专利名称：：一种曲霉纤维素酶菌种的制备方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种曲霉纤维素酶菌种的制备方法及这种菌种在酿造工业中的应用，具体地说是提供一种被称为EA181的曲霉纤维素酶变株的生产方法及利用所生产的曲霉纤酶EA181在酿造工业中的实际应用。近二十年世界各国对纤维素酶的研究进展较快，日本已在食品加工、酿造、医药、化工等方面获得广泛应用。美国、巴西、印度、苏联等国开展利用纤维素酶水解工业废纤维发酵酒精的研究已进入中试阶段，但是所用纤维素酶活力较低。我国曾在白酒生产、酱油酿造、食品加工与提高粗饲料营养价值等方面进行过纤维素酶的应用研究。但由于菌种活力较低，成本较高，菌种多属木霉，有毒性嫌疑，在食品发酵工业中未获得实际应用。本发明的目的是提供一种制备高活力纤维素酶菌种的方法，并将所制备的高活力菌种应用于食品酿造工业的生产中。本发明的曲霉纤维素酶菌种从具有纤维素酶活性的野生菌株分离、筛选出菌株，称原菌株，对其进行紫外线、秋水仙碱、硫酸二甲脂，亚硝酸及亚硝基胍中二种或多种过程。连续诱变处理而获得的一种高活性纤维素酶变株。这种原菌株菌落特征为在查氏琼脂25℃7天菌落直径4.0～4.6cm，中间灰白色、边缘褐色、绒毛状，从中心到边缘均有沟纹，背面中央浅褐色，边缘白色，10天菌落5.5～6.0cm，边缘淡紫色与形成黑色分生孢子，中央白色带浅黄，14天部分中心区孢子也呈黑色，背面中央浅褐色，边缘白褐色。分生孢子头成束，顶端散开，部分分叉，分生孢子梗光滑无色，小梗单层，浅褐色，顶囊浅褐色16-24×18-28μ，分生孢子圆形，黑色有明显小刺，根据曲霉鉴定手册(Raper.K.B.etal.thegenusAspergillus.Williamasandwilkinsco.Baltimore.293～3441965)此菌株鉴定为黑曲霉群(AsPergillusniger)，日本曲霉(Aspergillusjaponicus)。由这种原菌株经诱变育种而得到的本发明制备的新的高活力曲霉纤维素酶EA181变株现，寄存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号为160。EA181变株培养特征为生成较原菌株慢，在查氏琼脂25℃7天菌落直径3.5～4.0cm，背面淡黄色，10天，菌落5.5～6.0cm，中间白色转灰黄，带淡紫色，有放射状沟纹，14天中间淡紫色，边缘孢子呈器色。此菌株最适产酶培养基成分为以花生秸、苞米秸、谷草、稗草粉为碳源，用麸皮作氮源，再加以不同无机氮作补充氮源配成的营养盐溶液PH5.9～6.2进行固态培养EA181变株均能良好生长。但酶活性以谷草粉为碳源，硝酸铵、硝酸钠或硫酸铵的一种或二种混合无机盐溶液为补充氮源配成的培养基为最佳成份，且麸皮占固体粉料10～40%(重)，营养盐溶液中无机氮含量占总N量0.1～1%(重)，其较佳用量为0.2～0.4%(重)。此外，最适产酶PH值为5.9～6.2，温度为28～30℃，培养时间为120～150小时。为测酶活性，对固态曲酶活性测定是先将2克生成好的三角瓶固态曲，加水40ml，于30℃保温1小时，过滤得1∶20酶提取液，用DNS定糖的方法测定此酶液分解CMC(羧甲基纤维素钠)、滤纸、棉花与β-葡萄糖苷(水杨苷)酶活性，液体曲是直接用滤纸过滤同上法测定酶活性。下面通过实例进一步说明本发明提供的新EA181变株的制备过程和在酿造工业上的应用。实例1曲霉原菌株诱变、育种对曲霉原菌株进行紫外线、秋水仙碱、硫酸二甲酯等连续诱变处理可获得高活性曲霉纤维素酶EA181，其诱变处理过程对变株酶活性的影响如表1。表1不同诱变处理对变株酶活性的影响由表1所示结果，原菌株经连续诱变处理累计提高分解CMC与滤纸酶活性3倍，棉花酶活性3.7-3.9倍，本发明选定最后处理得到的变株为EA181。实例2，EA181变株制备用实例1得到EA181变株菌株，以谷草粉7克，麸皮3克，营养盐溶液(NaNO3和(NH4)2SO4分别取溶液重量的1.5%，0.8%)25ml配成培养基，PH5.9～6.2，菌株培养120～140小时。得到产品EA181变株酶活性测定为，该酶分解CMC，滤纸，棉花及水杨苷酶活性分别为7600～8100;270～310;380～410及2300～2600mg葡萄糖/gh。实例3，EA181变株毒性试验利用实例2制备出的EA181曲霉纤维素酶进行毒性试验，试验小白鼠10只，试验前停食24小时，按各小白鼠重发给以80g/kg的剂量制成饲料分笼饲养4小时后含药料块全部食完，观察7天，被试验小白鼠无任何毒性反应，饮食正常，毛色有光泽，体重增加，证明此菌酶制剂无毒性。实例4，EA181曲霉用于果汁提取试验条件先把果品用组织捣碎器打浆，桔子与葡萄为原汁浆，苹果加20%水打浆，然后取果浆200～250g，加酶液4～10ml(固态曲加4倍水提取)，对照加等体积水，28～50℃保温4～5小时，用多层纱布手挤压汁。试验结果列于表2，在5%酶液用量(对果浆比)条件下提高桔子汁产率15.2%，苹果汁10%，葡萄汁7.5%，果汁糖度也有所增加。表2EA181曲酶对提取果汁产率的影响</tables>实例5EA181曲霉用于酒精发酵试验条件苞米面60g，加220ml水，在水溶中糊化成浆状，冷却至70℃，加淀粉酶液化半小时，1kg/cm2灭菌30分钟，加糖化酶0.2g纤维素酶曲0.6g，对照只加糖化酶，50℃保温1小时，冷却后接种液体酵母菌种13.5ml，不同培养时间取样测定发酵液酒精含量，残糖及PH。其结果如表3。表3EA181曲酶对酒精发酵产率的作用</tables>由表3所示结果，加EA181曲酶的酒精发酵比对照旺盛，发酵周期明显缩短，30小时发酵已趋终止，酒精含量达到高峰，此时发酵液的酒精含量为9.17/，对照为7.44%，提高产率23.3%。此外，EA181曲酶不仅提高了发酵原料的利用率，而且还提高了发酵糖的利用速度。由上述实例，本发明方法制备出的曲酶EA181变株，具有较高的活性，其制备过程简单、且成本低。此外，这种新曲酶变株无毒，在提取果汁与酒精发酵等食品业使用可显著提高产率，例如可提高桔子汁产率15.2%，苹果汁10%，葡萄汁7.5%，酒精发酵产率7.2%，白酒产率7～8%具有明显的经济效益。权利要求1.一种曲霉纤维素酶菌种的制备方法，其特征在于该菌株是从具有纤维素酶活性的野生菌株分离，筛选出菌株，对其进行紫外线，秋水仙碱、硫酸二甲脂、亚硝酸及亚硝基胍中二种或多种过程连续诱变处理而获得的一种高活性纤维素酶变株，此菌株鉴定为黑曲霉群，日本曲霉，该菌株寄存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记人册的编号为160；该菌株可在以花生秸、苞米秸、谷草、稗草粉为碳源，用麸皮作氮源再加以不同无机氮作补充氮源配成的营养盐溶液配成的培养基中生长产酶。2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的培养基成分中碳源最好采用谷草粉，且麸皮与固体粉料10～40%(重)。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述培养基成分中营养盐溶液中无机氮含量占氮量0.1～1%(重)，其较佳用量为0.2～0.4%(重)。4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于菌株生产过程中最适产酶PH值为5.9～6.2，温度为28～30℃，培养时间为120～150小时。5.一种利用权利要求1所述方法制备出的曲霉纤维素酶的应用，其特征在于该菌株可用食品酿造工业，例如可用于提高果汁提取率，酒精发酵率和白酒产率。全文摘要一种被称之为EA181的曲霉纤维素酶变株的生产方法是从野生菌株分离，筛选出菌株，进行紫外线，秋水仙碱，硫酸二甲酯等连续诱变处理而获得的一种高活性曲霉变株。该曲霉被鉴定为黑曲霉群，日本曲霉(Aspergillusjapohicus)。适合EA181变株的最适产酶培养基成分为，谷草粉、麦皮及营养盐溶液(硝酸铵、硝酸钠、硫酸铵等)。EA181曲酶不仅活性高，制备过程简单，且无毒。在提取果汁与酒精发酵等食品业使用可显著提高产率，可提高桔子汁产率15.2％，苹果汁10％，葡萄汁7.5％，酒精发酵产率7.2％，白酒产率7～8％，具有明显的经济效益。文档编号C12N1/14GK1062167SQ9010645公开日1992年6月24日申请日期1990年12月5日优先权日1990年12月5日发明者王义甫,唐桂馥,陈源,张道海申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所