专利名称：：反式－4－羟基－l－脯氨酸的制造方法
技术领域：
：本发明涉及工业上制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，所说反式-4-羟基-L-脯氨酸可以作为N-乙酰羟脯氨酸(用作消炎药)、碳杂青霉烯系抗生素等医药品的合成原料或食品添加剂使用，而且本发明还涉及用于该制造方法中的含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因而且使脯氨酸合成系统活性增强的转化体。利用微生物制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法已知有如下一些报道。1)利用属于大肠杆菌属的微生物，由4-羟基-2-酮戊二酸制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法(特开平3-266995)，2)利用细菌或霉类直接发酵生产的方法(EuropeanPatentAp-plicationEPO547898A2、特开平5-236980、特开平6-245782)，3)利用属于链霉菌属的微生物，由L-脯氨酸制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法[J.Biol.Chem.、254卷、6684-6690页(1979年)，Biochem.Biophys.Res.Comm.、120卷，45-51页(1984年)，TetrahedronLetters，34卷，7489～7492页(1993年)，TetrahedronLetters、35卷，4649～4652页(1994年)]。以前的反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法中由于存在有如下一些问题，工业化生产困难，这些问题是1)由于是由4-羟基-2-酮戊二酸等制造反式-4-羟基-L-脯氨酸，基底物价格高而且很难买到，2)反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产效率低，3)参与反式-4-羟基-L-脯氨酸制造的酶的活性很弱。而有关参与反式-4-羟基-L-脯氨酸制造的酶有如下报道，即有从指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1精制L-脯氨酸-4-羟化酶的报道(特开平7-322885)，以及由上述的属于链霉菌属的微生物精制该酶的报道[Biochem.J.、313卷，185-191(1966)]。另外还有编码在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下，具有使游离的L-脯氨酸转换成反式-4-羟基-L-脯氨酸活性的L-脯氨酸-4-羟化酶的基因可从上述的指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1筛选出，获得含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的质粒pRH71，再构建在色氨酸串联启动子控制下使L-脯氨酸-4-羟化酶基因表达的质粒pTr2-40H，在大肠杆菌中表达活性的报道(日本农艺化学会1996年度大会、讲演要旨集257页)。使用活性高的L-脯氨酸-4-羟化酶，找出利于工业上制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。另一方面已弄清楚了有关脯氨酸生物合成途径中的酶和其基因存在于大肠杆菌等生物中[J.Gen.Microbiol.、118卷、287-293(1980年)，Blochim.Biophys.Acta、104卷、397-404(1965年)]。而脯氨酸生物合成例如在大肠杆菌等生物中作为生物合成途径中的第一酶γ-谷氨酰激酶(GK)可以通过产物脯氨酸的反馈抑制被调节[Biochim.Biophys.Acta、192卷、462-467(1969年)]。另外，已知通过使编码GK的基因ProB产生变异，生成使反馈抑制显著减少的GK，制造出脯氨酸高生产株[Mol.Gen.Genet.、182卷、82-86(1981年)，J.Becteriol.、156卷、1249-1262(1983年)，以及J.Bacteriol.、164卷、1088-1093(1985年)]。作为使该ProB引起了变异的基因已知有ProB74，已知ProB74的变异点通过将编码区5′端开始的319号的G换成A，结果使得从ProB蛋白的N末端的第107号天冬氨酸变成了天冬酰胺[Gene、64卷、199-205(1988年)]。参与脯氨酸分解的酶系、编码该酶系的基因、以及基因的调控也通过对大肠杆菌、沙门氏菌等研究逐渐清楚了[J.Bacteriol.、146卷、895-901(1981年)，J.Mol.Biol.、148卷、21-44(1981))。利用使脯氨酸生物合成系统的活性增强的菌株制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法还没有报道。本发明的课题在于为了更利于工业上利用L-脯氨酸-4-羟化酶有效地制造反式-4-羟基-L-脯氨酸，提供了一种含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因、带有使该基因高效表达的重组DNA、并且使脯氨酸生物合成系统的活性增强的转化体，以及利用该转化体能很便宜地工业上制造反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法。本发明是有关反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法的发明，其特征是将含有编码在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下能作用于游离的L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的具有L-脯氨酸-4-羟化酶活性的蛋白质的基因的DNA片段重组入载体里，得到带有重组DNA并且使L-脯氨酸生物合成系统的活性增强的转化体，然后培养该转化体，以该培养物、菌体或它们的处理物作为酶源，在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下，于水性介质中将L-脯氨酸转换成反式-4-羟基-L-脯氨酸，再从水性介质中获得生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸。以下详细地说明本发明。与本发明有关的L-脯氨酸-4-羟化酶是一种在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下，使游离的L-脯氨酸羟基化生成反式-4-羟基-L-脯氨酸的酶。含有编码本发明的L-脯氨酸-4-羟化酶的DNA的质粒，例如有pRH71等。含pRH71的大肠杆菌大肠杆菌SOLR/pRH71于平成7年3月2日以FERMBP-5025保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，地址是日本国茨城具筑波市东1丁目1番3号(邮政编码305)。为了使L-脯氨酸-4-羟化酶基因在宿主细胞中表达，首先用限制性酶类或DNA分解酶类将含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的DNA片段作成含有该基因的适当长度的DNA片段，然后插入表达载体中启动子的下游，再将该表达载体导入适合该载体的宿主中。作为宿主，可以表达目的基因的都可以使用。例如除了可以使用属于大肠杆菌属、沙雷代菌属、棒状杆菌属、短颈细菌属，假单胞菌属、芽胞杆菌属等属的微生物菌株外，也可使用酵母菌株或动物细胞宿主等。作为表达载体、可以使用能在上述宿主中独立复制或者可重组入染色体中，在可以转录L-脯氨酸-4-羟化酶基因的位置中含有启动子的载体。以大肠杆菌等微生物作为宿主时，L-脯氨酸-4-羟化酶表达载体在微生物中独立复制的同时，最好是由启动子、核糖体结合序列、L-脯氨酸-4-羟化酶基因、转录终止序列构成，含有控制启动子的基因更好。作为表达载体，例如有pBTrp2、pBTac1、pBTac2(以上都是BoehringerManheim出售)、pKYP10(特开昭58-110600)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.，48卷，669-675(1984年)、pLSA1[Agric.Biol.Chem.，53卷，277(1989年)]、pGEL1[Proc.Natl.A-cad.Sci.，USA，82卷，4306(1985年)]、pBluescript(STRATA-GENE公司)、pTrs30[由E.ColiJM109/pTrs30(FERMBP-5407)制备]和pTrs32[由E.ColiJM109/pTrs32(FERMBP-5408)制备]。作为启动子，只要是在大肠杆菌等宿主中能表达的即可。例如，可以用trp启动子(Ptrp)、lac启动子(Plac)、PL启动子、PR启动子等，以及来自大肠菌或噬菌体等的启动子。另外也可以采用像将2个Ptrp串联的启动子(Ptrpx2)、tac启动子那样人为设计改变的启动子。作为核糖体结合序列，只要是在大肠杆菌等宿主中能表达的即可，但最好是采用将核糖体结合序列和起始密码之间留出适当的距离(例如6-18碱基)的质粒。L-脯氨酸-4-羟化酶基因只要是编码L-脯氨酸-4-羟化酶的基因哪种都可以用，但为了使该基因的DNA序列变成最适合于在宿主微生物中表达的密码，通过替换碱基可以作到高效表达。以大肠杆菌作为宿主，作成最适合表达的密码，作为替换了碱基的L-脯氨酸-4-羟化酶基因的具体例子给出了序列号1等表示的碱基序列。该基因表达中的转录终止序列虽然未必需要，但最好是在紧靠着结构基因的下面配置转录终止序列。作为宿主可以使用大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌W1485、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101、大肠杆菌No.49、大肠杆菌W3110、大肠杆菌NY49、枯草杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短杆菌属immariophilumATCC14068、短杆菌属saccharolyticumATCC14066、短杆菌属flavumATCC14067、短杆菌属lactofermentumATCC13869、棒杆菌属glutamicumATCC13032、嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870、微杆菌属ammoniaphilumATCC15354等。用酵母菌株作宿主时，作为表达载体，例如可以使用YEp13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)等。作为启动子，只要是在酵母菌株的宿主中可以表达的即可。例如可以使用己糖激酶等糖酵解系统的基因的启动子、gal1启动子、gal10启动子、热休克蛋白启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等。作为宿主可以用酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、丝孢酵母属pullulans、河岸许旺酵母等。以动物细胞作为宿主时，作为表达载体可以使用pcDNAI/Amp、pcDNAI、pcDM8(都是Funacoshi公司出售)等。作为启动子，只要在动物细胞中能表达的即可。例如可以用人CMV的IE(im-mediateearly)基因的启动子等。另外也可以将人CMV的IE基因的增强子与启动子共用。作为宿主可以使用Namalba细胞HBT5637(特开昭63-299)、COS细胞、CHO细胞等。作为向动物细胞导入DNA的方法，只要能够将DNA导入动物细胞的即可。例如可以使用电穿孔法[Miyaji等人Cytotechnology，3，133(1990)]、磷酸钙法(特开平2-227075)、脂质体载体法[PhilipL.Felgner等人Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，84，7413(1987)]。转化株的获得和培养按照特开平2-227075或特开平2-257891记载的方法进行。为了作到使宿主的脯氨酸生物合成系统的活性增强可以通过以下步骤完成。1)使宿主中的脯氨酸合成系统基因的拷贝数增加、2)使编码受到来自脯氨酸反馈抑制的合成系统的基因变异，将编码来自脯氨酸反馈抑制显著减少的酶的基因导入宿主、3)使脯氨酸的分解活性缺失、或者是通过将上述操作组合起来。脯氨酸合成系统的基因或编码来自脯氨酸反馈抑制显著减少的脯氨酸合成系统的酶的基因无论是存在宿主的染色体上还是存在于质粒等宿主中的载体上都可以。作为编码因脯氨酸反馈抑制显著减少的脯氨酸合成系统酶的基因有proB74基因、DHPrproB基因[gene、39卷、109-112(1984年)]等。另外，使脯氨酸合成系统基因或编码来自脯氨酸反馈抑制显著减少的脯氨酸合成系统酶与脯氨酸-4-羟化酶基因共同存在于质粒等宿主中的载体上时，两个基因既可以存在于一个质粒上，也可以存在于其它的可能共存的质粒上。作为可能共存的质粒，例如有，在大肠杆菌中，大肠杆菌素E1系的质粒(例如pBR322)和pACYC系的质粒、大肠杆菌素E1系的质粒和F因子系的质粒、大肠杆菌素E1系的质粒和R因子系的质粒等。为了使脯氨酸合成系统基因在宿主中表达可以使用与上述的L-脯氨酸-4-羟化酶基因的表达同样的方法。为了使宿主的脯氨酸分解活性缺失，用变性剂处理宿主后，例如就细菌讲，可以选择在Pro-TTC板上[ApplEnviron，Microbiol，、33卷、434-444(1977年)]形成白色菌落的。另外，在大肠杆菌等生物中通过将转座子插入到put基因的适当位置可以使脯氨酸的利用性丧失[Genetics、92卷、741-747(1979年)]，插入转座子后通过耐药性和上述的Pro-TTC板选择，也可得到脯氨酸分解活性缺失株。还有通过P1转导[AShortCourseInBacterialGenetics，ALab-oratoryManualandHandbookforEsherichiacoliandRelatedBacteri-a，J.H.Miller，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1922，Labo-ratoryManual，pp.263]也可以将脯氨酸分解活性缺失这一特性从因转座子造成的脯氨酸分解活性丧失株转移到别的菌株里。如上所述利用脯氨酸生物合成系统的活性增强的宿主得到的转化体的培养可以按通常的方法进行。对用大肠杆菌或酵母菌等微生物作为宿主的转化体进行培养的培养基只要是含有微生物可以利用的碳源、氮源、无机盐类，可以有效对转化体进行培养的培养基，无论是天然培养基还是合成培养基都可以。作为碳源只要是各种微生物可以利用的就可以，可以使用葡萄糖、半乳糖、蔗糖、含有这些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等糖、醋酸、丙酸等有机酸、乙醇、丙醇等醇类。作为氮源可以使用氨、氯化铵、硫酸铵、醋酸铵、磷酸铵等各种无机酸或有机酸的铵盐、还有其它的含氮化合物以及胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆糟和大豆糟水解物、各种发酵菌体以及其消化物等。作为无机物可以用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。培养是在振荡培养或深部通气搅拌培养等好氧条件下进行。培养温度最好是15～40℃、培养时间为16～100小时。培养中pH保持在3.0～9.0。调整pH用无机或有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙、氨等。根据培养中的需要，也可以在培养基中添加氨苄青霉素或四环素等抗生素。在培养以采用了诱导性启动子的表达载体转化了的微生物时，根据需要也可以在培养基中添加诱导物。例如，在培养以采用Lac启动子的表达载体转化的微生物时，培养基中可加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等，而在培养以采用trp启动子的表达载体转化了的微生物时可向培养基中添加吲哚丙烯酸(IAA)。在培养以动物细胞为宿主的转化体时用的培养基通常是RP-MI1640培养基、EagleMEM培养基或使用在这些培养基中添加了胎牛血清的培养基。培养是在5％CO2存在下等条件下进行的。培养温度最好是35～37℃，培养时间通常为3～7日。另外，根据培养的需要培养基中也可添加卡那霉素、青霉素等抗生素。这样培养得到的转化体中，与带有用作基因源的微生物菌株、例如指状孢子囊·霉菌-RH1等和带有pTr2-4OH的重组大肠菌比较，L-脯氨酸-4-羟化酶的生成量显著蓄积，脯氨酸生物合成活性也高，同时反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造可以更高效率地进行。该转化体中L-脯氨酸-4-羟化酶的生成可通过如下步骤检测。将培养物、菌体或它们的处理物加到适于酶反应的水性介质中，同时加入L-脯氨酸、二价铁离子、2-酮戊二酸，根据需要添加表面活性剂或有机溶剂，检测生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸，就可知L-脯氨酸-4-羟化酸的生成。该酶的活性，在下述测定条件下以1分钟生成1nmol的反式-4-羟基-L-脯氨酸的活性作为1单位(U)表示。另外，这里微生物菌体包含动物细胞称之为菌体。L-脯氨酸-4-羟化酶活性的测定向含有12mML-脯氨酸、24mM2-酮戊二酸、4mM硫酸亚铁和8mML-抗坏血酸的240mM的MES[2-(N-吗啉代)乙磺酸]缓冲液(pH6.5)中添加菌体、菌体处理物或酶的标准品等，共计250μl，35℃反应10分钟。然后，将反应液于100℃加热2分钟，使反应停止，用高效液相色谱(以下略记为HPLC)对反应液中生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸进行定量分析。定量时只要是能定量反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法即可，例如使用配体交换色谱柱，如株式会社住化分析中心制SUMICHI-RALOA5000等，用HPLC对反应液中的反式-4-羟基-L-脯氨酸进行分离提取后，再通过7-氯-4-硝苯基-2-氧杂-1，3-二唑(以下略记为NBD)进行后柱诱导后再进行检测的方法(后柱诱导法)，或是将反应液中的目的化合物予先进行NBD诱导后再加到使用了HPLC的反相色谱分析，分离NBD诱导物后进行检测的方法[WilliamJ.LindbladandRobertF.Diegelmann，AnalyticalBio-chemistry、138卷、390～395、1984年](前柱诱导法)等。NBD诱导物的检测都是通过其荧光(激发波长503nm、荧光波长541nm)的测定进行的。如上所述，将确认在培养菌体中有L-脯氨酸生成的转化体在与上述转化体培养条件同样的条件下进行培养，使反式-4-羟基-L-脯氨酸生成蓄积，通过从该培养物中获取反式-4-羟基-L-脯氨酸，可以制造反式-4-羟基-L-脯氨酸。该培养过程中，也可以根据需要在培养基中添加2-酮戊二酸和2价铁离子。通过本发明制造的反式-4-羟基-L-脯氨酸可以利用上述的后柱诱导法或前柱诱导法进行定量分析。实施例1L-脯氨酸-4-羟化酶高表达质粒的构建使用AppliedBiosystem公司制的380A.DNA合成仪合成序列号2记载的DNA和序列号3记载的DNA。该合成的DNA的3′末端25bp设计成互补的序列。该合成DNA中含有编码来自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶蛋白的N末端部分的碱基序列，但在该碱基序列中，对于来自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的碱基序列实施了特定部位的碱基替换为的是使它成为最适于在大肠菌中表达的密码。以该合成DNA作为引物和模板进行PCR。使用含有0.5UPfuDNA聚合酶(STRATAGENE公司制)、PfuDNA聚合酶用×10缓冲液(STRATAGENE公司制)2μl、DMSO2μl、2.5mMdNTP液各1μl、序列号2记载的和3号记载的合成DNA各2μM的反应液20μl，96℃下温育5分钟后、然后是96℃-2分钟、50℃-1分钟、75℃-1分钟的温育过程，重复进行35次，进行PCR。反应结束后，将该反应液加到15％聚丙烯酰胺凝胶上(ATO株式会社制、PagelNPU-15L)，通过电泳运动，确认107bp扩增片段的生成。使用日本Ido株式会公司制的Davinchiqun(Pentatslicabali-NB-7000型)回收该107bp扩增片段后，用HindIII和SalI切该片段的两个末端。使用Bio，Inc.制的MERmaidKit回收HindIII-SalI切后的片段，回收液为16μl。按照参考例1记载的方法作成的质粒pTr2-4OHDNA用BamHI和PvuII切后，将反应液加到琼脂糖凝胶上电泳，确认生成了2个片段。用BioRad公司制的Prep-A-gene回收该片段内含有L-脯氨酸羟化酶的结构基因的长的片段，利用宝酒造公司制的Bluntingkit使其末端平滑后，再使用宝酒造公司制的连接试剂盒，使片段环化。使用已环化的质粒，按常规方法转化E.coliJM109，再将该转化体涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基后于37℃培养1夜。按常规方法从已生长的转化体的菌落提取质粒，通过限制酶消化确认其结构。以上结果可得到去除了pTr2-4OH的一部分序列的质粒pTr2-4OHΔ(图1)。用HindIII和SalI切获得的质粒pTr2-4OHΔDNA后，再将HindIII和SalI处理的上述PCR扩增片段使用宝酒造公司制的连接试剂合插入上述该切断部位。使用得到的质粒，按常规方法转化E.coliXL1-BlueMRF′株，将该转化体涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，于37℃培养一夜。从生长的转化体的菌落中利用常规方法提取质粒，得到质粒pWFH1(图2)。通过限制酶消化确认该质粒的结构。利用AppliedBiosystems公司制的碱基序列确定试剂盒(TaqDyeDeoxyTMTerminatorCycleSequencingKit)确定PCR扩增片段的插入部分。序列号1给出了该碱基序列。该质粒，除了从结构基因的5′末端5alI部位与来自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的碱基序列有一部分不同外，而编码与来自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶完全相同的氨基酸序列的结构基因DNA片段具有被插入到与Ptrpx2转录方向同方向的结构(图2)。如表1所示那样，带有pWFH1的转化体与用作基因源的指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1株比较，生产L-脯氨酸羟化酶的效率高1400倍，而与带有pTr2-4OH的转化体比较，高约5.4倍。表1<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="682">菌株菌体活性1)相对活性2)指孢囊菌RH13)0.0281.0E.coliATCC12435/pTr2-4OH4)3.7132E.coliATCC12435/pWFH14)401400</table></tables>1)菌体活性用每1mg湿菌体的酶活性(U/mgwetcells)表示。1U作为每1分钟生成1nmol的反式-4-羟基-L-脯氨酸的酶活性。2)相对活性是以指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1株生产的酶活性为1表示的。3)是从参考例2记载的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成量算出的菌体活性。4)从实施例8记载的反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成量算出的菌体活性。实施例2脯氨酸分解系统缺损株的制作用以下方法破坏参与E.ColiATCC12435的脯氨酸分解的基因putA，造成脯氨酸分解系统缺损株。将国立遗传学研究所保存的菌株E.coliME8395株[F-pyrD34trp-45his-68thyA25thideoR33galK35xyl-7mtl-2malA1rpsL118λR(λ)-appAlputA∷Tn5(Mu+)]接种到含有35μg/ml的卡那霉素的LB培养基上，过夜培养。向100μl该培养液中添加P1噬菌体液100μl，混合后放置5分钟。将该放置液与含有10mMCaCl2的3ml的LB软琼脂培养基混合，辅在含有10mMCaCl2的LB琼脂培养基上，37℃培养7小时。培养后将得到的琼脂培养基表面的溶菌产物回收到含有10mMCaCl2的2mlLB培养基中。向该回收液中加入0.5ml氯仿，用旋涡混合器混合后，3000rpm离心15分钟，离心的上清用作P1噬菌体溶菌产物。将该P1噬菌体溶菌产物50μl和在含有10mMCaCl的LB培养基中培养的E.coliATCC12435培养液100μl混合，于37℃静置20分钟。将该静置液与3mlF-top-citrate(F-top-citrateNaCl8.5g/l、柠檬酸二钠100mM、琼脂0.7％)混合，涂布于含有35μl/ml的卡那霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养1天。将通过该培养生长的耐卡那霉素株悬浮于0.85％NaCl中，涂布于Pro-TTC板上(K2HPO47g/l、KH2PO43g/l，MgSO40.1g/l、胨2g/1、2，3，5-三苯四唑氯化物0.025g/l、L-Pro2g/l、琼脂15g/l、pH7.2)，37℃下培养1～2天。通过这样培养将Pro-TTC板上形成白色菌落的菌株选择作为丧失分解消化脯氨酸能力的菌株，获得脯氨酸分解活性缺损株E.coliWT1株。该菌株于平成8年8月7日以FERMBP-5618保藏于工业技术院生命工学工业技术研究所，日本国茨城县筑波市东1丁目1番3号(邮编号305)。实施例3脯氨酸生物合成系统基因proB74和proA表达质粒的构建通过以下方法将编码来自大肠菌的γ-谷氨酰激酶的proB基因变换成对脯氮酸的反馈抑制脱敏的变异型基因proB74基因和构建编码来自大肠菌的γ-磷酸谷氨酰还原酶的proA基因的表达载体pPF1。将来自大肠杆菌的含有proB和proA基因的质粒pPRO-1[从大肠杆菌K83株(FERMBP-2807)获得]用EcoRV消化，琼脂糖凝胶电泳后，利用Prep-A-geneDNAPurificationSystem(BIO-RAD公司制)获得含有proB基因的一部分约1kb的DNA片段。将该DNA片段与pUC19(宝酒造公司制)的SmaI消化产物连接，得到质粒pBAB51(图3)。通过以下方法将该质粒中的proB基因变换成众所周知的[A.M.DandekarandS.L.Uratsu，J.Bacteri01.170，5943(1988)]的对来自脯氨酸的反馈抑制脱敏的变异型基因proB74。使用AppliedBiosystems公司制的380A·DNA合成仪合成了序列号4给出的寡核苷酸A1和序列号5给出的寡核苷酸A2。以寡核苷酸A1和M13引物M3(宝酒造公司制、目录号No.3831)作为一组引物，以pBAB51作为模板，通过PCR方法扩增变异型的proB基因proB74基因的部分序列。PCR反应级为含有0.1μgpBAB51、寡核苷酸A1和M13引物M3各2μM、1U的TaqDNA聚合酶(宝酒造公司制)、1.6μldNTP混合物(宝酒造公司制、目录号No.4030)、2μl附加的缓冲液共20μl反应液，反应过程为94℃-30秒钟、52℃-30秒、72℃-1分钟的温育过程，重复进行30循环，最后于72℃温育5分钟。利用同样的方法，以寡核苷酸A2和M13引物RV(宝酒造公司制、目录No.3830A)作为一组引物，以pBAB51为模板，通过PCR扩增变异型proB基因的部分序列。将PCR扩增的该2种DNA分别进行琼脂糖凝胶电泳，使用Prep-A-geneDNAPurificationSystem(BIO-RAD公司制)精制。将该2种精制的DNA片段混合后作为模板，用M13引物M3和M13引物RV作为引物，利用与上述同样的方法，进行PCR和精制，得到含有proB74基因的碱基序列大约1kb的DNA片段。将该DNA片段用Eco0651和SacII消化，得到Eco0651-SacII消化片段。将该消化片段与pPRO-1的Eco-0651-SacII消化DNA片段(约6.8kbp)连接，作成将pPRO-1的proB基因变换成脱敏型proB74基因的质粒pPRO74(图4)。使用AppliedBiosystems公司制380A·DNA合成仪合成序列号6给出的寡核苷酸p1和序列号7给出的寡核苷酸p2。以p1、p2作引物，用质粒pPRO74作模板，通过PCR扩增proB74和proA基因。PCR反应液20μl其中含有0.1μgpPRO74、p1、p2各2μM、TaKaRaExTaq1U(宝酒造公司制、目录RR001Q)、1.6μldNTP混合液(宝酒造公司制，目录号No.4030)，反应过程94℃-1分钟、42℃-2分钟、72℃-3分钟温育，重复进行30循环。将该反应液进行琼脂糖凝胶电泳，利用常规方法提取含有proB74和proA的2370bp的扩增片段，使用GENECLEANIIKIT(BIO101，INC.制)回收该DNA片段。用HindIII和BamHI切回收的2370bpDNA片段，通过乙醇沉淀法得乙醇沉淀。将该沉淀溶解于5μl的TE中，用作proB74和proA片段。使用宝酒造公司制的DNA连接试剂盒将proB74和proA片段与质粒pSTV29(宝酒造公司制)的HindIII-BamHI消化的DNA片段连接起来，构建成插入了proB74和proA片段的质粒。通过常规方法用该质粒转化E.coliJM109菌株，然后涂布于含有30μg/ml的氯霉素、0.1mMIPTG、40μg/ml的X-Gal的琼脂培养基上，于37℃培养过夜。通过培养形成白色菌落的菌株按常规方法提取质粒，通过限制酶消化确认该质粒的结构。利用上述方法，可以获得编码在脱敏型r-glutamylkinase的N末端结合了β-半乳糖苷酶的α片段的N末端8个氨基酸残基(lacZ.Nterm)的融合蛋白的基因和proA基因存在于Plac控制下的质粒pPF1(图5)。序列号8给出了该融合蛋白的结构基因(lacZ.Nterm-proB74)的碱基序列和氨基酸序列。实施例4通过含有脯氨酸生物合成系统基因表达质粒的转化体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸使用实施例3构建的质粒pPF1转化实施例2得到的E.coliWT1株，得到转化株E.coliWT1/pPF1。用实施例1构建的脯氨酸-4-羟化酶表达质粒pWFH1转化实施例2得到的WT1菌株，得到E.coliWT1/pWFH1。从该转化株E.coliWT1/pWFH1，利用氯化钙方法制作感受态细胞，然后导入到实施例3制作的质粒pPF1中，将带有两个质粒的转化株E.coliWT1/pWFH1/pPF1于含有30μg/ml的氯霉素和50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基上培养，通过选择生长出的菌落获得目的转化株。将WT1、WT1/pPF1、WT1/pWFH1和WT1/pWFH1/pPF1分别于含有卡那霉素37.5μg/ml、氨苄青霉素100μg/ml、氯霉素30μg/ml的LB培养基，然后再于含有氨苄青霉素100μg/ml和氯霉素30μg/ml的LB培养基中于37℃培养16小时。分别取培养液各100μl移入加了2％(W/V)的碳酸钙的10ml的Med7培养基(葡萄糖2％、硫酸铵1％、K2HPO40.1％、NaCl0.2％、MgSO40.05％、FeSO40.0278％、CaCl20.0015％、胨0.8％)的粗试管(Φ20×200mm)中，30℃下培养24小时。表2给出了培养上清中的L-脯氨酸和反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。表2</tables>能够确认在带有脯氨酸生物合成系统基因表达质粒pPF1菌株中，L-脯氨酸的生成显著增加，而L-脯氨酸-4-羟化酶表达质粒pWFH1和脯氨酸生物合成系统基因表达质粒pPF1的共存的转化体与单独带有L-脯氨酸-4-羟化酶表达质粒的转化体相比，反式-4-羟基-L-脯氨酸的生成量显著增加。实施例5L-脯氨酸-4-羟化酶和脯氨酸生物合成系统基因proB74和proA表达质粒的构建将来自指孢囊菌(Dactylosporangiumsp.)RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶基因、脯氨酸生物合成系统基因proB74和ProA的全部基因都保持在单一的质粒上，通过以下方法构建能使这一质粒表达的表达质粒pWFP1。以实施例1作成的pWFH1作模板，利用PCR扩增L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因。PCR反应液20μl，其中含有0.1μgpWFH1质粒、0.5UPfuDNA聚合酶(Stratagene公司制)、2μlPfuDNA聚合酶用×10缓冲液(Stratagene公司制)、2μlDMSO、各种2.5mMdNTP液1μl、序列号9记载的和序列号10记载的合成DNA各2μM，将反应液于96℃温育5分钟后、按96℃-2分钟、58℃-1分钟、75℃-3分钟温育过程重复进行30次循环。反应结束后，将该反应液进行琼脂糖凝胶电泳，利用常规方法提取含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的大约800bp的扩增片段，使用GENCLEANIIKIT(BIO101，INC.制)回收该DNA片段。该回收DNA片段用HindIII和EcoRI切后，进行琼脂糖凝胶电泳，使用GENCLEANIIKIT(BIO101，INC.制)回收带有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的HindIII-EcoRI切的DNA片段。将该L-脯氨酸-4-羟化酶基因片段与质粒pBluescriptIIKS(+)(Stratagene公司制)的HindIII-EcoRI消化DNA片段通过宝酒造公司制DNA连接试剂盒连接起来，构建成插入了L-脯氨酸-4-羟化酶片段的质粒pB11-4OH(图6)。以实施例3作成的pPRO74作模板，通过PCR扩增proB74和proA基因。PCR反应液共20μl，其中含有0.1μgpPRO74质粒、TakaraExTaq(宝酒造公司制，codeRR001Q)1U、TakaraExTaq用×10缓冲液(宝酒造公司制)2μl、2.5mMdNTP液1.6μl、序列号11和12记载的合成DNA各2μM，按94°-1分钟、42℃-2分钟、75℃-3分钟的温育过程，重复进行30次循环。反应结束后，对该反应液进行琼脂糖凝胶电泳，利用常规方法提取含有proB74和proA基因的大约2.3Kbp的扩增片段，使用GENECLEANIIKIT(BIO101，INC.制)回收该DNA片段。回收的DNA片段用BamHI和EcoRI切后进行苯酚/氯仿处理、乙醇沉淀，回收该DNA片段。将含有proB74和proA基因的DNA片段与上述质粒pBII-4OH的HindIII-EcoRI消化DNA片段使用宝酒造公司制的DNA连接试剂盒连结起来，构建含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因、proB74和ProA的质粒pBII-4OHBA(图7)。用HindIII和BamHI消化质粒pB11-40HBA，进行琼脂糖凝胶电泳，获得有L-脯氨酸-4-羟化酶基因、proB74和proA大约3.16Kbp的DNA片段。同时用HindIII和BamHI消化实施例1作成的pWFH1，琼脂糖凝胶电泳后获得不含L-脯氨酸-4-羟化酶基因，而含有复制起点的大约2.6Kbp的DNA片段。用宝酒造公司制的DNA连接试剂盒连结得到的2个DNA片段。构建在色氨酸串联启动子作用下能使L-脯氨酸-4-羟化酶、proB74蛋白质、proA蛋白质表达的质粒pWFP1(图8)。实施例6利用转化体E.coliWT1/pWFH1/pPF1和E.coliWT1/pWFP1生产反式-4-羟基-L-脯氨酸将转化株WT1/pWFH1/pPF1株于含有氨苄青霉素100μg/ml和氯霉素30μg/ml的50mlMed4G培养基[葡萄糖2％、蛋白胨1％(日本制药公司制)、酵母提取物0.5％(Difco公司制)、1％NaCl、2％碳酸钙、pH7.0]，而转化株WT1/pWFP1株于含有氨苄青霉素100μg/ml的50mlMed4G培养基中，分别接种后于30℃振荡培养16小时。以该培养液作为种子培养液，分别接种于加了2升Med7培养基的5升发酵罐中，在培养WT1/pWFH1/pPF1株时要添加100μg/ml的氨苄青霉素和30μg/ml氯霉素，而在培养WT1/pWFP1株时，要再添加100μg/ml氨苄青霉素，培养温度为30℃，搅拌数为400转/分，通气量1升/1升培养液/分。同时，在培养WT1/pWFH1/pPF1时，于培养的第8小时添加IPTG使其浓度为0.2mM。另外，两种菌株在培养到第24小时时都添加抗生素，添加的种类和浓度与开始时加的一样。培养中适时地向培养液中添加葡萄糖使其浓度大约为1％，使用NH4OH将pH控制在pH6.5下限。而培养5小时以后通过使搅拌数变化于250～700rpm，将培养液的溶存氧浓度控制在培养开始时的1/15。培养了99小时后，将该培养液离心分离，定量测定离心上清中生成蓄积的反式-4-羟基-L-脯氨酸含量，WT1/pWFH1/pPF1株为156mM(20.5g/l)，WT1/pWFP1株有191mM(25.0g/l)。实施例7利用含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因和脯氨酸生物合成系统基因表达质粒的转化体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸用实施例5构建的质粒pWFP1转化实施例2获得的E.coliWT1株，得到转化株E.coliWT1/pWFP1。将WT1/pWFP1于含有氨苄青霉素100μg/ml的LB培养基中37℃培养16小时。将该培养液100μl接种于装有2％(W/V)碳酸钙的10mlMed7培养基的粗试管(Φ20×200mm)中，于30℃培养24小时。该培养上清中的L-脯氨酸是0.56g/l，反式-4-羟基-L-脯氨酸为2.4g/l。实施例8利用转化体菌株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸将转化体E.coliATCC12435/pTr2-OH接种于含有50μg/ml的氨苄青霉素的3mlLB培养基中，30℃，振荡培养一夜，将该培养液离心分离，得E.coliATCC12435/pTr2-4OH的湿菌体。将转化体E.coliATCC12435/pWFH1接种于含有100μg/ml的氨苄青霉素的100mlMed4培养基[蛋白胨(日本制药)1％、酵母提取物(Difco)0.5％、NaCl1％]中，于30℃振荡培养16小时。将该培养液接种于加了2升Med7培养基(葡萄糖2％、硫酸铵1％、K2HPO40.1％、NaCl0.2％、MgSO40.05％、FeSO40.0278％、CaCl20.0015％，胨0.4％)的5升发酵罐中，然后再加入200mML-Pro，培养温度33℃，通气量为1升/1升培养液/分，在这样条件下，培养48小时。溶存氧浓度达到初期值的1/15时，以搅拌数400转/分作为基准，700转/分作为上限，通过改变搅拌数，将溶存氧的浓度控制在初期值的1/15。培养中，为了使L-脯氨酸维持在大约50mM要适时地添加葡萄糖，保证葡萄糖的供给，使用NH4OH，将pH控制在下限6.5。通过培养得到的培养液离心分离，得到E.coliATCC12435/pTr2-4OH和E.coliATCC12435/pWFH1的湿菌体。该两菌株的湿菌体，根据需要可以于-20℃冷冻保存，使用时解冻后用。向反应液250μl[240mM的MES缓冲液(pH6.5)中含有12mML-脯氨酸、24mM2-酮戊二酸、4mM硫酸亚铁和8mML-抗坏血酸]加入湿菌体使其最终的浓度为4％(W/V)，35℃反应10分钟。将反应液于100℃加热2分钟，终止反应。将该反应液离心分离，定量测定上清中的反式-4-羟基-L-脯氨酸含量，结果E.coliATCC12435/pTr2-4OH株生成了3mM/l，E.coliATCC12435/pWFH1株生成了16mM/l。相对于L-脯氨酸-4-羟化酶的菌体活性分别为7.5和40U/mg.wetcells。参考例1L-脯氨酸-4-羟化酶表达质粒的构建使用AppliedBiosystems公司制的380A·DNA合成仪合成序列号13记载的有意义链DNA引物和序列号14记载的反意义链DNA引物。以该合成的DNA作为引物，用pRH71[通过常规方法从含有该质粒的EscherichiaColiSOLR/pRH71(FERMBP-5025)得到]作模板，进行PCR。PCR反应液为20μl，其中含有0.1μgpRH71、有意义链和反意义链DNA引物各2μM、PfuDNA聚合酶(STRATAGENE公司制)0.125U/μl、DMSO10％、Tris.HCl(pH8.2)20mM、KCl10mM、硫酸铵6mM、氯化镁2mM、TritonX-1000.1％、BovineSerumAlbu-mine10ng/μl。于96℃温育5分钟后，按96℃-2分钟、58℃-1分钟、75℃-1分钟温育过程，重复进行30次循环。反应结束后，将该反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认生成了编码L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因844bp的扩增片段。利用常规方法从琼脂糖凝胶中提取844bp的扩增片段，使用Bio-Rad公司制的Prep-A-gene回收该片段。回收的844bp的DNA片段的两末端用HindIII和BamHI切，通过乙醇沉淀法，得乙醇沉淀。将该沉淀溶于5μl的TE中。以pBR322作为基本组件，将带有2个串联Ptrp启动子Ptrp×2的质粒pKYP200[Agric.Biol.Chem.48卷，669～675(1984年)]和合成连接体组合制作成ATG载体pTrS32[从E.coliJM109/pTrS32(FERMBP-5408)制备]，然后用HindIII和BamHI切。在该切断部位，使用宝酒造公司制连接试剂盒插入用HindIII和BamHI切断处理的上述L-脯氨酸-4-羟化酶结构基因片段。使用得到的质粒，按常规方法转化E.coliXL1-BlueMRF’株，将该转化体涂布于含有50μg/ml的氨苄青霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养过夜。从生长的转化体菌落按常规方法提取质粒，通过限制酶消化确认其结构。使用AppliedBiosystems公司制碱基序列确立试剂盒(TaqDyeDeoxyTMTerminatorCycleSequencingKit)确定结构基因部分的碱基序列，证明是序列号15给出的碱基序列。利用该方法得到了插入了编码与Ptrp×2的转录方向同方向的L-脯氨酸-4-羟化酶的结构基因的DNA片段的质粒pTr2-4OH(图9)。参考例2利用指孢囊菌(Dactylosporagiumsp)菌体生产反式-4-羟基-L-脯氨酸将SR3培养基(含有葡萄糖1.0％、可溶性淀粉1.0％、酵母提取液0.5％、胰蛋白胨0.5％、肉提取物0.3％和磷酸镁0.05％，用6NNaOH将pH调至7.2)分装于试管中，每管10ml，然后于120℃，灭菌20分钟。将于HT琼脂平板培养基培养的指孢囊菌RH1用一铂制小勺接种于上述培养基中，于28℃振荡培养2天，作种子培养液用。将Df1培养基(含有可溶性淀粉5％、大豆研磨物1.5％、磷酸二氢钾0.05％、硫酸镁·7H2O0.05％和碳酸钙0.5％，用6NNaOH将pH调至7.0)分装于试管中，每管10ml，于120℃灭菌20分钟。灭菌操作下将上述种子培养液1ml接种于该培养基中，于28℃振荡培养2天。将所得培养液于8000rpm、4℃下离心10分钟，得菌体。该菌体用80mMTES[N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]缓冲液(pH7，5)洗净后，离心分离，得湿菌体。将该湿菌体150mg悬浮于1.5ml的反应液[向含有4mML-脯氨酸、8mMα-酮戊二酸、4mML-抗坏血酸、2mM硫酸亚铁的80mMTES缓冲液(pH7.5)中添加1.4％(V/V)的奈敏(ナイミン)溶液(奈敏S-215(日本油脂株式会公司制)4g溶解于二甲苯10ml中)]，于30℃反应30分钟。反应结束后，将该反应液离心分离，对得到的上清中的反式-4-羟基-L-脯氨酸含量进行定量测定的结果是有84μmol/l反式-4-羟基-L-脯氨酸生成。该菌株相对于L-脯氨酸-4-羟化酶的菌体活性是0.028U/mg，wetcells。根据本发明，可以提供工业上制造作为医药品的合成原料或食品添加剂有用的反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，可以提供用于该方法中的含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因而且可使脯氨酸合成系统活性增强的转化体。序列表序列号1序列长度816序列类型核酸链数二条链拓扑型直链状序列种类其他的核酸序列ATGCTGACCCCGACCGAACTGAAACAGTATCGTGAAGCGGGCTATCTG48MetLeuThrProThrGluLeuLysGlnTyrArgGluAlaGlyTyrLeu151015CTGATTGAAGATGGCCTGGGCCCGCGTGAAGTCGACTGCCTGCGCCGG96LeuIleGluAspGlyLeuGlyProArgGluValAspCysLeuArgArg202530GCGGCGGCGGCCCTCTACGCGCAGGACTCGCCGGACCGCACGCTGGAG144AlaAlaAlaAlaLeuTyrAlaGlnAspSerProAspArgThrLeuGlu354045AAGGACGGCCGCACCGTGCGCGCGGTCCACGGCTGCCACCGGCGCGAC192LysAspGlyArgThrValArgAlaValHisGlyCysHisArgArgAsp505560CCGGTCTGCCGCGACCTGGTCCGCCACCCGCGCCTGCTGGGCCCGGCG240ProValCysArgAspLeuValArgHisProArgLeuLeuGlyProAla65707580ATGCAGATCCTGTCCGGCGACGTGTACGTCCACCAGTTCAAGATCAAC288MetGlnIleLeuSerGlyAspValTyrValHisGlnPheLysIleAsn859095GCGAAGGCCCCGATGACCGGCGATGTCTGGCCGTGGCACCAGGACTAC336AlaLysAlaProMetThrGlyAspValTrpProTrpHisGlnAspTyr100105110ATCTTCTGGGCCCGAGAGGACGGCATGGACCGTCCGCACGTGGTCAAC384IlePheTrpAlaArgGluAspGlyMetAspArgProHisValValAsn115120125GTCGCGGTCCTGCTCGACGAGGCCACCCACCTCAACGGGCCGCTGTTG432ValAlaValLeuLeuAspGluAlaThrHisLeuAsnGlyProLeuLeu130135140TTCGTGCCGGGCACCCACGAGCTGGGCCTCATCGACGTGGAGCGCCGC480PheValProGlyThrHisGluLeuGlyLeuIleAspValGluArgArg145150155160GCGCCGGCCGGCGACGGCGACGCGCAGTGGCTGCCGCAGCTCAGCGCC528AlaProAlaGlyAspGlyAspAlaGlnTrpLeuProGlnLeuSerAla165170175GACCTCGACTACGCCATCGACGCCGACCTGCTGGCCCGGCTGACGGCC576AspLeuAspTyrAlaIleAspAlaAspLeuLeuAlaArgLeuThrAla180185190GGGCGGGGCATCGAGTCGGCCACCGGCCCGGCGGGCTCGATCCTGCTG624GlyArgGlyIleGluSerAlaThrGlyProAlaGlySerIleLeuLeu195200205TTCGACTCCCGGATCGTGCACGGCTCGGGCACGAACATGTCGCCGCAC672PheAspSerArgIleValHisGlySerGlyThrAsnMetSerProHis210215220CCGCGCGGCGTCGTCCTGGTCACCTACAACCGCACCGACAACGCCCTG720ProArgGlyValValLeuValThrTyrAsnArgThrAspAsnAlaLeu225230235240CCGGCGCAGGCCGCTCCGCGCCCGGAGTTCCTGGCCGCCCGCGACGCC768ProAlaGlnAlaAlaProArgProGluPheLeuAlaAlaArgAspAla245250255ACCCCGCTGGTGCCGCTGCCCGCGGGCTTCGCGCTGGCCCAGCCCGTC816ThrProLeuValProLeuProAlaGlyPheAlaLeuAlaGlnProVal序列号2序列长度64序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列TGAGGAAAGCTTATGCTGACCCCGACCGAACTGAAACAGTATCGTGAAGC50GGGCTATCTGCTGA64序列号3序列长度66序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列CCGGAATTCGTCGACTTCACGCGGGCCCAGGCCATCTTCAATCAGCAGAT50AGCCCGCTTCACGATA66序列号4序列长度22序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列GACCCGTGCTAATATGGAAGAC22序列号5序列长度22序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列GTCTTCCATATTAGCACGGGTC22序列号6序列长度33序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列GGCAAAGCTTCATGAGTGACAGCCAGACGCTGG33序列号7序列长度33序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列TTTGCAGGATCCGGTTTTATTTACGCACGAATG33序列号8序列长度1125序列类型核酸链数二条链拓扑型直链状序列种类其他的核酸序列ATGACCATGATTACGCCAAGCTTCATGAGTGACAGCCAGACGCTGGTG48MetThrMetIleThrProSerPheMetSerAspSerGlnThrLeuVal151015GTAAAACTCGGCACCAGTGTGCTAACAGGCGGATCGCGCCGTCTGAAC96ValLysLeuGlyThrSerValLeuThrGlyGlySerArgArgLeuAsn202530CGTGCCCATATCGTTGAACTTGTTCGCCAGTGCGCGCAGTTACATGCC144ArgAlaHisIleValGluLeuValArgGlnCysAlaGlnLeuHisAla354045GCCGGGCATCGGATTGTTATTGTGACGTCGGGCGCGATCGCCGCCGGA192AlaGlyHisArgIleValIleValThrSerGlyAlaIleAlaAlaGly505560CGTGAGCACCTGGGTTACCCGGAACTGCCAGCGACCATCGCCTCGAAA240ArgGluHisLeuGlyTyrProGluLeuProAlaThrIleAlaSerLys65707580CAACTGCTGGCGGCGGTAGGGCAGAGTCGACTGATTCAACTGTGGGAA288GlnLeuLeuAlaAlaValGlyGlnSerArgLeuIleGlnLeuTrpGlu859095CAGCTGTTTTCGATTTATGGCATTCACGTCGGGCAAATGCTGCTGACC336GlnLeuPheSerIleTyrGlyIleHisValGlyGlnMetLeuLeuThr100105110CGTGCTAATATGGAAGACCGTGAACGCTTCCTGAACGCCCGCGACACC384ArgAlaAsnMetGluAspArgGluArgPheLeuAsnAlaArgAspThr115120125CTGCGAGCGTTGCTCGATAACAATATCGTTCCGGTAATCAATGAGAAC432LeuArgAlaLeuLeuAspAsnAsnIleValProValIleAsnGluAsn130135140GATGCTGTCGCTACGGCAGCGATTAAGGTCGGCGATAACGATAACCTT480AspAlaValAlaThrAlaAlaIleLysValGlyAspAsnAspAsnLeu145150155160TCTGCGCTGGCGGCGATTCTTGCGGGTGCCGATAAACTGTTGCTGCTG528SerAlaLeuAlaAlaIleLeuAlaGlyAlaAspLysLeuLeuLeuLeu165170175ACCGATCAAAAAGGTTTGTATACCGCTGACCCGCGCAGCAATCCGCAG576ThrAspGlnLysGlyLeuTyrThrAlaAspProArgSerAsnProGln180185190GCAGAACTGATTAAAGATGTTTACGGCATTGATGACGCACTGCGCGCG624AlaGluLeuIleLysAspValTyrGlyIleAspAspAlaLeuArgAla195200205ATTGCCGGTGACAGCGTTTCAGGCCTCGGAACTGGCGGCATGAGTACC672IleAlaGlyAspSerValSerGlyLeuGlyThrGlyGlyMetSerThr210215220AAATTGCAGGCCGCTGACGTGGCTTGCCGTGCGGGTATCGACACCATT720LysLeuGlnAlaAlaAspValAlaCysArgAlaGlyIleAspThrIle225230235240ATTGCCGCGGGCAGCAAGCCGGGCGTTATTGGTGATGTGATGGAAGGC768IleAlaAlaGlySerLysProGlyValIleGlyAspValMetGluGly245250255ATTTCCGTCGGTACGCTGTTCCATGCCCAGGCGACTCCGCTTGAAAAC816IleSerValGlyThrLeuPheHisAlaGlnAlaThrProLeuGluAsn260265270CGTAAACGCTGGATTTTCGGTGCGCCGCCGGCGGGTGAAATCACGGTA864ArgLysArgTrpIlePheGlyAlaProProAlaGlyGluIleThrVal275280285GATGAAGGGGCAACTGCCGCCATTCTGGAACGCGGCAGCTCCCTGTTG912AspGluGlyAlaThrAlaAlaIleLeuGluArgGlySerSerLeuLeu290295300CCGAAAGGCATTAAAAGCGTGACTGGCAATTTCTCGCGTGGTGAAGTC960ProLysGlyIleLysSerValThrGlyAsnPheSerArgGlyGluVal305310315320ATCCGCATTTGCAACCTCGAAGGCCGCGATATCGCCCACGGCGTCAGT1008IleArgIleCysAsnLeuGluGlyArgAspIleAlaHisGlyValSer325330335CGTTACAACAGCGATGCATTACGCCGTATTGCCGGACACCACTCGCAA1056ArgTyrAsnSerAspAlaLeuArgArgIleAlaGlyHisHisSerGln340345350GAAATTGATGCAATACTGGGATATGAATACGGCCCGGTTGCCGTTCAC1104GluIleAspAlaIleLeuGlyTyrGluTyrGlyProValAlaValHis355360365CGTGATGACATGATTACCCGT1125ArgAspAspMetIleThrArg370375序列号9序列长度37序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列TATCGATAAGCTTATGCTGACCCCGACCGAACTGAAA37序列号10序列长度33序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列GGCAGAATTCTAGACGGGCTGGGCCAGCGCGAA33序列号11序列长度38序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列AAAATTGAATTCCAGAGAATCATGAGTGACAGCCAGAC38序列号12序列长度36序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列ACCCGGATCCATTTACGCACGAATGGTGTAATCACC36序列号13序列长度37序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列GTGAGGAAAGCTTATGCTGACCCCGACGGAGCTCAAG37序列号14序列长度36序列类型核酸拓扑型一条链序列种类其他的核酸、合成DNA序列GCCTGCGGGATCCTAGACGGGCTGGGCCAGCGCGAA36序列号15序列长度816序列类型核酸链数二条链拓扑型直链状序列种类GenomicDNA起源生物名指孢囊菌种(Dactylosporangiumsp.)株名RH1确定特征的方法E序列ATGCTGACCCCGACGGAGCTCAAGCAGTACCGCGAGGCGGGCTATCTGCTCATCGAGGAC60GGCCTCGGCCCGCGGGAGGTCGACTGCCTGCGCCGGGCGGCGGCGGCCCTCTACGCGCAG120GACTCGCCGGACCGCACGCTGGAGAAGGACGGCCGCACCGTGCGCGCGGTCCACGGCTGC180CACCGGCGCGACCCGGTCTGCCGCGACCTGGTCCGCCACCCGCGCCTGCTGGGCCCGGCG240ATGCAGATCCTGTCCGGCGACGTGTACGTCCACCAGTTCAAGATCAACGCGAAGGCCCCG300ATGACCGGCGATGTCTGGCCGTGGCACCAGGACTACATCTTCTGGGCCCGAGAGGACGGC360ATGGACCGTCCGCACGTGGTCAACGTCGCGGTCCTGCTCGACGAGGCCACCCACCTCAAC420GGGCCGCTGTTGTTCGTGCCGGGCACCCACGAGCTGGGCCTCATCGACGTGGAGCGCCGC480GCGCCGGCCGGCGACGGCGACGCGCAGTGGCTGCCGCAGCTCAGCGCCGACCTCGACTAC540GCCATCGACGCCGACCTGCTGGCCCGGCTGACGGCCGGGCGGGGCATCGAGTCGGCCACC600GGCCCGGCGGGCTCGATCCTGCTGTTCGACTCCCGGATCGTGCACGGCTCGGGCACGAAC660ATGTCGCCGCACCCGCGCGGCGTCGTCCTGGTCACCTACAACCGCACCGACAACGCCCTG720CCGGCGCAGGCCGCTCCGCGCCCGGAGTTCCTGGCCGCCCGCGACGCCACCCCGCTGGTG780CCGCTGCCCGCGGGCTTCGCGCTGGCCCAGCCCGTC816附图的简单说明图1是表示质粒pTr2-4OHΔ的构建过程图。图中黑的粗线部分表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的耐氨苄青霉素基因；Ptrp×2表示来自大肠杆菌的色氨酸操纵子的启动子2个串联的启动子(串联Trp启动子)。箭头表示基因转录和翻译的方向。而图中只给出了与质粒构建有关的限制酶部位。图2是表示质粒pWFH1的构建过程图。图中网格粗线表示的部分表示HindIII和SalI处理的PCR扩增片段的插入部位。黑的粗线表示的部分表示含有来自指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的耐氨苄青霉素基因，Ptrp×2表示来自大肠杆菌的色氨酸操纵子的启动子2个串联起来的启动子(串联Trp启动子)。箭头表示基因转录和翻译方向。而图中只给出了与质粒构建有关系的限制酶切部位。图3是表示质粒pBAB51的构建过程图。图中黑的网格表示的部分是含有脯氨酸合成系统酶基因proB74和proA的部分。Ap表示来自pBR322的耐氨苄青霉素基因，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段的结构基因。Tc表示来自pBR322的耐四环素基因。箭头表示基因转录和翻译方向。而图中只给出了与质粒构建有关的限制酶切部位。图4是表示质粒pPRO74的构建过程中黑的网格表示的部分是含有脯氨酸合成系统酶基因proB74和proA的部分。黑的部分表示在proB74和proB中含有唯一不同碱基对的proB74基因的一部分。Tc表示来自pBR322的耐四环素基因。箭头表示基因转录和翻译的方向。而图中只给出了与质粒构建有关系的限制酶切部位。图5是表示质粒pPF1的构建过程图。图中黑的粗线部分表示含有脯氨酸合成系统酶基因proB74和proA的部分。Cmr表示来自Tn9的耐氯霉素基因的部分。pA-CYC.ori表示来自pACYC184的复制起点，Plac表示lacZ启动子，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段结构基因。lacZ.Nterm-proB74表示β-半乳糖苷酶α片段结构基因的N末端部分与proB74基因融合了的基因。箭头表示基因转录和翻译的方向。而图中只给出了与质粒构建有关系的限制酶切部位。图6是表示质粒pBII-4OH的构建过程图。图中黑粗线部分表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。Ap表示来自pBR322的耐氨苄青霉素的基因，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段的结构基因。箭头表示基因转录和翻译的方向。而图中只给出了与质粒构建有关的限制酶切部位。图7是表示质粒pBII-4OHBA的构建过程图。图中黑的粗线部分表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。黑网格部分表示含有脯氨酸的合成系统酶基因proB74和proA的部分。Ap表示来自pBR322的耐氨苄青霉素基因，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段结构基因。箭头表示基因转录和翻译的方向。而图中只给出了与质粒构建有关的限制酶切部位。图8是质粒pWFp1的构建过程图。图中黑粗线部分表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。黑网格部分表示含有脯氨酸合成系统酶基因proB74和proA的部分。Ap表示来自pBR322的耐氨苄青霉素的基因，lacZ表示β-半乳糖苷酶α片段结构基因。Ptrp×2表示来自大肠杆菌的色氨酸操纵子的启动子2个串联的启动子(串联Trp启动子)。箭头表示基因转录和翻译的方向。而图中只给出了与质粒构建有关的限制酶切部位。图9是表示质粒pTr2-4OH的构建过程图。图中黑粗线部分表示含有L-脯氨酸-4-羟化酶基因的部分。Ap是来自pBR322的耐氨苄青霉素的基因，Ptrp×2表示来自大肠杆菌的色氨酸操纵子的启动子2个串联的启动子(串联Trp启动子)。箭头表示基因转录和翻译的方向。而图中只给出了与质粒构建有关的限制酶切部位。权利要求1.一种带有重组DNA而且能使L-脯氨酸生物合成系统的活性增强的转化体，其中的重组DNA是通过将含有编码具有L-脯氨酸-4-羟化酶活性的蛋白质的基因的DNA片段重组到载体中得到的，所说的L-脯氨酸-4-羟化酶活性是指在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下作用于游离的L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸。2.权利要求1记载的转化体，其特征是L-脯氨酸生物合成系统的活性增强是通过使宿主中的脯氨酸合成系统基因的拷贝数增加、让受到来自脯氨酸反馈抑制的脯氨酸合成系统酶基因产生变异、向宿主中导入编码受到脯氨酸反馈抑制显著减少的酶的基因、使脯氨酸分解活性丧失、或通过以上这些手段的组合来实现的。3.权利要求1记载的转化体，其特征是L-脯氨酸生物合成系统活性的增强是通过导入编码与L-脯氨酸的生物合成有关的酶的基因来实现的。4.权利要求3记载的转化体，其中的基因是来自大肠杆菌的proB或proA基因。5.权利要求3记载的转化体，其中的基因是编码与来自L-脯氨酸反馈抑制减少的脯氨酸生物合成有关的酶的基因。6.权利要求5记载的转化体，其中的基因是来自大肠杆菌的proB74基因。7.反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法，其特征是将权利要求1、2、3、4、5或6记载的转化体在培养基上培养，将得到的培养物、菌体或它们的处理物作为酶源，在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下，于水性介质中使L-脯氨酸变换成反式-4-羟基-L-脯氨酸，再从该水性介质中获取生成的反式-4-羟基-L-脯氨酸。8.权利要求7记载的制造方法，其特征是水性介质是培养液。全文摘要本发明提供带有重组DNA而且可以使L－脯氨酸生物合成系统的活性增强的转化体,其中重组DNA是通过将含有编码在2－酮戊二酸和2价铁离子存在下,作用于游离的L－脯氨酸,生成反式－4－羟基－L－脯氨酸的具有L－脯氨酸－4－羟化酶活性的蛋白质的基因的DNA片段重组到载体后得到的,同时本发明还提供反式－4－羟基－L－脯氨酸的制造方法。文档编号C12N15/53GK1178245SQ97117929公开日1998年4月8日申请日期1997年9月2日优先权日1996年9月3日发明者尾崎明夫,柴崎刚,森英郎,丸山明彦,本山裕章申请人:协和发酵工业株式会社