细胞组合物的制作方法

专利名称：细胞组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞组合物。更具体地说，本发明涉及纯化的造血干细胞组合物。
背景技术：
由于细胞生物学的发展，已揭示了不同细胞的生理性质与功能，发展了把细胞本身用于医疗目的的方法。例如，虽然化疗和放疗已用于治疗癌症，但有时这种治疗方法导致正常细胞致死性的损害，特别是对骨髓细胞。于是为了减少这种危险，提出了自体骨髓移植，即在处理前从病人体内收获骨髓细胞，在处理后送还到该病人体中。此外，近来已发展了通过转移所需外源基因到靶细胞中的称为基因疗法的靶细胞转化技术。例如，当转移一多重抗药性基因到骨髓细胞时，所述细胞获得多重抗药性，因此使运用药物治疗癌症成为可能；由于这些药物对骨髓细胞有剧烈的细胞毒性，因而到现在为止它们没被用于这样的治疗。
发明目的这样，在医学领域，包含合适细胞的组合物或包含适当修饰细胞的组合物是非常重要的。然而，在靶细胞组合物被癌细胞污染的情况下，不能得到充分的治疗效果；特别是当上述多重抗药性基因被转移到癌细胞污染的细胞组合物时，污染的癌细胞也获得多重抗药性，这对所需的癌症治疗产生不利的影响。
本发明的目的是提供一适宜于基因治疗的靶细胞组合物，以及一种获得该组合物的方法；在该组合物中癌细胞已被大致除掉了。
发明概述本发明人发现，通过使用特异性诱导癌细胞细胞凋亡的细胞凋亡诱导物，只有造血干细胞组合物中污染的癌细胞能被特异性地消除掉；而且在用细胞凋亡诱导物处理后，通过转移一所需的外源基因到造血干细胞中去，能安全地进行基因治疗。如此，本发明就完成了。
即本发明的第一方面是细胞组合物，它包含大致无癌细胞的造血干细胞。特别是包含造血干细胞的细胞组合物，通过用对癌细胞特异性的细胞凋亡诱导物从其中已大致消除了癌细胞。其代表例为包含这种造血干细胞的缓冲液。
所述组合物中造血干细胞的量不特别地限制，可根据组合物的特殊用途而确定。另外，该缓冲液可以包含其它的造血细胞、基质细胞等等，并且它可以包含所述造血干细胞的培养基质、一种造血干细胞生长因子、一种干细胞分化因子、一种造血干细胞保护剂等等。
本发明的第二方面是获得包含大致无癌细胞的造血干细胞的细胞组合物的一种方法，特别是包括通过用对癌细胞特异性的细胞凋亡诱导物选择性地消除癌细胞的步骤的方法。
本发明的第三方面是包含大致无癌细胞的、转移了一外源基因的造血干细胞的细胞组合物，特别是包含造血干细胞的下述细胞组合物，所述细胞组合物通过用对癌细胞特异性的细胞凋亡诱导物已大致消除了其中的癌细胞，并于其中转入了一外源基因。
细胞凋亡是细胞死亡的一种方式，它不同于坏死。从形态学的观点来看，细胞凋亡通过核浓缩、细胞皱缩、空泡形成、细胞表面光滑化、细胞破碎等等而产生，并且是程序化细胞死亡的一种代表方式(Nikkei Biotech编辑，Nikkei Biotechnology New Terminology Dictionary，第4版，第21-22页)。
按照本发明，通过使用细胞凋亡诱导物，则所需的、已转入一外源基因的细胞可移植到宿主中，而没有把基因转入癌细胞这样的危险。
本发明的详细描述在本发明中所用的细胞凋亡诱导物就它对癌细胞有特异性细胞凋亡诱导活性而言，不限于特定的一种；细胞凋亡诱导物的选择性可通过用正常细胞和癌细胞来确定。细胞凋亡诱导物的实例包括硫酸化多糖和/或它们的分解产物的诱导物、包含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和/或它们的分解产物的诱导物以及包含由式(1)表示的4,5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的诱导物。
按照本来已知的方法，可以将单独的细胞凋亡诱导物或与一已知的药学上可接受的载体一起配制成药物制剂。该药学上可接受的载体可根据制剂特定的形式而适当地选择；例如，如果是固体制剂的话，可用乳糖、蔗糖、甘露(糖)醇、淀粉、羧甲基纤维素、无机盐等等。通过将上述制剂加入细胞组合物中或将它溶解到细胞组合物中而进行细胞与上述细胞凋亡诱导物的接触。
用于本发明的硫酸化多糖的实例包括岩藻多糖、硫酸葡聚糖等等。
岩藻多糖是在其分子中包含硫酸岩藻糖的多糖。尽管岩藻多糖的存在不限于特定的一类，例如褐藻、海参等等包含岩藻多糖[监督Tokuro Souda，编辑Fujio Egami,“Tatorui-Kagaku(多糖化学)”1995年12月15日由Kyoritsu Shuppan K.K.出版，第319和321页]，已知从褐藻得到的含硫酸岩藻糖的多糖通常被叫作岩藻多糖、岩藻聚糖和墨角藻多糖，并有若干分子种类。在本说明书中，它们全包含于岩藻多糖中；另外，在本发明中，岩藻多糖的分解产物也能使用。
象用于本发明的岩藻多糖一样，从含岩藻多糖物质得到的含岩藻多糖的提取物、或从所述提取物获得的纯化物质也可被运用。按照本来已知的方法可进行含岩藻多糖提取物的制备和提取物的纯化，且它们不限于特定的一种。
此外，岩藻多糖的分解产物是岩藻多糖经酶化学、化学或物理分解而得到的分解产物，任何已知的酶化学、化学或物理方法可用于此。
作为含岩藻多糖的褐藻，有例如Yukio Yamada和Sokichi Segawa描述的那些，参见1977年由HOIKUSHA出版的《日本海藻彩色图解》第22-52页；例如通过用消逝墨角藻(Fucus evanescens)、厚叶日本褐藻(Kjellmaniella Crassifolia)、海带及裙带菜(Undaria pinnatifida)，可制备出岩藻多糖。
作为含岩藻多糖的海参，有例如JP-A4-91027描述的那些，例如，可用刺参和玉足海参通过用其中描述的方法，可制备岩藻多糖。
通过干褐藻、海参等和随后研磨干材料，可制备含岩藻多糖的粉末。此外，通过用热水或稀酸抽提含岩藻多糖的粉末，可制备含岩藻多糖的提取物。
作为用于增加岩藻多糖含量的提取物纯化方法有用氯化钙、醋酸钡等对岩藻多糖进行分级分离；用酸性多糖凝聚剂例如氯化十六烷基吡啶鎓等对岩藻多糖进行分级分离；用酸性多糖凝聚剂在存在碱的情况下对岩藻多糖进行分级分离；凝胶过滤；离子交换层析等等。必要时，可通过联合使用这些纯化方法进行纯化。
作为岩藻多糖的分解方法，可使用分解岩藻多糖的已知方法，例如用岩藻多糖分解酶的方法、酸分解法、超声波法等等。通过上述方法可纯化分解产物。
岩藻多糖分子中有硫酸基团，并且这种基因和各种各样的碱反应生成盐。盐形式的岩藻多糖及其分解产物比具有游离硫酸基团的岩藻多糖及其分解产物更稳定；且它们通常以盐的形式被分离出来，例如以钠盐和/或钾盐等等的形式。通过用例如Dowex 50等阳离子交换树脂处理这些盐，这些盐可产生含游离硫酸基团的岩藻多糖及其分解产物；此外，必要时通过已知的常规盐的取代，可用各种各样其它所需的盐取代这些盐。用药学上可接受的盐作为岩藻多糖及其分解产物的盐，其实例包括与碱金属的盐，碱金属例如钾、钠等；与碱土金属的盐，碱土金属例如钙、镁、钡等；与有机碱的盐，有机碱例如吡啶鎓、铵盐等等。
在岩藻多糖的分子种类中有二组，一组含岩藻糖作为主要的成分；另一组含百分之几的糖醛酸和量相对大量的岩藻糖和甘露糖作为组成糖。在下文，把基本上无糖醛酸的岩藻多糖称作岩藻多糖-F，并把含糖醛酸的岩藻多糖称作岩藻多糖-U，其组合物简单表示为岩藻多糖。
在本发明中，岩藻多糖-F和岩藻多糖-U可各自单独使用，或可将其联合使用。
即用于本发明的细胞凋亡诱导物可包含按照下面实施例1描述的方法制备的、例如有下列物理化学特性的岩藻多糖-U。
(1)组成糖它主要由岩藻糖、甘露糖和半乳糖组成，并包含糖醛酸。
(2)用一种岩藻多糖分解酶将它分解成低分子量产物，该酶由黄杆菌属种名未定菌株SA-0082(FERM BP-5402)产生。
或者，用于本发明的细胞凋亡诱导物可包含按照下面实施例2描述的方法制备、例如有下列物理化学特性的岩藻多糖-F。
(1)组成糖这主要由岩藻糖组成，并基本上无糖醛酸。
(2)使用黄杆菌属种名未定菌株SA-0082(FERM BP-5402)产生的岩藻多糖分解酶，不引起低分子量产物的实际上的分解。
通过用能分解岩藻多糖的微生物，例如上述产生岩藻多糖分解酶的黄杆菌属种名未定菌株SA-0082来处理岩藻多糖，可制备岩藻多糖的微生物分解产物。
此外，用岩藻多糖分解酶例如上述黄杆茵属种名未定株SA-0082产生的岩藻多糖分解酶来处理上述岩藻多糖-U，可制备岩藻多糖-U的酶促分解产物。另外，按照这些分解产物各自的分子量，可从这些分解产物制备分级分离产物。
一般而言，岩藻依取糖易受酸和碱影响；于是，当用酸或碱溶液时，岩藻多糖可被容易地分解成低分子量的产物。通过调节加热温度、时间、pH等等，可制备任何所期望的分解产物；例如，通过凝胶过滤处理、分子量分级分离膜处理等等，可调节平均分子量、分子量分布和分解产物的类似性质。另外，岩藻多糖的分子量和糖组成取决于原料的收获季节和该原料的干燥与贮存的方法以及岩藻多糖的提取条件，例如加热条件、pH条件等等；例如用酸水解岩藻多糖。另一方面，在碱性条件下，由于糖醛酸的β-消除而形成低分子量的产物。因此，至于本文描述的岩藻多糖-U和岩藻多糖-F，它们的分子量和分子量分布仅仅是范例，且它们的分子量和分子量分布随着处理岩藻多糖条件的不同而可迅速地变化。例如，当在100℃加热一小时且用孔径大小为300的分子筛膜脱盐时，可制备分子量分布约为1000至10000的岩藻多糖、岩藻多糖-U或岩藻多糖-F。根据所用条件，可制备任何分子量和分子量分布的岩藻多糖，且在本发明中，可使用包含这些岩藻多糖的细胞凋亡诱导物。
当以1ug/ml或更大的浓度往癌细胞肉汤培养物中加入岩藻多糖或其分解产物时，在加入后的一至数天内，导致癌细胞细胞凋亡；由此显示出岩藻多糖或其分解产物的强烈的细胞凋亡诱导活性。另一方面，这些产物不诱导正常细胞的细胞凋亡，且对正常细胞不显示出任何毒性。特别是，得自可食用褐藻和海参的岩藻多糖及其分解产物是非常安全的，因为从天然存在的材料获得它们，且通过口服喂食老鼠，没观察到毒性。
至于把岩藻多糖用作细胞凋亡诱导物，可将岩藻多糖和/或其分解产物与已知的药学上可接受的载体结合，以获得药用制剂，且该药用制剂可被允许与所需细胞进行接触。
硫酸葡聚糖是葡聚糖的硫酸酯；葡聚糖是D-吡喃葡萄糖通过α-1,6-(糖苷)键连接而成的聚合物，且由微生物产生，例如由肠膜明串珠菌产生。在本发明中，可用市售硫酸葡聚糖。
当添加硫酸葡聚糖或其热处理产物到癌细胞肉汤培养物时，在加入后一至数天内导致癌细胞细胞凋亡；由此显示出硫酸葡聚糖或其分解产物具有诱导细胞凋亡的活性。至于把硫酸葡聚糖用作细胞凋亡诱导物，可将它与已知的药学上可接受的载体结合，以获得药用制剂，且该药用组合物可被允许与所需细胞进行接触。
另外，含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物，是从分子中含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的多糖、寡糖及单糖中选出来的；就它们具有的细胞凋亡诱导活性而言，并不特定地限于特定的一种化合物。
含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的多糖的实例包括果胶、果胶酸、藻酸、透明质酸等等。
含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的寡糖的实例包括从上述多糖得到的寡糖，它们可以按照已知方法产生。此外，本发明也包括用合成方法合成的寡糖。
糖醛酸和糖醛酸衍生物的实例包括半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸它们的内酯、它们的酯(例如甲酯)以及其酰胺，通过已知的方法可生产它们。
用于本发明的、含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物且具有细胞凋亡诱导活性的糖类化合物，可用含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物作为原料来生产。虽然原料来源和生产方法不限于特定的一种，但例如通过用含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物作为组成成分的多糖，例如果胶和果胶酸，可生产该糖类化合物。此外，在糖类化合物的生产中，尽管其生产方法不限于特定的一种，可用例如单一的化学法、酶法或物理生产法或者这些方法的组合，从原料生产出它们。
例如，作为生产用于本发明的糖类化合物的化学处理，将原料于室温至200℃处理数秒至数小时，最好于50至130℃处理几秒至60分钟。例如，在果胶的实例中，在pH 6.8、95℃的条件下处理几秒至几分钟导致β-消去反应，从而得到含不饱和糖醛酸和/或不饱和糖醛酸衍生物的糖类化合物，其在235nm的光吸收增加。本发明的糖类化合物包括含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的多糖经β-消去反应而形成的在其非还原末端具有不饱和糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的那些糖类化合物。
作为生产用于本发明的糖类化合物的酶处理，用酶水解分解含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的多糖是众所周知的。所述处理还包括已知用该类多糖的裂解酶类的含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物多糖的分解。例如，在果胶和果胶酸的实例中，通过分别用已知的果胶裂解酶(EC4.2.2.10)、果胶酸裂解酶(EC4.2.2.2)及聚半乳糖醛酸外切裂解酶(EC4.2.2.9)对其进行分解，形成具有4-脱氧-L-苏-己-4-烯吡喃糖醛酸酯(4-deoxy-L-threo-hexa-4-enopyranosyl uronate)或在其非还原末端形成甲酯的糖类化合物，从而可得到用于本发明的糖类化合物。此外，如果是透明质酸，用透明质酸裂解酶(EC4 2.2.1)，如果是藻朊酸，用藻朊酸裂解酶(EC4.2.2.3)。
作为生产用于本发明的糖类化合物的物理处理，其实例包括用近红外线、红外线、微波、超声波等等处理。例如，将果胶和/或果胶酸加入中性或碱性pH溶液中，并在高于室温的适当温度下和例如在存在维生素C下的合适的还原条件下，使其受声波处理达1秒或更长的时间以产生振动能，时间最好为5秒至1小时。如上所述，除超声波之外，微波、近红外线和红外线辐射也有效，且可用它们联合照射。可连续或间歇地进行照射。
通过用含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物作为原料，可生产含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物且具有将用于本发明的细胞凋亡诱导活性的糖类化合物的分解产物。尽管分解产物的生产方法不限于特定的一种，例如用化学法、酶法及物理生产法或其相结合的方法，由原料生产出它们。
所用的上述分解产物的实例包括含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物的热处理产物。
作为用于上述热处理产物的生产中的热处理方法，例如所述糖类化合物在例如65至350℃热处理几秒到几天，优选80至150℃几分钟至几天，以获得具有细胞凋亡诱导活性的热处理产物。
待用作糖类化合物的果胶不具体限制，例如为提取自柑桔果实的果皮和苹果的果实高的分子量多糖。工业生产果胶的原料是果实；除了例如柠檬、酸橙等等这些柑桔属果实榨汁后剩下的渣滓之外(主要为内皮)，可用从苹果获得汁后剩余的渣滓。这些渣滓主要含原果胶，并且在制备果胶的生产步骤中，果胶被溶解(抽提)出来。用酸性温水或酸性热水抽提，可进行增溶；且根据所用原料，通过控制提取温度、pH和时间，可高产量地获得具有稳定分子量和酯化度的果胶。通过离心或过滤可纯化提取物，并可浓缩该提取物；加乙醇到提取物中能沉淀果胶，且可回收果胶。可干燥沉淀，并研磨制成所需干果胶。
果胶的主要结构为部分甲基化的半乳糖醛酸的聚合物，该羧基可用甲基酯化或可游离。或者，该羧基可形成铵盐、钾盐或钠盐。按照果胶用甲基酯化的程度(DM度甲氧基与全部羧基之比)，把果胶分为具有高DM度的HM果胶和具有低DM度的LM果胶(TomoshiYoshizumi等编辑，Shin-Shokuhin Kaihatuyou Sozai Binran(《食品开发的新材料手册》)，第114-119页，由Korin Shoten于1991年出版]。在本发明中，可用作为添加剂的市售果胶[Akio Tonoyama编辑，Tennenbutsu Binran(《天然物质手册》)第12版，第138页，由Shokuhinto Kgaku Sha于1993年出版]、市售HM果胶、市售LM果胶(参见上述《食品开发的新材料手册)》)等等。
在本发明中，可用果胶和果胶酸的分解产物。作为果胶的分解方法，例如有诸如酸处理、碱处理等等的化学分解法；诸如超声处理、热处理、压力处理、压力及热处理等等的物理分解法，或酶促分解法。
用于本发明的含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和/或其分解产物包括其药学上可接受的盐。
至于用作细胞凋亡诱导物，含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物及/或其分解产物可与已知的药学上可接受的载体结合，以制备药物制剂。
当把含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和/或其分解产物力入癌细胞肉汤培养物中时，在加入后一至数天，导致癌细胞细胞凋亡，而且，它们对正常细胞不显示任何毒性。
含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物的糖类化合物和/或其分解产物得自天然存在的材料，且经口和非肠道将其给予小鼠时，没观察到毒性。
用于本发明并由式(1)表示的具有细胞凋亡诱导活性的4,5-二羟基-2-环戊烯-1-酮(在下文简称为环戊烯酮)可由化学合成而合成出来[Carbohydrate Res,247,217-222(1993)；和Helvetica Chimica Acta,55,2838-2844(1972)]，且反式和顺式同分异构体都能用于本发明。
此外，当D-葡萄糖醛酸水溶液在121℃受到4小时热处理时，在热处理材料中可形成环戊烯酮。用溶剂抽提热处理材料中的环戊烯酮，并浓缩提取物。然后，用硅胶柱层析分级分离浓缩物；将洗脱出的环戊烯酮部分浓缩，然后用氯仿从浓缩物中抽提环戊烯酮。浓缩该提取物并用正常相柱层析过柱分离，以获得纯化的环戊烯酮。
环戊烯酮的物理性质如下在下面的性质中，分别用DX 302质谱仪(由Nippon Denshi制造)进行质量分析；用JNM-A500(由NipponDenshi制造)测定使用氘化氯仿溶剂的核磁共振谱；用DIP-370旋光计(由Nippon Bunko制造)测定比旋光度；用UV-2500分光光度计(由Shimadzu制造)测定紫外吸收光谱；并用FTIR-8000红外分光光度计(由Shimadzu制造)测定红外吸收光谱。
MS m/z 115[M+H]+1H-NMR(CDCl3)δ4.2(1H,d,J=2.4Hz,H-5),4.83(1H,m,H-4),6.30(1H,dd,J=1.2,6.1Hz,H-2),7.48(1H,dd,J=2.16.1Hz,H-3)，如果把CHCl3的化学位移值看作7.26ppm，则1H-NMR的化学位移值显示如上。
比旋光度[α]20D0°(C=1.3,H2O)IR(KBr):3400,1715,1630,1115,1060,1025cm-1紫外线λ最大215nm(H2O)至于把环戊烯酮用作细胞凋亡诱导物，可将它与已知的药学上可接受的载体结合，以获得药物制剂。
当把环戊烯酮加入癌细胞肉汤培养物中时，在加入后的一至数天内导致癌细胞细胞凋亡，而且它对正常细胞不显示出任何毒性。
用于本发明的环戊烯酮对小鼠不显示出任何毒性。
造血干细胞是具有分化能力的细胞，能从单一的细胞分化成熟的血细胞，例如红血球、粒细胞、血小板、淋巴细胞等(多能性)，造血干细胞也具有自我复制的能力。
造血干细胞用于(1)造血干细胞缺陷型宿主造血系统的更新；(2)在给药、照射等之前从患病的宿主收获骨髓，从该骨髓制备造血干细胞；对其处理后，通过再移植于宿主而进行治疗；(3)产生不同的造血细胞；以及(4)尤其通过转入基因到自体的造血干细胞中，以治疗疾病。
为了获得造血干细胞，必需从骨髓细胞群体或其它造血源中分离制备多功能的造血干细胞。首先，可从骨髓源获得骨髓细胞；骨髓源例如髂嵴、胫骨、股骨、脊椎或其它骨腔。其它造血细胞源包括胚胎卵黄囊、胎肝、胎脾和成人脾以及血液，例如外周血及脐带血。
作为分离造血干细胞及制备其组合物的方法，虽然现在可用任何已知的方法，但制备造血干细胞组合物的一种最简单最有效的方法是JP-A7-313150公开的方法；由该方法可制备基本上均质的人造血干细胞组合物。例如通过用包裹一种抗体的磁珠的磁分离、亲和层析、使用单克隆抗体等，来获得含所需细胞的组分，并通过荧光活化的细胞分选器将该组分进一步分离以获得所需细胞。将该细胞悬浮于缓冲培养基中。
含所分离的造血干细胞的组合物可根据特定的目的而使用。然而，如果该组合物被癌细胞污染，可能会依该组合物的用途而产生各种各样的问题。
因而，通过使用对癌细胞特异性的细胞凋亡诱导物，本发明人在仅仅消除掉存在于造血干细胞组合物中的癌细胞方面已获成功。
本发明的细胞凋亡诱导物可以以足以诱导癌细胞细胞凋亡且仅消除癌细胞的浓度使用。可简易地把细胞凋亡诱导物加入造血干细胞肉汤培养物中；而且，在制备造血干细胞组合物期间的任何合适的步骤中，可加入细胞凋亡诱导物。然而，在造血干细胞组合物制备后立即加细胞凋亡诱导物于其中，可获得最有效的结果。
本发明的细胞组合物是包含如此获得的造血干细胞的组合物，并可用本来已知的方法制备。组合物中造血干细胞的量不被特别地限制，并可根据组合物的特定用途而确定该量。另外，该组合物可包含其它造血细胞、基质细胞等等，并且它还能包含一造血干细胞培养基质，一种造血干细胞生长因子、一种干细胞分化因子、一种造血干细胞保护剂等等。
按照本发明，甚至可从患有多发性骨髓瘤病人的外周血中制备造血干细胞组合物，在这种造血干细胞组合物中找不到癌细胞，即，癌细胞被从中大致消除了；从患多发性骨髓瘤病人获得无癌细胞的造血干细胞组合物，在现在则被认为是最困难的[Blood,86,381-389(1995)]。
用一种已知的方法，例如在前面JP-A 7-313150中描述的方法可增殖所制备的造血干细胞组合物。例如，在含一种保持因子或其同类物的培养基中，可通过与基质细胞的共培养而增殖该造血干细胞组合物。
造血干细胞可被用作基因转移的靶细胞。虽然按照已知的方法可将基因转入靶细胞，但作为把基因转入例如造血干细胞之类的靶细胞的方法，最有效的方法是1995年公布的WO 95/26200中公开的方法。
本发明中转入靶细胞的基因，即外源基因，可以是任何希望转入到细胞中的基因。例如，外源基因可以是编码例如腺苷脱氨酶(ADA)之类与疾病相关蛋白的基因，可以是编码反义核酸或核酶的基因，或者可以是编码假引物(例如参见1990年11月15日公布的WO90/13641)、细胞内抗体(例如参见1994年2月3日公布的WO94/02610)、生长因子等等的基因。
在适合于控制这些外源基因表达的启动子的控制下，可将这些外源基因转入靶细胞；通常，该启动子为外源启动了。此外，必要时，可加入启动子以外的表达控制因子，例如终止子序列和增强子序列。
通过用例如逆转录病毒载体，可进行转移基因到造血干细胞中去。所述载体可包含诸如如抗生素抗性基因之类的标记基因，以致于已转入所需基因的细胞能被容易地选择出来。用于本发明的代表性的载体的实例包括N2/Zip TKNEO(TKNEO)载体(效价1×105G418r cfu/ml，在NIH 3T3细胞上)、Zip PGK-hADA载体、ZipPGK-mADA载体等等。它们全都由Moritz等报道过(J.Exp.Med,178,529(1993))。
TKNEO载体具有由单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子表达的新霉素磷酸转移酶基因。用该载体转入了所需基因的细胞，可通过利用由标记基因提供的新霉素抗性选择出来。在ZipPG K-hADA载体中，由人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子表达人ADA(hADA)cDNA。该基因是该载体唯一可表达的基因，且该载体没有任何可选择的标记基因。ZipPGK-mADA(PGK-mADA)载体，除了用鼠ADA(mADA)cDNA替代人ADA cDNA外，它与ZipPGK-hADA载体是一样的。这些载体和其它病毒载体的性质和生产方法是众所周知的，给出了本文的说明书，载体的选择和使用则完全在本领域技术人员的技术范围内。
已转入所需基因的造血干细胞组合物可用于遗传疾病的治疗。通过移植含有能弥补致病基因缺陷或异常的基因的自体或同种异体造血干细胞组合物，可治疗与造血细胞相关的遗传病。
例如，由于已鉴定出象β-地中海贫血症(地中海贫血症)、镰状细胞贫血症、ADA缺陷、重组酶缺陷、重组酶调节基因缺陷等等这类疾病的致病基因，因而可通过同源或随机重组，将正常的野生型基因转入到造血干细胞的基因中，并移植所述细胞到病人体内，以进行治疗。
此外，如果是同种异体造血干细胞，可用无异常基因的正常造血干细胞进行治疗。
基因治疗的另一应用是通过转入抗药性基因到正常的造血干细胞中，供给该细胞抗药性，从而使以通常认为是危险的高浓度使用药物成为可能。特别是，通过将一种对抗癌药物有抗药性的基因(例如多重抗药性基因)转入按照本发明得到的大致无癌细胞的造血干细胞组合物，则可能使用高浓度的该抗癌药物进行治疗。
甚至对于造血系统相关疾病以外的那些疾病，在所述疾病涉及诸如激素、酶、细胞因子、生长因子等等分泌蛋白缺乏的情况下，可以用造血干细胞进行治疗。通过转移在一合适启动子控制下的编码该缺乏蛋白的基因到造血干细胞中，可诱导并表达所缺乏的蛋白；即使由与正常表达该蛋白的细胞类型不相同的细胞类型的细胞表达该蛋白，也能控制表达，使得所得到的活性与由其天然表达所得到的活性相同。
除了如上所述对基因的缺陷和异常弥补之外，可将编码核酶、反义核酸或其同类物的基因或者另一合适的基因插入到细胞中，以控制所述细胞中特定基因产物的表达或抑制患病的倾向，特别是抑制患血液病的倾向。
例如，对例如HIV、HTLV-Ⅰ、HTLV-Ⅱ等等血液病原体，人们可使造血干细胞受到基因修饰，而在造血干细胞或从造血干细胞分化出的细胞中表达反义核酸或核酶，所表达的反义核酸或核酶能阻止上述病原体在造血干细胞或在从其分化出的细胞中生长。
或者，在细胞表面受体中，可从属于T细胞的细胞消除特定的分子。即，通过运用由同源重组而产生的受体基因的基因修饰，或者通过用抑制受体基因表达的反义核酸或核酶，可抑制特定受体的表达。
例如，通过常规的静脉内注射，可将如此得到的、已转入一基因的造血干细胞组合物引入脊椎动物体中，该脊椎动物是细胞移植的受体。虽然优选的受体是供体本身，但可进行同种异体的移植。特别是，当脐带血细胞用于移植时，最好是同种异体移植。
通过使用本发明的具有癌细胞选择性的细胞凋亡诱导物，可选择性地除去用于基因转移的靶细胞组合物中的癌细胞。靶细胞不特别地限制，且其实例包括选自干细胞、造血细胞、原生殖细胞、卵母细胞、卵原细胞、卵细胞、精母细胞、精子、CD34+细胞、C-药盒+细胞、淋巴细胞、B细胞、T细胞、骨髓细胞等等的细胞。按照已知的方法可分别制备包含这些细胞的组合物。
此外，当胚胎干细胞、原生殖细胞、卵母细胞、卵原细胞、卵细胞、精母细胞、精子等等用作靶细胞时，可简单而容易地产生转基因的脊椎动物。
下面的实施例进一步详细地说明本发明，但不应解释为限制本发明的范围。在下面的实施例中，所有的％都按重量表示。实施例1(1)彻底地干燥厚叶日本褐藻后，用一空的M-2粉磨机(由NaraKikai Seisakusho制造)将该海藻(2千克)磨成粉，并将该干粉悬浮于80％的乙醇(9升)中。于80℃处理该悬浮液2小时，然后通过滤纸过滤以得到滤渣；将该滤渣用同样的乙醇洗涤及过滤步骤反复处理三次，以获得用乙醇洗涤过的残余物。将该残余物悬浮于0.2M醋酸钙溶液(36升)中，于95℃处理该悬浮液2小时并过滤。所产生的渣滓用0.2M醋酸钙溶液(4升)洗涤并将此洗涤液与上述滤液合并，以得到厚叶日本褐藻的岩藻多糖提取物(36升)。
用配备了超滤膜的超滤装置将该滤液浓缩至2升，该超滤膜的排阻分子量为10万。以终浓度为1.5M加氯化钠于该浓缩液中，然后加入5％的氯化十六烷基吡啶鎓，其加入量使得不再形成沉淀。通过离心除去形成的沉淀，用超滤将所产生的上清液浓缩到1升，并往其中加入(4升)乙醇。通过离心收集所产生的沉淀，加(100ml)4M氯化钠到该沉淀中，充分搅拌后，以终浓度为80％加入乙醇。搅拌该混合物并且离心，以获得沉淀。通过同样的悬浮于80％乙醇且离心的步骤，使所产生的沉淀受到反复处理，直到上清液在260nm的光吸收消失为止。将该沉淀溶解于(2升)2M氯化钠中，并通过离心除掉不溶物。然后，往所产生的上清液中加DEAE-Cellulofine A-800(由Seikagaku Kogyo生产，50ml)，并搅拌此混合物，接着通过过滤除去添加的树脂。把该滤液上柱，该柱为用2M氯化钠平衡的DEAE-Cellulofine A-800柱；并用一台超滤装置对未吸附的组分进行超滤，以完全除去生色物质和氯化钠，上述超滤装置配备一种中空纤维，其排阻分子量为10万或更小。然后，通过离心及过滤除去不溶物，并将滤液冻干以制备岩藻多糖-U；此干岩藻多糖-U的量为15克。
用Sephacryl S-500通过凝胶过滤测定了所产生的岩藻多糖-U的分子量；它显示出具有中位值约为19万的分子量分布。
(2)

图1显示在存在过量的氯化十六烷基吡啶鎓时，上述的岩藻多糖-U和在下文实施例2中制备的岩藻多糖-F在不同浓度氯化钠下的沉淀形成特性。
在图1中，垂直轴表示沉淀形成速率(％)，且水平轴表示氯化钠的浓度(M)。在图1中，实线和空心园表示在各个氯化钠浓度下的岩藻多糖-U的沉淀速率。在图1中，虚线和空心三角表示在不同氯化物浓度(M)下，岩藻多糖-F的沉淀形成速率。
在溶液温度为37℃的条件下，如下测定沉淀形成速率。
岩藻多糖-U和岩藻多糖-F以2％的浓度分别溶于水和4M氯化钠中，并以不同的比例混合所产生的溶液，以制备具有不同氯化钠浓度的岩藻多糖-U的溶液同岩藻多糖-F的溶液(每份125μl)。另一方面，在水和4M氯化钠中以2.5％的浓度分别溶解氯化十六烷基吡啶鎓，并将它们混合以便制备具有不同氯化钠浓度的1.25％的氯化十六烷基吡啶鎓溶液。
为了用1.25％的氯化十六烷基吡啶鎓溶液把岩藻多糖-U同岩藻多糖-F从其2％的水溶液中完全沉淀出来，需要3.2倍岩藻多糖溶液体积的氯化十六烷基吡啶鎓溶液。于是，将加400μl各个氯化物浓度的氯化十六烷基吡啶鎓溶液加入125μl各个氯化物浓度的2％的岩藻多糖-U溶液和岩藻多糖-F溶液中，并充分搅拌所产生的混合物。让所述混合物静置30分钟，然后离心。用苯酚-硫酸法[Analytical Chemistry,28350(1956)]测定上清液中的糖类含量，以计算在各个氯化钠浓度下岩藻多糖的沉淀形成速率。
(3)用下面的方法分析上述岩藻多糖-U的成分。
首先，根据Journal of Biological Chemistry,175,595(1948)]的描述，测定岩藻糖的量。
以0.5％的浓度将所得到的干燥的标准岩藻多糖-U溶解于1N的盐酸中，并通过在110℃处理2小时，将其水解成组成单糖。通过水解得到的单糖的还原端用GlycoTAGTM和GlycoTAGTM试剂盒(两者皆由Takara Shuzo生产)进行吡啶基-(2)-氨基化(PA衍生物)，并经过HPLC测定所述组成糖的比例。
其次，按照Analytical Biochemistry,4,330(1962)的描述，测定糖醛酸。
此外，按照Biochemical Joumal,84,106(1962)的描述，测定硫酸的含量。
结果，岩藻多糖-U的组成糖是岩藻糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、木糖和糖醛酸。
不含任何其它的中性糖。主要成分的摩尔比是岩藻糖∶甘露糖∶半乳糖∶糖醛酸∶硫酸酯基约为10∶7∶4∶5∶20。
(4)如下测定岩藻多糖-U的结构
(4)-1将下述的内切型岩藻多糖分解酶与纯化的岩藻多糖-U反应，并纯化所产生的分解产物。
即，将1％的岩藻多糖-U溶液(16ml)、50mM磷酸缓中液(pH 8.0,12ml)、4M的氯化钠溶液(4ml)和下述的内切型岩藻多糖分解酶溶液(32U/ml,8ml)混合，并于25℃让该混合物反应48小时。当反应进行时，辨认出了230nm处的光吸收增加，表明该岩藻多糖-U被该酶分解了。
反应混合物用Microancilyzer G3(由Asahi Kasei生产)脱盐后，把反应混合物分成(a)、(b)和(c)三个组分，并用DEAE Sepharose FF(由Pharmacia生产)纯化。
内切型岩藻多糖分解酶可制备如下用于生产内切型岩藻多糖分解酶的微生物菌株可以是任何能够产生所述内切型岩藻多糖分解酶的菌株，其实例包括种名未定的黄杆菌属菌株SA-0082(FERM BP-5402)。
该菌株被研究过且新近从日本青森的海水中获得，并且该菌株被表示为种名未定的黄杆菌属菌株SA-0082；按照《布达佩斯条约》自1995年3月29日(最初保藏日)以来，该茵株以保藏号FERM BP-5402已保藏于日本工业科学与技术局的国立生命科学和人类技术研究所，它位于1-3,Higashi l chome,Tsukuba-shi,Ibaraki-ken。
至于可被产内切型岩藻多糖分解酶菌株同化的营养源，可以加任何营养源到该菌株的培养基中。碳源的实例包括岩藻多糖、海藻粉、藻朊酸、岩藻糖、葡萄糖、甘露醇、甘油、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉等等。合适的氮源实例包括酵母膏、蛋白胨、酪蛋白氨基酸、玉米浆、肉膏、脱脂大豆、硫酸铵、氯化铵等等。另外，也可加入无机物，例如钠盐、磷酸盐、钾盐、镁盐、锌盐等等以及金属盐。
对于内切型岩藻多糖分解酶产生茵的培养，虽然产量依培养条件而变化，但一般而言，培育温度最好为15℃至30℃，培养基pH最好为5-9；并且通过5至72小时的通气搅拌培养，内切型岩藻多糖分解酶的产量达到最大值。自然，设定培养条件以便获得内切型岩藻多糖分解酶的最大产量。
内切型岩藻多糖分解酶既存在于微生物细胞中，又存在于培养上清液中。
在一合适的培养基中培养上述名未定的黄杆菌属茵株SA-0082，并收集其细胞，用常规的细胞破碎方法破碎其细胞。例如用超声波处理获得无细胞的提取物。
然后，可用常规的纯化方法从该提取物获得纯化的酶标准；例如，可通过盐析、离子交换柱层析、疏水键柱层析、凝胶过滤柱层析等等来进行纯化，以获得无其它岩藻多糖分解酶的纯化的内切型岩藻多糖分解酶。
此外，由于大量的酶(胞外酶)存在于培养上清液中，该培养上清液通过从上述内汤培养物除去细胞而得到，因而可用与纯化胞内酶方法相同的方法纯化胞外酶。
纯化内切型岩藻多糖分解酶的实施方案如下把由含(0.25％)葡萄糖、(1.0％)蛋白胨及(0.05％)酵母膏的人造海水组成的(600ml)培养基(由Jamarine实验室生产，pH 7.5)装入一个2升的锥瓶中，接着(在120℃)灭菌(20分钟)。接种种名未定的黄杆菌属菌株SA-0082(FERM BO-5402)到2升锥瓶里的(600ml)培养基中，并在24℃培育24小时以获得种子肉汤培养物。将含(0.25％)葡萄糖、(1.0％)蛋白胨、(0.05％)酵母膏和(0.01％)消泡剂(由Shinetsu Chemical生产)的人造海水组成的(20升)培养基(由Jamarine实验室生产，pH 7.5)置于一个30升的发酵罐中，并在120℃灭菌20分钟。冷却后，用上述(600ml)种子肉汤培养物接种，并在10升/分的通气量和以125 r.p.m.搅拌的培养条件下，于24℃培育24小时。培养结束后，离心肉汤培养物以获得微生物细胞。
将该细胞悬浮于含200mM氯化钠的20mM醋酸盐-磷酸盐缓冲液中(pH 7.5)，接着经超声波和随后的离心，以获得细胞提取物。细胞提取物中的本发明内切型岩藻多糖分解酶的活性被测定时，检测出肉汤培养物的活性为5mU/ml。活性的测定将在下文说明。
以终浓度为90％饱和度往该提取物中加入硫酸铵，并搅拌该混合物以溶解硫酸铵。将该混合物离心，并将所产生的沉淀悬浮于与上述微生物细胞提取缓冲液同样的缓冲液中。对含50mM氯化钠的20mM醋酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 7.5)充分透析该悬液。通过离心除去产生于透析的沉淀，然后将该上清液过用一个含50mM氯化钠的20mM醋酸盐-磷酸盐缓冲液(pH 7.5)平衡的DEAE Sepharose FF柱。用同样的缓冲液彻底洗涤该柱吸附的材料，并用50mM至600mM线性浓度梯度氯化钠洗脱该柱，以收集活性组分。接着，以终浓度为4M往该活性组分中加入氯化钠。将该组分过一个用含4M氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH 8.0)平衡的苯基Sepharose CL-4B柱(由Pharmacia生产)。用同样的缓冲液彻底洗涤该吸附物，并用4M到1M线性浓度梯度的氯化钠洗脱该吸附物以收集活性组分。然后，用超滤器浓缩该活性组分，并用Sephacryl S-300(由Pharmacia生产)对该浓缩物进行凝胶过滤层析，以收集活性组分，该Sephacryl S-300先用含50mM氯化钠的10mM磷酸缓冲液平衡。当根据在Sephacryl S-300柱上的保留时间来确定的分子量时，它约为46万。此外，用含25mM氯化钠的10mM磷酸缓冲液(pH 7)透析该活性组分。将该酶溶液过一个用含250mM氯化钠的10mM磷酸缓冲液(pH 7)平衡的Mono Q HR5/5柱(由Pharmacia制造)，用同样的缓冲液彻底洗涤该吸附剂，并用250mM至450mM线性浓度梯度的氯化钠洗脱该柱以收集活性组分，如此，得到纯化的酶。这些生产步骤显示于表1中，通过测量该酶溶液在280mM的光吸收来进行蛋白的测定，在该测定中，把1mg/ml蛋白溶液的光吸收看作1.0。
表1
该酶的活性如下测定将从厚叶日本褐藻(50μl)得到的2.5％的岩藻多糖溶液、酶溶液(10μl)及含667mM氯化钠的83mM磷酸缓冲液(pH 7.5)(60μl)混合，并让它们在37℃相互反应3小时；接着，将酶反应混合物(105μl)与水(2ml)混合，搅拌此混合物并于230nm测定其光吸收(AT)。作为对照，通过仅用用于溶解该酶的上述缓冲液代替该酶溶液在同样的条件下进行反应，及通过仅用水代替岩藻多糖溶液在同样的条件下进行反应；且测定该反应混合物的光吸收(AB1和AB2)。
将每分钟消去性地裂解1μmol甘露糖和糖醛酸之间的糖苷键所需要的酶量定义为1个酶单位(U)。通过把经消去反应形成的不饱和糖醛酸的mmol摩尔光吸收指数看作5.5，以计算键，来进行被裂解键的测定；通过下列等式计算酶活(AT-AB1-AB2)×2.105×120/5×105×0.01×180=U/ml其中2.015是测定光吸收的样品溶液的量(ml)；120是酶反应混合物的量(μl)；5.5是不饱和糖醛酸在230nm的mmol摩尔光吸收系数(/mM)；105是被稀释的反应混合物的量(μl)；0.01是酶溶液的量(ml)；180是反应时间(分钟)。
从厚叶日本褐藻得到的、用作底物的岩藻多糖如下制备用一空的M-2粉磨机将干燥的厚叶日本褐藻磨成粉，接着在70℃在10倍体积85％的甲醇中处理2小时，并过滤。于70℃在10倍体积的甲醇中处理所产生的滤渣2小时，接着过滤。向该滤渣加入20倍体积的水，并于100℃处理该混合物3小时，过滤它以获得提取物。把该提取物的盐浓度调整到与400mM氯化钠溶液的浓度同一样的浓度，然后，向其中加入氯化十六烷基吡啶鎓直到不再形成沉淀为止，离心此混合物。用乙醇充分洗涤沉淀，并在完全除去氯化十六烷基吡啶鎓后，脱盐；用一超滤装置进行低分子量物质的去除(超滤膜的排阻分子量10万，膜由Amicon生产)。通过离心除去形成的沉淀，冻干该上清液以获得纯化的厚叶日本褐藻的岩藻多糖。
(4)-2上述内切型岩藻多糖分解酶通过一消去反应裂解存在于复合多糖中的D-甘露糖和D-葡萄糖醛酸之间的α1→4键。当该酶与岩藻多糖反应时，形成具有由下面式(2)、(3)及(4)表示的结构的寡糖。

然后，用GlycoTAG和GlycoTAG试剂盒对上述用DEAE SepharoseFF(柱)分离且纯化的(a)、(b)及(c)三组分的各个部分进行其还原末端的吡啶基-(2)-氨基化作用(PA衍生物)，以分别获得糖类的PA衍生物(PA-a)、(PA-b)和(PA-c)。用HPLC对(PA-a)、(PA-b)和(PA-c)进行分析，以检查它们和三种寡糖PA衍生物间的差异，所述PA衍生物具有由上面(2)、(3)和(4)式表示的结构。
HPLC条件如下(ⅰ)运用分子量级分柱(molecular weight fraction column)的HPLC分析。
仪器L-6200 (由Hitachi Seisakusho制造)柱SHODEX SB-803(4.6×250mm)(由Showa Denko制造)洗脱溶液0.2M氯化钠∶二甲亚砜=9∶1检测用激发波长为320nm的荧光检测器F-1150(由HitachiSeisakusho制造)，在400nm的荧光波长下进行检测。
流速1ml/分钟。
柱温50℃。
(ⅱ)运用反相柱的HPLC分析仪器L-6200(由Hitachi Seisakusho制造)柱L-柱(4.6×250mm)(由Kagaku Yakuhin Kensa Kyokai制造)洗脱溶液50mM乙酸-三乙胺(pH 5.5)。
检测用激发波长为320nm的荧光检测器F-1150(由HitachiSeisakusho制造)，在400nm的荧光波长下进行检测。
流速1ml/分钟。
柱温40℃。
作为上面二项HPLC分析的结果，发现通过用上述内切型岩藻多糖分解酶分解岩藻多糖-U而得到的三种寡糖与具有由上述(2)、(3)及(4)式表示的结构的三种寡糖是相同的。
因此，(a)具有这样的结构不饱和D-葡萄糖醛酸和连接了一个硫酸酯基的L-岩藻糖均连接到还原末端残基D-甘露糖上；(b)具有这样的结构不饱和D-葡萄糖醛酸和连接了二个硫酸酯基的L-岩藻糖均连接到还原末端残基D-甘露糖上；且(c)具有这样的结构D-葡萄糖醛酸和连接硫酸酯基的L-岩藻糖均连接到还原末端残基D-甘露糖上，另外，另一个D-甘露糖连接到所述的D-葡萄糖醛酸上，且不饱和的D-葡萄糖醛酸和连接硫酸酯基的L-岩藻糖皆被进一步地连接到后一D-甘露糖上。
根据上面所述，所产生的岩藻多糖-U具有这样的结构D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖相互交替地连接，并且L-岩藻糖被连接到至少一个D-甘露糖上。
而且，岩藻多糖-U具有由下式表示的部分结构。
其中至少一个醇式羟基(alcoholic hydroxide group)被硫酸酯化，而n是1或更大的整数。
如上文所描述，当岩藻多糖-U和上述的内切型岩藻多糖分解酶反应时，形成由上面(2)、(3)及(4)结构式所表示的寡糖。
用高速、高灵敏旋光仪SEPA-300(由Horiba Seisakusho制造)测定岩藻多糖-U的冻干产物的比旋光度，它为-53.6°。
实施例2(1)将厚叶日本褐藻彻底干燥并用一台空的M-2粉磨机将其一部分(2kg)磨成粉。把所产生的干粉悬浮于80％的乙醇(9升)中并于80℃处理2小时，接着用滤纸过滤以得到滤渣。用同样的乙醇洗涤及过滤步骤反复处理该滤渣三次，以获得乙醇洗涤过的滤渣。将该滤渣悬浮于0.2M醋酸钙(36升)中，并于95℃处理2小时，接着过滤。此滤渣用0.2M醋酸钙(4升)洗涤，并将此洗出液和上述滤液合并，以获得厚叶日本褐藻的岩藻多糖提取物(36升)。
将5％的氯化十六烷基吡啶鎓加到所产生的提取物中直到不再形成沉淀为止，并通过离心收集沉淀。将该沉淀悬浮于0.4M氯化钠中，离心并洗涤，重复洗涤步骤三次并往沉淀中加4M氯化钠(1升)。搅拌此混合物并以80％的终浓度加入乙醇。搅拌所产生的混合物，并离心以获得沉淀。将沉淀悬浮于80％的乙醇中并离心，重复此步骤直到在260nm的光吸收消失为止。将沉淀溶解于2M氯化钠(3升)中并通过离心除去不溶物。然后加DEAE-Cellulofine A-800(100ml)到其中并搅拌此混合物，接着过滤以除去加入的树脂。将滤液过一个用2M氯化钠平衡的DEAE-Cellulofine A-800柱，并通过用一台配备了中空纤维的超滤装置对未被吸附的部分进行超滤，该中空纤维的排阻分子量10万或更小，从而完全除去生色物质和氯化钠；接着离心并过滤，以除去不溶物；并冻干，以获得岩藻多糖。
冻干的岩藻多糖的量为90克。
称冻干的岩藻多糖(7克)并将其溶解于0.2M氯化钙中。然后，用0.2M氯化钙平衡DEAE Sepharose FF柱。将溶于0.2M氯化钙中含硫酸岩藻糖的多糖混合物上该DEAE Sepharose FF柱，并用0.2M氯化钙充分洗涤，接着用0至4M线性浓度梯度的氯化钠洗脱。在被洗脱出的组分中，收集用0.05至0.8M浓度范围的氯化钠洗脱出的组分，并通过透析脱盐，接着冻干以得到基本上无岩藻多糖-F的岩藻多糖-U(2.1克)。
此外，在上述组分中，收集用0.9至1.5M浓度范围的氯化钠洗脱出的组分，并通过透析脱盐，接着冻干以获得基本上无岩藻多糖-U的岩藻多糖-F(4.7克)。
当通过用Sephacryl S-500的凝胶过滤柱层析测定上述岩藻多糖-F的分子量时，结果显示中位值约为19万的分子量分布。
(2)按照实施例1中描述的方法分析岩藻多糖-F的成分。
该岩藻多糖-F的组成糖是岩藻糖和半乳糖，且其摩尔比约为10∶1。不含大量的糖醛酸和其它中性糖类。另外，岩藻糖和硫酸酯基的摩尔比约为1∶2。
将1％的岩藻多糖-F溶液(16ml)和50mM磷酸缓冲液(pH 8.0,12ml)、4M氯化钠(4ml)及实施例1-3中描述的内切型岩藻多糖分解酶溶液(32mU/ml,8ml)混合，并于25℃使该混合物反应48小时。没观察到由于反应而产生的分解产物的形成。
然后用高速、高灵敏旋光仪SEPA-300(由Horiba Seisakusho制造)测定该岩藻多糖-F冻干产物的比旋光度，它为-135°。
实施例3用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(由Gibco生产)于37℃培养骨髓瘤细胞(P3×63Ag8,ATCC TIB-9)，所述胎牛血清(由JRHBioscience生产)先在56℃处理30分钟。将所述细胞以1×104个细胞/1.8ml的浓度悬浮于含10％胎牛血清的RPMl1640培养基中。另一方面，将实施例1中所述的岩藻多糖-U和实施例2所述的岩藻多糖-F分别溶解于含100mM氯化钠的50mM HEPES缓冲液中(pH 7.2)，并于120℃加热处理20分钟。将岩藻多糖浓度为5、10或20mg/ml的岩藻多糖-U溶液和岩藻多糖-F溶液各自(0.2ml)加入上述细胞悬浮液(1.8ml)中，并在存在5％CO2的条件下，于37℃培养这些混合物92小时。
在显微镜下观察培养的细胞，以检查细胞生长的程度及细胞的形态。结果是添加了岩藻多糖-U或岩藻多糖-F的骨髓瘤细胞显示出例如细胞皱缩、细胞核破碎等等细胞细胞凋亡特征。没加样品的对照组的骨髓瘤细胞数增加多至约70倍；而加了岩藻多糖-U或岩藻多糖-F的骨髓瘤细胞则被杀伤；表明这两种岩藻多糖显示出强烈的细胞凋亡诱导活性。按照Sosiki Baiyou no Gizyutsu(Technique for Tissue Culture)，第2卷，The Society ofJapan Tissue Culture编辑，Asakura Shoten出版，第26-28页，1990所描述的方法，在培养开始后随着时间进行活细胞数的计数；即，在血球计数器上数被锥虫蓝染色的细胞数，以得到活细胞数。
结果示于图2和图3，图2和图3是阐明培养时间和活细胞数之间关系的图解。该水平轴表示培养时间，垂直轴表示肉汤培养物中的活细胞数。图3是图2的扩大图，其中在垂直轴上的标度被扩大了。在图2和图3中，×代表没加任何样品的对照(C)，空心圆代表以浓度0.5mg/ml加入岩藻多糖-U，空心三角代表以浓度1mg/ml加入岩藻多糖-U，空心方格代表以浓度2mg/ml加入岩藻多糖-U，实心圆代表以浓度0.5mg/ml加入岩藻多糖-F，实心三角代表以浓度1mg/ml加入岩藻多糖-F，且实心方格代表以浓度2mg/ml加入岩藻多糖-F。
(2)在含10％于56℃处理30分钟的胎牛血清(由JRH Bioscience生产)的RPMI1640培养基(由Gibco生产)中培养人急性髓细胞性白血病细胞HL-60(ATCC CCL-240)。以5×104个细胞/900μl的浓度将该细胞悬浮于ASF104培养基(由Ajinomoto生产)中。在由FALCON生产6孔板的每个孔中，各加入4.5ml等份的这种悬浮液。另一方面，以10mg/ml的浓度将实施例1中描述的岩藻多糖-U和实施例2中描述的岩藻多糖-F分别溶解于含120mM氯化钠的30mM HEPES缓冲液(pH 7)中，并通过一滤纸进行过滤。将这些滤液每种(0.5ml)加入上面的悬浮液中，并于37℃在存在5％CO2的条件下培养。作为对照，加入等量的上述缓冲液并按照同样的方法培养该混合物。按照上面描述的同样方法，在培养开始后16小时及40小时，计数活细胞数。
结果显示于图4。即，图4是一图解，它说明了以1mg/ml的浓度往HL-60细胞肉汤培养物中加入岩藻多糖-U或岩藻多糖-F而得到的培养时间和活细胞数间的关系。该水平轴代表培养时间，且垂直轴代表肉汤培养物中的活细胞数。在图4中，空心圆代表岩藻多糖-U而实心圆代表岩藻多糖-F；对照(没加样品)的活细胞数在培养开始后16小时为7×104个细胞/ml，且在培养开始后40小时为1.4×105个细胞/ml。
结果，已发现抑制HL-60细胞生长速率的岩藻多糖-U和岩藻多糖-F导致HL-60细胞的细胞凋亡。
另外，以10mg/ml的浓度将岩藻多糖-U和岩藻多糖-F分别溶解于120mM氯化钠的30mM HEPES缓冲液中(pH7)，并于121℃高压灭菌20分钟。按照上面描述的同样方法测定这些溶液的细胞凋亡诱导活性，并且得到同样的结果。
(3)将5-氟尿嘧啶(5-FU，由Amresco生产，150mg/kg)经腹膜内给药于6至8周龄的小鼠(C3H/HeJ)。2天后，在股骨和胫骨上切切口以收集骨髓；将所收集的骨髓用Ficoll Hypaque(密度为1.0875g/ml、由Pharmacia生产)进行密度梯度离心，以制备低密度单核细胞组分；该组分用作小鼠骨髓细胞。在存在或不存在实施例中描述的岩藻多糖-U或实施例2中描述的岩藻多糖-F的条件下将小鼠骨髓细胞进行液体培养，即，将上述小鼠骨髓细胞以1×106个细胞/ml的细胞密度加入α-MEM(由Gibco生产)中，所述α-MEM含20％的胎牛血清、重组的人白细胞介素-6(rhIL-6,100U/ml，由Amgen生产)、重组小鼠干细胞因子(rmSCF,100ng/ml，由Amgen生产)、青霉素(50U/ml)和链霉素(50μg/ml)，且进一步加岩藻多糖-U或岩藻多糖-F(1mg/ml)于其中。然后，在5％CO2中于37℃培养该混合物48小时。
在培养结束后，通过倾析以收集未附着的细胞，并通过用一种细胞解离液(CDB，无任何酶，由Gibco生产)，收集附着于用于培养的板上的细胞。将所述细胞合并，并数细胞数。对收集的细胞进行HPP-CFC(高增殖潜力-集落形成细胞)分析。
按照Bradley等[Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci,44,287-293(1966)]描述的方法进行HPP-CFC分析。将1％/0.66％上层软琼脂培养基用作培养基，并以5×104个细胞/孔的浓度加入感染的细胞；在10％CO2中于37℃培养所述细胞13天。培养结束后，在倒置显微镜下观察出现的集落，并计数得自HPP-CFC的高密度集落，(其直径0.5毫米或更大)。
结果示于图5，即，图5为阐明岩藻多糖和高密度集落数之间关系的图形。该水平轴代表所用的岩藻多糖和没加任何岩藻多糖的对照，垂直轴代表高密度集落数。如同从图5所见，关于高密度集落数，在加了岩藻多糖-U或岩藻多糖-F的培养基和对照之间，没识别出明显的差异。
实施例4在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基(由Gibco生产)中于37℃培养骨髓瘤细胞(P3×63Ag8U.l,ATCC CRL-1597)，该胎牛血清(由JRHBioscience生产)已在56℃处理30分钟；并以2.5×105个细胞/4.5ml的浓度将骨髓瘤细胞悬浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中。另一方面，以10mg/ml的浓度将硫酸葡聚糖(分子量为50万、由Oncor生产)溶解于含120mM氯化钠的50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中，并通过过滤除茵。将该溶液(0.5ml)加入上述悬浮液(4.5ml)中，并在存在5％CO2的条件下于37℃培养60小时。
在显微镜下观察培养的细胞以检查生长的程度和细胞形态。结果是添加了硫酸葡聚糖的骨髓瘤细胞显示出细胞凋亡的特征，例如细胞皱缩、细胞核破碎等等。没加任何样品的对照骨髓瘤细胞的细胞数增加多至约20倍；而加了硫酸葡聚糖的骨髓瘤细胞被杀伤。因而，硫酸葡聚糖呈现出强烈的细胞凋亡诱导活性。在培养开始后，随着时间的延续，通过锥虫蓝染色而计数活细胞的数目。
结果示于图6。图6是一阐明培养时间和活细胞数间关系的图解，该水平轴代表培养时间，垂直轴代表肉汤培养物中的活细胞数。在图6中，空心方格代表没加任何样品的对照，而空心圆代表加了硫酸葡聚糖(1mg/ml)。
其次，以10mg/ml的浓度将硫酸葡聚糖(分子量为50万、由Oncor生产)溶解于含120mM氯化钠的50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中，并于120℃热处理20分钟。按照与上面描述方法相同的方法，使用硫酸葡聚糖测定细胞凋亡诱导活性。
结果示于图7。图7说明了培养时间和活细胞数间的关系，该水平轴代表培养时间，垂直轴代表肉汤培养物中的活细胞数。在图7中，空方格代表没加任何样品的对照，而实心圆代表添加了热处理的硫酸葡聚糖(1mg/ml)。该热处理的硫酸葡聚糖也具有强烈的细胞凋亡诱导活性。实施例5以10mg/ml的浓度将市售柠檬果胶溶解于含120mM氯化钠的50mM HEPES缓冲液(pH 7.0)中，该溶液的pH为5.0。将其于121℃加热处理30分钟，测紫外吸收光谱时，该热处理过的材料在约235nm的光吸收增加。
用1N氢氧化钠将这些样品调至pH 7.0，并按照象实施例3-(2)中描述的同样方法，测定细胞凋亡诱导活性。
结果示于图8。热处理过的果胶呈现出显著的细胞凋亡诱导活性。即，图8是一说明图，它阐明了当向HL-60细胞肉汤培养物中加入热处理过的果胶溶液(1mg/ml)时的培养时间和肉汤培养物中活细胞数。该水平轴代表培养时间，垂直轴代表肉汤培养物中的活细胞数。在图8中，空心方块代表没加任何样品的对照，而空心菱形代表添加了热处理过的果胶。实施例6(1)将D-葡萄糖醛酸(10g,Sigma生产，G 5269)溶解于水(1升)中，于121℃加热4小时，并在减压条件下浓缩至约10ml。将醋酸丁酯-醋酸-水(3∶2∶2)的混合物的上层液(40ml)加到该浓缩液中，并搅拌该混合物且离心，在减压条件下将上清液浓缩至约10ml。
用硅胶BW-300SP柱(2×28cm，由Fuji Silicia Chemical制造)对上述提取物进行柱层析，并在用压缩机形成的0.2kg/cm2的压力下，以5ml/分的流速，用醋酸丁酯-醋酸-水(3∶2∶2)的上层液作为洗脱液进行分级分离。收集各个10ml的级分并通过TLC对其一部分进行分析。作为结果，第61-80号的级分包含高纯度的环戊烯酮。合并这些级分并在减压条件下浓缩，然后用氯仿(约40ml)提取；在减压条件下浓缩提取物以获得环戊烯酮(约100mg)。
用PALPAK型S柱(由Takara Shuzo制造)对该级分进行了正相HpLC，并测定了其在215nm的紫外吸收。结果是纯度为98％。
(2)将脐带血管内皮细胞HUVEC细胞(原代培养物，由Clonetics生产，CC-2517)传代一次，并按照常规方法冰冻保藏。将细胞解冻，并在用磷酸缓冲盐溶液(由Takara Shuzo生产)洗涤二次后，以l×105个细胞/ml的浓度将其悬浮于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中。往96孔微量滴定板的每个孔中各加入90μl等份的该细胞悬浮液，并向各孔中分别加入10μl等份的10、20、50、100、200、500或1000μM的环戊烯酮水溶液或水(对照)。在存在5％CO2的条件下于37℃培养该板上的细胞48小时，然后，向其中加入含溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓(MTT、由Sigma生产)的磷酸缓冲盐水(5mg/ml)溶液(10μl)，再继续培养4小进。接着，在显微镜下观察细胞的生长。此外，加入含0.04N HCl的2-丙醇(100μl)，充分搅拌该混合物并测量其在590nm的光吸收。计算加入了环戊烯酮的组在590nm的光吸收与由仅加水进行培养的对照组在590nm的光吸收的比率，以根据对细胞生长的抑制活性来确定细胞凋亡诱导活性。
除了在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中传代外，对HL-60细胞进行同样的步骤。结果是与环戊烯酮对正常细胞HUVEC细胞的细胞生长抑制活性相比，环戊烯酮对癌细胞HL-60细胞具有更强的细胞生长抑制活性。
结果示于图9。图9是说明环戊烯酮的加入量(终浓度)与细胞生长程度之间关系的图解，在图9中，水平轴代表环戊烯酮的浓度(终浓度μM)，且垂直轴代表加入环戊烯酮组在590nm的光吸收与加水组在590nm的光吸收之比(％)。在图9中，空心圆代表用HUVEC而得到的结果，而实心圆代表用HL-60而得到的结果。此外，在显微镜下观察到的细胞生长和在590nm的光吸收是对应的。
(3)按照常规方法用胰蛋白酶分散成纤维细胞NTH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)，并以5×104个细胞/ml的浓度悬浮于含10％胎牛血清的Dulbecco修改的Eagle氏培养基中。接着，在一块96孔微量滴定板的各个孔内各加入90μl等份的上述悬浮液。向各孔中分别加入15.6、31.3、62.5、125、250、500或1000μM的环戊烯酮水溶液(10μl)，或加入水(10μl)作为对照；并在存在5％CO2的情况下于37℃培养该板上的细胞48小时。再加入5mg/ml MTT的磷酸缓冲盐溶液(10μl)，再继续培养4小时。在显微镜下观察细胞的生长并按照细胞生长抑制活性估计细胞凋亡诱导活性。
除了在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养细胞外，对HL-60细胞重复同样的步骤。
作为结果，对NIH/3T3细胞而言，在以终浓度25μM加入了环戊烯酮的组中，没观察到细胞的生长；而在以终浓度12.5μM加入了环戊烯酮的组中，观察到与加水的对照组细胞生长相同的细胞生长，相反地，对HL-60细胞，在以终度6.25μM加入了环戊烯酮的组中，没观察到细胞的生长，并且几乎所有细胞都被杀死。因而已经阐明，与非肿瘤细胞系NIH/3T3相比，环戊烯酮显示出对肿瘤细胞系HL-60选择性的细胞生长抑制活性和选择性的杀细胞活性。实施例7岩藻多糖-U对HUVEC和HL-60的活性将HUVEC细胞传代1次，并按照常规方法冰冻保藏。解冻细胞，并在用磷酸缓冲盐溶液洗二次后，将其以1×105个细胞/ml的浓度悬浮于含10％胎牛血清和0.1％牛脑提取物的EBM培养基中(由SankoPure Chemical生产)。往一块12孔微量滴定板的每个孔中各加入900μl等份的该细胞悬浮液，并向其中加入100μl的岩藻多糖-U水溶液(10mg/ml)或生理盐水(对照)。在存在5％CO2的条件下将该板上的细胞于37℃培养24或48小时；用胰蛋白酶处理后，收集所述细胞。用锥虫蓝将所述细胞染色，并计数活细胞数和死细胞数，以计算活细胞的比率，从而确定细胞凋亡诱导活性。
除了在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中传代所述细胞及不用胰蛋白酶进行处理外，对HL-60细胞进行同样的步骤。
结果是以1mg/ml的终浓度往HUVEC细胞中加入了岩藻多糖-U的组，显示出的活细胞比率与加了生理盐水的对照组的活细胞比率相同；而以1mg/ml的终浓度往HL-60细胞中加入了岩藻多糖-U的组，与加了生理盐水的对照组相比，显示出活细胞比率明显下降。因此已经阐明，岩藻多糖-U诱导对癌细胞特异性的细胞凋亡，降低其活细胞数。
结果示于图10和图11。图10是说明HUVEC细胞的培养时间和活细胞比率间关系的图解，其中水平轴代表培养时间(小时)，且垂直轴代表活细胞比率(％)；在图10中，实心圆代表用岩藻多糖-U而得到的结果，而空心圆代表通过使用加了生理盐水的对照而得到的结果。在图10中，在加入岩藻多糖-U的开始阶段，活细胞比率与加入了生理盐水的活细胞比率几乎相同，因此该实心圆重叠到空心圆上。此外，图11是说明H L-60细胞的培养时间和活细胞比率间关系的图解，其中水平轴代表培养时间(小时)，而垂直轴代表活细胞比率(％)。在图11中，实心圆代表用岩藻多糖-U而得到的结果，而空心圆代表用加了生理盐水的对照而得到的结果。
如同在上文所描述的，按照本发明，提供大致无癌细胞的造血干细胞组合物。当将一外源基因转入到该组合物中并移植到宿主体内时，可安全地进行造血干细胞的移植而没有将该基因转入到癌细胞中这样的风险。按照本发明，能除掉用于基因转移的靶细胞组合物中的癌细胞，以确立基因转移的安全。
附图简述图1是说明岩藻多糖-U和岩藻多糖-F形成沉淀的图解。
图2为一图解，它阐明了在存在岩藻多糖-U和岩藻多糖-F条件下，培养时间和活细胞数之间的关系。
图3是图2的一幅扩大图，其中在垂直轴上的标度被扩大了。
图4是说明HL-60细胞的培养时间和活细胞数之间关系的图解。
图5是说明岩藻多糖和高密度集落数之间关系的图解。
图6是一图解，它阐明了在存在硫酸葡聚糖的条件下，培养时间和活细胞数之间的关系。
图7是一图解，它说明了在存在加热的硫酸葡聚糖时，培养时间和活细胞数之间的关系。
图8是一图解，它说明了在存在热处理过的果胶时，培养时间和活细胞数之间的关系。
图9是一图解，它阐明了添加的环戊烯酮的浓度和细胞生长之间的关系。
图10是说明HUVEC细胞的培养时间和其活细胞比率之间关系的图解。
图11是说明HL-60细胞的培养时间和其活细胞比率之间关系的图解。
权利要求
1．包含造血干细胞的已大致除掉了癌细胞的细胞组合物。
2．按照权利要求1的细胞组合物，其中通过用一种对癌细胞特异性的细胞凋亡诱导物已选择性地除掉了癌细胞。
3．按照权利要求2的细胞组合物，其中所述细胞凋亡诱导物是包含硫酸化多糖和/或其分解产物的细胞凋亡诱导物。
4．按照权利要求3的细胞组合物，其中所述硫酸化多糖是一种岩藻多糖或是一种硫酸葡聚糖。
5．按照权利要求2的细胞组合物，其中所述细胞凋亡诱导物为含糖类化合物和/或其分解产物的细胞凋亡诱导物，且所述糖类化合物包含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物。
6．按照权利要求2的细胞组合物，其中所述细胞凋亡诱导物是包含由式(1)表示的4,5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的细胞凋亡诱导物。
7．获得包含造血干细胞的已大致除掉了癌细胞的细胞组合物的方法；所述方法包含的步骤是，通过用一种对癌细胞特异性的细胞凋亡诱导物，选择性地除掉所述细胞组合物中的癌细胞。
8．按照权利要求7的方法，其中所述细胞凋亡诱导物是包含硫酸化多糖及/或其分解产物的细胞凋亡诱导物。
9．按照权利要求8的方法，其中所述硫酸化多糖为岩藻多糖或硫酸葡聚糖。
10．按照权利要求7的方法，其中所述细胞凋亡诱导物为包含糖类化合物和/或其分解产物的细胞凋亡诱导物，且所述糖类化合物包含糖醛酸和/或糖醛酸衍生物。
11．按照权利要求7的方法，其中所述细胞凋亡诱导物为包含由式(1)表示的4,5-二羟基-2-环戊烯-1-酮的细胞凋亡诱导物。
12．细胞组合物，它包含造血干细胞和转移入所述造血干细胞中的外源基因，并且已从中大致除掉了癌细胞。
13．按照权利要求12的细胞组合物，其中通过用一种对癌细胞特异性的细胞凋亡诱导物已选择性地除掉了癌细胞。
全文摘要
细胞组合物,其中通过用对癌细胞特异的细胞凋亡诱导物,已选择性地除去了其中的癌细胞。
文档编号C12N5/00GK1224460SQ97196137
公开日1999年7月28日 申请日期1997年6月30日 优先权日1997年6月30日
发明者浅田起代蔵, 小西治子, 小山信人, 加藤郁之进 申请人:宝酒造株式会社