使用白介素－10产生抑制细胞群体的制作方法

专利名称：使用白介素－10产生抑制细胞群体的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及白介素-10(IL-10)的用途，即通过给与患病个体有效量的白介素-10产生这样的细胞群体，所述群体用来抑制各种免疫学功能(例如治疗和抑制组织排斥的方法)和其它免疫功能。
背景技术：
白介素-10为最初由于其抑制Th1细胞因子产生的活性而特征记述的细胞因子。参见例如de Vries和de Waal Malefyt(编辑，1995)Interleukin-10 Landes Co.,Austin,TX等。
发现免疫学功能的抑制在许多不同的方面具有实用性。参见例如Paul(编辑，1995)Fundamental Immunology第3版，Raven Press,NY。具体地说，异源免疫性在移植方面是重要的，主要是由于其异常强度引起的。因为器官移植和组织移植在医学方面越来越普遍，因此最大限度地减少组织排斥问题的能力表现出越来越大的经济优势。另外，最大限度地减轻自身免疫病以阻断对特定抗原(例如细菌和寄生虫的抗原)的某些反应并最大限度地减少对某些可溶性蛋白和变应原的反应的方法将明显有利于治疗目的。
缺少最大限度地减少或消除组织排斥、移植物抗宿主病或这些其它免疫学反应的完全有效的疗法产生许多问题。本发明指出并提供这些问题中的许多问题的解决方法。
发明概述本发明涉及细胞因子白介素-10(IL-10)抑制移植组织排斥的用途。本发明也包括包含白介素-10的药用组合物。最好是，本发明的白介素-10选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中提出的氨基酸序列定义的可读框的成熟肽。这两种形式的IL-10有时分别称为人IL-10(或人细胞因子合成抑制因子(“CSIF”))和病毒IL-10(或BCRF1)，例如Moore等，(1990)Science 248:1230-1234；Vieira等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1172-1176；Fiorentino等，(1989)J.Exp.Med.170:2081-2059；和Hsu等，(1990)Science 250:830-832。已经描述了2型疱疹病毒(Roe等，(1993)Virus Genes 7:111-116)以及多种不同物种的相应物中的同源物(homolog)。更优选的是，用于本发明方法的成熟IL-10是SEQ IDNO:3定义的IL-10或由SEQ ID NO:4定义的IL-10。
因此，在特定实施方案中，本发明提供在哺乳动物的骨髓移植中减轻或抑制移植物抗宿主病的方法，包括给与哺乳动物有效量的IL-10。也提供通过免疫系统抑制对所述抗原随后提呈的抗原特异性应答的方法，包括给与所述免疫系统有效量的外源白介素-10和该抗原。在最佳实施方案中，该免疫应答由巨噬细胞、APC、朗格汉斯细胞或树突细胞介导；该方法还抑制CD4+宿主反应性T细胞克隆的增殖性反应；或所述抑制持续至少约21天。在其它最佳实施方案中，所述有效量足以降低效应T细胞的激活；或还可以包括外周血单核细胞、树突细胞、单核细胞和/或正常的B细胞的刺激能力降低。
在另一实施方案中，本发明提供大致纯的抗原特异性无反应性T细胞，所述无反应性T细胞的特征在于再刺激时产生低IL-2；低IL-4；低IL-5；中间TFN-γ；低GM-CSF；和高IL-10；和通过给与所述T细胞前体外源IL-10和抗原的组合物产生的群体。在最佳实施方案中，所述前体为CD4+T细胞；所述细胞还产生高TNF-α；所述细胞诱导对该抗原的无反应性应答；给与的IL-10为人IL-10；给与所述IL-10至少约7天；和/或该无反应性状态持续至少约21天。该抗原特异性可以是对选自以下抗原的蛋白抗原、特定抗原、异体抗原或自体抗原。
另一实施方案是大致纯的抗原特异性的无反应性T细胞，该细胞的特征在于再刺激时产生低IL-2；低IL-5；中等FN-γ；低GM-CSF；和高IL-10。通常，该细胞因子的生产水平对于IL-2为低于约500pg/ml；对于IL-5为约300-3000pg/ml；对于IFN-γ至少为约1000gp/ml；对于GM-CSF为约300-3000pg/ml；对于IL-10至少为约3000pg/ml。最好是，用抗CD3再刺激时，所述IL-10的水平至少约为Th1细胞的5倍。
本发明也包括大致纯的T细胞，它对抗原表现出抗原特异性无反应性，包括例如该抗原为异体抗原或自身抗原；所述T细胞用抗CD3再刺激时产生至少约3000pg/ml的IL-10；或所述T细胞表现出至少约21天的抗原特异性的无反应性。
在另一实施方案中，本发明提供通过给与含这种细胞的免疫系统外源IL-10和或者抗原或者抗CD3抗体的组合物，抑制T细胞对抗原的应答的方法。最好是，该抗原为异体抗原或自身抗原；但通常受MHC分子限制。在其它实施方案中，体内进行该方法，或还抑制对随后刺激的应答，所述应答例如为伴随诸如器官移植或骨髓移植的组织移植的反应。通常，所述T细胞来自所述组织移植的受体，该抗原来自供体MHC。当该反应伴随组织移植时，通常所述给与在组织移植前进行；将所述T细胞导入该受体；或在移植到供体之前和/或期间，将IL-10给与待移植组织。在其它实施方案中，该抗原引起自身免疫病。
在其它实施方案中，本发明也提供通过给与免疫系统外源IL-10和或者抗原或者抗CD3抗体的组合物而抑制T细胞对该抗原随后反应的方法。最好是，该IL-10给与至少约7天。
本发明还提供通过给与所述T细胞前体或者外源IL-10和抗原；或者外源IL-10和抗CD3抗体而诱导T细胞对MHC抗原无反应性的方法。最好是给与IL-10至少约7天。
本发明包括的另一实施方案是包含IL-10和抗原的组合物。该组合物可以是包含IL-10和药学上可接受载体的药用组合物；所述IL-10可以是人IL-10；或该抗原可以是异体抗原、自身抗原、蛋白抗原或特定抗原。
附图简述

图1图释用于在哺乳动物细胞中表达IL-10的载体pcD(SRα)。
图2图释用于在细菌中表达IL-10的载体TRP-C11。
图3A-3C显示内源和外源IL-10对混合淋巴细胞应答中的增殖性应答影响的直方图。图3A显示内源和外源IL-10对混合淋巴细胞应答(MLR)中的增殖性应答的影响BPMC供体A×辐射PBMC供体B。图3B显示内源和外源IL-10对MLR中的增殖性应答的影响PBMC供体B×辐射BPMC供体A。图3C显示抗IL-10mAb对IL-10抑制作用的中和作用。
图4A-4D显示在增加浓度的IL-10存在下，用每种不同异源细胞刺激的纯化T细胞增殖性应答的直方图。图4A表明用同种异体辐射淘洗的(elutriated)单核细胞对纯化T细胞的刺激。图4B表明用阳性分选的CD14+单核细胞对纯化T细胞的刺激。图4C表明用纯化B细胞对纯化T细胞的刺激。图4D表明用EB病毒转化的类淋巴母细胞细胞系(EBV-LCL)对纯化T细胞的刺激。
图5显示IL-10对外周血单核细胞(PBMC)和同种异体辐射PBMC的动力学的直方图。
图6显示在存在或缺乏抗IL-1受体α链mAb BB10的情况下IL-10对MLR中产生IL-2的影响的直方图。
图7A-7B显示外源IL-2对受刺激T细胞减小的同种抗原诱导的增殖性应答的影响。图7A图示外源IL-2对用同种异体辐射PBMC刺激并用IL-10诱导的T细胞的减小的同种抗原诱导的增殖性应答的影响。图7B图示外源IL-2对用纯化异源B细胞刺激并用IL-10诱导的T细胞的减小的同种抗原诱导的增殖性应答的影响。
图8A-8B显示IL-10诱导MLR中的CD4+T细胞同种抗原特异性无反应性。图8A显示在IL-10(100U/ml)(黑色条带)或抗IL-2受体一条链的mAb BB-10(影线条带)的存在下，在单独的培养基(白色条带)中培养3天的纯化CD4+T细胞或在初次MLR中用异源纯化单核细胞(灰色条带)刺激的纯化CD4+T细胞的[3H]-TdR的掺入。图8B显示三个不同的板，它们代表的细胞已经按图8A所述预激活，在IL-10存在下保持培养10天，洗涤，并用以下培养基或细胞再刺激或者单独的培养基(黑色条带)；同种异体辐射PBMC(PBMC-2，交叉影线条带)，从不同于用于预激活步骤的单核细胞供体的第三组供体中分离；同种异体辐射PBMC(PBMC-1，灰色条带)，从用于预激活步骤的同一供体分离；PBMC-1加IL-2(20U/ml)(黑色影线条带)或PBMC-1加抗CD28mAb(10μg/ml)(影线条带)。
图9A-9B表明，IL-10在用CD3mAb激活的CD4+T细胞中诱导多克隆无反应性。图9A在单独的培养基(白色条带)中培养3天的纯化CD4+T细、或在存在IL-10(100U/ml)(交叉影线条带)的情况下用交联抗CD3mAb(500ng/ml)(黑色条带)或抗IL-2受体α链mAb BB-10(影线条带)刺激的纯化CD4+T细胞的[3H]-TdR的掺入。图9B显示三个不同的部分，它们代表的细胞已经如图9A中所述进行预激活，在IL-10存在下保持培养10天，洗涤并用以下培养基或细胞再刺激或者单独的培养基(黑色条带)、交联抗CD3mAb(灰色条带)、抗CD3mAb加IL-2(20U/ml)(交叉影线条带)、抗CD3mAb加抗CD28mAb(10μg/ml)(黑色影线条带)或者PMA(1ng/ml)加Ca2+离子载体(A23187,500ng/ml)(白色条带)。
图10显示IL-10对CD4+T细胞无反应性诱导的剂量依赖性影响。如4个不同板下所示，CD4+T细胞在以下物质存在下用交联抗CD3mAb激活10天单独的培养基、IL-10(5U/ml)、IL-10(20U/ml)或IL-10(100U/ml)。10天后，收集细胞，将其洗涤并用以下物质再刺激单独的培养基(白色条带)、交联抗CD3mAb(黑色条带)、交联抗CD3mAb加IL-2(20U/ml)(影线条带)或PMA加Ca2+离子载体(黑色影线条带)。
图11显示IL-10在CD4+T细胞中诱导无反应性的动力学。CD4+T细胞在缺乏(白色条带)或存在(黑色条带)IL-10(100U/ml)的情况下用交联抗CD3mAb激活。在所示的3-10天的不同培养时期后，收集细胞，将其洗涤并如每个板下所示用以下物质再刺激或者单独的培养基、交联抗CD3mAb、交联抗CD3mAb加IL-2(20U/ml)、交联可CD3mAb加抗CD28mAb(10U/ml)或PMA加Ca2+离子载体。
图12显示IL-10在CD4+T细胞中诱导的无反应持续长时间。CD4+T细胞在缺乏(白色条带)或存在(黑色条带)IL-10(100U/ml)的情况下用交联抗CD3mAb激活10天。10天后，收集细胞，将其洗涤并在存在IL-2(2U/ml)的情况下培养。24天后，收集细胞，用交联抗CD3mAb、交联抗CD3mAb加IL-2(20U/ml)、交联抗CD3mAb加抗CD28mAb(10μg/ml)或PMA加Ca2+离子载体再刺激。
图13显示无反应性T细胞的细胞荧光测定分析。CD4+T细胞在缺乏或存在IL-10(100U/ml)的情况下用交联抗CD3mAb激活10天，在用交联抗CD3mAb再激活24小时之前或之后分析CD3、CD28和HLA-DR的表达。黑线表示在缺乏IL-10的情况下培养的对照T细胞，虚线直方图表示在IL-10存在下培养的无反应性T细胞。
图14A-14B显示无反应性T细胞上IL-2Rα链的表达。CD4+T细胞在存在或缺乏IL-10(100U/ml)的情况下用交联抗CD3mAb激活3天(图14A)或10天(图14B)，并且或者用单独的交联抗CD3mAb或者用交联抗CD3mAb加IL-2(100U/ml)再刺激。
图15A-15B显示无反应细胞中钙转移分析。在缺乏(图15A)或存在(图15B)IL-10(100U/ml)的情况下，CD4+T细胞用抗CD3mAb活化10天，与indo-1/AMload。正如所示的，将抗CD3mAb(10μg/ml)、山羊抗小鼠IgG(1μg/ml)或Ca2+离子载体(500ng/ml)加入所述杯中，通过分光荧光法分析胞内Ca2+的升高，并于405/485nm通过发射率进行测定。
图16显示纯化CD4+T细胞的增殖性应答，所述CD4+T细胞在存在IL-10(100U/ml)的情况下用交联抗CD3mAb(100ng/ml)刺激10天后，已被赋予无反应性，在用浓度非常高的交联抗CD3mAb再刺激后可以部分恢复。诱导10天后，收获所述CD4+T细胞，在Ficoll/hypaque上离心，以除去无活力细胞。接着收获细胞，用PBS洗涤3次。CD4+T细胞(4×104/孔)随后通过提高交联抗CD3mAb的浓度(10ng至1mg/ml)再刺激3天。
图17显示与Th1和Th2克隆相比Tr1克隆的增殖性应答。通过以2周的间隔用辐射饲养细胞和PHA刺激，维持T细胞克隆。用饲养细胞和PHA刺激、洗涤并在存在或缺乏抗IL-10mAb(10μg/ml)或抗IL-2mAb(10μg/ml)的情况下用交联抗CD3mAb(100mg/ml)再刺激后12天，收获静息T细胞克隆。显示与Th1和Th2克隆相比，Tr1克隆的增殖性应答非常低。另外，与对照Th1和Th2克隆相对比，Tr1克隆的增殖性应答用抗IL-10mAb显著增强，但甚至在存在抗IL-10mAb的情况下，该应答从未达到对照Th1和Th2克隆的应答水平。包括Tr1克隆的所有类型T细胞克隆的增殖性应答均被抗IL-2mAb完全抑制。
图18A-18B显示在激活Tr1克隆细胞后快速发生Tr1克隆产生IL-10。在用或者抗CD3mAb或者抗CD28mAb(图18A)、或抗CD3mAb+佛波醇酯PMA(图18B)的组合物激活所述T细胞克隆后16小时，产生相当水平的IL-10。相反，在Th1或Th2克隆细胞激活后24小时时，可以第一次测量到仅低水平的IL-10产生。
图19显示鼠Tr1细胞在IL-10存在下的发育。来自BALB/c遗传背景(Murphy等，Science 250:1920-1720)上的D011.10αβTCR的转基因小鼠的原初(MEL14 bright)CD4+T细胞用OVA肽(0.6μM)和辐射脾APC刺激。另外，所述培养物接受细胞因子IL-4(200U/ml)或IL-10(100U/ml)或这两者。在上述相同条件下，每周重复刺激，连续刺激3周(Murphy等，J.Exp.Med.183:901-13)。然后收获细胞、洗涤，并用交联抗CD3mAb和抗CD28mAb于37℃再刺激4小时，用加入的布雷菲德菌素A(10μg/ml)如上述刺激最后2小时。Openshaw等，(1995)J.Exp.Med.182:1-11。然后将所述细胞固定并染色，以按指示用直接缀合的对IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10特异性的FITC或PE抗体、或对照同种型mAb(CT同种型)检测胞内细胞因子的合成。细胞也用抗TCR克隆型(clonotype)特异性mAb KJ1-26(KJ)染色，以显示培养3周后所有细胞为该转基因阳性。
图20A和20B显示Tr1细胞的增殖性应答。图20A人Th0(JDV305)和Tr1(JDV24)同种抗原特异性CD4+T细胞克隆或非抗原特异性Tr1细胞克隆(JDV15和JDV308)或者用同种异体辐射单核细胞刺激5天，或者用交联抗CD3和抗CD29mAb刺激3天。图20B来自BALB/C遗传背景上的D011.10αβTCR转基因小鼠的原初(MEL14 bright)CD4+T细胞按图19所述体外分化，用OVA肽(1μM)和辐射脾APC再激3天。一个OVA特异性Th0克隆(A-7)和两个OVA特异性Tr1型克隆(A-10-9和A-10-11)在相同条件下刺激。在培养的最后12小时期间，通过3[H]-TdR掺入测定所述增殖性应答。在对照同种型mAb(20μg/ml-黑色条带)、阻断抗IL-10mAb(对于人类细胞为12G8 5μg/ml或对于小鼠细胞为JES6-2A5 10μg/ml-白色交叉影线条带)、阻断抗TGF-β(Genzyme,MA；10μg/ml-黑色交叉影线条带)或这两种抗体的组合物(白色条带)存在下，进行人类细胞或鼠细胞的培养。
图21A和21B显示Tr1细胞抑制原初CD4+T细胞的Ag特异性增殖性应答。图21A将来自供体JDV的静息纯化人类CD4+T细胞在通透孔(transwell)的底部用同种异体纯化的辐射单核细胞刺激5天。所述静息T细胞与通透孔篮中含有的不同自体克隆共培养，所述自体克隆或者为同种抗原特异性Tr1克隆(JDV24)、同种抗原特异性Th0克隆(JDV305)，或者为非抗原特异性Tr1克隆(JDV308)。5天后取出该篮，在培养的最后12小时期间，通过3[H]-TdR掺入分析静息CD4+T细胞的增殖性应答。图21B来自BALB/C遗传背景上的D011.10αβTCR转基因小鼠的原初(MEL14 bright)CD4+T细胞在通透孔系统的底部用OVA肽(1μM)和辐射脾APC刺激3天。这些原初T细胞与所述通透孔篮中含有的指示群体共培养分别在IL-4(IL-4分化)、IL-10(IL-10分化)或IL-4和IL-10(IL-4/10分化)存在下连续3次再刺激体外分化的OVA特异性CD4+T细胞群体；或OVA特异性CD4+T细胞克隆A-10-9、A-10-11(Tr1型克隆)或A-7(Th1型克隆)。3天后取出该篮，在培养的最后12小时期间，通过3[H]-TdR掺入分析原初CD4+T细胞的增殖性应答。在对照同种型mAb(20μg/ml-黑色条带)、阻断抗IL-10mAb(对于人类细胞为12G8 5μg/ml，或对于小鼠细胞为JES6-2A5-10μg/ml-白色交叉影线条带)、阻断抗TGF-β(Genzyme,MA；10μg/ml-黑色交叉影线条带)或这两种抗体的组合物(白色条带)存在下，进行人类细胞或鼠细胞的培养。
发明详述在某些实施方案中，本发明涉及在移植患者中使用IL-10抑制组织排斥的方法。本发明也包括包含IL-10用于进行该方法的药用组合物。用于本发明的各种IL-10选自pH5C、pH15C和pBCRF1(SRα)的cDNA插入片段定义的可读框编码的成熟多肽，这些cDNA插入片段于1989年12月20日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rocville,Marland，保藏号为68191、68192和68193。构建物也基于其它表达系统。参见例如Pouwels等(1985和增刊)Cloning Vectors:ALaboratory Manual Elsevier,N.Y，和Rodriquez等(1988；编辑)Vectors:A Survev of Molecular Cloning Vectors and Their Uses Buttersworth,Boston,MA。可以应用PCR法分离编码IL-10的其它基因，例如多态型(polypmorphic)变异体或物种变异体。
IL-10是具有有效免疫抑制性质的细胞因子。参见例如Mosmann等美国专利5,231,012号，该专利通过引用结合到本文中。IL-10在不同水平上抑制抗原特异性T细胞增殖。IL-10通过向下调节MHCⅡ类分子的表达和共刺激分子ICAM-1和B7.1和B7.2的附着，抑制诸如单核细胞、树突细胞和朗格汉斯细胞的专门的(professional)抗原提呈细胞的抗原提呈和辅助细胞功能(综述载于de Vries和de Waal Malefyt(1995；编辑)Interlrukin 10 Landes Co.,Austin TX)。IL-10也抑制这些细胞产生IL-12,IL-12促进T细胞激活和Th1细胞的分化(D’Andrea等(1993)J.Exp.Med.178:1041；Hsieh等(1993)Science 260:547。另外，IL-10通过抑制IL-2基因转录和这些细胞产生IL-2，直接抑制T细胞的增殖(综述载于de Vries和de Waal Malefyt(1995；编辑)Interlrukin 10 Landes Co.,Austin TX)。
此外，IL-10具有强抗炎特性。它抑制活化的单核细胞/巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞产生前炎性细胞因子TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6和诸如IL-8、MIP-1α和MIP-1β的趋化因子(综述载于de Vries和de Waal Malefyt(1995；编辑)Interleukin 10Landes Co.,Austin TX；Takanashi等(1994)J.Exp.Med.180:711；Arock等(1996)Eur.J.Med.26:166)。另外，IL-10支持巨噬细胞的一氧化氮依赖性的杀菌活性和这些细胞产生前列腺素(Gazzinelli等(1992)J.Immunol.148:1792；Cunha等(1992)Biochem.Biophys.Res.Commun.182:1155；Niiro等(1994)Int.Immunol.6:661。另一方面，它向上调节单核细胞和粒细胞产生IL-1受体拮抗剂(综述载于de Vries和de WaalMalefyt(1995；编辑)Interleukin 10 Landes Co.,Austin TX)。
综合来说，这些数据表明，IL-10可能在治疗不良T细胞激活和T细胞扩增的相关疾病方面具有潜在的临床实用性，所述相关疾病诸如为自身免疫病、器官和骨髓移植排斥、移植物抗宿主病、寄生虫感染(例如肉芽肿)、炎症性疾病(例如节段性回肠炎、结肠炎、胰腺炎、炎症性肺病和眼病)、寄生虫病和变应性疾病，例如哮喘、特应性皮炎和鼻炎。Ⅰ．用于白介素-10的分析IL-10表现出可以形成分析基础和单位(units)的几种生物学活性。参见例如Coligan(1989和期刊增刊；编辑)Current Protocols inImmunology Greene/Wiley,NY．详细地说，IL-10具有抑制T辅助细胞群体中合成IFN-α、淋巴毒素、IL-2、IL-3和GM-CSF中的至少一种细胞因子，其中所述T辅助细胞群体已通过暴露于抗原和抗原提呈细胞(APC)诱导合成一种或多种这些细胞因子。以这种活性处理所述APC，使得它们不能复制，但它们的抗原加工器保持功能。通过在与所述T细胞混合之前，例如用大约1500-3000 R(γ或X辐射)辐射所述APC方便地完成这一点。
或者，在初次或最好是再次混合淋巴细胞反应(MLR)中分析细胞因子的抑制，在这种情况下不需要使用同系APC。MLR是本领域熟知的，例如参见Bradley，第162-166页，载于Mishell等(1980；编辑)Selected Methods in Cellular Immunologv Freeman,San Francisco；和Battisto等(1987)Meth.in Enzymol.150:83-91 Academic Press。简而言之，将两个群体的同种异体淋巴样细胞混合，一个群体在混合之前例如通过辐射处理，以防止增殖。最好是，在例如含有10％胎牛血清的RPMI1640的补加培养基中以大约2×106细胞/ml的浓度制备所述细胞群体。对于对和测试培养物，混合每个群体0.5ml用于该分析。对于再次MLR，在初次MLR中7天后保持的细胞用新鲜制备的辐射刺激细胞再刺激。将怀疑含有IL-10的样品在混合时加入测试培养物，可以分析对照培养物和测试培养物在混合后1-3天的细胞因子的产生。
获得T细胞群体和/或APC群体用于IL-10分析利用本领域熟知的技术，所述技术全面描述于例如DiSabato等(1984；编辑)Meth.inEnzymol.第108卷AcademicPress。用于优选IL-10分析的APC为外周血单核细胞。采用例如以下文献所述的标准方法获得这些外周血单核细胞Boyum(1984)Meth.in Enzymol.108:88-102；Mage(1984)Meth.in Enzymol.108:118-132；Litvin等(1984)Meth.in Enzymol.108:298-302；Stevenson(1984)Meth.in Enzymol.108:242-249；和Romain等(1984)Meth.in Enzymol.108:148-153，这些文献通过引用结合到本文中。最好是，将辅助T细胞用于IL-10分析中，通过首先从外周血分离淋巴细胞，然后采用市售抗CD4抗体，例如美国专利4,381,295号中描述并得自Ortho Pharmaceutical Corp.的OKT4，例如通过淘选或流式细胞仪选择辅助细胞而获得所述辅助T细胞。必需的技术全面公开于Boyum(1968)Scand.J.Clin.Lab.Invest.21(增刊97):77；Meth.inEnzymol.第108卷(以上引用的)和Bram等(1986)Meth.in Enzymol.121:737-748。PBL一般通过Ficoll-Hypaque密度梯度离心从新鲜血获得。
多种抗原可以用于该分析中，例如匙孔_血蓝蛋白(KLH)、禽γ-球蛋白等等。更优选的是，在该分析中用例如美国专利4,361,549号中公开的OKT3的抗CD3单克隆抗体代替抗原刺激辅助T细胞。
通过标准生物学和/或免疫化学测定，测定对照和测试样品中的细胞因子浓度。当可得到纯化的细胞因子时，用于特定细胞因子的免疫化学分析的构成是本领域熟知的，例如Campbell 1984)MonoclonalAntibody Technology Elsevier,Amsterdam；Tijssen(1985)Practice andTheory of Enzyme Immunoassays Elsevier,Amsterdam；和美国专利4,486,530号是大量所述主题文献的实例。用于人IL-2、人IL-3和人GM-CSF的ELISA试剂盒可购自Genzyme Corp.(Boston,MA)；用于人IFN-γ的ELISA试剂盒可购自Endogen.Inc.(Boston,MA)。人淋巴毒素特异性多克隆抗体可购自Genzyme Corp.，它们可以用于人淋巴毒素的放射免疫测定，例如Chard(1982)An Introduction to Radioimmunoassayand Related Techniques Elsevier,Amsterdam。也可参见Coligan等(编辑)Current Protocols in Immunology。
以上所列的细胞因子的生物学测定也可以用来测定IL-10活性。用于人淋巴毒素的生物学测定公开于Aggarwal(1985)Meth.inEnzymol.116:441-447和Matthews等，第221-225页，载于Clemens等(1987；编辑)Lymphokines and Interferons:A Practical Approach IRLPress.Washineton,D.C.。人IL-2和GM-CSF可以用因子依赖性细胞系CTLL-2和KG-1分析，所述细胞系分别得自ATCC，保藏号为TIB 214和CCL246。人IL-3可以通过它刺激软琼脂培养基中种类繁多的造血细胞集落形成的能力来分析，例如按Metcalf(1984)The HemopoieticColony Stimulating Facors Elsevier,Amsterdam中所述进行。IFN-γ可以用抗病毒分析定量，例如Meager，第129-147页，载于Clemens等编辑(以上引用的)。
可以通过如以下文献所述的胞质点杂交测定和分析细胞因子mRNA的产生，所述文献为White等(1982)J.Biol.Chem.257:8569-8572；和Gillespie等的美国专利4,483,920号，这些文献通过引用结合到本文中。其它方法包括采用纯化RNA的斑点印迹，例如Hames等(1985；编辑)Nucleic Acid Hybridization A Practical Approach第6章，IRL Press,Washington,D.C.
在某些情况下，待测试IL-10活性的样品可以进行预处理，以除去可以干扰该测定的预定的细胞因子。例如IL-2增加某些细胞的IFN-γ的产生。因此，根据用于该测定的辅助T细胞，应该从待测试样品中除去IL-2。通过使该样品通过标准抗细胞因子亲和柱常规完成这种去除。
为了方便进行，根据IL-10增加MC/9细胞的IL-4诱导的增殖能力定义IL-10活性单位，所述IL-4诱导的增殖描述于美国专利4,559,310号中并可得自ATCC，保藏号为CRL8306。1单位/ml定义为在以下测定中产生高于IL-4水平的50％最大MC/9增殖刺激的IL-10的浓度。在标准微量滴定板中制备IL-4和IL-10在50μl培养基/孔中的多份稀释液。例如，培养基由RPMI1640、10％胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇、2mM谷酰胺、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/L)组成。加入在培养基中稀释的25μl/孔1600U/ml(终浓度400U/ml)的IL-4，温育过夜，例如温育20-24小时。加入0.5-1.0μCi/孔的3H-胸苷(例如培养基中50μCi/ml)，将细胞再温育过夜，此后收获细胞并测定掺入的放射性活性。Ⅱ．纯化和药用组合物当本发明的多肽以例如转化酵母细胞或哺乳动物细胞分泌产物的可溶形式表达时，可以按照本领域标准方法将其纯化，所述方法包括以下步骤硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤、电泳、亲和层析和/或之类等等，例如“酶的纯化和相关技术”(1977)Methods inEnzymology 22:233-577和Scopes(1982)Protein Purification；Principlesand Practice Springer-Verlag，纽约；提供这种纯化的指南。同样，当本发明的多肽以例如团聚体、内含体等的不溶形式表达时，可以通过本领域的标准方法将其纯化，所述方法包括从破碎的宿主细胞中通过离心分离内含体，用离液剂和还原剂溶解内含体，稀释溶解的混合物，并降低离液剂和还原剂的浓度，以允许多肽呈现生物学活性构象。后面这些方法公开于以下文献中，这些文献通过引用结合到本文中Winkler等(1986)Biochemistry 25:4041-4045；Winker等(1985)Biotechnology 3:992-998；Koths等的美国专利4,569,790；和欧洲专利申请86306917.5和86306353.3。重组方法允许产生或者具有允许纯化的融合产物的蛋白、或者具有也有助于纯化或检测的表位标记的蛋白。可以将特定的工具工程改造到该构建物中，以允许取出外来序列。据信所述IL-10分子的氨基末端对于与其受体结合是重要的，因此通常最好在羧基末端制造融合。
本文所用的“有效量”是指足以提供所需结果的量，所需结果例如为在合适的环境中降低或防止组织排斥。最好是，这种量具有最小的负面副作用。特定患者的有效量可以随诸如以下因素而变化移植组织的状况、类型和量、患者的总体健康状况、给药方法、副作用的严重性等等。一般而言，IL-10以包含有效量IL-10和药用载体的药用组合物给与。药用载体可以是任何相容的、适于将本发明的组合物传递给患者的无毒物质。一般而言，可用于胃肠外给与这类药物的组合物是本领域众所周知的，例如Remington’s Pharmaceutical Science MackPublishing Company,Easton,PA；或Gilman等(编辑)Goodman andGilman’s:The Pharmacological Bases of Therapeutics Permagon Press。或者，可以将本发明的组合物通过可植入或可注射的药物传递系统导入患者体内，例如Urquhart等(1984)Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24:199-236；Lewis(1981；编辑)Controlled Release of Pesticides andPharmaceuticals Plenum Press，纽约；美国专利3,773,919号；美国专利3,270,960号等等。
当胃肠外给药时，最好将IL-10配制为与药用载体结合的单位剂量可注射形式(溶液、悬浮剂、乳剂)。参见例如Avis等(1993；编辑)Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral Medications Dekker,NY；Lieberman等(1990；编辑)Pharmaceutical Dosage Forms；TabletsDekker,NY；和Lieberman等(1990；编辑)Pharmaceutical Dosage Forms:Disperse Systems Dekker,NY。这类载体的实例包括生理盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。也可以使用非水载体，诸如固定油和油酸乙酯。推荐的载体是5％葡萄糖/盐水。该载体可以含有少量添加剂，诸如增加等渗性和化学稳定性的物质，例如缓冲液和防腐剂。最好以大致不含团聚体和其它蛋白的纯化形式，以大约5-20μg/ml的浓度配制IL-10。最好是，通过连续输注给与IL-10，使得每日传递大约50-800μg的量(即大约1-16μg/kg/天)。在监测副作用和血细胞计数的基础上可以变化日输注率。Ⅲ．Tr1细胞本发明也提供抗原特异性无反应性T细胞，它们不能以抗原特异性形式对该抗原的再提呈应答。参见例如Paul(1993；编辑)Fundamental Immunology Raven Press。这种抗原特异性无反应性可以区别于种属耐受，因为许多形式的耐受是由阻断T细胞表面上的T细胞受体信号引起的，因此与该抗原无关。如下所示，这里描述的抗原特异性无反应性看来不影响信号传导的Ca++依赖性信号途径，例如Ras/Raf/Mapk途径，因为仍保持对抗原占用的所述T细胞受体和Ca++流出的反应。此外，该无反应性不需要恒定给与阻断信号传导的早期的药物，例如有效阻断T细胞受体功能必需的药物。该无反应性似乎保持一段时间，例如至少14天、18天、21天、24天等。它可能保持数周、数月和最好是数年。
本文描述的抗原特异性无反应性可以通过提呈IL-10和抗原的组合物来产生。将所述组分提呈给免疫系统或其细胞足够的时间，通常为全部时间，尽管在整段时间内该时期不必需要两个组分。该时期通常至少大约为5天，更通常为至少大约7天，优选至少为大约9-11天，更优选至少为大约13-15天或更长时间。所述IL-10和或抗原的给药可以取决于不同因素，包括例如该抗原、所述时期的时间长短、两个组分是否都存在、所述IL-10是否在提呈抗原之前提呈等等。最好是将两个组分提呈至少大约7天。
以上已描述了IL-10。影响较高IL-10水平的其它方法包括内源IL-10的刺激，包括例如LPS、TNF-α、IL-12、BCG1(卡介菌)、小棒杆菌、poly I-C(激活单核细胞和巨噬细胞的同种佐剂(alloadjuvant))等等。所述IL-10受体的对抗抗体也可以作为激动剂起作用。
存在对其抗原特异性T细胞无反应性可能重要的不同类型的抗原。同种抗原和自身抗原在MHC的情况下提呈。参见例如Paul(编辑)Fundamental Immunology。对其T细胞无反应性可能重要的其它抗原包括可溶抗原，例如可溶性蛋白或不溶性复合物的可溶片段；特殊抗原，例如细菌或寄生虫和变应原。将不同形式的抗原与IL-10一起提呈，以诱导所述抗原特异性抗原。
抗原特异性无反应性涉及可区别于某些其它形式无应答性的机制。这些Tr1(它在提交的优先权专利申请中已经命名为Th3细胞，但它在本文重新命名为Tr1细胞，以区别于Weiner等(1996)Faseb Meeting,New Orleans,Louisiana描述的另一细胞群体A2558)细胞看来是例如CD45+的记忆T细胞，与例如CD45RA+或CD45RO-的原初T细胞相对。详细地说，这种抗原特异性无反应性反映出这些抗原特异性无反应性细胞对随后用特定抗原、通常用IL-2再刺激不能反应。当抗原特异性细胞用IL-2和正常水平的抗原再刺激时，所述细胞不能显著增殖或产生所述细胞因子。然而，含有Tr1细胞的无反应性群体当在随后用抗CD3抗体(大约100ng/ml)提呈刺激时，仅刺激Th0、Th1和Th2T细胞的生长。当以大约1-10μg/ml的较高水平的抗CD3刺激时，这些定义的T辅助亚群细胞产生所述细胞因子的分析是众所周知的。然而，在该水平的刺激下，Tr1细胞似乎不受刺激增殖或产生细胞因子。Tr1细胞用大约100-700μg/ml的抗CD3抗体刺激似乎既增殖，又产生细胞因子。因此，如果混合群体中的所述细胞在孔中被稀释为单个细胞，那么用100-700μg/ml的抗CD3抗体刺激所有的T辅助亚群，这允许按所述方法评价不同亚群Th0、Th1、Th2和Tr1的细胞因子产生分布型。
可以用不同方法定量测定对随后抗CD3抗体例如通过T细胞受体/CD3复合物的一般刺激的应答。如上所述，可以根据生物学活性测定不同的细胞因子。最好是，可以通过不同的下述免疫测定或其它测定，测定累积蛋白的量。或者，可以测定mRNA的产生以建立转录的刺激水平。
通常，在使用抗CD抗体(100-700μg/ml)随后(例如再次或后续)刺激时，在在设定时期分泌蛋白累积后，测量细胞因子。因此，累积的时间在大约1ml体积中最好至少为大约24小时，但可以更长，可以包括其它饲养细胞层等等。
可以用标准方法测定后续刺激后的细胞增殖。通常这包括测定核苷酸的掺入，但也可以包括测定细胞数、细胞体积等等。
尽管某些特征为无反应性的耐受的某些反应是因为阻断所述T细胞受体上的信号发送(参见Weiss和Littman(1994)Cell 76:263-274；Chan等(1994)Ann.Rev.Immunol.12:555-592；和Fraser等Immunol.Today 14:357-362)，但本文所述的无反应性与功能型T细胞受体一起存在。详细地说，用抗CD3刺激导致Ca++流出。但所述抗原特异性T细胞对正常方式的抗原刺激不应答，例如产生细胞因子和/或细胞增殖。
本文提供的无反应性包括或者对IL-2和/或抗原的增殖性应答与非无反应性细胞相比相当低，例如低于大约50％的应答，通常低于大约40％的应答，更通常低于大约30％的应答，优选低于大约20％，更优选低于10％或更低。或者，诱导应答需要的刺激需要IL-2和抗原的量相当大，例如5-50倍，以引出相同的增殖性应答。用抗CD3抗体再刺激集落时，该无反应性也反映在不同细胞因子产生分布型方面。参见下文。
细胞因子产生的测定在用特有抗原再刺激克隆之后，尽管更常见是在用抗CD3(体外大约为10μg/ml或更多)进行种属刺激之后，这似乎通过T细胞受体激活。这种刺激导致细胞增殖性应答减弱相当多和可区别的细胞因子产生分布型。未检测到IL-4和高水平IL-10的产生是再刺激和克隆后细胞因子产生的显著差异之一。参见以下例如表7。如上所指出的，抗CD3抗体的用量也影响该应答。
比较产生的细胞因子的量，注意到在抗CD3(10μg/ml)刺激后，Tr1细胞克隆产生不同于Th0、Th1或Th2克隆的细胞因子分布型。关于IL-2，这些无反应性Tr1细胞克隆产生低于大约30％，最好低于大约10％，通常低于大约2％的Th0或Th1细胞克隆的相应量。对于IL-4，这些无反应性Tr1细胞克隆产生低于大约30％，最好低于大约10％，通常低于大约1％的Th0或Th1细胞克隆的相应量。对于IL-5，这些无反应性Tr1细胞克隆产生大约10-20％的Th0细胞克隆的相应量，大约5-10％的Th2细胞克隆的相应量，大约5-30倍的Th1细胞克隆的相应量。对于IL-10，这些无反应性Tr1细胞克隆产生大约5-50倍的Th0或Th1细胞克隆的相应量，大约5-25倍的Th2细胞的相应量。对于IFN-γ，这些无反应性Tr1细胞产生大约3-20倍的Th2细胞克隆的相应量，与Th0或Th1细胞克隆产生的量相当，在2或3倍之内。对于TNF-α，这些Tr1细胞克隆产生大约2-5倍的Th0或Th2细胞克隆的量，与Th1细胞克隆产生的量相当，在2或3倍之内。所述无反应性Tr1细胞克隆也仅产生低水平的GM-CSF。
也注意到IL-10和抗原的时间可以影响可逆性的程度。尽管用正常量的IL-2或抗CD3抗体(10μg/ml)处理大约7天导致大致不可逆性，但非常高量的IL-2、抗原或抗CD3抗体(例如700μg/ml)倾向于具有更大的或者减弱该无反应性或者逆转该无反应性的能力。
IL-10以剂量依赖性方式抑制初次混合淋巴细胞反应中的同种抗原诱导的增殖性应答。当在所述培养开始时加入IL-10抑制作用是最适的，提示它作用于T细胞激活早期。在抗IL-10mAb存在下所述增殖性应答增强，提示内源产生的IL-10抑制初次MLR中的增殖。观察到IL-10的抑制作用与是否辐射同种异体外周血单核细胞(PBMC)、纯化单核细胞还是B细胞用作刺激细胞无关。用高浓度外源IL-2不使降低的增殖性应答恢复，表明IL-10的该作用与IL-2合成的抑制不相关。此外，IL-10减少初次MLR中IL-2、IFN-γ、IL-6、GM-CSF和TNF-α的产生，而在抗IL-10mAb存在下上述因子的产生增加。在IFN-γ的产生上观察到最强的作用。尽管IL-10降低所述增殖性应答，但在IL-10处理和对照培养物中，CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞之比保持相同。然而，由CD25+和HLA-DR+表达判断的活化CD3+T细胞百分比在IL-10存在下恒定降低。
人IL-10抑制人PBMC中由PHA、抗CD3mAb和IL-2诱导的IFN-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的合成(Bacchetta等(1989)J.Immunol.144:902；和Bevan(1984)Immunol Today 5:128。这种抑制发生在转录水平(Altman等(1989)Nature 338:512；Bacchetta等，见上述)。鼠IL-10(m-IL-10)对不同细胞类型具有多效活性，包括对胸腺细胞(Chen等(1991)J.Immunol.147:528)、细胞毒性T细胞(De Koster等(1989)J.Exp.Med.169:1191)和肥大细胞(de Waal Malefyt等(1991)J.Exp.Med.174:1209)的生长促进作用。m-IL-10诱导在B细胞上Ⅱ类MHC抗原表达和维持这些细胞的生存力(de Waal Malefyt等(1991)J.Exp.Med.174:915)。此外，IL-10抑制巨噬细胞产生细胞因子(Bejarano等(1985)Int.J.Cancer 35:327；Fiorentino等(1989)J.Exp.Med.170:2081)。h-IL-10和m-IL-10与EB病毒(EBV)基因组的可读框BCRF-1具有广泛的同源性(Azuma等(1992)J.Exp.Med.175:353；Bacchetta等(1989)J.Immunol.144:902)。BCRF-1的蛋白产物命名为病毒IL-10(v-IL-10)，与h-IL-10和m-IL-10共享大多数的性质，包括对人和小鼠T细胞的CSIF活性(Bacchetta等，见上述；Bevan,M.J.，见上述)。
人IL-10和v-IL-10通过向下调节Ⅱ类MHC分子降低人单核细胞抗体提呈的能力，来抑制抗原特异性增殖性应答(Figdor等(1984)J.Immunol.Methods 68:68)。而且，IL-10抑制LPS或IFN-γ激活的单核细胞合成细胞因子，包括GM-CSF、G-CSF和促炎细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α(Bejarano等(1985)Int.J.Cancer 35:327；Fiorentino等，见上述)。有趣的是，LPS激活的单核细胞产生高水平的IL-10，并且在抗IL-10mAb存在下观察到细胞因子的产生增加，表明IL-10对单核因子产生的自身调节作用(Bejarano等，见上述)。
同种异体反应性至少部分反映出外源MHC分子加各种来源的抗原肽的识别(Fiorentino等(1991)J.Immunol.146:3444；Fiorentino等(1991)J.Immunol.147:3815；Freedman等(1987)J.Immunol.139:3260；Go等(1990)J.Exp.Med.172:1625)。而且，同种异体反应性T细胞可以识别MHC分子之间、或甚至空MHC分子的构象差异，主要与结合的肽无关(Harding等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:5553；Hsu等(1990)Science 250:830；Julius等(1973)Eur.J.Immunol.3:645)。IL-10抑制同种异体特异性增殖性应答和细胞因子的产生。另外，降低的增殖性应答不能用外源IL-2恢复。
因此，本发明提供通过在IL-10存在下，用供体衍生辐射PBMC刺激宿主衍生CD4+T细胞，产生大量同种抗原特异性Tr1细胞的方法，其中刺激时间例如最小至少为大约3天，优选至少大约5天，更优选至少大约7天，在某些实施方案中为9、11、13、15天或更多天。这些细胞可以在给与移植物(器官或骨髓)之前给与，或与移植物同时给与。所述移植事件和/或治疗可以与或不与IL-10一起给与。
可以扩展以上细胞治疗，以治疗由抗原引起的其它慢性病，所述抗原诸如对于腹腔疾病的治疗为麦醇溶蛋白(例如谷蛋白)，对于慢性变应性疾病(哮喘、特应性皮炎、鼻炎)的治疗为变应原，或对于糖尿病的治疗为GAD(谷氨酸脱羧酶)或胰岛素。
另外，这可以提供对许多其它潜在自身抗原不当的敏感性的治疗。所述细胞或治疗可以提供体内诱导长期耐受和Tr1细胞发育的方法。用IL-10与例如Ⅰ类或Ⅱ类的合适MHC抗原或其它可溶性抗原共提呈长期(例如5-15天)的治疗，可以体内增强无反应性的产生。
本发明也提供一些给与IL-10的方法，以在体内诱导抗原特异性Tr1细胞和长期抗原特异性耐受，以治疗具有不良T细胞激活的疾病，所述疾病例如为移植排斥、移植物抗宿主病、寄生虫病、慢性炎症性疾病，诸如节段性回肠炎、结肠炎、慢性炎症性眼病、慢性炎症性肺病和慢性炎症性肝病。参见例如Frank等(编辑)Samter’s ImmunologicDiseases Little,Brown,Boston,MA。
在其它情况下，给与IL-10在体内诱导自身抗原特异性Tr1细胞和自身抗原特异性耐受以治疗自身免疫病可能是有用的，所述自身免疫病诸如类风湿性关节炎、糖尿病、多发性硬化。
在许多实施方案中，所述IL-10应该通常给与最少5-15天，最好至少大约7天。
如同例如出版物或专利申请的每个单独的参考文献具体和单独地指明通过引用结合到本文中一样，本文引用的所有参考文献均同样通过引用结合到本文中。
实施例以下实施例用来说明本发明。载体和宿主以及试剂浓度、温度、其它可变参数的值的选择仅仅例举本发明应用，要求保护的实施方案不限于本文具体描述的实施方案。
某些标准方法描述于或参见于例如Maniatis等(1982)分子克隆，实验室手册Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborPress；Sambrook等(1989)分子克隆实验室手册(第2版)，第1-3卷，CSH Press,NY；Ausubel等，Biology,Greene Publishing Associates,Brooklyn,NY；或Ausubel等(1987和增刊)分子生物学现行方法Greene/Wiley，纽约；Innis等(编辑；1990)PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications Academic Press，纽约。蛋白纯化的方法包括诸如硫酸铵沉淀、柱层析、电泳、离心、结晶和其它方法。参见例如Ausubel等(1987和期刊增刊)；Deutscher(1990)“蛋白纯化指南”，载于Methodsin Enzymology第182卷和该系列的其它卷；厂商对于蛋白纯化产品用法的资料，例如Pharmacia,Piscataway,N.J.，或Bio-Rad,Richmond,CA。与重组技术结合允许与合适的区段融合，例如与FLAG序列或可以通过蛋白酶可去除序列融合的等价物融合。参见例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 12:69-70；Hochuli(1990)“用金属螯合吸附剂纯化重组蛋白”，载于Setlow(编辑)Genetic Engineering,Principle and Methods 12:37-98,Plenum Press，纽约；和Crowe等(1992)QIAexpress:The High Level Expression & Protein Purification SystemQIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA。
采用标准方法，在Becton-Dickinson FACStar PLUS上进行荧光激活细胞细胞分选。参见例如Shapiro(1988)Practical Flow Cytometry(第2版)Alan Liss，纽约。实施例Ⅰ．人CSIF在细菌宿主中的表达从多个化学合成的双链DNA片段装配合成人CSIF基因，以形成命名为TAC-RBS-hCSIF的表达载体。在标准细菌系统中进行克隆和表达，所述标准细菌系统例如为大肠杆菌K-12株JM101、JM103等等，描述于Vieira和Messing(1982)Gene 19:259-268。采用例如Maniatis等(1982)(分子克隆实验室手册冷泉港实验室，纽约)的标准方案，进行限制性核酸内切酶消化和连接酶反应。也参见Ausubel(1987和期刊增刊；编辑)分子生物学现行方法Greene/Wiley，纽约；Sambrook等(1989)分子克隆实验室手册第2版，冷泉港实验室，纽约。
使用用于小规模质粒制备的碱法(Maniatis等，见上述)。对于大规模制备，使用碱法的修改方法，其中使用等体积异丙醇从透明的裂解液中沉淀核酸。在氯化铯平衡密度离心和用溴化乙锭检测之前，用冷2.5M醋酸铵沉淀用来除去RNA。
对于滤膜杂交，使用Whatman 540圆形滤膜(filter circle)lift菌落，然后将其裂解，通过用0.5M NaOH、1.5M NaCl；1M Tris HCl pH8.0、1.5M NaCl(每次2分钟)连续处理固定；于80℃加热(3分钟)。使用32P-标记的(激酶处理的(kinased))合成DNA，在6×SSPE、20％甲酰胺、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)、100μg/ml大肠杆菌tRNA中，于42℃杂交6小时。通过将174g NaCl、27.6g NaH2PO49H2O和7.4g EDTA溶于800ml H2O中，用NaOH将pH调至7.4，将体积调至1升，通过高压灭菌灭菌，制备20×SSPE)。滤膜用1×SSPE、0.1％SDS洗涤2次(15分钟，室温)。放射自显影(Fuji RX胶片)后，通过将再生长的菌落与滤膜上的染蓝色的菌落对齐，将阳性菌落定位。通过Sanger等(1977)的双脱氧法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74:5463)将DNA测序。双脱氧反应的模板或者为再克隆入M13mp载体(例如Messing等(1981)Nucleic Acids Res.9:309)相关区的单链DNA，或者为双链DNA，所述DNA通过微量碱法制备，用0.2M NaOH变性(5分钟，室温)，并通过加入2倍体积的乙醇从0.2M NaOH、1.43M醋酸铵沉淀。采用Applied Biosystems 380A合成仪，通过亚磷酰胺化学合成DNA。例如按Aplied Biosystens 380A合成仪手册中的所述步骤，进行合成、去保护、切割和纯化(7M尿素PAGE、洗脱、DEAE-纤维素层析)。
混合待克隆的合成DNA的互补链(各400ng)，并在50μl的反应体积中用多核苷酸激酶磷酸化。将该DNA与用合适的限制酶消化的1μg载体DNA连接，于室温在50μl的体积中连接4-12小时。已经描述了磷酸化、限制酶消化、聚合酶反应和连接的条件(Maniatis等，上述引用的)。通过在补加氨苄青霉素、异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(0.4mM)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)(40mg/ml)的L琼脂上铺平板，记录lacZ+菌落(需要时)。
通过用DNA聚合酶补平含tacP质粒pDR540(Pharmacia)的单一BamHⅠ位点，构建TAC-RBS载体。然后将其与未磷酸化的合成寡核苷酸(Pharmacia)连接，形成编码共有核糖体结合位点(RBS)GTAAGGAGGTTTAAC(SEQ ID NO:5)的双链片段。连接后，将该混合物磷酸化，再与SstⅠ接头ATGAGCTCAT(SEQ ID NO:6)连接。然后该复合物用SstⅠ和EcorⅠ切割，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离173bp的片段，如下将其克隆到EcoRⅠ-SstⅠ限制的pUC19(Pharmacia)中。最后构建物(称为TAC-RBS)的RBS-ATG-多接头区的序列示于图2。
将合成IL-10基因以8个步骤装配到pUC19质粒中。在每一步骤，在通过将pUC19的lacZ(a)基因与步骤1插入的ATG起始密码子保持在框架内进行克隆后，检测不含缺失和/或插入的插入片段。通过记录含X-gal和IPTG的L-氨苄青霉素平板上蓝色菌落，消除含有缺失和/或插入改变的克隆。或者，在每一步骤，可以采用通用测序引物，在例如可购自Boehringer Mannheim的小规模质粒DNA制剂上，容易地证实插入片段的序列。
在步骤1中，TAC-RBS载体用SstⅠ消化，用T4聚合酶(其3’核酸外切酶活性消化SstⅠ切口的突出链，形成平端片段)处理，在失活T4DNA聚合酶后，用EcoRⅠ处理，形成173碱基对(bp)的片段，该片段含有TAC-RBS区，在ATG起始密码子处具有平端，在相反端具有EcoRⅠ切口。最后，分离所述173bp TAC-RBS片段。
在步骤2中，将步骤1的分离TAC-RBS片段与EcoRⅠ/KpnⅠ消化的质粒pUC19、合成的片段1A/B混合，合成片段1A/B如下所示，在其上游端为平端，在其下游端为对应于KpnⅠ切口的交错端。该KpnⅠ端与BstEⅡ位点相邻并在其下游。将所述连接，形成步骤2的pUC19。
在步骤3中，将合成的片段2A/B和3A/B(下面所示)与BstEⅡ/SmaⅠ消化的步骤2的pUC19(在扩增和纯化后)混合并连接，形成步骤3的pUC19。请注意，片段3A/B的下游端含有形成SmaⅠ平端的额外碱基。在步骤4中切割这些额外的碱基。此外，片段2A/B和3A/B具有9个残基互补的单链端，它们混合时退火，留下2A/B的上游BstEⅡ切口和3A/B的下游平端，以与所述pUC19连接。
在步骤4中，再纯化AflⅡ/XbaⅠ消化的步骤3的pUC(扩增和纯化后)，将其与合成片段4A/B(下面所示)混合并连接，形成步骤4的pUC19。
在步骤5中，将XbaⅠ/SaⅠ消化的步骤4的pUC19(扩增和纯化后)与合成片段5A/B(下面所示)混合并连接，形成步骤5的pUC19。请注意，在步骤6中，通过用HpaⅠ消化消除片段5A/B的SalⅠ交错端。
在步骤6中，将HpaⅠ/PstⅠ消化的步骤5的pUC19(扩增和纯化后)与合成6A/B(下面所示)混合并连接，形成步骤6的pUCl9。
在步骤7中，将ClaⅠ/SphⅠ消化的步骤6的pUC19(扩增和纯化后)与合成片段7A/B(下面所示)混合并连接，形成步骤7的pUC19。
在步骤8中，将MluⅠ/HindⅢ消化的步骤7的pUC19(扩增和纯化后)与合成片段8A/B和9A/B混合并连接，形成最后的构建物。用标准技术，将最后的构建物插入例如可得自ATCC保藏号33876的大肠杆菌K-12 JM101菌株中。培养后，从JM101细胞中提取蛋白，并测试提取物稀释液的生物学活性。AGCCCAGGCC AGGGCACCCA GTCTGAGAAC AGCTGCACCC ACTTCCCAGG-TCGGGTCCGG TCCCGTGGGT CAGACTCTTG TCGACGTGGG TGAAGGGTCC-tAACCggtac (SEQ ID NO:7)aTTGGc (SEQ ID NO:8)片段1A/BGtAACCTGCC TAACATGCTT CGAGATCTCC GAGATGCCTT CAGCAGAGTG-GACGG ATTGTACGAA GCTCTAGAGG CTCTACGGAA GTCGTCTCAC-AAGACTTTCTTT (SEQ ID NO:9)TTC (SEQ ID NO:10)片段2A/BCAAATGAAGG ATCAGCTGGA CAACTTGTTc TtAAG (SEQ ID NO:11)TGAAAGAAA GTTTACTTCC TAGTCGACCT GTTGAACAAg AaTTC (SEQ ID NO:12)片段3A/BGAGTCCTTGC TGGAGGACTT TAAGGGTTAC CTGGGTTGCC AAGCCTTGTC TGAGATGATC-CTCAGGAACG ACCTCCTGAA ATTCCCAATG GACCCAACGG TTCGGAACAG ACTCTACTAG-CAGTTTTAt (SEQ ID NO:13)GTCAAAATaG AtC (SEQ ID NO:14)片段4A/BCTaGAGGAGG TGATGCCCCA AGCTGAGAAC CAAGACCCAG ACATCAAGGC-GAtCTCCTCC ACTACGGGGT TCGACTCTTG GTTCTGGGTC TGTAGTTCCG-GCATGTtAAC g (SEQ ID NO:15)CGTACAaTTG cagct (SEQ ID NO:16)片段5A/BAACTCCCTGG GGGAGAACCT GAAGACCCTC AGGCTGAGGC TACGGCGCTG-TTGAGGGACC CCCTCTTGGA CTTCTGGGAG TCCGACTCCG ATGCCGCGAC-TCATCGATct gca (SEQ ID NO:17)AGTAGCTAg (SEQ ID NO:18)片段6A/BCGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGAAGAA-TAAAGAAG GGACAGTTTT GTTCTCGTTC CGGCACCTCG TCCACTTCTT-cGCgTgcatg (EEQ ID NO:19)gCGcAc (SEQ ID NO:20)片段7A/BCGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCAT-AAATTA TTATTCGAGG TTCTGTTTCC GTAGATGTTT CGGTA-GAGTGAGTTT GAC (SEQ ID NO:21)CTCA (SEQ ID NO:22)片段8A/B
ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAATGAAGA-CTCAAACTG TAGAAGTAGT TGATGTATCT TCGGATGTAC TGTTA CTTCT-TACGAAACTG A (SEQ ID NO:23)ATGCTTTGAC TAcga (SEQ ID NO:24)片段9A/B(小写字母表示不同于同一位置上天然序列的碱基。)实施例2．vIL-10在COS7猴细胞中的表达使用允许后面将扩增片段插入EcoRⅠ消化的pcD(SRα)载体(图1)的引物，通过聚合酶链式反应扩增编码vIL-10可读框的基因。所述插入片段的编码链示于以下(以大写字母给出所述可读框)。aattcATGGA GCGAAGGTTA GTGGTCACTC TGCAGTGCCT GGTGCTGCTTTACCTGGCAC CTGAGTGTGG AGGTACAGAC CAATGTGACA ATTTTCCCCAGACCTAAGAG ATGCCTTCAG TCGTGTTAAA ACCTTTTTCC AGACAAAGGACGAGGTAGAT AACCTTTTGC TCAAGGAGTC TCTGCTAGAG GACTTTAAGGATGCCAGGCC CTGTCAGAAA TGATCCAATT CTACCTGGAG GAAGTCATGCCACAGGCTGA AACCAGGACC CTGAAGCCAA AGACCATGTC AATTCTTTGGGTGAAAATCT AAAGACCCTA CGGCTCCGCC TGCGCAGGTG CCACAGGTTCCTGCCGTGTG AGAACAAGAG TAAAGCTGTG GAACAGATAA AAAATGCCTTTAACAAGCTG CAGGAAAAAG GAATTTACAA AGCCATGAGT GAATTTGACATTTTTATTAA CTACATAGAA GCATACATGA CAATTAAAGC CAGGTGAg(SEQ ID NO:25)通过vIL-10的表达和/或限制性消化的电泳图案，鉴定携带合适方向的所述插入片段的克隆。携带vIL-10基因的一个这种载体命名为pBCRF1(SRα)，并于1989年12月20日保藏于ATCC，保藏号为68193。PBCRF1(SRα)在大肠杆菌MC1061中扩增，通过标准技术分离，并如下用于转染COS7猴细胞在转染前1天，将大约1.5×106COS7猴细胞接种到各个100mm平板上的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DME)中，该培养基含有5％胎牛血清(FCS)和2mM谷酰胺。为了进行转染，通过与胰蛋白酶温育，从平皿取出COS7细胞，在无血清DME中洗涤2次并在无血清DME中悬浮为107细胞/ml。将0.75ml等份与20μgDNA混合，并转移到无菌0.4cm电穿孔杯中。10分钟后，在BioRad基因脉冲发生器装置中，以200伏、96μF对细胞施加脉冲。再过10分钟后，从该杯中取出细胞，并加入含有5％FCS、2mM谷酰胺、青霉素、链霉素和庆大霉素的20ml DME中。将该混合物等份分装到4个100mm组织培养皿中。于37℃、5％CO2下12-24小时后，所述培养基用仅含1％FCS的相似培养基替换，于37℃、5％CO2下再继续温育72小时，此后收集培养基，分析它抑制IFN-γ合成的能力。
于37℃下，将10ml等份的新鲜分离的PBL(大约2×106细胞/ml)与PHA(100ng/ml)在培养基中温育，所述培养基包含(ⅰ)补加5％FCS和2mM谷酰胺的90％DME，和(ⅱ)来自先前用pBCRF1(SRα)转染的COS7细胞的10％上清液。24小时后，收获细胞和上清液，分别分析或者IFN-γ mRNA或者IFN-γ蛋白的存在。同样处理对照，只是10％的上清液来自先前用携带不相关cDNA插入片段的质粒转染的COS7培养物。vIL-10处理的样品相对于对照，表现出约50％抑制IFN-γ的合成。实施例3.vIL-10在大肠杆菌胞中的表达在大肠杆菌中表达编码示于SEQ ID NO:4的成熟vIL-10的基因。
将pBCRF1(SRα)的cDNA插入片段再克隆到M13质粒，这里它通过定点诱变改变2次首先在成熟vIL-10多肽编码区的5’端形成ClaⅠ位点，第二，在成熟vIL-10多肽编码区的3’端形成BamHⅠ位点。然后将突变序列容易地插入下述TRPC11表达载体中。
通过将合成共有RBS片段连接的ClaⅠ接头(ATGCAT)上，并将产生的片段克隆到ClaⅠ限制pMT11hc(它先前已经修饰以含有该ClaⅠ位点)中，构建TRPC11载体。PMT11hc是pBR322的小的(2.3千碱基对)高拷贝AMPR、TETS衍生物，它带有πVX质粒EcoRⅠ-HindⅢ多接头区。(μVX描述于Maniatis等(1982)分子克隆实验室手册冷泉港实验室)。这通过用EcoRⅠ和BamHⅠ限制pMT11hc，补平产生的粘性末端并与ClaⅠ接头(CATCGATG)连接，修饰为含有该ClaⅠ位点，由此恢复EcoRⅠ和BamHⅠ位点并用ClaⅠ位点取代SmaⅠ位点。来自TRPC11构建物的一个转化体具有侧翼为ClaⅠ位点的串联RBS序列。通过用PstⅠ消化该质粒，用Bal31核酸酶处理，用EcoRⅠ限制并在所有四种脱氧核苷三磷酸存在下用T4DNA聚合酶处理，除去其中一个ClaⅠ位点和所述RBS序列第二个拷贝的部分。通过PAGE并克隆到SmaⅠ限制的pUC12中，回收产生的30-40bp片段。然后将得自pKC101(描述于Nichols等(1983)Mehods in Enzymology 101:155 Academic Press，纽约)的248bp含大肠杆菌trpP的EcoRⅠ片段克隆到所述EcoRⅠ位点中，完成TRPC11的构建物，该构建物描述于图2。通过首先用ClaⅠ和BamHⅠ消化TRPC11，将其纯化，然后在标准连接溶液中将其与含成熟BCRF1编码核苷酸序列的M13的ClaⅠ-BamHⅠ片段混合，将TRPC11用作vIL-10的载体。含有插入片段的TRPC11称为TRPC11-BCRF1，将其在例如可得自ATCC保藏号33876的大肠杆菌K12JM101株中繁殖。实施例4．IL-10对初次MLR中产生同种异体反应性的影响在补加10％合并的热灭活人AB血清的Yssel氏培养基(Koulova等(1991)J.Exp.Med.173:759)中培养细胞。
产生抗v-IL-10的中和抗IL-10mAb 19F1，有效地中和h-IL-10和v-IL-10(Bejarano等(1985)Int.J.Cancer 35:327)。识别IL-2Rp55链的BB10 mAb为J.Wijdenes博士(CRTS,Bensancon，法国)的友好赠品。鼠抗CD3(抗Leu-4,IgG1)、抗CD4(抗Leu-3a,IgG1)、抗CD8(抗Leu-2a,IgG2a)、抗CD14(抗Leu-M3,IgG2b)、抗CD19(抗Leu-12,IgG1)、抗CD25(抗IL2R p55,IgG1)、抗CD56(抗Leu-19,IgG1)、抗HLA-DR(克隆L243,IgG2a)mAb和合适同种型对照mAb均得自Becton Dickinson(Mountain View,CA)。
血沉棕黄层制剂得自斯坦福大学医院的血库(blood bank)。通过在Ficoll-hypaque(Pharmacia,Uppsala，瑞典)上进行密度梯度离心分离PBMC。
为了纯化T细胞，通过塑料粘附和采用Linsley等(1991)(J.Exp.Med.173:721)的方法的铁吞噬作用，除去PBMC的单核细胞。使非粘附细胞通过描述于MacNeil等(1990)J.Immunol.145:4167)的尼龙棉(nylon Wool)。此后，通过用磁珠排除，除去NK细胞。简而言之，在用饱和浓度的抗CD56 mAb于4℃染色30分钟后，用Hank氏溶液平衡盐溶液(HBBS)洗涤2次，随后用包被羊抗鼠IgG的磁珠(DynabeadsM-450羊抗鼠IgG,Dynal AS,Oslo，挪威)，以40:1的磁珠与细胞之比形成花结(rosette)。在按照厂商的建议用磁性颗粒浓缩物除去花结细胞之前，该混合物于4℃温育30分钟，同时轻轻摇动。产生的细胞制剂＞99％CD3+、＜1％CD14+、＜1％CD19+、＜1％CD56+。
为了分离CD14+单核细胞，PBMC用PE缀合的CD14 mAb(Becton-Dickinson,Mountain View,CA)染色，在HBSS中洗涤2次，此后用FACStar-Plus(Becton-Dickinson,Sunnyvale,CA)分选为CD14+和CD14-群体。分选群体的再分析表明，高于99.5％的纯化细胞为CD14+。在某些实验中，通过在血成分分离器中的密度离心，然后按Moore等(1990)(Science 248:1230)详细描述的，通过离心淘汰，从外周血分离单核细胞。通过非特异性酯酶染色判断，这些单核细胞制剂的纯度为95％。
通过磁珠排除获得纯化的B淋巴细胞。非粘附PBMC与饱和浓度的抗CD3、CD4、CD8、CD14和CD56 mAb于4℃温育30分钟。将细胞在HBSS中洗涤2次，此后用包被羊抗鼠IgG(Dynal,AS,Oslo,挪威)以40:1的磁珠与细胞之比形成花结。随后，按上述除去花结细胞。产生的群体由＞98％的CD19+细胞组成。
关于增殖测定，用不同辐射(400rad)同种刺激细胞刺激PBMC或高度纯化的T细胞(1×105细胞/孔)。通过离心淘汰分离PBMC、CD14+、单核细胞，或用纯化的B淋巴细胞分别以1:1、5:1、5:1和3:1的R:S比用作刺激细胞。在96孔平底微量滴定板中，在缺乏或存在IL-10的情况下，在200μl培养基中以三份进行培养。
在5天培养时期的最后10小时，用[3H]TdR对培养物施加脉冲，在玻璃纤维滤膜上收获细胞，通过液闪计数测定放射性活性。结果以[3H]TdR掺入的cpm表示，代表多份培养物的平均值。
关于大量培养，在50ml烧瓶中，在存在或缺乏100U/ml IL-10的情况下，PBMC或高度纯化的T细胞与辐射同种细胞以上述R:S比一起培养，浓度为1×106效应细胞/ml。5-6天后，收集上清液，冷冻于-20℃，用于测定其细胞因子含量，而回收细胞用于表型分析。
关于荧光测定，从大量培养物中回收的细胞(105)在V形底微量滴定板(Flow Laboratories，城市，州)与10μl纯化的PE缀合的mAb于4℃温育30分钟。在双标记实验中，在FITC标记之后，细胞在1％正常鼠血清中洗涤2次，加入PE缀合的mAb。细胞用含有1％BSA和0.02M NaN3的HBSS洗涤2次，此后在FACScan上分析。
关于细胞因子的测定，按Ohlen等(1990)(J.Immunol.145:52)的描述，通过淋巴因子特异性ELISA分析在第5天或第6天从大量培养物收集的上清液检测其GM-CSF、IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4、IL-5和IL-6的含量。关于IL-2产生的定量，在10μg/ml抗IL-2受体抗体BB10存在下进行培养，以便最大限度地减少IL-2消耗。72小时后收获上清液，通过特异性ELISA测定IL-2水平。不同ELISA的灵敏度为对于IL-4为40pg/ml；对于IL-2、IL-5和IL-6为20pg/ml；对于GM-CSF为50pg/ml；对于TNF-α和IFN-γ为100pg/ml。
为测定IL-10对典型的单向初次MLR中的增殖性应答的影响，在缺乏或存在不同浓度的IL-10的情况下，用辐射同种PBMC刺激PBMC。在图3中，表明IL-10以剂量依赖性方式抑制增殖性应答。
如图3所示，PBMC(1×105细胞/孔)和同种辐射PBMC(1×105/孔)(PBMC供体A×辐射PBMC供体B(A):PBMC供体B×辐射PBMC供体A(B))在增加浓度的IL-10(空心条带)和抗IL-10mAb(实心条带)存在下培养5天。在缺乏(实心条带)或存在(影线条带)100U/ml IL-10以及增加浓度的抗IL-10mAb的情况下进行MLR。
在低达1U/ml的IL-10浓度下，已观察到对增殖的显著抑制作用，而在100U/ml的IL-10浓度下获得最大抑制效果(在不同实验中范围为33-95％的抑制)。抗IL-10mAb完全中和IL-10对PBMC增殖的这些抑制作用，表明抑制是特异性的(图3C)。在中和抗IL-10mAb存在下进行的MLR中的增殖性应答显著增强，表明外源产生的IL-10在初次MLC\R中导致抑制增殖性应答。
最近，证明IL-10通过向下调节Ⅱ类MHC抗原强烈地降低单核细胞的抗原(Ag)提呈(AP)能力。相反，EBV转化的B细胞(EBV-LCL)的Ⅱ类MHC的表达和AP能力不受IL-10的影响(Figdor等(1984)J.Immunol.Methods 68:68)。因此，研究IL-10在MLR中的抑制作用是否仅在单核细胞存在时观察到。为此，通过负选择获得的高度富集的T细胞用作效应细胞。或者通过离心淘汰或者通过从PBMC直接分选CD14+细胞富集的纯化单核细胞群体、纯化B淋巴细胞和EBV-LCL用作刺激细胞。
图4A-4D显示IL-10对用不同同种异体细胞刺激的纯化T细胞的增殖性应答的影响。纯化T细胞(1×105/孔)与同种辐射淘汰的单核细胞(2×104/孔)(图4A)、阳性分选(positively sorted)CD14+单核细胞(2×104/孔)(图4B)、纯化B细胞(3.3×104/孔)(图4C)、EVC-LCL(1×104/孔)(图4D)在增加浓度的IL-10存在下培养5天正如图4A-4D中可以看出的，Il-10强烈抑制同种单核细胞诱导的增殖性应答，与所述单核细胞是通过离心淘汰(图4A)获得的还是通过FACS阳性分选的(图4B)无关，而对同种EBV-LCL的增殖性应答保持不受影响(图4D)。正如用对可溶性抗原的特异性增殖性应答观察到的，这些结果表明，当同种异体单核细胞而不是同种异体EBV-LCL用作刺激细胞时，阻断同种异体特异性增殖。有趣的是，新鲜分离的高度纯化的同种B细胞诱导的增殖性应答也被IL-10抑制(图4C)，表明当B细胞用作刺激物时，也存在IL-10的抑制作用，尽管IL-10对这些细胞上的Ⅰ类或Ⅱ类MHC表达的作用检测不到。
动力学实验揭示，IL-10对MLR诱导的增殖的影响随时间逐渐减小。这些结果示于图5，其中PBMC(1×105/孔)和同种辐射PBMC(1×105/孔)一起培养5天，在指定时间加入增加浓度的IL-10。IL-10当在初次培养开始时加入时，是最有效的如果开始培养后在第2天或第3天加入，所述作用仅仅是临界的，并且没有观察到清楚的剂量反应作用。这些结果表明，IL-10在MLR中作用于T细胞激活的早期。实施例5．IL-10对MLR中细胞因子产生的作用已经表明IL-10降低抗CD3或PHA激活的PBMC的IFN-γ和GM-CSF的产生(Bacchetta等(1989)J.Immunol.144:902；Bevan(1984)见上述)。另外，IL-10抑制单核细胞产生细胞因子(Bejarano等(1985)Int.J.Cancer 35:327；Fiorentino等，见上述)。为测定IL-10在单向MLR中对细胞因子产生的作用，将同种PBMC用作效应细胞和刺激细胞。人PBMC单独培养5天，或在缺乏和存在IL-10或抗IL-10mAb 19F1的情况下与同种辐射PBMC一起培养。第5天时收集上清液，分析其细胞因子含量。通过细胞因子特异性ELISA，在上清液中测定细胞因子的产生。表1表明外源和内源IL-10对同种抗原刺激的淋巴细胞产生细胞因子的作用。
表1
在表1中，表明在MLR中产生IFN-γ、IL-6、GM-CSF和TNB-α,IL-10在不同程度上抑制这些细胞因子的产生。
没有检测到显著的IL-4的产生，IL-5的水平低于100pg/ml。在不同实验中，IL-10产生的范围为1000-3000pg/ml。观察到外源IL-10对IFN-γ产生的这些强烈抑制作用，而观察到对IL-6产生的抑制作用最弱。
如表Ⅰ所示，在抗IL-10mAb存在下进行的MLR的上清液中观察到增加的IFN-γ、GM-CSF和TNF-α水平。抗IL-10mAb对细胞因子产生的这些增强作用是剂量依赖性的。综合这些结果表明，内源和外源IL-10减少测试的细胞因子的产生。为评价IL-10对MLR中IL-2产生的作用和减少激活T细胞的IL-2消耗，在存在或缺乏IL-10和抗IL-2受体mAb BB10的情况下进行培养。在这些实验中，IL-10以剂量依赖性方式防止IL-2产生(图6)。当加入100U/ml的IL-10时，不能检测到可测定水平的IL-2。在图6中，PBMC(1×105/孔)和同种异体辐射PBMC(1×105/孔)与增加浓度的IL-10在存在或缺乏10μg/ml抗IL-2 R抗体BB10的情况下培养。3天后收获上清液，通过细胞因子特异性ELISA分析IL-2含量。
为研究IL-10的抑制作用是否在外源IL-2存在下观察到，用不同浓度的IL-2进行MLR。在图7A-7B中，显示外源IL-2对IL-10诱导降低的T细胞同种抗原诱导增殖应答的作用。在缺乏(空心符号)或存在(实心符号)100U/ml IL-10的情况下，用同种辐射PBMC(105/孔)(图7A)或纯化B细胞(3.3×104/孔)(图7B)刺激的纯化T细胞(105/孔)与增加量的IL-2一起培养。这些表明，将增加量的IL-2加入纯化T细胞用作效应物而PBMC或纯化B细胞用作刺激物的MLR中，在缺乏和存在IL-10的情况下均增强增殖。然而，当IL-2以高至100U/ml[10U/ml足以饱和高亲和力IL-2受体(IL-2R)]的浓度加入时，仍存在IL-10的抑制作用。同样，加入400U/ml具有T细胞生长因子活性的IL-4(Panina-Bordignon等(1991)Science 252:1548)不能恢复IL-10降低的增殖性应答。综合来看，这些结果证明，IL-2的缺乏不是产生在IL-10存在下进行MLR时观察到的降低的增殖性应答的限制性因素。实施例6．IL-10对MLR中激活T细胞繁殖的作用为确定在IL-10存在下MLR中降低的增殖性应答是影响CD4+还是影响CD8+T细胞亚群，在缺乏或存在IL-10(100U/ml)的情况下将纯化T细胞与同种辐射PBMC、纯化B细胞或单核细胞一起培养。6天后，计数回收的T细胞，通过间接免疫荧光测定表型。确定CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞的比例。表2表明IL-10对同种抗原刺激的T细胞的作用。
表2T细胞计数 阳性细胞％
实验1T+PBMC 1.3.7669732124 4 2 3 2T+B细胞 1.2.7255622828241819 8实验2T+PBMC 1.41.0NDbNDNDND392736. 32T+B细胞 .90.68NDNDNDND20 818 4T+单核细胞a1.2.40NDNDNDND52244325实验3T+PBMC 1.02 .3777781816161315 9T+单核细胞c.50.17767919167 4 8 5a阴性分选的单核细胞bND=未做c阳性分选的单核细胞(CD14+)在表2中，显示当用同种PBMC、纯化单核细胞或B细胞在IL-10存在下刺激所述T细胞时，总T细胞数降低30-60％。然而，CD4+和CD8+细胞的比例保持相同，表明IL-10对这些T细胞亚群的每一种没有优先作用。
相反，在含IL-10的培养物中，表达CD25抗原的激活T细胞和HLA-DR抗原的激活T细胞的质粒恒定下降。通常在用纯化B细胞或单核细胞刺激纯化CD3+T细胞的MLR中，观察到最强的降低。
因此，在两个不同供体的同种异体PBMC分别用作效应细胞和辐射刺激细胞的典型单向初次MLR中，IL-10以剂量依赖性方式降低同种异体反应性T细胞的增殖。用抗IL-10mAb完全中和这些抑制作用，表明该抑制的特异性。在抗IL-10mAb存在下增殖性应答显著增强，表明内源IL-10的产生引起抑制MLR中的增殖性应答。
在高度纯化的T细胞用作效应物、而纯化的单核细胞用作刺激物的MLR中，IL-10也降低所述增殖性应答。有趣的是，当用辐射同种EBV-LCL刺激纯化T细胞时，IL-10是无效的。当单核细胞而不是EBV-LCL用作APC时，IL-10强烈阻断T细胞或T细胞克隆对可溶性抗原或抗原肽的特异性增殖性应答。发现这种降低的抗原提呈能力与IL-10对单核细胞上Ⅱ类MHC表达的向下调节作用有关(Figdor等(1984)J Immunol.Methods 68:68)。从这些数据总结出降低的抗原特异性增殖性T细胞应答反映出阻止效应细胞的激活，而不是对T细胞增殖的直接抑制作用。在IL-10存在下激活的效应T细胞克隆中Ca2+流出减少(Figdor等(1984)J.Immunol.Methods 68:68)，进一步支持该结论。
有趣的是，MLR诱导的增殖不仅当单核细胞用作刺激物时受IL-10抑制，而且当纯化B细胞用作刺激物时也受IL-10抑制。几个研究已经表明，MHC同种抗原的T细胞识别的机制与识别病毒、细菌或其它外源蛋白抗原的机制相似(Fiorentino等(1991)J.Immunol.146:3444；Fiorentino等(1991)J.Immunol.147:3815；Freedman等(1987)J.Immunol.139:3260；Go等(1990)J.Exp.Med.712:1625)。最近已经表明，显著比例的MHC Ⅱ类同种异体反应性T细胞克隆识别加工的与同种Ⅱ类分子相关的人血清蛋白的决定簇(Fiorentino等(1991)J.Immunol.147:3815)。与必须形成新MHC肽复合物以激活抗原特异性T细胞克隆的情况(R_tzchke等(1991)J.Exp.Med.174:1059)相反，没有证据表明，必须在单核细胞或B细胞上形成新同种异体MHC-肽复合物，以刺激MLR中的T细胞。IL-10对MLR诱导的T细胞增殖的抑制作用，不可能仅仅归因于单核细胞上MHCⅡ类表达的向下调节。
已经证明，除了用特异性同种抗原交联TCR/CD3复合物外，同种异体特异性T细胞产生细胞因子需要LFA-1-ICAM-1的相互作用(Santos-Aguado等(1989)Proc Natl.Acad.Sci.USA 86:8936)。此外，已经表明CD28-B7/BB1的相互作用是诱导静息T细胞同种抗原特异性激活必需的，导致细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性(Spits等(1987)J.Immunol.139:1143；Thompson-Snipes等(1991)J.Exp.Med.173:507；Vieira等(1991)Proc Natl.Acad.Sci.USA 88:1171)。B7在静息B细胞和单核细胞上表达弱，但在这些细胞激活后表达提高。Hokochi等(1982)J.Immunol.128:823；Yssel等(1986)Eur.J.Immunol.16:1187)。然而，可以排除的是降低的增殖性同种异体反应和细胞毒性同种异体反应由于IL-10向下调节或者TCR/CD3或者这些辅助分子表达引起的。
对同种抗原的增殖性诱应答降低反映出阻止效应T细胞的激活。IL-10必须从培养开始时存在，以施加其最大抑制作用。另外，通过CD25和HLA-DR抗原的表达判断，与对照MLR相比，激活T细胞的比例在含IL-10的培养物中低得多。尽管在IL-10存在下进行的MLR中产生的CD3+T细胞总数降低，但IL-10不优先影响CD4+或CD8+T细胞的应答，因为这些T细胞亚群的比例与在IL-10缺乏下进行的对照MLR中的比例相当。CD25表达降低表明，对MLR中T细胞增殖的抑制作用不仅仅是IL-10细胞因子抑制活性的结果。以下发现支持这一点当以足以饱和高亲和性IL-2受体的浓度加入外源IL-2时，IL-10也降低增殖性应答。综合来说，这些数据提示IL-10降低MLR中PBMC、单核细胞和正常B细胞的刺激能力。
在外源IL-10存在下，在使用总同种异体PBMC作为效应物和刺激物的MLR中产生的细胞因子水平也显著降低。IL-2、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的量比缺乏IL-10时进行的对照MLR中的量低大约2-3倍。对IL-6产生的影响相当低，这可能是因为以下事实存在于这些培养物中的单核细胞在激活后非常早时、在抑制活性的IL-10有效之前已经产生相当量的该细胞因子(Bejarano等(1985)Int.J.Cancer35:327)。实施例7．IL-10和SCID患者中的耐受在移植有HLA错配的胎肝干细胞的严重联合的免疫缺陷病(SCID)的两个患者中研究T细胞的所有组成成分和耐受机制。两个非常年轻的SCID儿童17年和5年前移植来自HLA完全不相称供体的胎肝干细胞。患者SP接受2次胎肝干细胞移植，在两种情况下均同时注射同源胎儿胸腺。尽管标准HLA分型表明细胞的移入仅来自第二个供体，采用对多态性HLA决定簇特异性的单克隆抗体的更精细的细胞荧光分析，表明10-20％的所述T淋巴细胞实际来自第一个供体。第二个患者RV接受7次胎肝干细胞移植，但在外周血中仅能鉴定出一个供体细胞群体(表3)。
表3HLA分型
在这种患者中，在移植后观察到供体T细胞的持久移入，而B细胞和单核细胞为宿主来源(表4)。
表4嵌合现象
<p>尽管存在免疫系统细胞内的这种分裂嵌合现象，但达到完全重建，并且观察到对回忆抗原的体内和体外抗体反应。这是由于供体T细胞横跨同种异体障碍与该宿主的APC协同作用引起的。详细地说，这些研究证明，从患者SP的外周血分离的供体来源的破伤风类毒素(TT)特异性T细胞克隆，可以识别宿主B细胞、EBV转化的B细胞系和NK细胞克隆加工和提呈的抗原(Ag)。相反，测试的所述Ag特异性T细胞克隆均不识别通过供体细胞表达的Ⅱ类HLA抗原提呈的TT,Roncarolo等(1989)J.Exp.Med.167:1523。
如表4所示，在两个患者中，NK群体的嵌合现象不同。在一个病例中，新鲜的NK细胞和NK细胞克隆表现出该宿主的HLA表型；在另一病例中，它们均为供体来源。这些NK细胞表达CD16和CD56抗原，并对各种各样的NK敏感型靶展示出正常胞毒活性。
这些发现提示，宿主或供体功能NK细胞的存在在胎儿干细胞移植后，不阻止供体T细胞的稳定移入。尽管同时存在淋巴样细胞与主要和/或次要组织相容性抗原的差异，但在这两个患者体内均达到完全耐受，没有观察到急性或慢性移植物抗宿主病的体征。此外，体外研究表明，在原代混合白细胞培养物(MLC)中存在供体T细胞对宿主表达的HLA抗原的特异性不反应性，而对同种异体细胞的增殖性应答正常。然而，在该克隆水平上，所述发现不同。已经从两个患者的外周血中衍生出识别该宿主或者HLAⅠ类或HLAⅡ类抗原的供体来源的宿主反应性增殖性和细胞毒性T细胞克隆。与在移植有来自HLA单倍相同的亲代供体骨髓的SCID患者中报道的(Keeren等Hu Immunol.29:42,(1990))相反，在这两个患者中没能分离供体反应性T细胞克隆。此外，在患者RV中，没有鉴定出与所述供体共享的宿主HLAⅠ类基因座A抗原特异性的T细胞克隆。采用改良的限制稀释测定的频率分析证实缺乏供体反应性，并证明CD8+宿主反应性T细胞的频率和T细胞对第三组HLA抗原的反应频率的范围相同。因此，没有从供体T细胞所有组成成分中克隆除去宿主反应性细胞。假定，这种宿主反应性T细胞受到调节，因为在这些患者中移植物抗宿主病的临床表现不明显。一个可能性是，宿主反应性细胞在体内是无反应性的，在IL-2存在下体外刺激可以破坏这种变应性。已知宿主反应性T细胞在多克隆刺激和抗原特异性刺激后表现出淋巴因子产生的特殊型式。CD4+以及CD8+T细胞克隆均不能分泌IL-4，而在多克隆激活后它们合成正常水平的IL-2、Il-5和GM-CSF。这些克隆的IFN-γ的产生通常非常高。另外，在抗原特异性刺激后患者RV的CD4+宿主反应性T细胞克隆的IL-10的产生极高，似乎与低IL-2合成成反比。另外，加入外源IL-10在体外可以显著抑制CD4+宿主反应性T细胞克隆的增殖性应答。因此，宿主反应性T细胞的IL-10产生可能在体内向下调节其应答方面起重要作用。
所述患者现在(1992)17岁和5岁，健康，对回忆抗原表现出正常的免疫应答。它们的T细胞为供体来源，而单核细胞和B细胞仍为宿主的。NK细胞具有不同来源，因为在一个患者中，它们得自供体，而在另一患者中来自宿主。尽管供体和宿主细胞之间的HLA错配，但没有观察到急性或慢性移植物抗宿主病。用PBMC的体外实验表明对宿主细胞表达的HLA抗原特异性地无应答性。然而，广泛的克隆分析表明，在两个患者的外周血中均存在分别识别宿主的Ⅱ类和Ⅰ类HLA分子的CD4+和CD8+宿主反应性T细胞克隆。限制稀释实验表明，CD8+宿主反应性细胞的频率范围与同种异体反应性T细胞观察到的相同。相反，没能分离出供体反应性CD8+T细胞。宿主反应性CD4+和CD8+T细胞克隆产生IL-2、IFN-γ、GM-CSF和IL-5的能力正常，但它们不能合成IL-4。另外，患者RV的CD4+T细胞克隆分泌非常高水平的IL-10。外源IL-10能够抑制CD4+宿主反应性T细胞克隆的增殖性应答。在同种异体胎肝干细胞移植后，从供体T细胞所有组成成分中去除了宿主反应性细胞。因此，由细胞因子起作用的外周自身调节机制维持宿主和供体之间的体内耐受。实施例8．在人CD4+T细胞中诱导长期抗原特异性无反应性存在外源IL-10时在初次MLR中同种异体单核细胞激活的人CD4+T细胞，在用相同的同种抗原再刺激后特异性地不能增殖。可以通过在外源IL-10存在下用交联抗CD3mAb激活CD4+T细胞，诱导T细胞无应答性的相当的状态。无反应性T细胞用同种抗原或抗CD3mAb再刺激时，不能产生IL-2、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF。然而，用抗CD3mAb再刺激无反应化T细胞，诱导正常的Ca2+流出，导致CD3、CD28和Ⅱ类MHC表达增加，表明在这些无反应性细胞中发生钙调磷酸酶介导的信号发送。IL-10诱导的无反应性状态是长期保持的。T细胞无反应性在用抗CD3mAb和抗CD28mAb再刺激所述细胞后不能逆转，尽管CD3和CD28的表达正常。然而，IL-2Rα链的表达不向上调节，这可能导致外源IL-2不能逆转该无反应性状态。有趣的是，用PMA和Ca2+离子载体激活后，无反应性T细胞和它们的非无反应性对应物表现出相当水平的增殖和细胞因子产生，表明PKC依赖性途径的直接激活可能克服IL-10的耐受作用。综合来讲，这些数据证明，IL-10诱导T细胞无反应性，因此可以在诱导和维持抗原特异性T细胞耐受方面起重要作用。
已经表明IL-10抑制人外周血T细胞和属于Th0、Th1或Th2亚群的T细胞克隆的抗原特异性激活和增殖。Yssel等(1992)J.Immunol.149:2378-2384；和de Waal Malefyt等(1991)J.Exp.Med.174:915-924。这些抑制作用是间接的，并通过抑制抗原提呈细胞(APC)的功能而介导。Macatonia等(1993)J.Immunol 150:3755-3765；Caux等(1994)Int.Immunol.6:1177-1185；Pecanha等(1993)J.Immunol.150:3215-3223；和Ding和Shevach(1992)J.Immunol.148:3133-3139。IL-10调节单核细胞、树突细胞和朗格汉斯细胞上组成型的和IFN-γ或IL-4诱导的Ⅱ类MHC表达。de Waal Malefyt等(1991)J.Exp.Med.174:915-924；和Peguet-Navarro等(1994)Eur J.Immunol.24:884-891。另外，IL-10抑制CD54(ICAM-1,LFA-1的配体)的表达以及作为T细胞激活的重要共刺激分子起作用的CD80和CD86(CD28的配体)的表达。Ding等(1993)J.Immunol.15:1224-234；Willems等(1994)Eur.J.Immunol.24:1007-1009；Chang等(1995)Eur.J.Immunol.25:394-398。新近，已经表明IL-10也具有通过抑制IL-2分泌对CD4+的直接作用。de Waal Malefyt等(1993)J.Immunol.150:4754-4765；和Taga等(1993)Blood 81:2964-2971。
与IL-10对响应可溶性抗原的T细胞增殖的抑制作用相似，IL-10强烈降低混合淋巴细胞反应(MLR)中人同种异体反应性细胞的增殖，在这些MLR中产生的细胞因子水平在存在外源IL-10时限制降低。Bejarano等(1992)Int.Immunol.4:1389-1397和以上文献。另外，IL-10抑制CD4+同种异体T细胞克隆的增殖性应答。与增殖降低平行，观察到这些T细胞克隆产生IL-2、IL-5、GM-CSF和IFN-γ的水平降低。Roncarolo(1995)“白介素-10和移植耐受”，载于de Waal Malefyt和deVries(编辑)Interleukin-10 Landes Company,Austin,Texas，第113-120页。
最近，据报道，在成功移植HLA错配造血细胞的SCID患者中，特异性地识别宿主同种抗原的CD4+T细胞克隆在抗原刺激后，产生非常低水平的IL-2，但分泌非常高量的IL-10，这部分抑制它们在体外的增殖。Bacchetta等(1994)J.Exp.Med.179:493-502。此外，与PBMC正常对照相比，这些SCID患者的PBMC表达相当高水平的IL-10转录物，尤其是在非T细胞亚群中。Bacchetta等(1994)J.Exp.Med.179:493-502。这些结果提示，在SCID人嵌合体中检测到的高表达的IL-10可能通过在对宿主同种抗原特异性的供体衍生T细胞中诱导无反应性状态，在维持体内耐受方面起关键作用。
同种异体反应性T细胞的最佳激活和扩增除需要TCR复合物的连接外，还需要同种抗原提呈细胞上表达的一种或多种辅助分子提供的共刺激信号。抗原占用TCR而无共刺激导致T细胞无反应性。DeSilva等(1991)J.Immunol.147:3261-3267；Jenkins等(1990)J.Immunol.144:16-22；Schwartz(1990)Science 248:1349-1356；和Sloan-Lancaster等(1994)J.Exp.Med.180:1195-1205。通过在缺乏CD28信号发送的情况下用模拟T细胞受体占用的药物刺激，和/或通过抑制T细胞分泌IL-2，也可以在长期T细胞克隆中体外诱导这种无应答状态。de Silva等(1991)J.Immunol 147:3261-3267；Jenkins等(1990)J.Immunol.144:16-22；Schwartz(1990)Science 248:1349-1356；和Sloan-Lancaster等(1994)J.Exp.Med.180:1195-1205。高水平的IL-10与移植耐受相关并且该细胞因子已经表现出抑制单核细胞的抗原提呈功能和辅助功能和抑制T细胞产生IL-2，这些观察提示，IL-10可能参与CD4+T细胞中无反应性的诱导。
在本项研究中，证明IL-10能够诱导对同种抗原的长期持续的抗原特异性无应答性，这种无应答性不能通过IL-2或CD28刺激恢复。
细胞通过在Ficoll-hypaque上离心制备外周血单核细胞。通过负选择纯化CD4+T细胞。采用导向非CD4+T细胞的抗体的混合物进行负纯化，所述抗体为CD8、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56、HLA-DR抗体。细胞与饱和量的抗体于4℃温育30分钟。洗涤后，将Dynabeads(Dynal,Oslo，挪威)以10珠粒/靶细胞的比率加入，于4℃温育1小时。通过磁场除去珠粒和污染细胞。剩余的细胞用同等数目的珠粒再悬浮，于4℃再温育1小时。除去污染细胞后，通过FACScan(Becton Dickinson,Mountain View,CA)分析CD4+T细胞，表明阳性高于90-95％。采用相同方法，用含CD2、CD3、CD8、CD16、CD19、CD20、CD56抗体的混合物纯化单核细胞。通过FACScan分析，这些单核细胞的CD4+高于95％。在某些实验中，通过正选择，采用直接包被CD4mAb的磁珠按照厂商的说明(Dynal,Oslo，挪威)纯化CD4+T。用该方法，细胞的纯度高于95％。
试剂由Schering-Plough研究所(Kenilworth,NJ)提供纯化的重组IL-10。先前描述了抗IL-2受体单克隆抗体B-B10(Herve等(1990)Blood75:1017-1023)、抗CD3mAb SPV-T3(Spits等(1983)Hvbridoma 4:423-437)和抗CD28(Becton Dickinson,Mountain View，美国)。CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56、HLA-DR的非缀合PE抗体或FITC缀合抗体和合适同种型的对照mAb购自Becton Dickinson(Mountain View,CA)。
增殖测定在这些增殖测定中，在补加10％FCS和1％人血清的Yssel氏培养基(Yssel等(1984)J.Immunol.Methods 72:219-227)中培养细胞。对于MLR，用纯化的同种异体单核细胞(5×104细胞/孔)或用辐射PBMC(105细胞/孔)在200μl平底96孔板(Falcon,Becton Dickinson,LincolnPark,NJ)刺激纯化的CD4+T细胞(5×104细胞/孔)。用作刺激物的PBMC以4,000rad照射。
对于交联抗CD3mAb激活，在0.1M pH9.5 Tris缓冲液中稀释时的500ng/ml抗CD3mAb在平底96孔板中或24孔板中于4℃温育1周。在测试不同浓度抗体和不同温育时间的实验中，发现这些实验条件是最适的。洗涤所述板3次后，以5×104细胞/孔加入CD4+T细胞。
对于用佛波醇酯(PMA)+Ca2+离子载体(A23187 Sigma，美国)的激活，细胞以5×104细胞/孔培养，并用PMA(1ng/ml)和A23187(500ng/ml)激活3天。
为测定T细胞的增殖，按Bacchetta等(1994)J.Exp.Med.179:493-502中所述，用于MLR实验的细胞于37℃在5％CO2中培养72小时或5天，随后用[3H]-TdR施加脉冲12小时并收获。
无反应性的诱导为诱导无反应性，在24孔板(Linbro,ICN Biomedical,Ohio)中以2.5×105细胞/ml培养CD4+T细胞，在IL-10(100U/ml)存在下，或者用纯化同种异体单核细胞激活，或者用交联抗CD3mAb激活。在不同温育时期(范围为3-10天，参见下面)后收获细胞，铺在Ficoll-hypaque梯度上，以除去死细胞，洗涤2次，用辐射同种异体PBMC或交联抗CD3mAb再刺激。
免疫荧光分析为测定细胞表面抗原，用PE或FITC缀合mAb标记105细胞。细胞与合适的抗体于4℃在含有0.1％BSA和0.02mM NaN3的PBS中温育30分钟。洗涤3次后，在FACScan(Becton Dickinson)上分析标记的细胞样品。
淋巴因子产生的测定细胞用交联抗CD3mAb、PMA和Ca2+离子载体(A23187)或同种异体单核细胞刺激24小时。通过ion Bacchetta等(1994)J.Exp.Med.179:493-502和Bacchetta等(1995)Blood 85:1944-953描述的免疫酶测定法，测定IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的分泌。各种ELISA的灵敏度为对于IL-2为20pg/ml；对于IL-4和IL-5为40pg/ml；对于GM-CSF和IL-10为50pg/ml；对于IFN-γ和TNF-α为100pg/ml。
钙转移研究采用标准荧光测定评价负荷(load)indo-l/AM的无反应性细胞中的胞内钙转移。细胞在完全生长培养基中于20℃用2μM indo-l/AM负荷45分钟。然后洗涤细胞，将其再悬浮于含有1％BSA的Na-HBSS(以mM计，2CaCl2、145NaCl、5KCl、1MgCl2、5d-葡萄糖、20HEPES；pH7.3)中，于20℃保持多至2小时。然后将大约5×105细胞悬浮于2ml Na-HBSS中，于37℃在恒定搅拌的丙烯酸杯中保持。加入抗CD3mAb(1μg/ml)，然后加入山羊抗小鼠免疫球蛋白，以将抗CD3mAb交联到该细胞表面。在缺乏交联时没有检测到Ca2+流出，在无反应性细胞和对照细胞中也没有检测到。采用Photon TechnologiesInc.的荧光分光光度计进行测定[Ca2+]i的荧光测定。
IL-10诱导同种抗原特异性T细胞无反应性如先前所示(Bejarano等(1992)Int.Immunol.4:1389-1397；和上述)，IL-10部分抑制对初次MLR中同种异体单核细胞应答的外周血CD4+T细胞的增殖(图8A)。这种抑制与抗IL-2α链受体mAb(抗CD25mAb)诱导的抑制相当。为确定在IL-10中延长同种抗原刺激的CD4+T细胞的温育是否也可能在再刺激后向下调节所述细胞的增殖性应答，将所述细胞在存在或缺乏IL-10时保持培养10天(图8B)。在两种培养条件下均未观察到明显的细胞死亡，在所述测定终止时收获的细胞数相当。在该培养期后，用同种抗原在缺乏IL-10时刺激的CD4+对照T细胞达到静息状态，并且完全可以被再次MLR中的相同的同种异体辐射单核细胞再激活，或被初次MLR中的第三组同种异体单核细胞再激活。相反，存在IL-10时温育的CD4+T细胞在应答相同的同种异体PBMC的再次MLR中不能增殖，但它们保留在初次MLR中正常增殖为第三组同种抗原的能力。这种无应答状态不可能由饱和浓度的外源IL-2(20U/ml)或抗CD28mAb(10μg/ml)逆转。而且，这种T细胞的无应答状态是IL-10特异性的，不是由于抑制初次MLR引起的，是因为在存在抗CD25mAb(10μg/ml)时温育10天的CD4+T细胞表现出的增殖性应答与其未处理的对应物的增殖性应答相当。
IL-10在被抗CD3mAb激活的CD4+T细胞中诱导无反应状态接着分析IL-10诱导的无反应性是否反映出IL-10对CD4+T细胞的直接作用。为此，高度纯化的外周血CD4+T细胞在存在或缺乏外源IL-10的情况下用交联抗CD3mAb激活10天。观察到IL-10对CD4+T细胞增殖的直接作用(de Waal Malefyt等(1993)J.Immunol.150:4754-4765；和Taga等(1993)Blood 81:2964-2971)，这种抑制作用与抗CD25mAb诱导的抑制作用相当(图9A)。在存在IL-10时激活CD4+T细胞导致T细胞无应答性的极度状态，该状态不能被外源IL-2或抗CD28mAb逆转(图9B)。然而，无反应性细胞对Ca2+离子载体和PMA刺激应答正常增殖。这些结果表明，IL-10诱导CD4+T细胞的无反应状态，但这些细胞对绕过TCR激活的信号正常应答。这种无反应性诱导是IL-10特异性的，与IL-10诱导的T细胞对同种抗原的无应答性相似，与细胞增殖的抑制无关，因为在存在抗CD25mAb时温育10天的CD4+T细胞对用交联抗CD3mAb再刺激应答而正常增殖。IL-10的无反应性的诱导是剂量依赖性的，在100U/ml下观察到最大效应(图10)。已经被抗CD3mAb激活并在存在或缺乏IL-10的情况下培养10天的细胞处于静息状态，在对照或IL-10处理的细胞培养物中没有观察到程序性细胞死亡。因此，IL-10在同种抗原特异性并且抗CD3刺激的CD4+T细胞中诱导T细胞相当状态的无反应性。
IL-10诱导无反应性的动力学为测定T细胞无反应性诱导的动力学，用交联抗CD3mAb在存在或缺乏IL-10时激活CD4+T细胞，并且在开始培养后的不同时间点再刺激(图11)。在存在IL-10时仅培养3天的细胞已经不能对交联抗CD3mAb再激活应答而增殖。有趣的是，这些细胞的无反应状态仍可以被外源IL-2(20U/ml)或抗CD28(10μg/ml)逆转。相反，T细胞与Il-10温育9-10天导致完全无反应性状态，它不能通过或者加入IL-2或者加入抗CD28mAb逆转。这些结果表明，在存在IL-10时通过其TCR/CD3复合物激活的T细胞获得不同程度的无应答性，取决于它们已经暴露于IL-10的时间长短。这表明IL-10的暴露时间在抑制效率方面非常重要。
IL-10诱导的T细胞无反应性是长期持续的为测定在除去IL-10后IL-10在CD4+T细胞中诱导的无反应状态的持续时间，用交联抗CD3mAb在存在或缺乏IL-10时激活10天。该温育时期后，洗涤细胞，在存在低浓度(2U/ml)的外源IL-2的情况下再培养24小时，以在延长的培养时期内、但在缺乏IL-10的情况下最佳保持T细胞。在培养期间每隔1天收集这些T细胞，将其洗涤，用抗CD3mAb再刺激。先前已经与IL-10温育的T细胞甚至在除去IL-10后24小时仍不能增殖。相反，在缺乏IL-10时已经用抗CD3mAb激活并在缺乏IL-10时保持24小时的对照CD4+T细胞，对用抗CD3mAb刺激应答而正常增殖。另外，培养IL-10处理的细胞24天后观察到的无应答性不可能被IL-2(20U/m1)或抗CD28(10μg/ml)mAb逆转。这些结果表明，IL-10诱导的T细胞无反应性是严重的(profound)并且持续时间长。
无反应性化T细胞不能分泌细胞因子T细胞无反应性一般定义为T细胞不能对触发TCR而增殖和产生IL-2(参见Schwartz(1990)Science 248:1349-1356)。为确定在存在IL-10的情况下，T细胞在用或者同种异体单核细胞或者抗CD3mAb激活后是否赋予无应答性、是否保留其分泌细胞因子的能力，分别分析了用相同同种异体单核细胞或抗CD3mAb再刺激后其细胞因子的产生。
在缺乏(对照细胞)或存在(无反应性细胞)IL-10(100U/ml)的情况下，CD4+T细胞用或者交联抗CD3mAb(10μg/ml)、同种异体单核细胞激活。将细胞保持培养10天，洗涤，并分别用交联抗CD3mAb；或TPA(1pg/ml)和Ca2+离子载体(A23187:500ng/ml)；或同种异体PBMC再刺激。24小时后收获上清液，通过ELISA分析细胞因子的水平。为测定细胞增殖，在用交联抗CD3mAb激活细胞3天结束时，或在用同种异体单核细胞激活细胞5天结束时，用[3H]TdR向细胞施加脉冲12小时。
表5显示再刺激后IL-10诱导的无反应性T细胞的细胞因子分布型。用或者同种抗原加IL-10、或抗CD3mAb加IL-10激活后赋予无应答性的T细胞，在用相关同种异体单核细胞或抗CD3mAb再刺激后24小时或48小时，不能产生可检测量的IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF。相反，未处理对照细胞产生的IL-2、IL-5、IL-10、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF的水平与得自不同供体并以相同方式刺激的CD4+T细胞板的水平相当。然而，这些细胞不能分泌可检测水平的IL-4。
表5Cpm IL-2 IL-4 IL-5IL-10TNF-α IFN-γ GM-CSFpg/ml pg/ml pg/ml pg/mlng/mlng/mlpg/mlCD3 对照42,369 875＜40 80 1.06710.5 5.5 1,245细胞 ±59 ±23±226±0.9±0.6±687无反应性 2,635＜40 ＜40 ＜20＜s0 ＜0.1＜0.1＜50细胞TPA+Ca2+对照147,217 2,121 ＜40 841 51 21.6 7.6 2,721离子载体细胞 ±317 ±127 ±27 ±5.1±3.1±635无反应性 169,321 1,921 ＜40 1,517 117 18.4 8.4 1,615细胞 ±427 ±415 ±4.3±3.6±2.6±317单核细胞对照32,236 617＜40 64 897 9.2 2.3 987细胞 ±42 ±15±125±0.5 ±0.1 ±98无反应性细胞 869 ＜40 ＜40 ＜20＜50 ＜0.1 ＜0.1 ＜50图9表明，用PMA和Ca2+离子载体的激活完全逆转抗CD3激活的T细胞的IL-10诱导的无应答性。表5表明，用PMA和Ca2+离子载体激活无反应性T细胞24小时，也导致IL-2、IL-5、IL-10、IFN-γ和TNF-α产生水平与其非无反应性对应物的水平相当。
无反应性T细胞在激活后不能表达CD25在存在IL-10的情况下在用抗CD3mAb激活后赋予无反应性的T细胞的表型分析表明，与其未处理对应物相比没有主要的差异，只是在无反应性T细胞上IL-2Rα链(CD25)表达降低(参见图13和14A和14B)。在无反应性细胞上没有观察到CD3或CD28表达的调节，用交联抗CD3mAb激活增强CD3、CD28和Ⅱ类MHC表达，其表达程度与对照细胞相同(图13)。这些结果排除了T细胞无应答性与缺陷的TCR/CD3和CD28表达相关的可能性，并表明通过TCR/CD3复合物的信号发送仍存在于这些无反应性化T细胞中，但对T细胞增殖是不足的。
然而，与对照细胞相反，无反应性T细胞不能向上调节IL-2Rα链的表达，表明IL-2Rα链表达的抑制是无反应性化T细胞的一个特异性的特性(图14A和14B)。CD25表达向上调节的缺陷也在存在外源IL-2时观察到，与IL-2不能逆转与IL-10温育8-10天诱导的T细胞无反应性相关(图11)。相反，与IL-10温育3天后赋予无应答性的T细胞仍表达相当水平的CD25(图14A)。用抗CD3mAb再刺激后也观察到略微向上调节CD25，但表达水平与未处理细胞相比仍然降低。然而，加入能够逆转无反应性状态的IL-2，导致对照T细胞和在存在IL-10时温育3天的T细胞产生相当水平的CD25表达(图14A)。
抗CD3mAb在无反应性T细胞中诱导正常的Ca2+流出通过在这些细胞中测定Ca2+流出的诱导，证实在无反应性T细胞中发生通过TCR/CD3复合物发送信号的想法。负荷Indo-1后，按图15的指示，细胞用山羊抗小鼠免疫球蛋白交联的抗CD3mAb激活。用交联抗CD3mAb激活后，在无反应性化T细胞中诱导的Ca2+流出与未处理对照T细胞相当(图15)。无反应性细胞和对照细胞的Indo-1负荷是相等的，正如通过加入Ca2+离子载体在所述细胞中诱导的Ca2+流出升高相当所示(图15)。这些结果表明，IL-10诱导的无反应性影响参与T细胞激活的向下调节事件。
本项研究表明，在存在IL-10时用同种异体单核细胞激活10天的人外周血CD4+T细胞以抗原特异性方式赋予无应答性。这些无应答性CD4+T细胞用相同的同种异体单核细胞再刺激时不能增殖和产生细胞因子。然而，这些T细胞群体对第三组同种抗原应答而正常增殖。在存在IL-10时抗CD3mAb激活CD4+T细胞后，诱导相当状态的T细胞无反应性。IL-10诱导的无反应性是剂量依赖性的，并且在除去IL-10后持续多于24天，这是所分析的最长的时间。此外，所述无反应性状态不能被外源IL-2或加入抗CD28mAb逆转。另外，在存在抗IL-2受体mAb时，T细胞无反应性不能通过用同种异体单核细胞或抗CD3mAb刺激诱导。这些结果表明，所述T细胞无反应性由IL-10特异性诱导，不是简单地与这些细胞IL-2产生的向下调节相关。
IL-10诱导的T细胞无反应性明显不同于小鼠或人T细胞与抗原肽在缺乏专业APC时温育诱导的T细胞无应答性。参见例如Sloan-Lancaster等(1994)J.Exp.Med.180:1195-1205；Lamb等(1983)J.Exp.Med.157:1434-1447；和Fasler等(1995)J.Immunol.155:4199-4206。在这后一种情况下，TCR/CD3复合物的表达向下调节，并且没有观察到[Ca2+]i的转移(Lamb等(1983)J.Exp.Med.157:1434-1447；和Fasler等(1995)J.Immunol.155:4199-4206)，与用IL-10诱导的无反应性的发现不同。
另一方面，由IL-10无反应性化的CD4+T细胞与通过缺乏共刺激信号诱导的无反应性鼠模型中所述的无反应性T细胞共享许多特性。参见De Silva等(1991)J.Immunol.147:3261-3267；Schwartz(1990)Science 248:1349-1356；Suzuki等(1995)Int.Immunol.71:37-43；和Ramsdell和Fowlkes(1992)Science 257:1130-1134。这两种形式的无反应性均不能增殖和产生IL-2，但它们具有CD3或CD28表面分析的正常表达以及在TCR/CD3复合物转移后正常的Ca2+流出。参见Schwartz(1990)Science 248:1349-1356。然而，IL-10诱导的T细胞无反应性较这些鼠模型中描述的要严重得多，因为无反应性T细胞的增殖不能通过加入IL-2或抗CD28mAb恢复。此外，在后续刺激时，这些无反应性细胞不仅IL-2的产生受损，而且IFN-γ、IL-5、IL-10、TNF-α和GM-CSF的产生也受损。因此，IL-10对T细胞无反应性的诱导不是简单地因为抑制IL-2的产生和阻止生产性CD28-CD80/CD86的相互作用而引起的。IL-10无反应性化的T细胞也不同于经历细胞凋亡的T细胞或在缺乏增殖的情况下能够分泌细胞因子的无反应性T细胞。参见Jenkins(1992)Immunol.Today 132:69-73；和Grous等(1993)Eur.J.Immunol.23:1623-1629。事实上，在IL-10中培养的无反应性T细胞中没有观察到显著的细胞凋亡的细胞损失，所述无反应性T细胞是有活力的，如用Ca+离子载体和PMA刺激后正常增殖所证明。
总之，这些数据表明，通过TCR/CD3复合物的信号发送在IL-10无反应性化的T细胞中选择性地受损。这不是因为TCR或CD28分子的向下调节，因为所述无反应性T细胞的TCR/CD3和CD28的表达水平与未处理T细胞的表达水平相当。此外，尽管通过TCR/CD3复合物刺激所述无反应性T细胞不导致细胞增殖和细胞因子产生，但在用抗CD3mAb再刺激所述细胞后观察到CD3、CD28和Ⅱ类MHC表达的明显增加，表明在这些无反应性细胞中发生某些程度的TCR激活。
这种想法进一步为以下观察所支持在无反应性化T细胞中的Ca2+流出在CD3激活后正常，证明钙调磷酸酶介导的信号发送不受影响。重要的是，用PMA和Ca2+离子载体激活后，观察到无反应性的完全逆转。这些刺激物绕过TCR激活，完全恢复无反应性细胞的增殖和细胞因子的产生。这些发现提示，IL-10可能在Ras-MAP激酶激活的水平干扰TCR信号途径中的最近的事件，如无反应性诱导的小鼠模型所提示的。参见例如Kang等(1992)Science 257:1134-1138；Fields等(1996)Science 271:1276-1278；和Li等(1996)Science 271:1272-1275。或者，尽管p2lras的信号级联下游似乎是完整的，但不可能排除IL-10诱导该信号途径的负调节物。
通过激活并与IL-10温育9-10天赋予无反应性的T细胞与其未处理对应物相反，用抗CD3mAb再刺激时不能向上调节IL-2Rα链的表达。因此，人们可能很想推测，IL-2Rα链表达的这种缺陷导致外源IL-2不能逆转无反应性。这种假设为以下观察所支持通过激活并与IL-10温育3天赋予无反应性、仍表达CD25的T细胞可以被外源IL-2所拯救。已经报道了TCR转基因小鼠中超级抗原诱导的T细胞无应答性的IL-2利用上的相当缺陷，但less profound。参见Bhandoola等(1993)J.Immunol.151:2355-2367。总之，这些数据提示，如果适当的诱导，无反应性诱导可以是永久的。
已经提出的导致合适同种异体反应性T细胞功能性失活的非缺陷机制是负责诱导对同种抗原耐受的机制之一。这种功能性失活可以通过阻断APC和T细胞上表达的辅助分子提供的共刺激信号而达到。参见Lenschow和Bluestone(1993)Curr.Opin.Immunol.5:747-752；Linsley等(1992)Science 257:792-795；Charlton等(1991)Immunol.Cell.Biol.692:89-93；和Nakao等(1994)J.Immunol.153:5819-5825。防止CD28和或者CD80或者CD86之间的相互作用看来对这种无反应性诱导是关键性的，但也可能涉及诸如CD2、CD4或CTLA-4的其它共刺激分子的阻断。参见Boussiotis等(1994)J.Exp.Med.180:1665-1673。然而，在这些实验模型中诱导的耐受是长期持续的并且是潜在不可逆的事实，提示潜在机制可能比识别同种抗原时仅仅缺乏T辅助细胞的第二信号更复杂。可能某些形式的主动抑制是细胞因子介导的。这些细胞因子可能不仅通过向下调节共刺激分子，而且诱导诸如CTLA-4之类的负调节物表达，导致诱导或保持T细胞的无反应性。参见Tivol等(1995)Immunity 3:541-547。在人类中，SCID患者是HLA错配移植后获得的体内耐受的少数实例之一。这种耐受是因为负责特异性识别宿主同种抗原的T细胞功能失活的非缺陷机制。参见以上和Roncarolo等(1988)J.Exp.Med.167:1523-1534；和Bacchetta等(1993)J.Clin.Invest.91:1067-1078。这些宿主反应性T细胞体外分泌高水平的IL-10，在体内观察到高IL-10水平，提示IL-10可能在诱导和保持耐受方面起重要作用。参见Bacchetta等(1994)J.Exp.Med.179:493-502。在本结果的基础上，人们很想总结出，在这些患者中观察到的高水平的IL-10体内赋予宿主反应性T细胞无反应性。在移植前高水平的IL-10分泌也已经表明与移植的成功结果相关(Holler等(1995)Eur J.Cancer 31:39-45)，进一步支持IL-10可能在诱导耐受方面起重要作用的假设。
总之，这些数据提示，IL-10通过诱导对供体特异性和/或宿主特异性同种抗原无反应性，在移植耐受方面起重要作用。另外，它们提示，IL-10在预防或降低GVHD和同种异体移植排斥方面具有潜在的临床实用性。
图16表明，在IL-10(100U/ml)存在时用交联抗CD3mAb(100ng/ml)刺激10天后已经赋予无反应性的纯化CD4+T细胞，在用非常高浓度的交联抗CD3mAb再刺激后，可以部分恢复增殖性应答。
表6显示用抗CD3mAb再刺激时无反应性细胞的细胞因子分布型。细胞(2.5×106细胞/孔)在存在(无反应性细胞)或缺乏(对照细胞)IL-10(100U/ml)的情况下用交联抗CD3mAb刺激。10天后，收集洗涤，铺在Ficoll-Hypaque梯度上，洗涤3次，并以2.5×105细胞/ml用交联抗CD3mAb(或者10mg/ml或者700mg/ml)再刺激。24小时后，收集上清液并通过ELISA测定细胞因子的量。结果为一个代表性实验的多次测量的平均值±SD。从表6提出的数据看出，在IL-10存在下交联抗CD3mAb刺激10天后已经无反应性化的CD4+T细胞用极高水平的抗CD3mAb(700mg/ml)再刺激，导致低水平的增殖和Tr1细胞因子产生分布型，其特征在于产生高水平的IL-10、非常低水平的IL-2和不可检测水平的IL-4。另外，IL-5、IFN-γ、GM-CSF和TNF-α的产生可以检测到。相反，所述无反应性化CD4+T细胞用浓度为10μg/ml的交联抗CD3mAb刺激时，不能增殖和产生细胞因子。
表6cpm IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF-αIFN-γ GM-CSFpg/mlpg/mlpg/mlpg/ml ng/ml ng/mlpg/ml对照 42,369 875±＜40 80± 1067± 10.5±5.5±1245±CD3细胞 5923 226 0.9 0.6 68710μg/ml 无反应性 2,635＜40 ＜40 ＜20 ＜40 ＜20 ＜40 ＜40细胞对照 75,236 1045± ＜40 107± 1145± 11.2±4.3±1569±CD3细胞 105 39 321 1.3 1.2 537.
700μg/ml 无反应性 24,569 321±＜40 445± 6421± 9.5± 1.6±1125±细胞 6551 547 0.8 0.4 327图17显示与Th1和Th2克隆相比的Tr1克隆的增殖性应答。
表7显示由两种不同供体的无反应性细胞群体获得的Tr1、Th0、Th1和Th2克隆的细胞因子产生的分布型。用辐射饲养细胞混合物+PMA刺激后收集各种CD4+T细胞克隆，并且用抗CD3mAb和抗CD82mAb再刺激24小时后12天。细胞因子的产生(平均值±SD)以pg/106细胞/ml表示。Tr1克隆的特征性细胞因子产生的分布型显示如下没有显著的IL-2和IL-4产生，但产生非常高水平的IL-10。另外，这些细胞产生IL-5和IFN-γ和TNF-α。这种细胞因子产生分布型显然不同于得自无反应性或非无反应性对照T细胞群体的Th0、Th1和Th2克隆。
表7克隆 IL-2 IL-4 IL-5 IL-10IFN-γ TNF-α数无反应性Tr115 10 10 1070 1229038705950Th055302270 6120 660 19902340Th2510 3250 136901340 350 1140Th1552010 80 790 63306310对照Th054902900 11240850 26564210Th2510 4890 222101690 440 520Th1547010 10 470 30402120图18A和18B表明在激活Tr1克隆细胞后快速发生Tr1克隆产生IL-10。实施例9．人类Tr1细胞克隆纯化CD4+T细胞的分离通过在Ficoll-Hypaque上离心，制备外周血单核细胞。通过负选择纯化CD4+T细胞。采用导向非CD4+T细胞的抗体混合剂进行负纯化，所述抗体为CD8、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56、HLA-DR。细胞与饱和量的抗体于4℃温育20分钟。洗涤后，以10珠粒/靶细胞的比率加入Dynabeads(Dynal，挪威)，并于4℃温育1小时。通过磁场除去珠粒和污染细胞。留下的细胞用等量的珠粒再悬浮，于4℃进行1小时的第二次温育。除去污染细胞后，用FACScan(BectonDickinson,Mountain View,CA)分析CD4+T细胞，表明阳性高于90-95％。在某些实验中，采用直接包被CD4mAb的磁珠，按照厂商(Dynal,挪威)的说明通过正选择纯化CD4+T细胞。用该方法，细胞的纯度高于95％。
培养条件在这这些测定中，在补加10％FCS和1％人血清的Yssel氏培养基中培养细胞。
对于交联抗CD3mAb的激活，将于0.1M pH9.5 Tris缓冲液中稀释的100μg/ml(对于克隆无反应性细胞)或500ng/ml(对于诱导无反应性)的抗CD3mAb(SPV-T3)在平底96孔板中于4℃温育1周。然后，用RPMI将板洗涤3次。
无反应性的诱导和克隆为诱导无反应性，在24孔板(Linbro,ICN Biomedical,Ohio)中以2.5×105细胞/ml培养CD4+T细胞，并在IL-10(100U/ml)存在下用交联抗CD3mAb激活。10天后，收集细胞，铺在Ficoll-hypaque梯度上，以除去死细胞，洗涤2次，并以0.3细胞/ml克隆。通过在预先包被100μg/ml抗CD3mAb板上的饲养(5×105PBMC+5×104EBV转化的B细胞(JK)加2U/ml IL-2中稀释无反应性细胞，进行终点稀释克隆。10天后，在每孔中加入含有2U/ml IL-2的新鲜培养基。每3周用饲养(106PBMC+105EBV-LCL)+PHA(10μg/ml)+IL-2(2U/ml)再刺激所有孔。5-8周后，长出的细胞转移到48孔板中，然后转移到24孔板中。
Tr1细胞的保持每3周用饲养(106PBMC+105EBV-LCL)+PHA(10μg/ml)+IL-2(2U/ml)刺激T细胞克隆。每3天检查细胞，必要时进行分裂，加入含2U/ml IL-2的新鲜培养基。
因此，本发明提供纯化为同质性的Tr1细胞，例如为克隆形式，或包含高水平Tr1细胞的群体，后者包括的Tr1型细胞的纯度至少为40％，一般为至少大约50％，通常至少为大约60％，更常见为至少大约70％，优选为至少80％，更优选为至少90％，在某些最佳实施方案中，至少为大约95％或更高。实施例10．在人和小鼠中新调节性CD4+T细胞的体外分化外周耐受的诱导和保持是维持免疫系统平衡的重要机制。除T细胞耐受和T细胞无反应性外，已经提出T细胞或T细胞因子介导的主动抑制为外周耐受的机制。Germain和Benacerraf(1981)Scand.J.Immunol.13:1。然而，迄今不能分离和克隆参与抗原特异性抑制免疫应答的调节性T细胞妨碍阐明主动抑制潜在机制。已将IL-10与SCID患者在同种异体干细胞移植后耐受的诱导和保持联系起来。Becchetta等(1991)J.Exp.Med.179:493-502。另外，人CD4+T细胞在存在IL-10时的刺激导致抗原特异性T细胞无应答性。Groux等(1996)J.Exp.Med.184:1-11。这里已经表明，人和鼠CD4+T细胞在存在IL-10时的激活产生的CD4+T细胞克隆，其增殖能力低，产生高水平的IL-10，低水平的IL-2以及不产生IL-4。这些抗原特异性T细胞克隆抑制原初CD4+T细胞对同一抗原应答而增殖。这种抑制作用由IL-10和TGF-β介导。因此，IL-10驱动产生命名为T调节细胞(Tr1)的新CD4+T细胞亚群，它们抑制免疫应答，并可能被募集诱导和保持耐受。
免疫系统的一个主要特征为辨别自身与非自身。Rocha和vonBoehmer(1991)Science 251:1225-8；Nossal(1987)Int.Rev Immunol.2:321。免疫耐受提供免疫系统以自身/非自身辨别，并对防止对自身抗原的致病性反应性是关键性的。免疫系统通过吸入和摄食外源物质，面临非致病抗原的重复刺激。为避免慢性细胞刺激和炎症，免疫系统必须发展对这类刺激物的无应答性。因此，必须存在调节外周部分中的不当反应性T细胞的机制。已经描述了外周免疫耐受的几种机制，包括T细胞无反应性(Jenkins等(1990)J.Immunol.144:16-22；和Schwartz(1990)Science 248:1349-56)、T细胞缺失(Rocha和vonBoehmer(1990)Science 251:1225-8)、和主动免疫抑制(Germain和Benacerraf(1981)Scand.J.Immunol.13:1)。
了解这些耐受诱导机制在临床上对治疗自身免疫病和移植均是有关系的，这里移植物必须最终被识别为自身并被耐受。在人类中，SCID患者是HLA错配的干细胞移植后建立体内耐受的少数实例之一。Bacchetta等(1993)J.Clin.Invest.91:1067-78。先前表明，这种耐受是由负责特异性识别宿主同种抗原的T细胞功能失活的非缺陷机制引起的。Roncarolo等(1988)J.Exp.Med.167:1523-34。这些宿主反应性CD4+T细胞在抗原刺激后一般具有低增殖能力，并产生非常低水平的IL-2。相反，与正常对照相比，它们分泌高水平的IL-10，在这些患者PBMC中也观察到的高水平的IL-10mRNA。此外，已经表明移植前高水平IL-10的分泌与移植后成功的无事故临床进程有关。Holler等(1994)EBMT年会，Davos，瑞士。另外，表明IL-10在人CD4+T细胞诱导长期持续的抗原特异性无反应性状态。这些观察支持IL-10可能在耐受诱导中起作用的假设。
IL-10诱导的无反应性T细胞不能对抗原刺激或对交联抗CD3mAb应答而增殖和产生细胞因子。Groux等(1996)J.Exp.Med.184:1-11。
例如，在人CD4+T细胞中获得IL-10诱导的T细胞无反应性。简而言之，CD4+T细胞以106细胞/ml在24孔板中培养，并用或者交联抗CD3mAb(SPV-T3；100ng/ml)或者纯化辐射同种异体单核细胞(106细胞/ml)在IL-10(100U/ml)存在下激活。10天后，收集细胞，铺在Ficoll梯度上，以1200rpm离心除去死细胞。从界面收集活细胞，洗涤2次并克隆。通过FACS分选进行克隆。细胞用抗CD4-FITC mAb(Becton,Dickinson)标记，在包被100μl中的抗CD3(SPV-T3-100μg/ml)的孔中，将活细胞以1细胞/孔分选。分选后，加入100μl中的辐射饲养细胞(EBV-LCL 105细胞/ml和PBMC 106/ml)和10U/ml重组IL-2的混合物。用IL-2(10Uml)并通过用高剂量的交联抗CD3mAb(100μg/ml)重复刺激扩增克隆。
这里表明，非常高剂量的交联抗CD3mAb(700μg/ml)导致由IL-10赋予无反应性的CD4+T细胞的增殖性应答部分恢复，然而，这些应答仍比用其非无反应性化对应物低3-5倍(表9)。也已经描述了用高剂量的抗原逆转鼠CD4+Th1细胞的无反应性。Schwartz(1990)Science 248:1349-56。有趣的是，用高剂量的交联抗CD3mAb刺激后，无反应性人T细胞的细胞因子产生分布型不适用于Th0、Th1或Th2表型(表9)。Mosmann和Coffman(1989)Ann.Rev.Immunol.7:145-73。这些细胞最突出的特征是其异常高水平的IL-10产生。另外，它们基本上不分泌IL-4，并且IL-2的水平非常低，而其产生IL-5、IFN-γ、TGF-β和TNF-α的水平与人Th0克隆的水平相当(表9)。
表9显示人Tr1细胞的细胞因子产生。CD4+T细胞用交联抗CD3mAb(100ng/ml)在存在(无反应性细胞)或缺乏(对照细胞)IL-10(100U/ml)时刺激。培养10天后，与IL-10培养的细胞用抗CD3mAb(100ng/ml)再刺激时无反应性。然而，这些IL-10无反应性化的CD4+T细胞用高浓度的交联抗CD3mAb(700μg/ml)激活时，部分恢复细胞增殖(24,569cpm)。然而，在缺乏IL-10的情况下培养10天的对照细胞的增殖性应答总是较高(75,236cpm)。在这两个用交联抗CD3mAb(700μg/ml)激活48小时的细胞群体的培养上清液中，通过ELISA测定细胞因子产生的水平。结果表示来自一个代表性实验的数据，并以pg/ml表示。
将来自这两个群体的细胞克隆，扩增后，用交联抗CD3mAb(10μg/ml)和抗CD28mAb(1μg/ml)刺激不同的克隆。在培养48小时后收集的培养上清液中，通过ELISA分析细胞因子的产生。结果表示得自各个T细胞克隆的数据的平均值。
为产生抗原特异性T细胞克隆，用辐射纯化同种异体单核细胞在存在或缺乏IL-10(100U/ml)的情况下刺激来自供体JDV的CD4 T细胞。10天后克隆CD4+T细胞。扩增不同的T细胞克隆，并就对相同同种异体单核细胞的特异性进行选择。为测定细胞因子的产生，用交联抗CD3mAb(10μg/ml)和抗CD28mAb(1μg/ml)激活T细胞，培养48小时后，或对于TGF-β为培养72小时后，收集上清液。表9提出的结果代表来自不同独立实验的合并数据。
表9
从人CD4+T细胞群体分离的最初用交联抗CD3mAb(10μg/ml)在IL-10存在下刺激的T细胞克隆，对其分析揭示，分析的CD4+T细胞克隆的一半也展示出相似的细胞因子分布型，特征为IL-10水平高、IL-2非常低并且没有IL-4分泌(表9)。
人CD4+T细胞克隆或群体以106细胞/ml用交联抗CD3mAb(10μg/ml)和抗CD28mAb(1μg/ml)刺激48小时。通过免疫酶测定，测量IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α和IFN-γ的产生。参见Murphy等(1996)J.Exp.Med.183:901-13。在用OVA肽(1μM)和辐射总脾APC刺激的细胞(10°细胞/ml)培养48小时后，在收集的上清液中通过ELISA测定鼠CD4+T细胞克隆的IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的细胞因子产生。对于TGF-β的测定，在无血清的Yssel氏培养基中培养细胞，在酸激活后，用市售ELISA试剂盒(R&amp;D System)，按照厂商的说明测定TGF-β的量。
相反，从在缺乏IL-10的情况下培养的对照T细胞群体中，仅分离出Th1、Th2和Th0克隆(表9)。因此，在IL-10存在下激活人CD4+T细胞导致产生具有独特细胞因子分布型和增殖能力低的新T细胞亚群。在其功能的基础上，这些细胞在早期文件中命名为Th3细胞，在这里重新命名为Tr1细胞。
从最初用同种异体单核细胞在IL-10存在下刺激的CD4+T细胞群体中，分离出同种抗原特异性Tr1 CD4+克隆(JDV24)和非同种抗原特异性Tr1克隆(JDV15和JDV308)(图9)。相反从最初用同种异体单核细胞在缺乏IL-10的情况下刺激的CD4+T细胞的对照群体中，没有分离出Tr1克隆，而仅分离出Th0(JDV305)和Th1克隆，进一步证明IL-10驱动CD4+T细胞向Tr1表型分化。
也可以从小鼠分离Tr1细胞。OVA特异性CD4+T细胞得自OVA特异性TCR转基因小鼠(Murphy等(1990)Science 250:1920-1722)，所述转基因小鼠已经在IL-10、或IL-10和IL-4的组合物存在下重复刺激，展示出Tr1细胞的细胞因子分布型。参见Murphy等(1996)J.Exp.Med.183:901-13。
胞内细胞因子合成的流式细胞仪分析。通过流式细胞仪进行胞内细胞因子的分析。Kuhn等(1993)Cell 75:263-274。细胞(106细胞/ml)用交联抗CD3mAb和抗CD28mAb(Pharmingen)激活4小时。收、获前2小时，加入10μg/ml的布雷菲德菌素A。收获细胞，将其洗涤，用甲醛(2％)固定。对于胞内染色，将细胞与以下mAb温育抗IL-4-FITC或PE(11B11；5μg/ml)、抗IFN-γ-PE(XMG1.2-PE；5μg/ml)、抗IL-5-PE(TRFK5；2.5μg/ml)、抗IL-10-FITC(JES-16E3；5μg/ml)、抗IL-2-PE(JES6-5H4；2.5μg/ml)或抗克隆型KJ1-26-FITC(5μg/ml)。在FACScanTM(Becton Dickinson)上分析样品。
这些细胞的特征为高水平的IL-10和IL-5分泌以及低水平的IL-2和IL-4分泌(图19)。相反，从仅在IL-4存在下刺激的OVA特异性TCR转基因小鼠分离的对照CD4+T细胞，展示出典型的Th2型分布型，分泌IL-4、IL-5和IL-10(图19)。另外，从已经在IL-10存在下重复刺激的T细胞群体中分离出具有Tr1细胞因子分布型的几种OVA特异性CD4+T克隆。
表10显示得自D011-10 TCR转基因小鼠的L-10无反应性化T细胞的鼠OVA特异性CD4+T细胞克隆的细胞因子产生。来自D011-10转基因小鼠的原初(MEL14 bright)CD4+T细胞在存在或缺乏IL-10(100U/ml)的情况下用OVA肽(0.6μM)刺激。在相同条件下重复刺激后，通过限制稀释，在包被PBS中的50μg/ml抗CD3mAb并含有辐射总脾细胞(107细胞/ml)和20U/ml IL-2的孔中，以0.3细胞/孔克隆来自这两个群体的CD4+T细胞。克隆用IL-2(20U/ml)和IL-4(20U/ml)扩增，并在IL-2和IL-4存在下用OVA肽(2μM)和辐射脾APC(107细胞/ml)重复刺激。然而，从在IL-4存在下刺激的T细胞培养物中没有获得Tr1细胞克隆。扩增后，T细胞克隆用OVA肽(1μM)和辐射脾APC刺激。培养48小时后，在收集的培养上清液中ELISA分析细胞因子。对于TGF-β的测定，在无血清的Yssel氏培养基中培养细胞72小时，在酸激活后，通过ELISA(R&amp;D Systems)按照厂商的说明测定无活性TGF-β的量。结果表示来自代表性实验的合并数据。
表10
与用作对照的代表性Th0克隆(JDV305)相比，用或者交联抗CD3mAb和抗CD28mAb或者同种异体单核细胞(对于JDV24)刺激的人Tr1细胞表现出增殖性应答降低(图20A和图20B)。在补加10％FCS和1％人血清(对于人细胞)或无人血清(对于鼠细胞)的Yssel氏培养基(Yssel等(1984)J.Immunol.Meth.72:219-27)中进行增殖测定。通过用纯化辐射(4,000rad)单核细胞(105细胞/孔)刺激人CD4+T细胞克隆(105细胞/孔)，在圆底96孔板(Linbro)中的200μl中进行同种抗原特异性刺激。于37℃、5％CO2温育5天后，并且随后用3[H]-TdR施加脉冲12小时，然后如所述收获细胞后，测定CD4+T细胞增殖。按先前Groux等(1996)J.Exp.Med.184:1-11所述，用交联抗CD3mAb和抗CD28mAb激活人CD4+T细胞。简而言之，在0.1M pH9.5 Tris缓冲液中，以指定浓度稀释抗体，将板在平底96孔板中于4℃温育1周。洗涤这些板后，加入浓度为5×104细胞/孔的CD4+T细胞，温育3天并用3[H]-TdR施加脉冲12小时后，测定增殖。鼠T细胞克隆的CD4+T细胞群体以5×104细胞/孔的浓度，用OVA肽(0.6μM)和辐射(4000rad)总脾细胞(5×105细胞/孔)刺激3天，然后用3[H]-TdR施加脉冲12小时。
用OVA特异性鼠Tr1克隆和已经在单独的IL-10或与IL-4组合的IL-10存在下重复刺激的OVA特异性T细胞群体，观察到用OVA肽和脾APC相似刺激后增殖性应答的相似受损。相反，Th1克隆(A-7)或已经在IL-4存在下产生的OVA特异性Th2细胞群体的增殖在正常范围内(图20A和20B)。
动力学研究表明，刺激人Tr1克隆后快速产生IL-10，因为IL-10蛋白在激活后8小时的上清液中已经可检测到。相反，得自相同克隆实验的Th0、Th1和Th2克隆的IL-10产生发生相当晚，首先在激活后20小时可检测到。Tr1克隆的快速IL-10产生一般与IL-2产生同时发生，或甚至在其之前发生。早期的内源IL-10产生部分导致Tr1克隆对TCR/CD3刺激应答的低增殖能力(图20A和20B)，因为通过加入中和抗IL-10mAb部分恢复Tr1克隆的增殖，这与显示IL-10防止或抑制T细胞增殖的观察一致。de Waal Malefyt等(1991)J.Exp.Med.174:915-24。相反，抗IL-10mAb对Th1、Th2或Th0对照克隆的增殖性应答无作用(图20A和20B)。
中和抗TGF-βmAb也部分恢复Tr1克隆的增殖(图20A和20B)，而Th1克隆的增殖仍不受影响(图20A和20B)。有趣的是，抗IL-10和抗TGF-β组合物的作用在特异性恢复人Tr1克隆的增殖性应答中具有叠加作用(图20A和20B)。用鼠Tr1细胞获得相似的数据(图20A和20B)，证实这样一种一般原理内源产生的IL-10和TGF-β在控制Tr1细胞的增殖性应答中起主要作用。
Tr1细胞分泌高水平的免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-β以及低水平的T细胞生长促进细胞因子IL-2和IL-4的观察，提示Tr1细胞的抗原特异性激活可能导致抑制旁观(bystander)T细胞的抗原特异性增殖。为解决该问题，用通透孔系统进行共培养实验。为不同JDV克隆自身的人静息CD4+T细胞在底部用供体N的辐射同种异体单核细胞刺激，而在通透孔篮中用供体N的单核细胞刺激同种抗原特异性JDV24和非抗原特异性JDV308 Tr1克隆。在图21A中，表明Tr1克隆JDV24的同种抗原特异性刺激强烈地降低原初人CD4+T细胞的增殖性应答，而非抗原特异性Tr1克隆JDV308无效。在用抗原特异性Th0克隆(JDV305)共培养后，注意到原初CD4+T细胞增殖略微增强(图21A)。加入中和抗IL-10和抗TGF-β部分恢复在Tr1细胞存在下原初CD4+T细胞的增殖性应答，而加入这两个抗体具有叠加作用，将所述D4+T细胞的增殖性应答恢复80％。
用鼠Tr1克隆获得相似的数据。在图20B中，表明原初CD4+T细胞在与OVA肽激活的Tr1克隆或与在IL-10存在下产生的激活Tr1细胞群体共培养后，对OVA肽和脾APC应答的增殖显著降低。相反，对照OVA特异性Th1克隆和在IL-4存在下产生的Th2细胞群体没有抑制作用，反而增强CD4+T细胞的增殖。
再者，加入中和抗IL-10或抗TGF-β抗体部分恢复小鼠T细胞的OVA特异性增殖性应答，而两种抗体的组合物具有叠加作用，将增殖恢复至对照水平的70％(图21B)。这些数据证明，人和小鼠Tr1细胞的抑制作用主要由IL-10和TGF-β介导。
本发现表明，在IL-10存在下刺激CD4+T细胞产生可以通过分泌IL-10和TGF-β向下调节抗原特异性免疫应答的新CD4+T细胞亚群。所述细胞因子分布型看来是稳定的，因为在已经保持培养6个月以上的Tr1克隆激活后产生相同的细胞因子分布型。
T调节细胞已经在口服耐受的的几种模型中进行了描述。Chen等(1994)Science 265:1237-1240；Miller等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:421-5。在Lewis大鼠中用作为口服抗原的髓鞘碱性蛋白刺激后，分离出CD8+调节T细胞(Miller)。这些调节T细胞通过分泌TGF-β介导主动抑制。此外，从SJL小鼠中，在用髓鞘碱性蛋白饲养动物后诱导口服耐受后，分离出抗原特异性调节CD4+T细胞克隆。这些CD4+T细胞克隆在口服耐受诱导后产生的转移，抑制实验性变应性脑脊髓炎。这种抑制由抗TGF-β减轻，提示这些克隆也通过TGF-β介导其抑制。的确，与这里描述的Tr1细胞相对比，这些T细胞克隆产生非常高水平的活性TGF-β(高至1000pg/ml)，而检测到的IL-10和IL-4的水平低。另外，从MBP转基因小鼠分离的T细胞克隆只产生TGF-β，而不产生IL-10、IL-4、IL-2和TNF-α。Weiner等(1996)FASEBMeeting,New Orleans,Louisiana.A2558。因此，这些命名为Th3的鼠T细胞分泌TGF-β作为介导其抑制活性的主要细胞因子。与Th3细胞相反，这里描述的Tr1细胞产生低水平的活性TGF-β。在激活Tr1细胞克隆的上清液中仅检测到微量的活性TGF-β(低于40pg/ml)，而潜伏TGF-β的水平与对照T细胞的水平相当(表9和表10)。此外，这些Tr1细胞产生高水平的引起其抑制活性的IL-10。因此，似乎可能是Tr1细胞通过既分泌IL-10又通过再一待定义机制促进激活TGF-β而起作用。总之，这些数据提示，Th3和Tr1细胞是两个不同群体的CD4+调节T细胞。在口服接触抗原后，特异性地产生前者，并通过分泌TGF-β起作用，后者可能是在淋巴器官中抗原特异性刺激的结果，依赖IL-10的产生。从体内高水平IL-10与同种异体干细胞移植后的耐受有关的SCID患者的外周血中分离相似的Tr1细胞，支持这种假设，并提示通过在IL-10存在下将原初T细胞暴露于同种抗原，可以体内产生Tr1细胞。此外，在Tr1细胞的体外免疫抑制反应性的基础上，人们可能很想推测，这些宿主反应性Tr1细胞在体内具有相似的性质，因此，导致移植耐受。
IL-10缺陷小鼠发展出炎症性肠炎，该病在幼鼠中可通过给与IL-10预防。Kuhn等(1993)Cell 75:263-274。另外，给与IL-10显著抑制通过将CD45RBhiCD4+T细胞转移到SCID小鼠中诱导的结肠炎的发展。powrie等(1994)Immunity 1:553-562。在SCID小鼠中CD45RBhiCD4+T细胞诱导的结肠炎也可以通过共转移CD45RBloCD4+T细胞预防。Powrie等(1993)Int.Immunol.5:1461-1471；Powrie等(1994)J.Exp.Med.179:589-600。然而，所述保护作用被抗TGF-βmAb完全消除。Powrie等(1996)J.Exp.Med.183:2669-74。这些结果证明，在这些预防结肠炎的调节细胞和这里描述的Tr1细胞之间有明显的相似性。应该指出，迄今描述的所有调节细胞均在体内用抗原引发后分离出来。体外抗原暴露后产生Tr1细胞的可能性可以是获得这些细胞用于进一步功能分析和潜在临床应用的一个主要优点。
这些数据综合证明，IL-10在小鼠和人中均诱导产生Tr1细胞，该细胞向下调节抗原特异性T细胞应答，因此对于耐受的一般诱导和保持具有潜在的重要性。
申请人已经于1989年12月20日将携带pH5C、pH15C和pBCRF1(SRα)的大肠杆菌MC1061的各个培养物保藏于美国典型培养物保藏中心，Rockville,MD，美国(ATCC)，保藏号分别为68191、68192和68193。这些保藏物处于这样的条件下在ATCC同意下提供用于专利目的的培养物保藏，这确保美国专利和商标局局长可根据35U.S.C.§122和37C.F.R.§1.14得到该保藏物，并且当颁发美国专利时公众可得到，这需要保持该保藏物。保藏的菌种的可得性不应解释为违背任何政府权威机构根据专利法授权而实施本发明的许可。
为了说明和描述，已经提出了本发明的前述实施方案的描述。它们不是详尽的或将本发明限制于公开的确切形式，显然根据以上内容可以进行许多修改和变化。所述实施方案选择和描述以最好地解释本发明的原理，由此使本领域其它技术人员能够在各种实施方案上并且根据设想的特定用途进行各种修改而利用本发明。本发明的范围由本文所附的权利要求书定义。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人Schering Corporation(ⅱ)发明名称使用白介素-10产生抑制细胞群体(ⅲ)序列数25(ⅳ)通信地址(A)收信人Schering-Plough Corpration(B)街道2000 Galloping Hill Road(C)城市Kenilworth(D)州New Jersey(E)国家美国(F)邮政编码07033(ⅴ)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机Macintosh(C)操作系统7.5.3(ⅵ)当前申请数据(A)申请号(B)提交日期(C)分类(ⅶ)在先申请数据(A)申请号US 08/643,810(B)提交日期1996年5月6日(A)申请号US 07/846,208(B)提交日期1992年5月4日(C)分类(ⅷ)代理律师/代理人资料
(A)姓名Foulke,Cynthia L.
(B)注册号32,364(C)参考/档案号DX0261K1(ⅸ)电讯资料(A)电话908-298-2987(B)传真908-298-5388(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度178个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:1:Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val1 5 10 15Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His20 25 30Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe35 40 45Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu50 55 60Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys65 70 75 80Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro85 90 95Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu100 105 110Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg115 120 125Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn130 135 140Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu145 150 155 160Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile165 170 175Arg Asn(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度170个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:2:Met Glu Arg Arg Leu Val Val Thr Leu Gln Cys Leu Val Leu Leu Tyr1 5 10 15Leu Ala Pro Glu Cys Gly Gly Thr Asp Gln Cys Asp Asn Phe Pro Gln20 25 30Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe35 40 45Gln Thr Lys Asp Glu Val Asp Asn Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu50 55 60Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile65 70 75 80Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro85 90 95Glu Ala Lys Asp His Val Asn Ser Leu Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu100 105 110Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys115 120 125Ser Lys Ala Val Glu Gln Ile Lys Asn Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu130 135 140Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr145 150 155 160Ile Glu Ala Tyr Met Thr Ile Lys Ala Arg165 170(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度160个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型肽(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:3:Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro1 5 10 15Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg20 25 30Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu35 40 45Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala50 55 60Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala65 70 75 80Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu85 90 95Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu100 105 110Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe115 120 125Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp130 135 140Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn145 150 155 160(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度147个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性
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(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(寡核苷酸)(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:18:GATCGATGAC AGCGCCGTAG CCTCAGCCTG AGGGTCTTCA GGTTCTCCCC CAGGGAGTT 59(2)SEQ ID NO:19的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度60个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(寡核苷酸)(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:19:CGATTTCTTC CCTGTCAAAA CAAGAGCAAG GCCGTGGAGC AGGTGAAGAA CGCGTGCATG 60(2)SEQ ID NO:20的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度54个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(寡核苷酸)(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:20:CACGCGTTCT TCACCTGCTC CACGGCCTTG CTCTTGTTTT GACAGGGAAG AAAT 54(2)SEQ ID NO:21的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度58个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(寡核苷酸)(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:21:CGCGTTTAAT AATAAGCTCC AAGACAAAGG CATCTACAAA GCCATGAGTG AGTTTGAC 58(2)SEQ ID NO:22的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(寡核苷酸)(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:22:ACTCATGGCT TTGTAGATGC CTTTGTCTTG GAGCTTATTA TTAAA 45(2)SEQ ID NO:23的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性
(ⅱ)分子类型DNA(寡核苷酸)(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:23:ATCTTCATCA ACTACATAGA AGCCTACATG ACAATGAAGA TACGAAACTG A 51(2)SEQ ID NO:24的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度38个碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(寡核苷酸)(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:24:AGCTTCAGTT TCGTATCTTC ATTGTCATGT AGGCTTCTAT GTAGTTGATG AAGATGTCAA 60ACTC 6430(2)SEQ ID NO:25的信息(ⅰ)顺序特征(A)长度498个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ⅱ)分子类型DNA(寡核苷酸)(ⅹⅰ)顺序描述SEQ ID NO:25:AATTCATGGA GCGAAGGTTA GTGGTCACTC TGCAGTGCCT GGTGCTGCTT TACCTGGCAC 64CTGAGTGTGG AGGTACAGAC CAATGTGACA ATTTTCCCCA GACCTAAGAG ATGCCTTCAG 120TCGTGTTAAA ACCTTTTTCC AGACAAAGGA CGAGGTAGAT AACCTTTTGC TCAAGGAGTC 180TCTGCTAGAG GACTTTAAGG ATGCCAGGCC CTGTCAGAAA TGATCCAATT CTACCTGGAG 240GAAGTCATGC CACAGGCTGA AACCAGGACC CTGAAGCCAA AGACCATGTC AATTCTTTGG 300GTGAAAATCT AAAGACCCTA CGGCTCCGCC TGCGCAGGTG CCACAGGTTC CTGCCGTGTG 360AGAACAAGAG TAAAGCTGTG GAACAGATAA AAAATGCCTT TAACAAGCTG CAGGAAAAAG 420GAATTTACAA AGCCATGAGT GAATTTGACA TTTTTATTAA CTACATAGAA GCATACATGA 480CAATTAAAGC CAGGTGAG 498
权利要求
1．生产药物的方法，所述药物用于通过免疫系统抑制抗原特异性应答，包括对所述抗原后续提呈的抗原特异性应答；该方法包括将有效量的白介素-10与或者所述抗原或者抗CD3抗体混合。
2．权利要求1的方法，其中所述有效量足以降低效应T细胞的激活。
3．权利要求1的方法，其中所述白介素-10为人白介素-10。
4．大致纯的抗原特异性无反应性T细胞，其特征在于再刺激时产生a)低IL-2；b)低IL-5；c)中等IFN-γ；d)低GM-CSF；和e)高IL-10。
5．权利要求4的T细胞，它再刺激时还产生高TNF-α。
6．权利要求4的T细胞，其中所述产生的a)IL-2低于大约500pg/ml；b)IL-5为大约300-3000pg/ml；c)IFN-γ至少为大约1000pg/ml；d)GM-CSF为大约300-3000pg/ml；和e)IL-10至少为大约3000pg/ml。
7．权利要求6的T细胞，其中再刺激时，所述IL-10水平至少为大约Th1细胞的5倍。
8．权利要求4的T细胞，它表现出至少大约21天的抗原特异性无反应性。
9．制备大致纯的权利要求4的抗原特性无反应性T细胞的方法，包括给与所述T细胞前体下述组合物ⅰ)外源IL-10；和ⅱ)或者所述抗原，或者抗CD3抗体。
10．权利要求9的方法，其中所述前体为CD4+T细胞。
11．权利要求9的方法，其中所述IL-10给与至少大约7天。
12．权利要求9的方法，其中所述抗原为蛋白抗原、颗粒抗原、同种抗原、自身抗原或MHC相关抗原。
13．药用组合物，包含IL-10、抗原或抗CD3抗体和药学上可接受的载体。
14．权利要求13的组合物，其中所述IL-10为人IL-10。
15．权利要求13的组合物，其中所述抗原为同种抗原、自身抗原、蛋白抗原；颗粒抗原或MHC相关抗原。
全文摘要
描述了白介素－10用于例如在移植物抗宿主病或组织排斥中产生能够抑制或压抑对同种抗原反应的细胞群体。也描述了白介素－10用于在混合淋巴细胞反应(MLR)中降低反应。外源IL－10或诱导的内源IL－10用来抑制或压抑对同种抗原的反应。
文档编号C12N5/08GK1224465SQ97196131
公开日1999年7月28日 申请日期1997年5月2日 优先权日1997年5月2日
发明者M·G·龙卡罗罗, R·德瓦尔马勒费特, R·巴彻塔, H·M·格劳克斯, J·E·德维里斯 申请人:先灵公司