专利名称：纤维素酶的两阶段共水解方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术领域的水解方法，具体地，涉及一种纤维素酶的两 阶段共水解方法。
背景技术：
利用纤维素酶水解木质纤维素生成还原糖，继而利用酵母等发酵生产燃料酒 精等能源物质一直是近年来人们研究的热点。而纤维素酶的失活是影响纤维素酶 水解顺利进行的瓶颈之一。部分纤维素酶在纤维素表面的不可逆性吸附被认为是 纤维素酶失活的主要机制。许多研究者发现，添加鼠李糖脂类生物表面活性剂能 够改善纤维素的表面特性并且减少纤维素酶的不可逆性吸附，从而有利于提高纤 维素酶的有效利用率，进而提高木质纤维素酶水解的效率。
铜绿假单胞菌是产生鼠李糖脂类生物表面活性剂的主要菌种。但是在其添加 至稻草水解过程中时，往往与纤维素酶产生菌的生长条件不具备兼容性，如生长 周期、温度、pH值均各不相同。由于真菌具备相对完整的纤维素酶酶系，因而 被广泛用于纤维素酶的生产中。但是，真菌的生长周期一般为96 h，而铜绿假 单胞菌这种细菌的生长周期一般在48 h左右。且真菌与细菌对温度及的pH值的 要求各不相同，因此使得铜绿假单胞菌与纤维素酶产生菌的共水解变得十分困 难。经文献检索，至今并无纤维素酶两阶段共水解新工艺的研究。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种纤维素酶的两阶段共水解 方法。本发明的共水解方法是将里氏木霉ZM4-F3与铜绿假单胞菌BSZ-07分别用 于纤维素酶的生产与鼠李糖脂类生物表面活性剂的生产。由于这两株菌的生长周 期与生长条件各不相同，因此本发明采用两阶段共水解新工艺，有效解决了铜绿 假单胞菌BSZ-07与里氏木霉ZM4-F3进行共水解时难以相互兼容的关键问题，有 效的提高了纤维素酶的水解效率，同时与常规水解方法相比较，水解的时间縮短
了 10%以上，有效地节约了成本。
本发明是通过以下技术方案实现的
第一步、生物质冲洗去除杂质，切成1到2厘米的小段，置于69到71 °C
烘箱中干燥至恒重，然后将剪切好的生物质用碱进行预处理，具体方法为将剪 好的生物质置于指质量体积比为2%的氢氧化钠溶液中，其中氢氧化钠溶液的体
积数值为放入的生物质的质量数值的3. 8到4. 2倍；在84到86 'C水浴58到62 分钟，然后用蒸馏水洗至PH至7，置于烘箱中干燥至质量不再增加；
第二步、用预处理后的生物质制备里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养基，然后 将里氏木霉ZM4-F3置于该水解产糖培养基中，在29到31 。C、 195到205 rpm 摇床的水解条件下水解47到49小时；
第三步、将铜绿假单胞菌BSZ-07接种至种子培养基中培养至对数生长期；
第四步、将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种至发酵产剂培养 基中，接种浓度为里氏木霉ZM4-F3接种浓度的4y。；然后在温度为32"C、 pH值 为5. 5的条件下进行两株菌的共水解。
所述第一步中的生物质是指稻草、玉米皮、麦麸、玉米芯、稻壳等植物纤维。
所述第二步中的水解产糖培养基各组分的质量百分比为生物质为2.9%， 麸皮为0. 97%， Mandels微量元素盐溶液为0. 48%，磷酸二氢钾为0. 04%，硫酸铵 为O. 16%，硫酸镁为0.01%，蛋白胨为O. 1%，蒸馏水为85.9%。
所述第三步中的种子培养基各组分的质量百分比为牛肉膏为0.3%， NaN03 为0. 1%，(鹏"04为0. 1%， N&HP04为0. 12%， KH2P04为0. 1%， MgS04 7H20为 0.001%， CaCl2为0. 0002%，蒸馏水为99. 3%。
所述第四步中的发酵产剂培养基各组分的质量百分比为葡萄糖为0.2%， 酵母膏为0, 01%， ,03为0. 05%，机油为0. 2%， KH2P04为0. 1%， Na2HP04为0. 1%， MgS04 7H20为0. 002%，微量元素溶液为0. 05%，蒸馏水为92. 3%。
本发明利用共水解过程需要两种微生物具有水解条件的兼容性，优化了两株 菌在后续48 h中协同作用时的最优温度、最优pH值及两株菌的最优接种比例。 使用本发明的两阶段共水解方法可以使样品在84 h时还原糖量达2.571 g/1， 比对照样的还原糖最大值时间提前了 12h，还原糖最大值提高了 15. 20%。同时，
两阶段共水解新工艺降解稻草96 h时的生物质降解率可提高至71. 21%，比对照 样达生物质降解率最大值时的时间提前了 24 h，生物质降解率的最大值也提高 了 3%。
本发明所使用的菌株为ZM4-F3和BSZ-07。经鉴定，ZM4-F3属于里氏木霉 (Trichoderma reesei)， BSZ-07属于铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。 保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。保藏号分别为CCTCC 40360 (里氏木霉)与CCTCC AB93066 (铜绿假单孢菌)。
图l纤维素酶两阶段共水解工艺对还原糖产量的影响图。 图2纤维素酶两阶段共水解工艺对稻草降解率的影响图。
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
将收割后的稻草用自来水冲洗4一5遍以去除杂质以及茎结，并切至l-2cra 的小段。切好的稻草置于7(TC烘箱中千燥至恒重，在室温下储存以备后续使用。 在酶水解前，将剪切好的稻草用碱进行预处理，具体方法为将10g剪好的稻 草置于装有40ml 2%的氢氧化钠的锥形瓶中，保持固液比为1:4， 85 'C水浴1 h。用蒸馏水洗至中性，置于70 。C烘箱中干燥至恒重。
将预处理后的稻草用里氏木霉ZM4-F3在30 。C、 200 rpm摇床中水解48 h， 然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到其中，接种浓度为里氏 木霉ZM4-F3的4%。后续的48 h，在温度32 °C、 pH值5. 5实现这两株菌的共水 解。测定还原糖产量随水解时间的变化值，并与未添加鼠李糖脂的对照样进行比 较。
研究发现，铜绿假单胞菌BSZ-07与里氏木霉ZM4-F3共水解时，自第48 h 起其还原糖产量迅速增加。在对照样中，96 h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时 间，其产还原糖量达最大值，为2.231g/1。而在两阶段共水解样品中，产糖84
h时就可使还原糖量达2. 321 g/l。因此，此种两阶段共水解新工艺不仅能增加 还原糖的产量，还能明显縮短最优产糖时间，从而降低纤维素酶的生产成本。 实施例2
将收割后的玉米皮用自来水冲洗4一5遍以去除杂质以及茎结，置于70 °C 烘箱中干燥至恒重，在室温下储存以备后续使用。在酶水解前，将玉米皮用碱进 行预处理，具体方法为将10 g玉米皮置于装有40 ml 2%的氢氧化钠的锥形 瓶中，保持固液比为1:4， 85'C水浴lh。用蒸馏水洗至中性，置于7(TC烘箱 中干燥至恒重。
将玉米皮用里氏木霉ZM4-F3在30 。C、 200 rpm摇床中水解48 h，然后将 培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到其中，接种浓度为里氏木霉 ZM4-F3的4%。后续的48 h，在温度34 °C、 pH值5. 0实现这两株菌的共水解。 测定还原糖产量随水解时间的变化值，并与未添加鼠李糖脂的对照样进行比较。
研究发现，铜绿假单胞菌BSZ-07与里氏木霉ZM4-F3共水解时，自第48 h 起其还原糖产量迅速增加。在对照样中，96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时 间，其产还原糖量达最大值，为2.231g/1。而在两阶段共水解样品中，产糖84 h时就可使还原糖量达2. 427 g/1。因此，此种两阶段共水解新工艺不仅能增加 还原糖的产量，还能明显縮短最优产糖时间，从而降低纤维素酶的生产成本。
实施例3
将收割后的麦麸用自来水冲洗4一5遍以去除杂质以及茎结置于70 'C烘箱 中干燥至恒重，在室温下储存以备后续使用。在酶水解前，将麦麸用碱进行预处 理，具体方法为将10 g麦麸置于装有40 ml 2%的氢氧化钠的锥形瓶中，保 持固液比为1:4， 85 。C水浴1 h。用蒸馏水洗至中性，置于70 'C烘箱中干燥至 恒重。
将预处理后的麦麸用里氏木霉ZM4-F3在30 °C、 200 rpm摇床中水解48 h， 然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到其中，接种浓度为里氏 木霉ZM4-F3的4%。后续的48 h，在温度34 'C、 pH值5. 5实现这两株菌的共水 解。测定还原糖产量随水解时间的变化值，并与未添加鼠李糖脂的对照样进行比 较。
研究发现，铜绿假单胞菌BSZ-07与里氏木霉ZM4-F3共水解时，自第48 h
起其还原糖产量迅速增加。在对照样中，96h是里氏木霉ZM4-F3的最优产糖时 间，其产还原糖量达最大值，为2.231g/1。而在两阶段共水解样品中，产糖84 h时就可使还原糖量达2. 571 g/1。因此，此种两阶段共水解新工艺不仅能增加 还原糖的产量，还能明显縮短最优产糖时间，从而降低纤维素酶的生产成本。 实施例4
将收割后的玉米芯用自来水冲洗4_5遍以去除杂质以及茎结，并切至l-2cm 的小段。切好的玉米芯置于70 。C烘箱中干燥至恒重，在室温下储存以备后续使 用。在酶水解前，将剪切好的玉米芯用碱进行预处理，具体方法为将IO g剪 好的玉米芯置于装有40 ml 2%的氢氧化钠的锥形瓶中，保持固液比为1 : 4， 85 °。水浴1 h。用蒸馏水洗至中性，置于70 。C烘箱中干燥至恒重。
将预处理后的玉米芯用里氏木霉ZM4-F3在30 。C、 200 rpm摇床中水解48 h， 然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到其中，接种浓度为里氏 木霉ZM4-F3的4%。后续的48 h，在温度34 °C、 pH值5. 5实现这两株菌的共水 解。测定玉米芯降解率随水解时间的变化值，并与未添加鼠李糖脂的对照样进行 比较。
研究发现，铜绿假单胞菌BSZ-07与里氏木霉ZM4-F3共水解的样品自48 h 起其玉米芯降解率优于对照样。两阶段共水解样品可以使玉米芯降解率在96 h 时达到71.21%，比对照样达玉米芯最大降解率的时间提前了 24 h，且最大降解 率提高了 3%。
由于纤维素酶两阶段共水解新工艺有效解决了铜绿假单胞菌BSZ-07与里氏 木霉ZM4-F3进行共水解时难以相互兼容的关键问题，因此可有效提高纤维素酶 的水解效率。
权利要求
1、一种纤维素酶的两阶段共水解方法，其特征在于，包括如下步骤第一步、生物质冲洗去除杂质，切成1到2厘米的小段，置于69℃到71℃烘箱中干燥至恒重，然后将剪切好的生物质用碱进行预处理，具体方法为将剪好的生物质置于指质量体积比为2％的氢氧化钠溶液中，其中氢氧化钠溶液的体积数值为放入的生物质的质量数值的3.8到4.2倍；在84℃到86℃水浴58到62分钟，然后用蒸馏水洗至pH至7，置于烘箱中干燥至质量不再增加；第二步、用预处理后的生物质制备里氏木霉ZM4-F3水解产糖培养基，然后将里氏木霉ZM4-F3置于该水解产糖培养基中，在29℃到31℃、195到205rpm摇床的水解条件下水解47到49小时；第三步、将铜绿假单胞菌BSZ-07接种至种子培养基中培养至对数生长期；第四步、将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种至发酵产剂培养基中，接种浓度为里氏木霉ZM4-F3接种浓度的4％；然后在温度为32℃、pH值为5.5的条件下进行两株菌的共水解。
2、 根据权利要求1所述的纤维素酶的两阶段共水解方法，其特征是，第一 步中所述的生物质是指稻草、玉米皮、麦麸、玉米芯、稻壳等植物纤维。
3、 根据权利要求1所述的纤维素酶的两阶段共水解方法，其特征是，第二 步中所述的水解产糖培养基各组分的质量百分比为生物质为2.9%，麸皮为 0. 97%， Mandels微量元素盐溶液为0. 48%，磷酸二氢钾为0. 04%，硫酸铵为0. 16%， 硫酸镁为0.01%，蛋白胨为O. 1%，蒸馏水为85.9%。
4、 根据权利要求1所述的纤维素酶的两阶段共水解方法，其特征是，第三 歩中所述的种子培养基各组分的质量百分比为牛肉膏为0.3%， NaN03为0. 1%， (NH4)2S。4为0. 1%， Na2HP04A 0. 12%， ,04为0, 1%， MgS04 7H20为0. 001%， CaCl2 为0. 0002%，蒸馏水为99. 3%。
5、 根据权利要求1所述的纤维素酶的两阶段共水解方法，其特征是，第四 歩中所述的发酵产剂培养基各组分的质量百分比为葡萄糖为0.2%，酵母膏为 0.01%， NH4N03为0.05%，机油为0.2%， KH2P04为0.1%， Na2HP04为0.1%， MgS04 7H20为0. 002%， 1敛量元素溶液为0. 05%，蒸馏水为92. 3%。
全文摘要
一种生物技术领域的纤维素酶的两阶段共水解方法，本发明的方法包括如下步骤将里氏木霉ZM4-F3在水解产糖培养基中水解48h，然后将培养至对数生长期的铜绿假单胞菌BSZ-07接种到其中，接种量为里氏木霉ZM4-F3的4％。铜绿假单胞菌BSZ-07可产生鼠李糖脂生物表面活性剂，以促进稻草酶解的进行。在后续的48h两株菌共水解阶段中，采用温度32-35℃、pH值5.5。由于纤维素酶两阶段共水解新工艺有效解决了铜绿假单胞菌BSZ-07与里氏木霉ZM4-F3进行共水解时难以相互兼容的关键问题，因而可有效提高纤维素酶的水解效率。
文档编号C12P39/00GK101358226SQ20081004277
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月11日 优先权日2008年9月11日
发明者张秋卓, 蔡伟民 申请人:上海交通大学