纤维素织物的脱浆方法

专利名称：纤维素织物的脱浆方法
技术领域：
本发明领域本发明涉及织物或纺织品，更特别是含纤维素织物或纺织品脱浆〔即从中除去“浆料”(参看下文)〕的改良酶学方法，以及该方法中所用的组合物。
本发明背景纺织品纺织方法中，丝线承受着相当大的机械张力。为了避免断裂，通常要包被(“上浆”)一种胶凝状物质(“浆料”)。
最常用的上浆剂是天然或经修饰的淀粉。然而，在浆料中也可有大量其它聚合物，例如聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，聚丙烯酸(PAA)或纤维素衍生物〔如羧甲基纤维素(CMC)，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素或甲基纤维素〕。小量的如脂肪或油类也可加入浆料中作为润滑剂。
上浆带来的后果，使得织物丝线不能充分地吸收水分、整理剂或其它组分(例如，漂白，染色或防皱组分)。因此只有从织物中除去浆料后才能获得均一持久的织物整理；用于该目的的除浆方法被称为“脱浆”方法。
在浆料包含淀粉的实例中，脱浆处理可以用淀粉降解酶(例如淀粉酶)来完成。在浆料中含有脂肪和/或油类的实例中，脱浆处理可包括使用脂解酶(脂酶)。在浆料中含有明显数量的羧甲基纤维素(CMC)或其它纤维素衍生物的实例中，脱浆处理可以选用纤维素分解酶进行，或单独使用或与其它物质结合使用皆可，可任选与其它酶类如淀粉酶和/或脂酶结合使用。
本发明目标是通过酶类修饰使得酶对纤维素织物的亲和力改变(增加)，以便经修饰的酶可以与上浆剂更近地接触，从而在脱浆条件下获得更好的酶性能。
本发明概述现令人惊异地发现，通过一种酶促方法来获得改良酶促去除吸附在含纤维素的织物或纺织品上的浆化剂是可行的，其中织物或纺织品与一种已被改良的酶相接触，这种改良增加了酶结合纤维素织物或纺织品的亲和力(相对于未经改良有酶而言)。
本发明的详细描述因此本发明特别涉及纤维素织物或纺织品的脱浆方法，其中织物或纺织品用改良酶(酶杂合体)处理(通常在水介质中接触)，该酶含有与具纤维素结合结构域的氨基酸序列相连接的一种酶-特别是非纤维素分解酶-的具催化(酶学)活性的氨基酸序列。
术语“脱浆”应以常规方式理解，即从织物上除去上浆剂。
术语“含纤维素的”和“纤维素的”与织物或纺织品相联系使用时是表示由含纤维素材料(例如棉花)或由纤维素衍生材料(如由木浆或棉花制备)制备的任意类型织物，特别是机织织物。
在本文中，术语“织物”意在包括服装和其它类型经过加工的织物，并可与术语“纺织品”替换使用。
由天然发生的纤维素纤维所生产的纤维素织物的实例是棉布、苧麻织物、黄麻织物和亚麻织物。由人造纤维素纤维生产的纤维素织物的实例是粘胶纤维(人造丝)和lyocell(例如TencelTM)织物；同时与本发明内容有关的实例是纤维素纤维(如粘胶纤维，lyocell，棉，苧麻，黄麻或亚麻)和其它纤维，例如羊毛、聚酯、聚丙烯酸、聚酰胺或聚醋酸纤维的所有混纺织物。混合型纤维素织物的特别实例是粘胶纤维/棉花混纺品，lyocell/棉花混纺品(如TencelTM/棉花混纺品)，粘胶纤维/羊毛混纺品，lyocell/羊毛混纺品，棉花/羊毛混纺品，棉花/聚酯混纺品，粘胶纤维/棉花/聚酯混纺品，羊毛/棉花/聚酯混纺品和亚麻/棉花混纺品。
纤维素结合结构域尽管专利文献和科学论文中已经叙述了许多类型的碳水化合物结合结构域，其中大部分-许多来自纤维素分解酶(纤维素酶)-常称作“纤维素结合结构域”；典型的纤维素结合结构域(CBD)因此是指存在于纤维素酶中并优选与纤维素和/或多糖或寡糖片段结合的结构域。
纤维素结合(及其它碳水化合物结合)结构域是一种多肽氨基酸序列，其作为含有两或更多多肽氨基酸序列区的更大多肽或蛋白质的组成部分，特别存在于包括具有底物水解活性位点的催化结构域和与碳水化合物底物结合的碳水化合物结合结构域的水解酶中。这类酶可以包括不止一个催化结构域和一、两个或三个碳水化合物结合结构域，并且它们可以进一步含有把碳水化合物结合结构域与催化结构域相连接的一或多个多肽氨基酸序列区，该区以下通常被称为连接子或连接区。
含有纤维素结合结构域的水解酶的实例是纤维素酶，木聚糖酶，甘露聚糖酶，阿拉伯呋喃糖苷酶，乙酰酯酶和几丁质酶。“纤维素结合结构域”也已发现于海藻中，例如在红藻Porphyra purpurea中以非水解多糖结合蛋白形式存在〔见P.Tomme等，纤维素结合结构域-分类和性质，摘自《可溶性碳水化合物的酶法降解》John N.Saddler和MichaelH.Penner编，ACS专题论文系列，No.618(1996)〕。然而，绝大多数已知CBD〔由P.Tomme等(见前)分类和定义为“纤维素结合结构域”〕都来自于纤维素酶和木聚糖酶。
本文中，术语“纤维素结合结构域”应与下列参考文献(P.Tomme等，见上)中作同样的理解。P.Tomme等的文献中将超过120种“纤维素结合结构域”分为10个家族(Ⅰ-Ⅹ)，它们在底物结合机制方面，具有不同的功能或角色。然而，据预测将来还会发现新的家族代表成员以及其它家族，并且与本发明相联系的一类新型CBD家族的代表成员事实上已被确证(见实施例2)。
在具有CBD的蛋白质/多肽中(例如酶类，典型诸如纤维素酶之类的水解酶)，CBD可以位于N或C末端或位于中间区。
多肽或蛋白质(如水解酶)中构成CBD的那部分本身典型地由多于大约30但少于大约250个氨基酸残基组成。例如根据P.Tomme等(见上述)所列出并分类在家族Ⅰ中的那些CBD含有33-37个氨基酸残基，所列出并分类在家族Ⅱa中的CBD含有95-108个氨基酸残基，所列出并分类在家族Ⅳ中的成员含有85-92个氨基酸残基，列出并分类在家族Ⅳ中的成员中含有85-92个氨基酸残基，而在家族Ⅶ中所列出的一种CBD(由热纤梭菌的纤维素酶得到)含有240个氨基酸残基。相应地，构成CBD本身的氨基酸序列的分子量典型位于大约4kD至大约40kD范围内，并常低于35kD。
酶杂合体(Enzyme hybrid)本说明书中相关的酶分类号(EC号)来自于国际生化及分子生物学联盟命名委员会推荐命名(1992)，学术出版公司，1992。
本发明所用的改良酶(酶杂合体)含有一种可用于脱浆的酶的具催化活性(酶学活性)的氨基酸序列(一般是多肽氨基酸序列)，更特别是指一种非纤维素水解酶的序列(即纤维素酶以外的其它酶的具催化活性的氨基酸序列)，特别是选自淀粉酶(例如α-淀粉酶，EC.3.2.1.1)和脂酶(例如三酰基甘油脂酶，EC3.1.1.3)的酶的序列，并与含有纤维素结合结构域的氨基酸序列相融合(连接)。该具催化活性的氨基酸序列含有或包括，例如，整个或基本上整个的该成熟酶的完整氨基酸序列，或可以仅包括保留有与完整序列基本上相同的催化(酶活)特性的完整序列的一部分。
本领域内已知该类型改良酶类(酶杂合体)，以及其制备和纯化方法的详细描述〔见，例如WO90/00609,WO94/24158和WO95/16782,以及Greenwood等，生物技术和生物工程44(1994)pp.1295-1305〕。它们可以例如通过用至少含有在有或无连接子的情况下，连接至编码目的酶的DNA序列的编码纤维素结合结构域的DNA的DNA构建物转化宿主细胞，并培养转化细胞使融合基因表达来产生。一种按本方法可获得的但非限制性的重组产物(酶杂合体)类型-在本领域常称作“融合蛋白”-可用下列通式之一表示A-CBD-MR-X-BA-X-MR-CBD-B在以上通式中，CBD是至少含有纤维素结合结构域(CBD)本身的氨基酸序列。
MR(中间区，一段连接子)可以是一个键或含有1至大约100个氨基酸残基连接基团，特别是2到40个氨基酸残基，例如2至15个氨基酸残基的基团。MR原则上也可以是非氨基酸连接子。
X是含有以上提及的由一段DNA序列编码的多肽的具催化(酶学)活性的氨基酸序列，该DNA序列编码目标非纤维素水解酶。
A和B部分可独立任选。选用时，A或B部分构成CBD或X部分的末端延伸区，并且通常含有一或多个氨基酸残基。
因此，特别从上述内容可知，该类型融合酶中的CBD可以位于酶杂合体的C-末端、N-末端或中间区。相应地，该类型酶杂合体中X部分可以位于融合酶的N-末端、C-末端或中间区。
本发明的目标酶杂合体包括含有不至一个CBD的酶杂合体，例如，两个或更多CBD直接彼此相连，或通过间隔或连接子序列(典型地由适当长度的氨基酸序列组成)将彼此分隔开。该类型酶杂合体中两个CBD可以例如被上述-MR-X-部分彼此相分隔。
该类型酶杂合体构建中非常重要的问题是抗蛋白水解酶切割的稳定性。两或多结构域蛋白对结构域间连接区蛋白水解酶的切割特别敏感。产生这类切割的蛋白酶可以是例如枯草蛋白酶，已知它们显示出广泛的底物特异性〔见，例如Grφn等，生物化学31(1992),pp.6011-6018；Teplyakov等，蛋白质工程5(1992),pp.413-420〕。
真核生物体内连接区残基的糖基化是天然阻止蛋白酶切割的方式之一。另一种方法选用蛋白酶较不偏爱的氨基酸。连接区长度在关系到蛋白酶接近的能力上也扮演一定角色。采用哪种“方案”取决于酶杂合体发挥功能的环境。
当构建新酶杂合体分子时，连接区稳定性则成为非常重要的问题。在本发明内容中所列实例所述的多种连接区已考虑到这一问题。
用于制备CBD的纤维素酶(纤维素酶基因)适于分离纤维素酶基因的技术在本领域已广为人知。在本文中，术语“纤维素酶”和“纤维素水解酶”是指催化纤维素降解为葡萄糖、纤维二糖、三糖和/或其它纤维素寡糖的酶。
本文中优选纤维素酶(即含有优选CBD的纤维素酶)是微生物纤维素酶，特别是细菌或真菌纤维素酶。内切葡聚糖酶，值得注意的是内切-1,4-β-葡聚糖酶〔EC3.2.1.4)，特别是单组分(重组)内切-1,4-β-葡聚糖酶为一类优选的纤维素酶。
有用的细菌纤维素酶实例是由下列细菌所产生或可从中产生的纤维素酶假单胞菌属，芽孢杆菌属，纤维单胞菌属，梭状芽胞杆菌属，微孢菌属，栖热袍菌属，Caldocellum和放线菌纲诸如链霉菌属，高温单孢菌属和热酸菌属，特别来自于下列群体包括解纤维假单胞菌，灿烂芽孢杆菌，类肥纤维单胞菌，热纤维梭状芽孢杆菌，双孢微孢菌，褐色高温单孢菌，解纤维高温单孢菌和解纤维热酸菌。
纤维素酶可以是酸性、中性或碱性纤维素酶，即各自分别在酸性、中性或碱性范围内具有最大的纤维素水解活性。
一种有用的纤维素酶是酸性纤维素酶，优选真菌酸性纤维素酶，它是由或可由下列真菌产生木霉属，漆斑菌属，曲霉属，Phanaerochaete,脉孢菌属，Neocallimastix和葡萄孢属。
优选的一种有用的酸性纤维素酶是由下列真菌群体种类之一产生的或可从中产生绿色木霉，木霉T.reesei，木霉T.longibrachiatum，疣孢漆斑菌，黑曲霉，米曲霉，Phanaerochaete chrysosporium,粗糙脉孢菌，Neocallimastix partriciarum和灰葡萄孢霉。
另一种有用的纤维素酶是中性或碱性纤维素酶，优选真菌中性或碱性纤维素酶，来自于或可由下列真菌群体之一的真菌产生曲霉属，青霉属，毁丝霉属，腐殖霉属，耙菌属，镰孢霉属，葡萄穗霉属，帚霉属，毛壳菌属，疣孢霉属，轮枝孢属，漆斑菌属，丝葚霉属，粘帚霉属，头孢属和枝顶孢属。
优选的碱性纤维素酶是来自于或可由下列真菌种类群体之一的真菌产生鞋垫腐殖霉(H.insolens)，尖镰孢，嗜热毁丝霉，微紫青霉和头孢菌，优选下列群体之一鞋垫腐殖菌DSM1800，尖镰孢DSM2672，嗜热毁丝霉CBS117.65和头孢菌RYM-202。
一种优选的纤维素酶是碱性内切葡聚糖酶，它可与一种抗体发生免疫反应，该抗体是由来自鞋垫腐殖霉DSM1800的经高度纯化的约43kD内切葡聚糖酶作为抗原所诱导产生的抗体，或者该内切葡聚糖酶是后者约43kD内切葡聚糖酶的衍生物并且具有纤维素酶活性。
其它有应用价值的纤维素酶实例是真菌或细菌来源的亲本纤维素酶的异体形式，例如可来自于真菌腐殖霉属、木霉属、镰孢属或毁丝霉属菌株的亲本纤维素酶的变体。
纤维素结合结构域的分离为了分离例如纤维素酶的纤维素结合结构域，可以利用数种遗传工程方法。一种方法是利用限制性酶切除基因的一部分，然后将剩余基因部分与载体片段框内隔合以获得编码一种截短型蛋白质的变异基因。另一种方法涉及核酸外切酶如Bal31用以系统删除或者是DNA的5′和3′末端延伸区的核苷酸或者是基因中部的限制酶间区。这些基因删除法产生出编码变短的基因分子的变异基因，它们的表达产物于是可以进行底物结合(例如纤维素结合)活性的评估。适于评估结合活性的底物包括诸如AvicelTM和棉织物之类的纤维素材料。其它方法包括利用能够从该蛋白多肽链的其余部分切下CBD(例如末端型CBD)的选择性或特异性的蛋白酶。
正如已经介绍的(参看上文)，一旦编码底物结合(碳水化合物结合)区的核苷酸序列被确证，无论是cDNA还是染色体DNA，那么就可以多种方式进行操作，把它融合到编码目的酶类或具酶活氨基酸序列的DNA序列上。编码碳水化合物结合氨基酸序列的DNA片段和编码目的酶类或具酶活性氨基酸序列的DNA就可以在有或无一段连接子存在条件下进行连接了。所产生的连接DNA可以用多种方式操作以获得表达。优选的微生物表达宿主包括某些曲霉种(例如黑曲霉或米曲霉)，芽孢杆菌种，和诸如大肠杆菌或酿酒酵母类的生物体。
淀粉水解酶淀粉酶(例如α-或β-淀粉酶)是本发明所用的酶杂合体类型的基础，包括来源于细菌或真菌的淀粉酶。这类淀粉酶的化学或遗传改良突变体也包括在这之内。相关的α-淀粉酶包括，例如可由枯草杆菌所获得的α-淀粉酶，特别株系为地衣芽孢杆菌，这在GB1296839中有更为详细的描述。相关的商业上可获得的淀粉酶包括DuramylTM,TermamylTM,FungamylTM和BANTM(可从Novo Nordisk A/S公司，Bagsvaerd,丹麦获得)和RapidaseTM和MaxamylTMP(可从Gist-Brocades公司，荷兰获得)。
其它有应用价值的淀粉酶为CGT酶(环糊精葡聚糖转移酶，EC2.4.1.19)，例如可从芽孢杆菌属、热厌氧杆菌属的菌种中获得。
脂类水解酶适于用作本发明酶杂合体类型之基础的脂类水解酶包括来源自细菌或真菌的脂酶。也包括这类脂酶的化学或遗传改良突变体。
有应用价值的脂酶实例包括疏棉毛状腐质霉(H.lanuginosa)脂酶，例如，在EP258068和EP305 216中所述；Rhizomucor miehei脂酶，如EP238 023所述；假丝酵母脂酶，诸如南极假丝酵母脂酶，如EP214761中所述的南极假丝酵母脂酶A或B；假单胞菌脂酶，诸如EP721 981所述之一(从保藏号为FERM BP-4772的假单胞菌SD705株系得到的脂酶)；PCT/JP96/00426,PCT/JP96/00454所述脂酶(例如，茄假单胞菌脂酶)；EP571 982或WO95/14783所述脂酶(例如，门多萨假单胞菌脂酶)；产碱假单胞脂酶或类产碱假单胞菌脂酶，例如在EP218 272所述；洋葱假单胞菌脂酶，例如在EP331 376所述；施氏假单胞菌脂酶，例如在GB1372 034所述；施氏假单胞菌脂酶，例如在GB1372 034所述；或荧光假单胞菌脂酶；芽孢杆菌脂酶，例如枯草芽孢杆菌脂酶〔Dartois等，生物化学及生物物理学报1131(1993)PP.253-260〕；嗜热脂肪芽孢杆菌脂酶(JP64/744 992)和短小芽孢杆菌脂酶(WO91/16422)。
其外，还有一些有应用价值的已克隆脂酶，包括Yamaguchi等在基因103(1991),PP.61-67所述沙门柏干酪青霉脂酶，白地霉脂酶〔Y.Schimada等，生化杂志(J.Biochem)106(1989),383-388〕，和多种根霉脂酶诸如戴尔根霉脂酶〔M.J.Hass等，基因109(1991)pp.117-113〕，雪白根霉脂酶〔Kugimiya等，生物科学生物技术及生物化学56(1992),pp.716-719〕和米根霉脂酶。
其它有潜在应用价值的脂类水解酶包括角质酶，例如来自于WO88/09367所述的门多萨假单胞菌的角质酶，或来自于腐皮镰孢f.pisi的角质酶(例如WO90/09446所述)。
商业上可获得的适当脂酶包括LipolaseTM和Lipolase UltraTM(Novo Nordisk A/S公司有货)，M1 LipaseTM,LumafastTM和LipomaxTM(Gist-Brocades公司有货)和脂酶P“Amano”(AmanoPharmaceutical有限责任公司有货)。
质粒能够表达融合蛋白的质粒的制备在本领域众所周知，例如见WO90/00609和WO95/167827。这些融合蛋白的氨基酸序列来自于不止一个多肽片段。表达盒式结构可以包含在复制系统内以便以游离体保持在合适的宿主细胞中，或者直接整合进宿主基因组而无需复制系统。可用已知技术诸如转化、微注射等将DNA导入宿主细胞。
一旦融合基因被导入适当的宿主体内，就可以让宿主生长以表达融合基因。正常情况下最好另加一段提供给融合基因分泌功能的信号序列。有应用价值的典型的融合基因实例是信号肽序列-(前肽)-碳水化合物结合结构域-连接区-目的酶序列，或信号肽序列-(前肽)-目的酶序列-连接区-碳水化合物结合结构域，其中前肽序列通常含有5-100，例如5-25个氨基酸残基。
重组产物可以是糖基化或非糖基化的。
α-淀粉酶活性(KNU)的测定酶或融合酶的α-淀粉水解活性可以选用马铃薯淀粉作为底物进行测定。该法是基于被修饰的马铃薯淀粉的降解(水解)，并且反应后将淀粉/酶或淀粉/融合酶样品溶液与碘溶液相混合。最初呈蓝黑色，但随着淀粉的降解，蓝色变弱并且最终变成棕红色。最终颜色可以与标准有色玻璃校准器标准相比较。
一千Novoα-淀粉酶单位(KNU)所定义(酶杂合体)量是指在标准条件下(即37±0.05℃,0.0003M Ca2+,pH5.6)每小时将5.26克淀粉干物质(Merck可溶淀粉)进行糊精化所需的酶量。
脂水解活性(LU)的测定酶或酶杂合体的脂水解(脂酶)活性可以用三丁精(三丁酸甘油酯)作底物进行测定。该法是基于酶或酶杂合体对三丁精的降解，并且以时间为函数记录碱消耗量。
一个脂酶单位(LU)是指在标准条件下(即30.0℃,pH7.0；用阿拉伯树胶作乳化剂，三丁精作底物)每分钟释放1微摩尔可滴定丁酸所需的酶量。
操作条件将会认识到，本发明方法可以按照本领域已知的任何合适的脱浆方法来完成，例如E.S.Olson在Textile Wet Processes第一卷，Noyes出版社，Park Ridge，新泽西，美国(1983)或M.Peter和H.K.Rouette在Grundlagen der Textilveredlung,Dentsche Fachverlag GmbH，法兰克福，德国(1988)所述方法。因此，用于完成本发明的操作条件可以根据特别的装备或所期望使用的特别类型的方法来进行选择。优选的适于本发明应用的方法类型实例包括卷染/绞盘(Jigger/Winch)，浸染-轧(Pad-Roll)和浸染-蒸(Pad-Steam)类型。对这些类型随后会有更详细说明。
本发明方法可以分别作为分批操作、半连续或连续操作来执行。例如，该方法可以包括以下步骤a)将织物浸泡在含有(至少)淀粉水解酶杂合体和/或脂解酶杂合体的脱浆浴中。
b)对浸泡的织物进行汽蒸，以使织物达到所期望的反应温度，通常在20℃至120℃之间，及c)在J型箱、U型箱、或地毯机等中将布卷取或褶裥保持充分的时段(正常为几分种至几小时)以便发生脱浆。
在进行所选择的处理之前，淀粉水解酶杂合体和/或脂解酶杂合体可以方便地与其它常规用于脱浆方法的组分相混和。
完成该方法所需其他组分可以分别加入。因此，例如可以加入润湿剂和可任选地加或不加稳定剂。该稳定剂可以是稳定淀粉水解酶杂合体和/或脂解酶杂合体的试剂。润湿剂用于改善织物的湿度，从而获得快速、均匀的脱浆效果，优选氧化稳定型润湿剂。
在本发明方法的优选实施方案中，所用淀粉水解酶杂合体的量相应于淀粉酶活性在每升脱浆液中为1和5000KNU之间，例如每升脱浆液10至1000KNU，优选每升50至500KNU，更优选每升脱浆液20到500KNU。
在本发明方法的优选实施方案中，所用的脂解酶杂合体的量相应于脂酶活性在每升脱浆液中为10和20000LU之间，例如每升脱浆液50至10000LU，更优选每升脱浆液100至5000LU。
不论选用何种类型脱浆方法，本发明方法正常在30-100℃温度范围内完成，例如35-60℃，PH范围为3-11，优选7-9。然而，实际的操作条件可在这些范围内有广泛多样的选择。
应理解，本方法可在任何能充分耐受该操作条件的装备中完成。
本发明方法可以单独进行或与一种或多种其它酶法脱浆方法结合使用。适当的组合包括如下淀粉水解酶杂合体处理，和纤维素酶处理；脂解酶杂合体处理，和纤维素酶处理；淀粉水解酶杂合体处理，和脂酶或脂解酶杂合体处理；脂解酶杂合体处理，和淀粉酶或淀粉水解酶杂合体处理；淀粉水解酶杂合体处理，和脂酶或脂解酶杂合体处理和纤维素酶处理；脂解酶杂合体处理，和淀粉酶或淀粉酶杂合体处理和纤维素酶处理。
多种酶/酶杂合体正常可一步加入，但脱浆方法也可不止一步来完成，每次选用一种酶/酶杂合体。
本发明的组合物尽管酶杂合体例如淀粉水解酶杂合体和/或脂解酶杂合体可以加入其本身，但还优选以适当的脱浆组合物形式进行配制。
本发明脱浆组合物可以包括单一类型融合酶或多类型融合酶(例如淀粉水解酶杂合体和脂解酶杂合体)。该组合物形式可以是例如颗粒状，优选非粉状颗粒，或液态，特别是稳定化的液态，或者是浆状，或者是一种被保护的形式。可以例如按US4,106,991和US4,661,452所公开的方法(都属于Novo Nordisk A/S公司)生产非粉状颗粒，并且可以任选用本领域已知方法进行包被。在颗粒配方(“颗粒化”)的情形中，不同的酶杂合体可以按如下配制，例如，或者作为单一颗粒，其中每个颗粒含有所有的上述酶杂合体类型，或者作为分立的不同颗粒的混合物，其中每单个颗粒含有上述酶杂合体的一种。
液态酶的制品可以例如通过根据已确定的程序加入多元醇(例如丙二醇或其它二元醇)、糖类、糖醇或乙酸来稳定化。其它的酶稳定剂在本领域也是众所周知，可按EP238 216公开的方法制备被保护的酶类。
本发明组合物可以包括润湿剂和/或，任选地，加入由下列组分中选择的一种或多种组分分散剂、螯合剂(和/或沉淀剂)和乳化剂。适当的润湿剂实例是商业产品ArbylTMR，购自德国Grunau公司。乳化剂用于乳化可能存在于织物中的疏水杂质。分散剂用来阻止提取出的杂质在织物上的再次淤积。螯合剂或沉淀剂用来去除去对脱浆方法产生负面影响的金属离子(如Ca2+,Mg2+和Fe2+)；适当的实例包括苛性苏打(NaOH)和纯碱(Na2CO3)。
本发明其它方面涉及到这里所公开的DNA构建物，其编码或含有的序列编码本说明所公开的酶杂合体。
本发明其它方面还涉及到由该DNA构建物或序列编码的和/或本说明所公开的多肽(融合蛋白或融合酶)。
后面进一步给出实例来进一步说明本发明，这些实例并无限制本发明权利要求范围的意图材料和方法菌株粘琼脂芽孢杆菌NCIMB No.40482含有下列实例2编码内切葡聚糖酶的DNA序列。
大肠杆菌SJ2〔Diderichscn等，细菌学杂志172(1990)，pp.4315-4321〕。
制备电击感受态细胞并选用Bio-Rad GenePulserTM电击仪进行转化，具体操作见制造商的指示。枯草芽孢杆菌PL2306该菌株是apr和npr基因被断裂的枯草芽孢杆菌DN1885〔Diderichsen等，细菌学杂志172(1990),PP.4315-4321〕，已知的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因的转录单位被破坏，产生无纤维素酶活性的细胞。失活破坏基本按Sonenshein等编的《枯草芽孢杆菌和其它格兰氏阳性菌》，美国微生物学会(1993),p618所述方法完成。
质粒
pND1528〔Jφrgensen等，细菌学杂志173(1991),p.559-567〕。
pBluescriptKSII(Stratagene公司，美国)。
pND1981〔Jφrgensen等，基因96(1990),p.37-41〕。
溶液/培养基TY和LB琼脂〔如Ausubel等(编)，《现代分子生物学方法》，John Wiley&Sons(1995)所述〕。
SB:32g蛋白，20g酵母提取物，5gNaCl和5ml1N NaOH用蒸馏水混匀溶解至终体积1升。该溶液经121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
10％AvicelTM:100gAvicelTM(FLUKA公司，瑞士)用蒸馏水溶解至1升终体积，所得10％AvicelTM经121℃高压灭菌20分钟。
缓冲液0.05M磷酸钾溶液，pH7.5。
常规分子生物学方法DNA操作及转化按分子生物学标准方法进行〔Sambrook等，分子克隆实验指南，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(1989)；Ausubel等(编)，现代分子生物学方法，John Wilney&Sons出版社(1995)；C.R.Harwood和S.M.Cutting(编)，细菌的分子生物学方法，John Wiley&Sons(1990)〕。
DNA操作所用酶的使用根据提供者的说明。实施例1部分Termamyl序列的亚克隆用PCR方法扩增出pDN1528上的α-淀粉酶基因并在其编码区3′末端引入BamHⅠ位点。PCR及克隆方法如下述在HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim,德国)中加入约10-20ng pDN1528质粒，每种dNTP各200μm，2.6单位的HiFidelityTM扩增酶混合物及下列每种引物各300pmol；#52895′-GCT TTA CGC CCG ATT GCT GAC GCT G-3′#267485′-GCG ATG AGA CGC GCG GCC GCC TAT CTT TGA ACA TAA ATT GAAACG GAT CCG-3′(下划线表示BamHⅠ位点)选用DNA热循环仪(Landgraf公司，德国)完成PCR反应。先94℃2分钟，60℃30秒及72℃45秒温育，随后按94℃变性30秒，60℃退火30秒及72℃延伸45秒进行10次循环，再按94℃退火30秒，60℃30秒及72℃45秒进行20次循环(在该延伸步骤中，每循环增加20秒)。取10μl扩增产物进行1％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳，并选用ReadyloadTM100bpDNA标准(GibcoBRL公司，丹麦)作为分子量大小标准。
由上述方法得到的40μlPCR产物经QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)进行纯化，步骤按厂商操作指示进行。纯化的DNA用50μl的10mM Tris-HCl,pH8.5溶液洗脱。经BamHⅠ和PstⅠ双酶切消化25μl纯化后的PCR片段，随后进行1.0％低熔点琼脂糖(SeaPlaqueTMGTG,FMC)凝胶电泳，从胶上切下目标条带，按QIAquickTM凝胶抽提试剂盒(Qiagen,USA)的操作指示进行酶切产物的回收纯化。分离得到的DNA片段然后连接到经BamHⅠ-PstⅠ双酶切消化后的pBlueseriptⅡKS-载体上，用连接混合物转化大肠杆菌SJ2。
细胞被均匀涂在含200μg/ml氨卡青霉素和50μg/mlX-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-α-D-吡喃半乳糖苷)的LB琼脂平板上，过夜37℃下培养。次日，白色菌落被重新划线在新鲜的LB-氨卡青霉素琼脂平板上，37℃培养过夜。再次日，单个菌落被接种到含200μg/ml氨卡青霉素的液体LB培养基中，37℃下250rpm振荡培养过夜。
用QIAgen质粒纯化小试剂盒按使用说明进行液体培养物中质粒的纯化。5μl质粒样品经PstⅠ和BamHⅠ双酶切消化，用1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳检测酶切结果。一个含有包含部分α-淀粉酶基因的PstⅠ-BamHⅠ片段的阳性克隆，被称为pMB335。该质粒随后用于构建α-淀粉酶-CBD融合酶。
基因组DNA的分离在苏格兰国家工业及海洋微生物保藏有限公司(NCIMB)所推荐的特定培养基中在60℃下厌氧条件下培养粪堆梭菌(Clostridiumstercorarium)NCIMB11754。通过离心收集菌体细胞。
基因组DNA依Pitcher等，应用微生物学通讯(Lett.Appl.Microbiol.)8(1989),pp.151-156所述方法分离。
体外扩增粪堆梭菌(NCIMB11754)XynA的CBD二聚体在HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中加入大约100-200纳克基因组DNA，及每种dNTP各200μm,2.6单位的HiFidelityTM扩增酶混合物和下列两条引物各300pmol进行PCR扩增。
引物#271835′-GCT GCA GGA TCC GTT TCA ATT TAT GTT CAA AGA TCT GGC GGACCT GGA ACG CCA AAT AAT GGA AGA GG-3′引物#271825′-GCA CTA GCT AGA CGG CCG CTA CCA GTC AAC ATT AAC AGG ACCTGA G-3 ′(下划线部分为BamHⅠ和EagⅠ限制酶切位点)。
这对引物是用来扩增编码粪堆梭菌NCIMB11754的XynA纤维素结合结构域编码基因的DNA；DNA序列摘录自GenBank数据库，登记号为D13325。
PCR反应在DNA热循环仪(Landgraf，德国)中进行。首先依次94℃2分钟，60℃30秒及72℃45秒温育一次，随后按94℃变性30秒，60℃退火30秒及72℃延伸45秒进行10次循环，再按94℃变性30秒，60℃30秒和72℃45秒(在该延伸步骤，每个循环增加20秒)进行20次循环。10μl扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电脉，分子量大小标准选用ReadyloadTM100bp DNA(GibcoBRL,丹麦)。
聚合酶链式反应(PCR)进行基因克隆PCR片段的亚克隆。
按上述方法得到的40μlPCR产物，用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(QIAgen,USA)根据操作指示进行纯化。纯化后的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5缓冲液洗脱。25μl纯化PCR片段用BamHⅠ和EagⅠ进行消化，随后经1.0％低熔点琼脂糖(SeaPlaqueTMGTG,FMC)凝胶电泳，从胶上切下相应片段，用QIAquickTM凝胶抽提试剂盒(QIAgen,USA)按操作指示进行纯化。所分离的DNA片段随后连接到经BamHⅠ-NotⅠ消化的pMB335上。连接产物用来转化大肠杆菌SJ2。
阳性克隆的确定及特征分析细胞涂在含200μg/ml Amp的LB琼脂平板上，于37℃培养过夜。次日，菌落被重新划线于新鲜的LB-Amp琼脂平板上，于37℃过夜培养。再次日，单个菌落接种至含200μg/ml Amp的液体LB培养基上，于37℃振荡(250rpm)培养过夜。
用QIAgen质粒纯化小试剂盒(QIAgen,USA)按操作指示，从液体培养液中提取质粒。5μl质粒样品用BamHⅠ和NotⅠ消化。消化产物经1％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳检测。出现与PCR扩增产物大小相同的DNA片段表明其是阳性克隆。
一个含有粪堆梭菌(NCIMB11754)XynA的CBD二聚体和α-淀粉酶基因融合构建物的阳性克降被称为MBamyX。
将融合构建物克隆进基于芽孢杆菌的表达载体上含有地衣芽孢杆菌amyL基因的pDN1528载体在枯草芽孢杆菌中进行活性表达，导致培养液上层清液中出现有活性的α-淀粉酶产物。为了实现表达，以上构建的编码融合蛋白的基因被导入到pDN1528中。为此目的，用SalⅠ-NotⅠ消化pMBamyX和pDN1528，并且将4.7kb pDN1528SalⅠ-NotⅠ片段和1.0kb pMBamyX SalⅠ-NotⅠ片段纯化后进行连接。这产生出带有TermanyLTM(地衣芽孢杆菌(α-淀粉酶)基因杂合构建物的同框融合体。pMB206融合构建物的DNA序列及其对应氨基酸序列，分别见SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
连接混合物被用来转化枯草牙孢杆菌PL2306感受态细胞。细胞被涂在含6μg/ml氯霉素、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氢钾的LB琼脂平板上，并在37℃培养过夜。次日，将菌落划线接种在新鲜LBPG(含0.4％葡萄糖和10mM磷酸钾，pH10)氯霉素琼脂糖平板上，37℃培养过夜。次日，每个克隆的单菌落被转移至含6μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，于37℃250rpm振荡培养过夜。
用QIAgen质粒纯化小试剂盒(QIAgen,USA)根据操作指示进行液体培养物的质粒提取。然而，重悬缓冲液中补加1mg/ml鸡蛋白溶菌酶(SIGMA,USA)，然后在37℃进行细胞裂解15分钟。5μl质粒样品用BamHⅠ和NotⅠ消化，并经1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳检测消化结果。出现与PCR扩增产物同等大小的DNA片段表明这是一个阳性克隆。一个阳性克隆被指称为MB-BSamyX。
融合蛋白的表达、分泌及功能分析MB-BSamyX克隆(表达TermamylTM与粪堆梭菌XynA二聚体CBD的融合产物)接种于SB培养液，在37℃,250rpm振荡培养20小时。取1ml无细胞上层清液与200μl10％AvicelTM相混合。混合物于0℃静置1小时后，5000xg离心5分钟。沉淀重新悬浮于100μlSDS-PAGE缓冲液中，经95℃沸煮5分钟，5000xg离心5分钟，取25μl加样于4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEXTM凝胶(Novex,USA)上。将样品在XcellTMMini-Cell(NOVEX,USA)中按操作指示进行电泳。随后所有有关凝胶的操作，包括杂色(考马氏亮蓝)、脱色和干燥，皆按操作说明进行。
出现分子量大约85kD的蛋白条带意味着枯草芽孢杆菌中表达了Termamyl-CBD融合蛋白amyX。
实施例2确认代表新型CBD家族的新型CBD如下述的枯草芽孢杆菌中克隆的碱性纤维素酶，通过其克隆菌斑接种于SB培养液中，于37℃250rpm振荡培养20小时而得以表达。所表达的纤维素酶具有特异性结合AvicelTM的能力从而表明其含有CBD。
当让其继续再培养20小时后，纤维素酶被蛋白水解酶切开，经SDS-PAGE电泳出现了两条特异蛋白条带，一条对应于纤维素酶的催化部分，分子量约为35kD，另一条分子量大约8kD，对应于推测的连接区和CBD。
CBD被发现位于纤维酶的C-末端，并且不属于任何前述的任一种CBD家族成员〔Tomme等，纤维素结合结构域分类及特征，摘自J.N.Saddler和M.H.Penner(编)，《可溶性碳水化合物的酶学降解》ACS专题讨论系列No.618(1996)〕。因此，该CBD似乎是一个新家族的首位成员。
粘琼脂芽孢杆菌(Bacillus agaradherens)碱性纤维素酶(内切葡聚糖酶)基因克隆及其在枯草芽孢杆菌中的表达编码粘琼脂芽孢杆菌(保藏号No.NCIMB40482)碱性纤维素酶的核苷酸序列经PCR克隆后被导入表达质粒pDN1981中。PCR基本按上面已述方法完成，其中基因组DNA为500纳克，使用下述一对含有NdeⅠ和KpnⅠ限制性酶切位点的引物，以便将内切葡聚糖酶编码DNA序列导入pDN1981中进行下一步的表达引物#208875′-GTA GGC TCA GTC ATA TGT TAC ACA TTG AAA GGG GAG GAG AATCAT GAA AAA GAT AAC TAC TAT TTT TGT CG-3′引物#213185′-GTA CCT CGC GGG TAC CAA GCG GCC GCT TAA TTG AGT GGT TCCCAC GGA CCG-3′PCR循环完成后，用QIAquickTMPCR柱试剂盒(QIAgen,USA)按照操作指示进行PCR片段的纯化。纯化后的DNA用50μl10mMTris-HCl,pH8.5洗脱，经NdeⅠ和KphⅠ消化后，纯化并连接至经同样消化的pDN1981载体上。连接混合物用于转化枯草芽孢杆菌PL2306。感受态细胞的制备及转化如Yasbin等，《细菌学杂志》121(1975),PP296-304所述。
枯草芽孢杆菌转化体的分离鉴定转化细胞被涂在含有10mg/ml卡那霉素，0.4％葡萄糖，10mM磷酸钾和0.1％AZCL HE-纤维素(Megazyme，澳大利亚)的LB琼脂平板上，并在37℃培养18小时。含内切葡聚糖酶的阳性克隆菌落周围有蓝色晕环。
每个阳性转化体均接种于含有10mg/ml卡那霉素的10ml TY培养液中，经过37℃,250rpm振荡培养1天后，提取50ml上层清液。将该50ml上层清液加在含有0.1％AZCL HE-纤维素的LB琼脂平板中的琼脂上所刺穿的孔洞中。
经37℃培养16小时后，在孔洞周围出现蓝色晕圈显示出枯草杆菌表达了内切葡聚糖酶。这类克隆之一被指称为MB208。该内切葡聚糖酶的编码DNA序列和氨基酸序列分别示于SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
DNA序列测定如下经Qiagen纯化的质粒DNA，利用引物#21318和#20887(见上)以及Taq脱氧末端循环测序试剂盒(PerkinElmer,USA)，选用ABI373A自动测序仪进行序列测定，具体操作见操作指示。序列数据分析根据Devereux等，Carcinogenesis14(1993),pp.795-801完成。
粘琼脂芽孢杆菌NCIMB40482内切葡聚糖酶CBD的体外扩增在HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim,德国)中加入大约10-20纳克pMB 208质粒，每种dNTP各200μm，2.6单位HiFidelityTM扩增酶混合物和下列每种引物各300pmol进行PCR扩增引物#271845′-GCT GCA GGA TCC GTT TCA ATT TAT GTT CAA AGA TCT CCT GGAGAG TAT CCA GCA TGG GAC CCA A-3′引物#284955′-GC ACA AGC TTG CGG CCG CTA ATT GAG TGG TTC CCA CGG ACC G-3′(下划线部分表示BamHⅠ和NotⅠ限制性内切酶酶切位点)。
所设计的引物是用来扩增粘琼脂芽孢杆菌MCIMB40482纤维素酶编码基因的CBD-编码DNA。
利用DNA热循环仪(Landgraf，德国)完成PCR反应。首先经94℃2分钟，60℃30秒和72℃45秒温育一次，随后进行10次PCR循环，每个循环设定为94℃变性30秒，60℃退火30秒，并72℃延伸45秒，紧接着再进行20次PCR循环，每个循环设定为94℃30秒，60℃30秒和72℃45秒(在该延伸步骤，每一个循环增加20秒)。10μl扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳分析，并选择ReadyLoadTM100bp DNA(GibcoBRL,丹麦)作为大小对照。
通过聚合酶链式反应(PCR)进行克隆PCR片段的亚克隆用上述方法得到的40μlPCR产物，用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)进行纯化，操作步骤按制造商的说明。纯化后的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.0缓冲液洗脱。251μl经纯化的PCR片段用BamHⅠ和NotⅠ消化，随后进行1.5％低熔点琼脂糖(SeaPlaqueTMGTG,FMC)凝胶电泳，从胶上切下出现的相关片段，利用QIAquickTM凝胶抽提试剂盒(Qiagen,USA)进行纯化,具体操作按制造商的说明。分离的DNA片段被连接到经BamH-NotⅠ消化的pMB335上，连接混合物用于转化大肠杆菌SJ2。
阳性克隆的确认及其特征分析将细胞涂在含有氨苄青霉素(Amp200μg/ml)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜，次日，将菌落重新划线于新鲜LB-氨苄琼脂平板上，37℃过夜培养。后一天，单个菌落被移至含有氨苄青霉素(200μl/ml)的液体LB培养基中，37℃,250rpm振荡培养过夜。
利用QIAgen质粒纯化小试剂盒(Qiagen,USA)从液体培养物中提取质粒，具体操作根据厂商说明。5μl质粒样品用BamHⅠ和NotⅠ消化。消化物经1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳检测。出现与PCR扩增产物同样大小的DNA片段表示这是阳性克隆。
一个阳性克隆，其含有粘琼脂芽孢杆菌NCIMB40482碱性纤维素酶Cel5A的CBD和TermamylTMα-淀粉酶基因融合构建物，被指称为MBamyC5A。
将融合构建物克隆进基于芽孢杆菌的表达载体上如前所提，地衣芽孢杆菌的amyl基因(位于pND1528载体上)在枯草芽孢杆菌中进行活性表达，在培养上清液中产生出活性α-淀粉酶。为了表达的目的，如上述构建的编码融合蛋白的DNA被导入pDN1528质粒载体上。为此，用SalⅠ-NotⅠ消化pMBamyC5A和pDN1528，纯化酶切片段，并将4.7kb的pDN1528SalⅠ-NotⅠ片段与0.5kb的pMBamyC5A SalⅠ-NatⅠ片段连接。这就造成了杂合构建物与pNBamylTM基因的同框融合。pMB378融合构建物的DNA序列，及其相应的氨基酸序列，分别见SEQ ID No.5和SEQ ID No.6。
连接混合物用来转化枯草芽孢杆菌PL2306的感受态细胞。细胞被平涂在含有氯霉素(6μg/ml)、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氢钾的LB琼脂板上，37℃过夜培养。次日，菌落被重新划线于新鲜的KBPG氯霉素琼脂板上，并于37℃培养过夜。后一天，每个克隆的单菌落被转移至含有氯霉素(6μg/ml)的液体LB培养基中，37℃250rpm振荡培养过夜。
利用QIAgen质粒纯化小试剂盒(Qiagen,USA)从液体培养物中抽提质粒，具体操作按厂商的说明。然而，在于37℃进行细胞裂解15分钟之前，悬浮缓冲液中另加了1mg/ml鸡蛋白溶菌酶(SIGMA，美国)。5μl质粒样品用BamHⅠ和NotⅠ消化。消化产物经1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳检测。出现与PCR扩增产物同等大小的酶切片段显示这是阳性克隆。一个阳性克隆被指称为MB378。
融合蛋白的表达、分泌及功能分析MB378克隆(表达与粘琼脂芽孢杆菌Cel5A CBD融合的TermamylTM)在SB培养液中，于37℃250rpm振荡培养20小时。1ml无细胞悬液与200μl10％AvicelTM混合。混合物于0℃温育1小时，然后于5000xg离心5分钟。沉淀用100μl SDS-PAGE缓冲液悬浮，悬浮液于95℃煮5分钟，于5000xg离心5分钟，取25μl上清加样于4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE NOVEXTM胶上(Novex,USA)。样品经XcellTMMini-Cell(Novex,USA)电泳装置电泳，操作按厂商的说明。随后所有的凝胶操作，包括染色(考马氏亮蓝)、脱色和制干胶，都依厂商操作说明所述完成。
出现分子量约60kD的蛋白条带表明在枯草芽孢杆菌中位于质粒pMB378上的编码TermamylTM-CBD融合蛋白的基因进行了表达。
实施例3本实例描述了利用序列重叠延伸(SOE)程序〔见，例如Sambrook等，Ausubel等，或C.R.Harwood和S.M.Cutting(loc.cit.)〕进行粪肥纤维单胞菌(ATCC484)cenA基因的CDB与TermamylTM的融合。最终的构建物如下TermamylTM启动子-TermamylTM信号肽-cenACBD-连接区-成熟TermamylTM。
SOE所需TermamylTM片段的扩增大约10-20μg质粒pDN1528加入HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)进行PCR扩增，其中加有每种dNTP各200μM,2.6单位HiFidelityTM扩增酶混合物，以及下列两引物各100pmol引物#45765′-CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC-3′引物#284035′-TGC ACT GGT ACA GTT CCT ACA ACT AGT CCT ACA CGT GCA AATCTT AAT GGG ACG CTG-3′引物#28403划线部分构成TermamylTM序列的一个片段。该划线序列的5′侧序列编码与CBD相连的连接区。
PCT反应是在DNA热循环仪(Landgraf，德国)上完成的。先于94℃2分钟，55℃30秒和72℃45秒依次温育一次，接下来进行的20次PCR循环中每个循环依次按96℃变性10秒，55℃退火30秒，和72℃延伸45秒进行。取扩增产物10μl进行1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳，DNA大小标准选用ReadLoadTM100bp DNA序列梯(GibcoBRL,丹麦)。
如上述得到的PCR产物40μl经QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)进行纯化，具体操作按制造商的说明。所纯化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5缓冲液洗脱。
基因组DNA的分离粪肥纤维单胞菌ATCC484于30℃250rpm振荡生长于TY培养液中。离心收集细胞。
基因组DNA分离方法如Pitcher等，应用微生物学通讯(Lett.Appl.Microbiol.)8(1989),pp.151-156所述。
粪肥纤维单胞菌(ATCC484)CenA基因中用于SOE方法的CBD的体外扩增在HiFidelityTMPCR缓冲液(Boehringer Mannheim，德国)中加入大约100-200ng基因组DNA用于PCR扩增，另加每种dNTP各200μM，2.6单位HiFidelityTM扩增酶混和物，以及下列两引物各100pmol引物#88285′-CTG CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GCA AAT CTT AAT GCT CCCGGC TGC CGC GTC GAC TAC-3′引物#284045′-TGT AGG AAC TGT ACC AGT GCA CGT GGT GCC GTT GAG C-3 ′(下划线表示PstⅠ限制酶切位点)。
所设计的引物是用来扩增编码粪肥纤维单胞菌(ATCC484)的CenA编码基因的编码纤维素结合结构域的DNA。该DNA序列来自GenBank数据库，登记号为M15823。
PCR循环依下述完成先于94℃2分钟，55℃30秒和72℃45秒依次温育一次，随后的30次PCR循环中每次循环设定为96℃变性10秒，55℃退火30秒，及72℃延伸45秒。取10μl扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳分析，选用ReadyLoadTM100bpDNA序列梯(GibcoBRL丹麦)作为大小标记对照物。
由上述方法产生的40μlPCR产物经QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)纯化，操作按制造商的说明。所纯化的DNA用50μl10mM Tris-HC,pH85缓冲液洗脱。
粪肥纤维单胞菌(ATCC484)cenA基因的CBD和TermamlTM基因的SOE方法大约100-200ng TermamylTMPCR扩增片段和cenA CBD PCR扩增片段被用于第二次PCR循环。两种片段的SOE在HiFidelityTMPCR缓冲液中进行，另加每种dNTP各200μm，及2.6单位的HiFidelityTM扩增酶混和物。
一种降温(touch-down)PCR循环如下进行按96℃2分钟，60℃2分钟及72℃45秒依次温育一次。该循环重复10次，其中每增加一次循环其退火温度下降1℃。
为扩增杂合DNA，加入各100pmol的两种引物#8828和#4576(见上述)，开始第三次PCR反应。PCR反应如下进行将SOE反应混和物于96℃2分钟，55℃30秒及72℃45秒依次温育。随后进行20次PCR循环，每次循环按96℃变性10秒，44℃退火30秒，以及72℃延伸45秒依次进行。取10μl扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳分析，所用大小参照标准为ReadyLoadTM100bp DNA序列梯(GibeoBRL,丹麦)。所得SOE片段具有预期大小879bp。
编码CBD-Termamyl杂合体的SOE片段的亚克隆由上述产生的40μlSOE-PCR产物经QIAquickTMPCR纯化试剂盒(Qiagen,USA)纯化，操作按照制造商指示。所纯化的DNA用50μl10mM Tris-HCl,pH8.5缓冲液洗脱。取25μl纯化PCR片段用PstⅠ和KpnⅠ消化，随后进行1.0％低熔点琼脂糖(SeaPlaqueTMGTG,FMC)凝脉电泳，从胶上切下837bp片段，用QIAquickTM凝胶抽提试剂盒进行纯化(Qiagen,USA)，操作依照制造商说明指示。所分离的DNA片段被连接到经PstⅠ和KpnⅠ消化的pDN1981上，所得连接混和物被用来转化枯草杆菌PL2306感受态细胞。细胞被平涂在含有卡那霉素(10μg/ml)、0.4％葡萄糖和10mM磷酸氢钾的LB琼脂平板上，于37℃培养过夜。次日，菌落被重新划线于新鲜的LBPG卡那霉素琼脂板上，37℃培养过夜。再次日，每个克隆的单菌落被转移至含有卡那霉素(10μg/ml)的液体LB培养基中，于37℃250rpm振荡培养过夜。
利用QIAgen质粒纯化小试剂盒(Qiagen,USA)从液体培养物中提纯质粒，操作依照制造商的说明指示。然而，在于37℃进行细胞裂解15分钟前，要加1mg/ml鸡卵白溶菌酶(SIGMA,USA)于重悬缓冲液中。5μl质粒样品经PstⅠ和KpnⅠ消化。消化产物经1.5％琼脂糖凝胶(NuSieveTM,FMC)电泳检测。出现与PCR扩增产物同等大小的837bp DNA片段，表明是阳性克隆。一个阳性克隆被指称为MOL1297。
融合蛋白的表达、分泌及功能分析该MOL1297克隆(表达粪肥纤维单胞菌cenA CBD与TermamylTMN-末端融合体)被接种于SB培养基，于37℃250rpm振荡培养20小时。1ml无细胞悬液与200μl10％AvicelTM相混合。混合物于0℃温育1小时，然后5000xg离心5分钟。沉淀重悬于100μl SDS-PAGE缓冲液中，于95℃煮5分钟后，5000xg离心5分钟，取25μl上清加样于4-20％Laemmli Tris-甘氨酸，SDS-PAGE Novex胶上(Novex,USA)。样品随后经XcellTMMini-Cell(NOVEX,USA)电泳，操作依照制造商的说明指示。随后的所有凝胶操作包括染色(考马氏亮兰)，脱色和制干胶，皆依照生产商所述完成。
出现分子量大小约85kDa的蛋白条带表明在枯草杆菌中表达了CBD-TermamylTM融合蛋白。
粪肥纤维单胞菌cenA CBD-Termamyl杂合体的编码序列见SEQID No.7(其中小写字母表示该序列的CBD编码部分)。杂合体相应的氨基酸序列见SEQ ID No.8(其中小写字母表明CBD氨基酸序列)。
实施例4本例描述了一种脂酶(来自于疏棉毛状腐质霉脂酶)和一种CBD的融合蛋白(酶杂合体)的构建。因为酶N-末端远离活性位点，而C-末端相对靠近于活性位点，所以选择了带有N-末端CBD的构建物。
pIVI450构建物(CBD-连接区-脂酶)这种构建物是为了表达在LipolaseTMN-末端具有嗜热毁丝霉纤维素酶CBD和接头的蛋白。
用含有嗜热毁丝霉纤维素酶基因的pA2C161(DSM9967)克隆作模板，以及下列寡核苷酸作引物引物#82025′ACGTAGTGGCCACGCTAGGCGAGGTGGTGG 3 ′引物#196725′CCACACTTCTCTTCCTTCCTC 3 ′得到了PCR片段。
所得PCR片段经BamHⅠ和BalⅠ双酶切，克隆进也经BamHⅠ和BalⅠ双酶切的pAHL质粒的恰恰在预计信号肽加工位点上游的位点中。所得克隆经过测序证实(见SEQ ID No.9)。
除去CBD和脂酶间的连接区这一构建是为了在CBD和脂酶间能插入任何目的连接子以便发现最佳连接子。
通过USE技术(Stratagene目录No.200509)在pIVI450的CBD和连接子区之间引入一个NheⅠ位点，产生出pIVI450+HheⅠ位点。用XhoⅠ和NheⅠ切割pIVI450+NheⅠ位点，分离含有CBD部分的载体。
pIVI393质粒经XhoⅠ和NheⅠ酶切，并分离含有LipolaseTM基因(减去信号肽编码序列)的片段。
将DNA片段进行连接，产生出在CBD和脂酶基因间含有一个NheⅠ位点的pIVI450CBD-NheⅠ位点-LipolaseTM。在该NheⅠ位点可以导入不同的连接子。
非糖基化连接子的导入从所述构建体表达的蛋白含有以下类型的结构CBD-非糖基化连接子-脂酶。
连接子区的氨基酸序列如下NNNPQQGNPNQGGNNNGGGNQGGGNGG用如下引物进行PCR反应#293155′GATCTAGCTAGCAACAATAACCCCCAGCAGGGCAACCCCAACCAGGGCGGGAACAACGGC 3′#293165′GATCTAGCTAGCGCCGCCGTTGCCGCCGCCCTGGTTGCCGCCGCCGTTGTTCCCGCCCTG 3′PCR片段经NheⅠ酶切，载体pIVI450CBD-NheⅠ-LipolaseTM也同样用NheⅠ酶切，并且将两片段连接，产生pIVI450CBD-非糖基化连接子-LipolaseTM(SEQ ID No.10)。
鞋垫腐殖霉家族45纤维素酶连接子的导入这里所述构建物所表达的蛋白质含有如下类型的结构CBD-糖基化连接子-脂酶。
连接子的氨基酸序列如下
VQIPSSSTSSPVNQPTSTSTTSTSTTSSPPVQPTTPS用下述引物进行PCR反应引物#293135′GATACTGCTAGCGTCCAGATCCCCTCCAGC 3′引物#293145′GATACTGCTAGCGCTGGGAGTCGTAGGCTG 3′PCR片段经NheⅠ酶切，载体pIVI450CBD-NheⅠ-LipolaseTM也同样用NheⅠ酶切，并且将所得两片段连接，产生pIVI450CBD-鞋垫腐殖霉家族45纤维素酶连接子-LipolaseTM(SEQ ID No.11)。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名字Novo NORDISK A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)国家丹麦(F)邮编(ZIP)DK-2880(G)电话+4544448888(H)传真+4544493256(ⅱ)发明题目纤维素织物中除去或漂白污斑或色斑的方法(ⅲ)序列数目6(ⅳ)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release #1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID No.1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度2253碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.1ATGAAACAAC AAAAACGGCT TTACGCCCGA TTGCTGACGC TGTTATTTGC GCTCATCTTC 60TTGCTGCCTC ATTCTGCAGC AGCGGCGGCA AATCTTAATG GGACGCTGAT GCAGTATTTT 120GAATGGTACA TGCCCAATGA CGGCCAACAT TGGAAGCGTT TGCAAAACGA CTCGGCATAT 180TTGGCTGAAC ACGGTATTAC TGCCGTCTGG ATTCCCCCGG CATATAAGGG AACGAGCCAA 240GCGGATGTGG GCTACGGTGC TTACGACCTT TATGATTTAG GGGAGTTTCA TCAAAAAGGG 300ACGGTTCGGA CAAAGTACGG CACAAAAGGA GAGCTGCAAT CTGCGATCAA AAGTCTTCAT 360TCCCGCGACA TTAACGTTTA CGGGGATGTG GTCATCAACC ACAAAGGCGG CGCTGATGCG 420ACCGAAGATG TAACCGCGGT TGAAGTCGAT CCCGCTGACC GCAACCGCGT AATCTCAGGA 480GAACACCTAA TTAAAGCCTG GACACATTTT CATTTTCCGG GGGCCGGCAG CACATACAGC 540GATTTTAAAT GGCATTGGTA CCATTTTGAC GGAACCGATT GGGACGAGTC CCGAAAGCTG 600AACCGCATCT ATAAGTTTCA AGGAAAGGCT TGGGATTGGG AAGTTTCCAA TGAAAACGGC 660AACTATGATT ATTTGATGTA TGCCGACATC GATTATGACC ATCCTGATGT CGCAGCAGAA 720ATTAAGAGAT GGGGCACTTG GTATGCCAAT GAACTGCAAT TGGACGGAAA CCGTCTTGAT 780GCTGTCAAAC ACATTAAATT TTCTTTTTTG CGGGATTGGG TTAATCATGT CAGGGAAAAA 840ACGGGGAAGG AAATGTTTAC GGTAGCTGAA TATTGGCAGA ATGACTTGGG CGCGCTGGAA 900AACTATTTGA ACAAAACAAA TTTTAATCAT TCAGTGTTTG ACGTGCCGCT TCATTATCAG 960TTCCATGCTG CATCGACACA GGGAGGCGGC TATGATATGA GGAAATTGCT GAACGGTACG 1020GTCGTTTCCA AGCATCCGTT GAAATCGGTT ACATTTGTCG ATAACCATGA TACACAGCCG 1080GGGCAATCGC TTGAGTCGAC TGTCCAAACA TGGTTTAAGC CGCTTGCTTA CGCTTTTATT 1140CTCACAAGGG AATCTGGATA CCCTCAGGTT TTCTACGGGG ATATGTACGG GACGAAAGGA 1200GACTCCCAGC GCGAAATTCC TGCCTTGAAA CACAAAATTG AACCGATCTT AAAAGCGAGA 1260AAACAGTATG CGTACGGAGC ACAGCATGAT TATTTCGACC ACCATGACAT TGTCGGCTGG 1320ACAAGGGAAG GCGACAGCTC GGTTGCAAAT TCAGGTTTGG CGGCATTAAT AACAGACGGA 1380CCCGGTGGGG CAAAGCGAAT GTATGTCGGC CGGCAAAACG CCGGTGAGAC ATGGCATGAC 1440ATTACCGGAA ACCGTTCGGA GCCGGTTGTC ATCAATTCGG AAGGCTGGGG AGAGTTTCAC 1500GTAAACGGCG GATCCGTTTC AATTTATGTT CAAAGATCTG GCGGACCTGG AACGCCAAAT 1560AATGGCAGAG GAATTGGTTA TATTGAAAAT GGTAATACCG TAACTTACAG CAATATAGAT 1620TTTGGTAGTG GTGCAACAGG GTTCTCTGCA ACTGTTGCAA CGGAGGTTAA TACCTCAATT 1680CAAATCCGTT CTGACAGTCC TACCGGAACT CTACTTGGTA CCTTATATGT AAGTTCTACC 1740GGCAGCTGGA ATACATATCA ACCGTATCTA CAAACATCAG CAAAATTACC GGCGTTCATG 1800ATATTGTATT GGTATTCTCA GGTCCAGTCA ATGTGGACAA CTTCATATTT AGCAGAAGTT 1860CACCAGTGCC TGCACCTGGT GATAACACAA GAGACGCATA TTCTATCATT CAGGCCGAGG 1920ATTATGACAG CAGTTATGGT CCCAACCTTC AAATCTTTAG CTTACCAGGT GGTGGCAGCG 1980CTTGGCTATA TTGAAAATGG TTATTCCACT ACCTATAAAA ATATTGATTT TGGTGACGGC 2040GCAACGTCCG TAACAGCAAG AGTAGCTACC CAGAATGCTA CTACCATTCA GGTAAGATTG 2100GGAAGTCCAT CGGGTACATT ACTTGGAACA ATTTACGTGG GGTCCACAGG AAGCTTTGAT 2160ACTTATAGGG ATGTATCCGC TACCATTAGT AATACTGCGG GTGTAAAAGA TATTGTTCTT 2220GTATTCTCAG GTCCTGTTAA TGTTGACTGG TAG 2253(2)SEQ ID No.2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度750氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.2Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe1 5 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu20 25 30Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly35 40 45Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His50 55 60Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln65 70 75 80Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe85 90 95His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu100 105 110Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly115 120 125Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val130 135 140Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly145 150 155 160Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Ala Gly165 170 175Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp G1y Thr180 185 190Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly195 200 205Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr210 215 220Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu225 230 235 240Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly245 250 255Asn Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp260 265 270Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val275 280 285Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn290 295 300Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln305 310 315 320Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu325 330 335Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe340 345 350Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val355 360 365Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu370 375 380Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly385 390 395 400Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile405 410 415Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe420 425 430Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val435 440 445Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly pro Gly Gly Ala450 455 460Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp465 470 475 480Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp485 490 495Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg500 505 510Ser Gly Gly Pro Gly Thr Pro Asn Asn Gly Arg Gly Ile Gly Tyr Ile515 520 525Glu Asn Gly Asn Thr Val Thr Tyr Ser Asn Ile Asp Phe Gly Ser Gly530 535 540Ala Thr Gly Phe Ser Ala Thr Val Ala Thr Glu Val Asn Thr Ser Ile545 550 555 560Gln Ile Arg Ser Asp Ser Pro Thr Gly Thr Leu Leu Gly Thr Leu Tyr565 570 575Val Ser Ser Thr Gly Ser Trp Asn Thr Tyr Gln Pro Tyr Leu Gln Thr580 585 590Ser Ala Lys Leu Pro Ala Phe Met Ile Leu Tyr Trp Tyr Ser Gln Val595 600 605Gln Ser Met Trp Thr Thr Ser Tyr Leu Ala Glu Val His Gln Cys Leu610 615 620His Leu Val Ile Thr Gln Glu Thr His Ile Leu Ser Phe Arg Pro Arg625 630 635 640Ile Met Thr Ala Val Met Val Pro Thr Phe Lys Ser Leu Ala Tyr Gln645 650 655Val Val Ala Ala Leu Gly Tyr Ile Glu Asn Gly Tyr Ser Thr Thr Tyr660 665 670Lys Asn Ile Asp Phe Gly Asp Gly Ala Thr Ser Val Thr Ala Arg Val675 680 685Ala Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Gln Val Arg Leu Gly Ser Pro Ser690 695 700Gly Thr Leu Leu Gly Thr Ile Tyr Val Gly Ser Thr Gly Ser Phe Asp705 710 715 720Thr Tyr Arg Asp val Ser Ala Thr Ile Ser Asn Thr Ala Gly Val Lys725 730 735Asp Ile Val Leu Val Phe Ser Gly Pro Val Asn Val Asp Trp740 745 750(2)SEQ ID No.3信息(ⅰ)序列特征(A)长度1203碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.3ATGAAAAAGA TAACTACTAT TTTTGTCGTA TTGCTTATGA CAGTGGCGTT GTTCAGTATA 60GGAAACACGA CTGCTGCTGA TAATGATTCA GTTGTAGAAG AACATGGGCA ATTAAGTATT 120AGTAACGGTG AATTAGTCAA TGAACGAGGC GAACAAGTTC AGTTAAAAGG GATGAGTTCC 180CATGGTTTGC AATGGTACGG TCAATTTGTA AACTATGAAA GTATGAAATG GCTAAGAGAT 240GATTGGGGAA TAAATGTATT CCGAGCAGCA ATGTATACCT CTTCAGGAGG ATATATTGAT 300GATCCATCAG TAAAGGAAAA AGTAAAAGAG GCTGTTGAAG CTGCGATAGA CCTTGATATA 360TATGTGATCA TTGATTGGCA TATCCTTTCA GACAATGACC CAAATATATA TAAAGAAGAA 420GCGAAGGATT TCTTTGATGA AATGTCAGAG TTGTATGGAG ACTATCCGAA TGTGATATAC 480GAAATTGCAA ATGAACCGAA TGGTAGTGAT GTTACGTGGG GCAATCAAAT AAAACCGTAT 540GCAGAGGAAG TCATTCCGAT TATTCGTAAC AATGACCCTA ATAACATTAT TATTGTAGGT 600ACAGGTACAT GGAGTCAGGA TGTCCATCAT GCAGCTGATA ATCAGCTTGC AGATCCTAAC 660GTCATGTATG CATTTCATTT TTATGCAGGG ACACATGGTC AAAATTTACG AGACCAAGTA 720GATTATGCAT TAGATCAAGG AGCAGCGATA TTTGTTAGTG AATGGGGAAC AAGTGCAGCT 780ACAGGTGATG GTGGCGTGTT TTTAGATGAA GCACAAGTGT GGATTGACTT TATGGATGAA 840AGAAATTTAA GCTGGGCCAA CTGGTCTCTA ACGCATAAAG ATGAGTCATC TGCAGCGTTA 900ATGCCAGGTG CAAATCCAAC TGGTGGTTGG ACAGAGGCTG AACTATCTCC ATCTGGTACA 960TTTGTGAGGG AAAAAATAAG AGAATCAGCA TCTATTCCGC CAAGCGATCC AACACCGCCA 1020TCTGATCCAG GAGAACCGGA TCCAACGCCC CCAAGTGATC CAGGAGAGTA TCCAGCATGG 1080GATCCAAATC AAATTTACAC AAATGAAATT GTGTACCATA ACGGCCAGCT ATGGCAAGCA 1140AAATGGTGGA CACAAAATCA AGAGCCAGGT GACCCGTACG GTCCGTGGGA ACCACTCAAT 1200TAA 1203(2)SEQ ID No.4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度400氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.4Met Lys Lys Ile Thr Thr Ile Phe Val Val Leu Leu Met Thr Val Ala1 5 10 15Leu Phe Ser Ile Gly Asn Thr Thr Ala Ala Asp Asn Asp Ser Val Val20 25 30Glu Glu His Gly Gln Leu Ser Ile Ser Asn Gly Glu Leu Val Asn Glu35 40 45Arg Gly Glu Gln Val Gln Leu Lys Gly Met Ser Ser His Gly Leu Gln50 55 60Trp Tyr Gly Gln Phe Val Asn Tyr Glu Ser Met Lys Trp Leu Arg Asp65 70 75 80Asp Trp Gly Ile Asn Val Phe Arg Ala Ala Met Tyr Thr Ser Ser Gly85 90 95Gly Tyr Ile Asp Asp Pro Ser val Lys Glu Lys Val Lys Glu Ala Val100 105 110Glu Ala Ala Ile Asp Leu Asp Ile Tyr Val Ile Ile Asp Trp His Ile115 120 125Leu Ser Asp Asn Asp Pro Asn Ile Tyr Lys Glu Glu Ala Lys Asp Phe130 135 140Phe Asp Glu Met Ser Glu Leu Tyr Gly Asp Tyr Pro Asn Val Ile Tyr145 150 155 160Glu Ile Ala Asn Glu Pro Asn Gly Ser Asp Val Thr Trp Gly Asn Gln165 170 175Ile Lys Pro Tyr Ala Glu Glu Val Ile Pro Ile Ile Arg Asn Asn Asp180 185 190Pro Asn Asn Ile Ile Ile Val Gly Thr Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val195 200 205His His Ala Ala Asp Asn Gln Leu Ala Asp Pro Asn Val Met Tyr Ala210 215 220Phe His Phe Tyr Ala Gly Thr His Gly Gln Asn Leu Arg Asp Gln Val225 230 235 240Asp Tyr Ala Leu Asp Gln Gly Ala Ala Ile Phe Val Ser Glu Trp Gly245 250 255Thr Ser Ala Ala Thr Gly Asp Gly Gly Val Phe Leu Asp Glu Ala Gln260 265 270Val Trp Ile Asp Phe Met Asp Glu Arg Asn Leu Ser Trp Ala Asn Trp275 280 185Ser Leu Thr His Lys Asp Glu Ser Ser Ala Ala Leu Met Pro Gly Ala290 295 300Asn Pro Thr Gly Gly Trp Thr Glu Ala Glu Leu Ser Pro Ser Gly Thr305 310 315 320Phe Val Arg Glu Lys Ile Arg Glu Ser Ala Ser Ile Pro Pro Ser Asp325 330 335Pro Thr Pro Pro Ser Asp Pro Gly Glu Pro Asp Pro Thr Pro Pro Ser340 345 350Asp Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Pro Asn Gln Ile Tyr Thr Asn355 360 365Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln Ala Lys Trp Trp Thr370 375 380Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro Trp Glu Pro Leu Asn385 390 395 400(2)SEQ ID No.5的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1683碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.5ATGAAACAAC AAAAACGGCT TTACGCCCGA TTGCTGACGC TGTTATTTGC GCTCATCTTC 60TTGCTGCCTC ATTCTGCAGC AGCGGCGGCA AATCTTAATG GGACGCTGAT GCAGTATTTT 120GAATGGTACA TGCCCAATGA CGGCCAACAT TGGAAGCGTT TGCAAAACGA CTCGGCATAT 180TTGGCTGAAC ACGGTATTAC TGCCGTCTGG ATTCCCCCGG CATATAAGGG AACGAGCCAA 240GCGGATGTGG GCTACGGTGC TTACGACCTT TATGATTTAG GGGAGTTTCA TCAAAAAGGG 300ACGGTTCGGA CAAAGTACGG CACAAAAGGA GAGCTGCAAT CTGCGATCAA AAGTCTTCAT 360TCCCGCGACA TTAACGTTTA CGGGGATGTG GTCATCAACC ACAAAGGCGG CGCTGATGCG 420ACCGAAGATG TAACCGCGGT TGAAGTCGAT CCCGCTGACC GCAACCGCGT AATCTCAGGA 480GAACACCTAA TTAAAGCCTG GACACATTTT CATTTTCCGG GGGCCGGCAG CACATACAGC 540GATTTTAAAT GGCATTGGTA CCATTTTGAC GGAACCGATT GGGACGAGTC CCGAAAGCTG 600AACCGCATCT ATAAGTTTCA AGGAAAGGCT TGGGATTGGG AAGTTTCCAA TGAAAACGGC 660AACTATGATT ATTTGATGTA TGCCGACATC GATTATGACC ATCCTGATGT CGCAGCAGAA 720ATTAAGAGAT GGGGCACTTG GTATGCCAAT GAACTGCAAT TGGACGGAAA CCGTCTTGAT 780GCTGTCAAAC ACATTAAATT TTCTTTTTTG CGGGATTGGG TTAATCATGT CAGGGAAAAA 840ACGGGGAAGG AAATGTTTAC GGTAGCTGAA TATTGGCAGA ATGACTTGGG CGCGCTGGAA 900AACTATTTGA ACAAAACAAA TTTTAATCAT TCAGTGTTTG ACGTGCCGCT TCATTATCAG 960TTCCATGCTG CATCGACACA GGGAGGCGGC TATGATATGA GGAAATTGCT GAACGGTACG 1020GTCGTTTCCA AGCATCCGTT GAAATCGGTT ACATTTGTCG ATAACCATGA TACACAGCCG 1080GGGCAATCGC TTGAGTCGAC TGTCCAAACA TGGTTTAAGC CGCTTGCTTA CGCTTTTATT 1140CTCACAAGGG AATCTGGATA CCCTCAGGTT TTCTACGGGG ATATGTACGG GACCAAAGGA 1200GACTCCCAGC GCGAAATTCC TGCCTTGAAA CACAAAATTG AACCGATCTT AAAAGCGAGA 1260AAACAGTATG CGTACGGAGC ACAGCATGAT TATTTCGACC ACCATGACAT TGTCGGCTGG 1320ACAAGGGAAG GCGACAGCTC GGTTGCAAAT TCAGGTTTGG CGGCATTAAT AACAGACGGA 1380CCCGGTGGGG CAAAGCGAAT GTATGTCGGC CGGCAAAACG CCGGTGAGAC ATGGCATGAC 1440ATTACCGGAA ACCGTTCGGA GCCGGTTGTC ATCAATTCGG AAGGCTGGGG AGAGTTTCAC 1500GTAAACGGCG GATCCGTTTC AATTTATGTT CAAAGATCTC CTGGAGAGTA TCCAGCATGG 1560GATCCAAATC AAATTTACAC AAATGAAATT GTGTACCATA ACGGCCAGCT ATGGCAAGCA 1620AAATGGTGGA CACAAAATCA AGAGCCAGGT GACCCGTACG GTCCGTGGGA ACCACTCAAT 1680TAA 1683(2)信息有关于SEQ ID N0.6(ⅰ)序列特征(A)长度560氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No.6Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe1 5 10 15Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Asn Leu20 25 30Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asn Asp Gly35 40 45Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu Ala Glu His50 55 60Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Thr Ser Gln65 70 75 80Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe85 90 95His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys Gly Glu Leu100 105 110Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn Val Tyr Gly115 120 125Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr Glu Asp Val130 135 140Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val Ile Ser Gly145 150 155 160Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro Gly Ala Gly165 170 175Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr180 185 190Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Phe Gln Gly195 200 205Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr210 215 220Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val Ala Ala Glu225 230 235 240Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln Leu Asp Gly245 250 255Asn Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe Leu Arg Asp260 265 270Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met Phe Thr Val275 280 285Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn290 295 300Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Gln305 310 315 320Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met Arg Lys Leu325 330 335Leu Asn Gly Thr Val Val Ser Lys His Pro Leu Lys Ser Val Thr Phe340 345 350Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu Ser Thr Val355 360 365Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu Thr Arg Glu370 375 380Ser Gly Tyr Pro Gln Val Phe Tyr Gly Asp Met Tyr Gly Thr Lys Gly385 390 395 400Asp Ser Gln Arg Glu Ile Pro Ala Leu Lys His Lys Ile Glu Pro Ile405 410 415Leu Lys Ala Arg Lys Gln Tyr Ala Tyr Gly Ala Gln His Asp Tyr Phe420 425 430Asp His His Asp Ile Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser Val435 440 445Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro Gly Gly Ala450 455 460Lys Arg Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Glu Thr Trp His Asp465 470 475 480Ile Thr Gly Asn Arg Ser Glu Pro Val Val Ile Asn Ser Glu Gly Trp485 490 495Gly Glu Phe His Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Ile Tyr Val Gln Arg500 505 510Ser Pro Gly Glu Tyr Pro Ala Trp Asp Pro Asn Gln Ile Tyr Thr Asn515 520 525Glu Ile Val Tyr His Asn Gly Gln Leu Trp Gln Ala Lys Trp Trp Thr530 535 540Gln Asn Gln Glu Pro Gly Asp Pro Tyr Gly Pro Trp Glu Pro Leu Asn545 550 555 560SEQ ID 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ID No.11:GCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGCATTCCGAATACGAGGCCTGATTAATGATTACATACGCCTCCGGGTAGTAGACCGAGCAGCCGAGCCAGTTCAGCGCCTAAAACGCCTTATACAATTAAGCAGTTAAAGAAGTTAGAATCTACGCTTAAAAAGCTACTTAAAAATCGATCTCGCAGTCCCGATTCGCCTATCAAAACCAGTTTAAATCAACTGATTAAAGGTGCCGAACGAGCTATAAATGATATAACAATATTAAAGCATTAATTAGAGCAATATCAGGCCGCGCACGAAAGGCAACTTAAAAAGCGAAAGCGCTCTACTAAACAGATTACTTTTGAAAAAGGCACATCAGTATTTAAAGCCCGAATCCTTATTAAGCGCCGAAATCAGGCAGATAAAGCCATACAGGCAGATAGACCTCTACCTATTAAATCGGCTTCTAGGCGCGCTCCATCTAAATGTTCTGGCTGTGGTGTACAGGGGCATAAAATTACGCACTACCCGAATCGATAGAACTACTCATTTTTATATAGAAGTCAGAATTCATAGTGTTTTGATCATTTTAAATTTTTATATGGCGGGTGGTGGGCAACTCGCTTGCGCGGGCAACTCGCTTACCGATTACGTTAGGGCTGATATTTACGTGAAAATCGTCAAGGGATGCAAGACCAAAGTAGTAAAACCCCGGAAGTCAACAGCATCCAAGCCCAAGTCCTTCACGGAGAAACCCCAGCGTCCACATCACGAGCGAAGGACCACCTCTAGGCATCGGACGCACCATCCAATTAGAAGCAGCAAAGCGAAACAGCCCAAGAAAAAGGTCGGCCCGTCGGCCTTTTCTGCAACGCTGATCACGGGCAGCGATCCAACCAACACCCTCCAGAGTGACTAGGGGCGGAAATTTAAAGGGATTAATTTCCACTCAACCACAAATCACAGTCGTCCCCGGTATTGTCCTGCAGAATGCAATTTAAACTCTTCTGCGAATCGCTTGGATTCCCCGCCCCTAGTCGTAGAGCTTAAAGTATGTCCCTTGTCGATGCGATGATACACAACATATAAATACTAGCAAGGGATGCCATGCTTGGAGGATAGCAACCGACAACATCACATCAAGCTCTCCCTTCTCTGAACAATAAACCCCACAGGGGGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAAAGCGACTTGAAACGCCCCAAATGAAGTCCTCCATCCTCGCCAGCGTCTTCGCCACGGGCGCCGTGGCTCAAAGTGGTCCGTGGCAGCAATGTGGTGGCATCGGATGGCAAGGATCGACCGACTGTGTGTCGGGCTACCACTGCGTCTACCAGAACGATTGGTACAGCCAGTGCGCTAGCGTCCAGATCCCCTCCAGCAGCACCAGCTCTCCGGTCAACCAGCCTACCAGCACCAGCACCACGTCCACCTCCACCACCTCGAGCCCGCCAGTCCAGCCTACGACTCCCAGCGCTAGCCCTCCTCGTCGACCTGTCTCGCAGGATCTGTTTAACCAGTTCAATCTCTTTGCACAGTATTCTGCAGCCGCATACTGCGGAAAAAACAATGATGCCCCAGCTGGTACAAACATTACGTGCACGGGAAATGCCTGCCCCGAGGTAGAGAAGGCGGATGCAACGTTTCTCTACTCGTTTGAAGACTCTGGAGTGGGCGATGTCACCGGCTTCCTTGCTCTCGACAACACGAACAAATTGATCGTCCTCTCTTTCCGTGGCTCTCGTTCCATAGAGAACTGGATCGGGAATCTTAAGTTCCTCTTGAAAAAAATAAATGACATTTGCTCCGGCTGCAGGGGACATGACGGCTTCACTTCGTCCTGGAGGTCTGTAGCCGATACGTTAAGGCAGAAGGTGGAGGATGCTGTGAGGGAGCATCCCGACTATCGCGTGGTGTTTACCGGACATAGCTTGGGTGGTGCATTGGCAACTGTTGCCGGAGCAGACCTGCGTGGAAATGGGTATGATATCGACGTGTTTTCATATGGCGCCCCCCGAGTCGGAAACAGGGCTTTTGCAGAATTCCTGACCGTACAGACCGGCGGAACACTCTACCGCATTACCCACACCAATGATATTGTCCCTAGACTCCCGCCGCGCGAATTCGGTTACAGCCATTCTAGCCCAGAATACTGGATCAAATCTGGAACCCTTGTCCCCGTCACCCGAAACGATATCGTGAAGATAGAAGGCATCGATGCCACCGGCGGCAATAACCGGCCGAACATTCCGGATATCCCTGCGCACCTATGGTACTTCGGGTTAATTGGGACATGTCTTTAGTGGCCGGCGCGGCTGGGTCGACTCTAGCGAGCTCGAGATCTAGAGGGTGACTGACACCTGGCGGTAGACAATCAATCCATTTCGCTATAGTTAAAGGATGGGGATGAGGGCAATTGGTTATATGATCATGTATGTAGTGGGTGTGCATAATAGTAGTGAAATGGAAGCCAAGTCATGTGATTGTAATCGACCGACGGAATTGAGGATATCCGGAAATACAGACACCGTGAAAGCCATGGTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAGACAGTCCCTGATTTACCCTTGCACAAAGCACTAGAAAATTAGCATTCCATCCTTCTCTGCTTGCTCTGCTGATATCACTGTCATTCAATGCATAGCCATGAGCTCATCTTAGATCCAAGCACGTAATTCCATAGCCGAGGTCCACAGTGGAGCAGCAACATTCCCCATCATTGCTTTCCCCAGGGGCCTCCCAACGACTAAATCAAGAGTATATCTCTACCGTCCAATAGATCGTCTTCGCTTCAAAATCTTTGACAATTCCAAGAGGGTCCCCATCCATCAAACCCAGTTCAATAATAGCCGAGATGCATGGTGGAGTCAATTAGGCAGTATTGCTGGAATGTCGGGCCAGTTGGCCCGGGTGGTCATTGGCCGCCTGTGATGCCATCTGCCACTAAATCCGATCATTGATCCACCGCCCACGAGGCGCGTCTTTGCTTTTTGCGCGGCGTCCAGGTTCAACTCTCTCGCTCTAGATATCGATGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGACGCGTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTT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权利要求
1．一种含纤维素类织物或纺织品的脱浆方法，其中所述织物或纺织品用一种改良的酶(酶杂合体)处理，该酶含有与含纤维素结合结构域的氨基酸序列相连的非纤维素分解酶的具催化活性的氨基酸序列。
2．权利要求1的方法，其中所述具催化活性的氨基酸序列来自于从淀粉酶和脂酶中选择的一种酶。
3．权利要求2的方法，其中所述淀粉酶是可从枯草杆菌属菌种中获得的一种α-淀粉酶。
4．权利要求2或3的方法，其中所述α-淀粉酶可从地衣芽孢杆菌中获得。
5．权利要求2-4任一项的方法，其中淀粉酶杂合体以相当于淀粉酶活性为1至5000KNU/每升脱浆液的量使用。
6．权利要求2中的方法，其中所述脂酶可从腐质霉菌属、假丝酵母属、假单孢菌属或芽孢杆菌属的菌种中获得。
7．权利要求2或6的方法，其中脂解酶杂合体以相当于脂酶活性为10至20000LU/每升脱浆液的量使用。
8．权利要求1的方法，其中所述纤维素酶结合结构域可从纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶或几丁质酶中获得。
9．权利要求1的方法，其中所述酶杂合体是根据以下方法获得的，该方法包括培养一种含有表达盒的已转化宿主细胞，该表达盒包括一种编码上述酶杂合体的DNA序列，从而表达所述酶杂合体。
10．脱浆组合物，包括一种含有与含纤维素结合结构域的氨基酸序列相连接的非纤维素分解酶的催化活性氨基酸序列的酶杂合体；和润湿剂。
全文摘要
一种含纤维素织物的脱浆方法,包括用一种含有与含纤维素酶结合结构域的氨基酸序列相连接的酶类、特别是非纤维素酶类的催化活性氨基酸序列的修饰酶(酶杂合体)处理织物。适用于该方法的脱浆组合物,包括所述类型的酶杂合体和一种润湿剂。
文档编号C12N9/20GK1209838SQ9719194
公开日1999年3月3日 申请日期1997年1月29日 优先权日1996年1月29日
发明者C·冯德奥斯腾, M·E·比约恩韦德, J·文德, M·D·拉斯穆森 申请人:诺沃挪第克公司