生和细胞征集(recruitment)。在以前的研究中，已表明，通过正调控IL-1βmRNA(脂多糖)以及诱导IL-8mRNA(IL-1β)，A549细胞会对脂多糖和IL-1β产生应答。在本发明中，用100单位/毫升IL-1β或0.5微克/毫升脂多糖处理A549细胞4小时，然后用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE进行转染。如图1所示，与用培养基处理的A549细胞相比，IL-1β和脂多糖都明显地降低了β-gal活性。实施例10在pCMVβ-gal-阳离子脂质-转染的A549细胞中局部用的糖皮质素增强β-半乳糖苷酶活性在转染之前，用剂量为10-7至10-6M合成的、局部用糖皮质素倍氯米松或用培养基预处理A549细胞4小时。在5×10-7M至10-6M范围内的倍氯米松时，可一直观察到2-4倍的增强情况，而对于10-7M仅观察到稍微增强(图2A)。此外，其他局部用类固醇如布地奈德、FLUN和倍氯米松的中性脂质体形式(即倍氯米松-DLPC)也可增强A549细胞中的β-gal活性(图2b)。10-6M的倍氯米松-DLPC也可将β-gal活性提高到类似于乙醇中布地奈德或倍氯米松所达到的程度(图2A)，这表明脂质体分子并不影响这一效果。FLUN总是表现出较低的增强效果，这与糖皮质素的效力是相符的。实施例11糖皮质素处理可逆转IL-1β和脂多糖对基因表达的抑制作用倍氯米松表现出，已逆转了这两种免疫调节物质的不良效应。为了更具体地显示这一现象，用10-6M倍氯米松预处理A549细胞4小时，然后用脂多糖或IL-1β处理4小时，再用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE进行转染。如前所见，IL-1β和脂多糖会抑制β-gal表达的程度，而倍氯米松会增强β-gal活性2.5倍。在用倍氯米松预处理，然后用IL-1β或脂多糖处理(倍氯米松，脂多糖；倍氯米松，IL-1β)的细胞中，β-gal的表达超过未处理细胞2倍，并接近“仅用倍氯米松”预处理的细胞中的水平。这暗示，倍氯米松中断了IL-1β或脂多糖的抑制效应。因为许多进行基因治疗的病人患有慢性的革兰氏阴性细菌感染，因此，在输送基因或倍氯米松之前，就可能存在脂多糖和IL-1β的抑制效应。为了确定倍氯米松对β-gal表达的增强效应是否可在用脂多糖或IL-1β预处理过的细胞中克服β-gal活性的抑制作用，先用脂多糖或IL-1β预处理A549细胞4小时，然后用倍氯米松处理4小时，接着用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE进行转染(IL-1β、BEC；脂多糖、BEC)。图3显示，即使在用脂多糖或IL-1β处理细胞，从而早已建立起抑制过程(参见仅用脂多糖、IL-1β处理的情况)的情况下，倍氯米松双丙酸酯处理不仅可恢复β-gal活性，而且可以将β-gal活性增加到高于用培养基处理的转染细胞。在用脂多糖或IL-1β预处理过然后用倍氯米松处理的细胞中，β-gal活性水平不能很好地达到在仅用倍氯米松预处理的细胞中所见到的β-gal活性的增加水平。这暗示，某些方面的脂多糖或IL-1β-诱导的抑制活性被保留了。因此，本发明表明，即使在已发生感染的情况下，倍氯米松处理也可提高DNA-阳离子脂质法的基因转染作用。实施例12糖皮质素介导的报道基因活性增强的定性研究为了确定糖皮质素所导致的β-gal活性增强是否是一种更普遍的现象，将大鼠原代肺细胞分离出，然后用培养基或糖皮质素预处理4小时，接着再用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE进行转染。如图4中所示，可看出对几种不同的大鼠细胞制备物的综合结果，即β-gal活性提高2倍。与A549细胞相比，大鼠原代肺细胞似乎对倍氯米松更敏感，其中发现β-gal活性的最佳增强是在10-7M。与在A549细胞中所观察到的结果相似，脂多糖抑制β-gal活性。同样，用倍氯米松预处理然后用脂多糖进行刺激，可以将β-gal活性恢复到用培养基预处理细胞中的活性水平；超过对照的增强情况较轻微。因此，在大鼠原代肺细胞的异质群体中，糖皮质素也可逆转脂多糖对β-gal活性的抑制效应，这暗示，糖皮质素也可在体内增强对类似细胞类型的转染糖皮质素效应并不是对阳离子脂质DMRIE/DOPE特异，因为在先用倍氯米松预处理然后用pCMVβ-gal和DOSPA/DOPE(另一种阳离子脂质)转染的细胞中β-gal表达也上升(图5A)。此外，该效应对载体中的CMV启动子也不是特异的，因为当A549细胞先用倍氯米松双丙酸酯预处理，然后用pSVβ-DMRIE/DOPE(一种含有SV40启动子的载体)转染时，也观察到糖皮质素介导的增强情况(图5B)。最后，糖皮质素介导的基因表达增强也不限于β-gal报道基因，因为当报道基因是氯霉素乙酰转移酶(CAT)时也观察到了类似结果(图5C)。为了排除其他类固醇也可能提高β-gal活性的可能性，在通过阳离子DMRIE/DOPE用pCMVβ-gal或pSVβ进行转染之前，用各种剂量的雌激素(雌二醇)、黄体酮、胆固醇或者用倍氯米松处理4小时。仅在用倍氯米松处理的细胞中观察到β-gal的增强效应，这表明，在A549细胞中增强效应是糖皮质素特异性的。使用不同的脂质、启动子或报道基因时的倍氯米松介导的增强作用的剂量应答，与用pCMVβ-gal+DMRIE/DOPE在A549细胞中所见的情况相似，在5×10-7至10-6M时产生最大增强的报道基因活性。本发明这些研究的综合结果表明，这种糖皮质素对细胞的效应是一种普遍的现象，它并不限于特定的糖皮质素、报道基因、启动子、脂质或细胞系。该效应在原代肺细胞中是剂量依赖型的，表现出对倍氯米松更高的敏感性。因为该效应并不是特定糖皮质素所特有的，所以溶解在乙醇中的倍氯米松可用于本文下述的其余研究工作。实施例13倍氯米松双丙酸酯-介导的报道基因表达增强的机制载体摄入一种使报道基因表达提高的可能性是更高的载体摄入。这一可能性可以用两种方法来处理确定β-gal染色的细胞数目对活性，以及放射性标记的质粒-阳离子脂质的摄入。对于染色的细胞，将相同的A549细胞培养物用倍氯米松双丙酸酯或仅用培养基处理4小时，然后用DMRIE/DOPE和pCMVβ-gal进行转染。在48小时时，将一组培养物进行裂解，并测定β-gal活性，而另一组则用中性缓冲的甲醛固定并用β-gal染色(对于每种处理有重复的孔)。计数在1×1平方厘米面积内的染色细胞。如表I所示，当在β-gal分析中β-gal活性增加的同时，被β-gal染色的细胞数目，在用培养基预处理过的细胞和用倍氯米松双丙酸酯预处理过的细胞之间是相近的。这暗示，更高的β-gal表达并不是因为有更多数目的细胞摄入了质粒。表I</tables>因为有可能染色技术不够灵敏以致于不能检测出质粒摄入的增加，所以用下列方法来解决这一问题，即将用倍氯米松处理过和培养基处理过的细胞中放射性标记质粒的摄入量进行比较。为了保证在标记中质粒基本上未被改变，通过在质粒制备(参见上面内容)过程中向细菌培养物中加入3H-胸苷而使质粒被代谢标记。在对标记材料确定了饱和结合和摄入动力学之后，用数种浓度的倍氯米松双丙酸酯处理A549细胞4小时，然后用3H标记的DNA-DMRIE/DOPE进行转染。在2小时后，用胰蛋白酶处理细胞、裂解并通过LSC确定放射性标记质粒的摄入情况。在图6中所示的结果证实了用染色法所见的结果；倍氯米松并不增加摄入量，因此倍氯米松必然是通过某种其他机制起作用，从而提高β-gal活性。实施例14GC-介导的转染β-gal表达的增强的动力学为了确定糖皮质素诱导β-gal活性增强的时间进程，用培养基或用10-6M倍氯米松预处理A549细胞不同时间，以确定这一效应的动力学。如图7所见，为了看到β-gal转染的增强，需要最少暴露于倍氯米松3-4小时。在8小时预处理时，增强的β-gal活性为最大，而且在监测的24小时内仍维持最大。3-4小时的预温育需求加上质粒摄入实验暗示，在被倍氯米松增强的β-gal应答的介导过程中涉及一细胞内的合成步骤，而不是仅仅涉及一个细胞表面的事件。实施例15糖皮质素介导的载体活性增强的细胞内作用为了确定被倍氯米松介导的β-gal活性的提高是否需要蛋白质合成，采用了蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)。对指定的A549细胞培养物用培养基预处理或用CHX预处理以阻断蛋白质合成。在30分钟之后，被培养基处理过的细胞培养物再用培养基或倍氯米松进行处理。那些早已用CHX处理过的细胞，再用培养基+CHX或倍氯米松+CHX处理4小时。所有的细胞都用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE进行转染，并在48小时后测定β-gal活性。如图8所示，在对照细胞中CHX中等地抑制了β-gal活性，最可能是阻断了β-gal蛋白质的合成(与pCMVβ-gal加和减CHX相比)。与之相反，在用倍氯米松+CHX处理过的细胞中，仍看到了倍氯米松介导的β-gal活性的提高。事实上，在存在CHX的情况下，倍氯米松介导的β-gal活性提高得更多。这些结果显示，对于倍氯米松而言，为了提高β-gal活性并不需要蛋白质合成。实施例16BEC对A549细胞中pCMVβ-galmRNA水平的影响为了建立β-gal基因表达的动力学，用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE转染A549细胞。在转染结束(2.5小时)后的不同时间，在T＝2、3、7、11和24小时时收获总RNA。在2小时时可检测到mRNA，并且在整个检测期间都维持高水平(数据未给出)。一旦建立了β-gal基因表达的动力学，用培养基或10-6M倍氯米松预处理A549细胞4小时，然后用pCMVβ-gal转染2.5小时。在T＝0、2、3或24小时收获总RNA，然后用RS-PCR确定mRNA水平。尽管T＝2小时时，在未处理的细胞以及用倍氯米松处理的细胞中mRNA水平是高的(分别为38倍和18倍诱导)，但是在T＝3和T＝24小时时，在用倍氯米松双丙酸酯处理过的细胞中检测到稳定态mRNA水平的明确增加(图9)。这些结果表明，糖皮质素或者使转录增加了，或者使mRNA在细胞质中稳定化了。本发明显示，糖皮质素可提高通过阳离子脂质-介导的转染法而转入细胞中的报道基因的表达。这种糖皮质素效应并不依赖于特定的阳离子脂质、载体启动子、载体报道基因或细胞类型。相反，这种糖皮质素效应是一种与糖皮质素有关的普遍现象，因为用两种驱动β-gal基因的启动子时，其他类固醇如雌激素、黄体酮或胆固醇不能提高报道基因的表达。糖皮质素并不是通过增加细胞对质粒的摄入来起作用，而是以某种方式提高报道基因的表达。为了看到基因表达的增加，需要最少3-4小时暴露于糖皮质素。对于倍氯米松增加报道基因活性而言，并不需要新蛋白质合成，而且在倍氯米松双丙酸酯不存在时，CHX并不提高基因表达，这暗示在存在CHX时看见的超诱导可能是糖皮质素特异性的。在A549细胞、人肺癌细胞系和大鼠原代肺细胞分离株中看到了糖皮质素效应。在用pCMVβ-gal-DMRIE/DOPE转染的COS-1猴肾细胞中，没有看到糖皮质素介导的β-gal活性的上升。这可能是因为COS-1细胞没有糖皮质素的受体，或者缺少某种其他在增强反应中所涉及的糖皮质素敏感性细胞内因子。不对糖皮质素效应作出反应的细胞系可用于阐明该反应的本质。最可能的是，如果使用浓度为10-7M倍氯米松而不是使用10-6M的浓度(在大鼠原代培养物中10-6M比10-7M的效力低)，那么在脂多糖存在时可看到更高的倍氯米松对β-gal活性的增强作用。用中间浓度5×10-7M，对这种改变进行检查。在大多数实验室中使用的质粒制剂和几乎每种其他制备的质粒制剂中，都存在脂多糖。将脂多糖从质粒中去除是一个需要在使用基因治疗时加以克服的障碍。无论脂多糖是否存在于质粒中，或者早已存在于有炎症的肺中，倍氯米松能够逆转脂多糖或IL-1β(而且可能其他细胞因子或免疫过程)的抑制效应这一能力，对于临床上的基因治疗是具有重大意义的。糖皮质素介导的报道基因表达增强的机制，才刚刚开始被阐明。已表明，糖皮质素有多种调控性能，它们依赖于糖皮质素浓度、细胞类型、和靶基因或细胞内位点。糖皮质素可以将调控作用于免疫应答；已知被糖皮质素负调控的基因包括IL-1β基因、TNF-α、胞内粘着分子-1(ICAM-1)以及形成细胞外基质如胶原和溶基质素的结构基因。已表明，糖皮质素可通过几种不同的机制调控基因，如通过降低基因转录(如在IL-1β基因中所见的那样)，而且糖皮质素还可在转录后步骤中影响IL-1β表达。糖皮质素还可正调控基因表达。在与糖皮质素相互作用之后，糖皮质素受体就直接与调控元件即已知的糖皮质素应答元件(glucocorticoidresponseelement，GRE)特异性DNA片段结合。在糖皮质素应答性基因启动子中，GC-糖皮质素受体复合物的结合会正调控基因转录。或者，已表明，糖皮质素受体会结合于其他的转录因子如c-fos或c-jun(它们在没有糖皮质素受体存在时会激活基因转录)。通过糖皮质素受体-c-fos或c-jun缔合作用，c-fos、c-jun就不能去激活应答基因了。在本发明中，通过检索序列基因库加以确定，使用的启动子中没有一种具有更普通的GRE。信使RNA半衰期，可能因为糖皮质素介导的对mRNA-特异性内切核酸酶的抑制作用而延长，但是因为在不存在倍氯米松时CHX并不超诱导基因表达，所以对内切核酸酶的抑制作用必然对糖皮质素是有某些特异性的。或者，一种增强转录或翻译的辅因子(一种对于新蛋白质合成不需要的辅因子)可能被糖皮质素正调控，从而增强报道基因蛋白质的产生。Liu等人的最近研究表明，当地塞米松(DEX)被偶联于抑生长素启动子片段时，它可提高报道基因基活性。已表明，其机制并不涉及启动子中经典的GRE，相反糖皮质素受体表现出与蛋白质cAMP调控元件结合蛋白(CREB)(已知它结合于另一转录元件cAMP调控元件(CRE))的联合活性。cAMP和蛋白质激酶A都涉及Dex-介导的报道基因活性增强效应。对于PEPCK基因也表现出类似的情况糖皮质素正调控以及cAMP增加转录。在本发明中，此处所示的糖皮质素效应对一个启动子区域而言并不是特异的。就是说，对于具有SV40启动子或CMV启动子的载体，糖皮质素都可提高该载体中β-gal的活性。不可能这两种启动子在其启动子中都有类似的CRE序列，但是这种可能性还不确定。另一研究显示了细胞增殖对转染基因表达的正向效应。与此处所见的相类似，没有观察到报道基因摄入的增加，但是在因细胞受伤而刺激进行增殖的细胞中观察到荧光素酶活性增加10倍。在本发明的研究中，糖皮质素不可能诱导细胞增殖，因为在48小时的整个温育期间，A549细胞或肺细胞的密度是始终处于对数生长期的。多年来，糖皮质素已被用于临床，并被认为是安全和有效的。具有慢性肺炎疾病的病人是将糖皮质素作为气溶胶输送以进行局部治疗的良好候选对象。此外，已表明，糖皮质素治疗可提高囊性纤维变性病人的总体肺功能，尤其是当治疗是在局部早期进行时。考虑到糖皮质素的安全性和基因治疗的成本(它由昂贵的DNA制剂和阳离子脂质构成)，并且考虑到将大量DNA-脂质反复输送所带来的潜在副作用，这使本发明在基因治疗和糖皮质素的分子生物学方面更具吸引力。在本说明书中提及的所有专利和出版物代表了本发明有关的
技术领域：
中技术人员的水准。这些专利和出版物都同等地被引用作为参考，就象每篇出版物被具体而单独地被注明被引用一样。本领域的技术人员会轻易地理解，本发明适用于实施目的并获得所提及的结果和好处，以及那些内在的结果和好处。此处所述的这些实施例和方法、程序、处理、分子、和具体的化合物是目前优选例子的代表，是代表性的，因而不用于限制本发明范围。本领域的技术人员可进行改动或作其他用途，这些都包括在本发明的被权利要求所界定的范围内。序列表(1)一般信息(i)申请人Schwarz，L.等人(ii)发明名称糖皮质素对基因表达的增强作用(iii)序列数目3(iv)通讯地址(A)姓名JamesF.Weiler，律师(B)街道OneRiverway，Suite1560(C)城市Houston(D)州Texas(E)国家USA(F)邮政编码77056(v)计算机可读形式(A)记录介质类型DS，HD1.44Mb/1.44Mo(B)计算机IBMPC兼容型(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件WordPerfect6.0(vi)本申请资料(A)申请号(B)申请日(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Weiler，JamesF.(B)登记号16,040(C)参考/案卷号D-5806(ix)通讯信息(A)电话713-626-8646(B)传真713-963-5853(2)SEQIDNO1的信息(i)序列特征(A)长度50(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述其他核酸(iii)假设否(iv)反义否(vi)最初来源(B)菌株N/A(C)单个分离株N/A(D)发育阶段N/A(F)组织类型N/A(G)细胞类型N/A(H)细胞系N/A(xi)序列描述SEQIDNO1GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATACACCTCGCGGAAACCGACAT50(2)SEQIDNO2的信息(i)序列特征(A)长度22(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述其他核酸(iii)假设否(iv)反义否(vi)最初来源(B)菌株N/A(C)单个分离株N/A(D)发育阶段N/A(F)组织类型N/A(G)细胞类型N/A(H)细胞系N/A(xi)序列描述SEQIDNO2GAGAATACCGACGGGTTGTTACT22(2)SEQIDNO3的信息(i)序列特征(A)长度31(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述其他核酸(iii)假设否(iv)反义否(vi)最初来源(B)菌株(C)单个分离株(D)发育阶段(F)组织类型(G)细胞类型(H)细胞系(xi)序列描述SEQIDNO3GAACATCGATGAACAAGCTTAGGTATCGATA3权利要求1.一种将基因输送给动物之后，提高该基因在生物组织中细胞表达的方法，其特征在于，该方法包括步骤给该动物施用药理有效量的、足以提高该基因细胞表达的糖皮质素。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该糖皮质素选自下组氢可的松、泼尼松、泼尼松龙、曲安西龙、倍他米松、布地奈德、氟尼缩松和地塞米松。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该糖皮质素的施用剂量约为0.1-50毫克/千克。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该生物组织选自下组肝、白细胞、肺、肠胃道、肾、骨骼肌肉、平滑肌、神经组织、皮肤细胞、癌细胞、眼、骨髓和肿瘤。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该糖皮质素为选自下组的形式液体可溶形式、醇可溶形式或水可溶形式。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该基因被包裹在脂质体中。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该基因被溶解在溶剂中。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该基因的输送是通过选自下组的途径注射、口服给药、皮肤给药或气溶胶给药。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该糖皮质素的施用是与该基因的输送同时进行，或在输送该基因之前或之后进行。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该动物选自下组人和非人的动物。11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该糖皮质素选自下组合成的糖皮质素和非合成的糖皮质素。12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该基因是用选自下组的方法转染的病毒转染、阳离子脂质转染、以及采用受体和阳离子胺的靶向基因治疗。13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，该阳离子胺是聚-L-赖氨酸。14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该基因选自下组重组基因、天然基因、cDNA和寡聚体。15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该糖皮质素增强质粒或病毒载体中所含基因的表达和/或活性。16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该糖皮质素增强启动子的活性。17.一种治疗人病理状态的方法，它是通过将基因输送给需要这种治疗的动物的生物组织之后，提高该基因的细胞表达，其特征在于，该方法包括步骤给该动物施用药理有效量的、足以提高该基因细胞表达的糖皮质素。全文摘要本发明提供了一种将基因输送给动物之后,提高该基因在生物组织中细胞表达的方法,该方法包括步骤:给该动物施用药理有效量的、足以提高该基因细胞表达的糖皮质素。还提供了一种治疗人病理状态的方法,它是通过将基因输送给需要这种治疗的动物的生物组织之后,提高该基因的细胞表达,该方法包括步骤:给该动物施用药理有效量的、足以提高该基因细胞表达的糖皮质素。文档编号C12N15/87GK1198676SQ96197408公开日1998年11月11日申请日期1996年9月6日优先权日1995年9月8日发明者L·施瓦茨,J·L·约翰逊,V·奈特申请人:研究发展基金会