专利名称：结核菌快速培养基及其制备方法
技术领域：
本发明提供一种结核菌快速培养基及其制备方法，它属于结核菌存在测定的特殊培养基技术领域。
目前我国普遍使用一种被称之为“改良罗氏培养基”的固体结核菌培养基来对结核菌进行体外人工分离培养，其成分为“天门冬酰胺0.72克、磷酸二氢钾0.96克、枸橼酸镁0.12克、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.048克、中性甘油2.4毫升、水120毫升、马铃薯粉6克、新鲜鸡蛋6-8只、1％孔雀绿水溶液8毫升”；其制法为“将天门冬酰胺、磷酸二氢钾、枸橼酸镁及甘油加水后，置于沸水浴中加热溶解。再加入马铃薯粉，继续在沸水浴中加热30分钟，时加搅拌，使成均匀糊状。待冷至65℃时，加入新鲜全蛋液200毫升及1％孔雀绿8毫升，充分搅匀后用双层纱布过滤，然后分装于大试管中，每管10毫升，用橡皮塞塞紧，置成长斜面。用85℃、150分钟流动蒸气灭菌即成”。这些内容记载在福州部队总医院编、朱忠勇陈之航主编、上海科学技术出版社1978年4月出版的《临床医学检验》第454页上。由于现有的固体结核菌培养基均是靠各医院去配制而无现成产品可购，这就需要院方单独为此添置一套相应的生产设备，既加大了医院的设备开支，又相应增加了配制工作量，由以上所述可知，固体结核菌培养基的现有配制过程较为复杂和麻烦，故医院只能根据近期内固体结核菌培养基的大致用量予先配制一些备用，但是，全国几千家医院各自分散配制的固体结核菌培养基，均存在着质量标准不一致、成品率不高、不易长期贮存及贮存期稍长因水份散失、药物分解而使检测结果不准的缺陷。临床检测中发现现有的固体结核菌培养基存在以下缺陷1、由于现有的固体结核菌培养基保藏在大试管中，管口用橡皮塞塞紧，故该培养基贮存时被密封的程度较差，其内的水份易散失，以至该培养基的贮存期很短(仅3个月)，这样便不能通过工业化生产手段进行大批量生产，而只能由医院自行配制，因此，目前在我国固体结核菌培养基仅有医院配制品而并无工业化产品。2、众所周知，结核菌的生长繁殖所需条件较高，其培养基中需有多种营养物质，而如上所述可知，现有的固体结核菌培养基中营养物质的种类少，另外其内也没有能加快结核菌新陈代谢活动以提高结核菌生长繁殖速度的能量物质和植物生长刺激物质，这样使得结核菌在现有的固体结核菌培养基中不能进行很好地生长繁殖，分裂周期长达12-16小时，要4-6周方能看到菌落，因此，使用现有的固体结核菌培养基来对结核菌进行体外人工分离培养时，其检测速度相当慢，阳性检出率低，不利于结核病的早期诊断和治疗。
本发明的目的在于提供一种结核菌快速培养基及其制备方法，它是采用基础物质、能量物质、植物生长刺激物质混合配制而成，具有贮存期长，易于标准化生产，检测快速，阳性检出率高的优越性。
本发明所提供的结核菌快速培养基，它是由基础物质、能量物质、植物生长刺激物质混合配制而成，基础物质中有磷酸二氢钾、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、枸橼酸镁、柠檬酸铁铵、天门冬酰胺、中性甘油、马铃薯粉、新鲜鸡蛋液、2％孔雀绿水溶液、水、动物血清，能量物质中有辅酶A、三磷酸腺苷、细胞色素丙，植物生长刺激物质中有α-萘乙酸，每1000克结核菌快速培养基中各组分的含量为磷酸二氢钾1.36-1.4克新鲜鸡蛋液 560-600克硫酸镁 0.136-0.14克2％孔雀绿水溶液11-13克枸橼酸镁 0.3-0.4克水 300-340克柠檬酸铁铵 0.028-0.03克动物血清 56-60克天门冬酰胺2.06-2.1克辅酶A0.4-0.8克中性甘油 6-8克三磷酸腺苷 0.04-0.08克马铃薯粉 17-17.5克细胞色素丙 0.045-0.075克α-萘乙酸0.05-0.1毫克。所述的动物血清可为羊血清、牛血清、猪血清、人血清中的任意一种。
所述水可用同等重量的牛肉或牛、猪心消化液代替，所述能量物质中还可有长效维生素B12，所述植物生长刺激物质中还可有2,4-二氯苯乙酸和6-糠基氯基嘌呤，每1000克结核菌快速培养基中上述组分的含量为长效维生素B12 0.25-0.75克2,4-二氯苯乙酸 0.05-0.15克6-糠基氯基嘌呤 5-15毫克。
制备每1000克结核菌快速培养基的方法，它依次包括如下步骤(a)、制糊将17-17.5克的马铃薯粉加150-170克水后，置于沸水浴中加热，时加搅拌，使成均匀糊状，自然降至室温后备用；(b)、混合调配将1.36-1.4克的磷酸二氢钾、0.136-0.14克的硫酸镁、0.3-0.4克的枸橼酸镁、0.028-0.03克的柠檬酸铁铵、2.06-2.1克的天门冬酰胺、6-8克的中性甘油加150-170克水后，置于沸水浴中加热溶解，待冷至50℃以下时，加入560-600克的新鲜鸡蛋液、56-60克的动物血清、0.4-0.8克的辅酶A、0.04-0.08克的三磷酸腺苷、0.045-0.075克的细胞色素丙、0.05-0.1毫克的α-萘乙酸，充分搅匀后，再加入167-187.5克的马铃薯糊及11-13克的2％孔雀绿水溶液，并经充分搅匀后得1000克混合物；(c)、分装及密封将混合物分装于大试管中，每管分装5克，置成长斜面后，熔封；(d)、灭菌采用血清凝固器对大试管进行灭菌，灭菌条件为头日，85℃,30分钟；次日，80℃,30分钟；第三日，80℃,30分钟。
上述(a)、(b)两步骤还可同时用(e)、(f)两步骤代替(e)、制糊将17-17.5克的马铃著粉加150-170克牛肉或牛、猪心消化液后，置于沸水浴中加热，时加搅拌，使成均匀糊状，自然降至室温后备用
(f)、混合调配将1.36-1.4克的磷酸二氢钾、0.136-0.14克的硫酸镁、0.3-0.4克的枸橼酸镁、0.028-0.03克的柠檬酸铁铵、2.06-2.1克的天门冬酰胺、6-8克的中性甘油加150-170克牛肉或牛、猪心消化液后，置于沸水浴中加热溶解，待冷至50℃以下时，加入560-600克的新鲜鸡蛋液、56-60克的动物血清、0.4-0.8克的辅酶A、0.04-0.08克的三磷酸腺苷、0.045-0.075克的细胞色素丙、0.25-0.75克的长效维生素B12、0.05-0.1毫克的α-萘乙酸、0.05-0.15克的2,4-二氯苯乙酸、5-15毫克的6-糠基氯基嘌呤，充分搅匀后，再加入167-187.5克的马铃薯糊及11-13克的2％孔雀绿水溶液，并经充分搅匀后得1000克混合物。
所述的动物血清可为羊血清、牛血清、猪血清、人血清中的任意一种。
制备本发明所述的结核菌快速培养基时，所用器皿、试管须经高压蒸气灭菌后使用。
打制新鲜鸡蛋液时所用鸡蛋先用清水洗净蛋壳，用75％乙醇浸泡30分钟，以灭菌纱布擦干后打入灭菌容器内。
牛内或牛、猪心消化液的成分及制法记载在福州部队总医院编、朱忠勇陈之航主编、上海科学技术出版社1978年4月出版的《临床医学检验》第440页上。
由检验师本人取本发明方法制备的结核菌快速培养基即可对病人实施结核菌检测，根本无须依赖各医院制剂室予先去配制，也无须去专门准备一套用以配制结核菌快速培养基的设备，故减少了医院的设备开支，又目应减轻了配制工作量；另外，本发明方法制备的结核菌快速培养基可现开现用，故不会出现浪费现象，不会出现贮存期稍长因水份散失、药物分解而使检测结果不准的现象，因此，在一定程度上保证了检测的准确有效，提高了医疗质量。
本发明所述的结核菌快速培养基及其制备方法，具有如下优点
(1)、本发明所述的结核菌快速培养基是采用基础物质、能量物质、植物生长刺激物质，通过大规模混合生产技术，经制糊、混合调配、分装及熔封、灭菌步骤配制而成，这样，本发明提供了一种采用工业化生产手段制备结核菌快速培养基的方法，使得结核菌快速培养基易于标准化生产，填补了我国医药工业的一项空白；如上所述本发明所述的结核菌快速培养基是采用熔封方法保藏在大试管中，该培养基贮存时被密封的程度相当好，使得该培养基内的水份不易散失，故大大延长了该培养基的贮存期限。
(2)、如上所述，本发明所述的结核菌快速培养基中含有基础物质，基础物质中包含现有固体结核菌培养基中所有的9种组分，它们为磷酸二氯钾、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、枸橼酸镁、天门冬酰胺、中性甘油、马铃薯粉、新鲜鸡蛋液、2％孔雀绿水溶液、水，前8种组分所起的作用分别为马铃薯粉、新鲜鸡蛋液为营养物，蛋黄中含有磷、磷脂和一些盐类，鸡蛋白能中和脂肪酸的毒性并有缓冲作用，枸橼酸镁、中性甘油补充碳源，硫酸镁等盐类供给镁、钾等元素，有调节渗透压的作用，使结核菌的细胞膜有良好的通透性，天门冬酰胺为氮源，可促进结核菌的生长和繁殖，磷酸二氢钾为缓冲剂，调节培养基PH值，2％孔雀绿水溶液可抑制标本中部分杂菌的生长，另外，基础物质中还有柠檬酸铁铵和动物血清，且基础物质中的水还可用同等重量的牛肉或牛、猪心消化液代替，柠檬酸铁铵可提供一定的铁质以满足结核菌生长繁殖所需，动物血清中有X生长因子、V生长因子及大量的高蛋白营养物质，牛肉或牛、猪心消化液可作结核菌增菌培养用，因此，本发明所述的结核菌快速培养基与现有的固体结核菌培养基相比，其内营养物质的种类多，它可为结核菌的生长繁殖提供充足的营养物质；本发明所述的结核菌快速培养基中还含有能量物质和植物生长刺激物质，能量物质可加速结核菌的新陈代谢活动，能提高结核菌的生长繁殖速度，植物生长刺激物质能促进植物的生长，而结核菌与植物细胞一样，均有细胞壁，故植物生长刺激物质同样能提高结核菌的生长繁殖速度；综上所述，本发明所述的结核菌快速培养基中既有可满足结核菌生长繁殖所需的多种营养物质，又有能加快结核菌新陈代谢活动以提高其生长繁殖速度的能量物质和植物生长刺激物质，这样使得结构菌在本发明所述的结核菌快速培养基中能够进行很好地生长繁殖，且分裂周期大为缩短，因此，使用本发明所述的结核菌快速培养基来对结核菌进行体外人工分离培养时，其检测速度相当快，阳性检出率高，有利于结核病的早期诊断和治疗。
经对本发明方法制备的结核菌快速培养基进行检测，其质量稳定可靠，保存期可长达一年以上，易于标准化生产，便于流通、贮存和临床使用；从临床上使用本结核菌快速培养基的初步统计来看，用本结核菌快速培养基检测结核菌的检测速度为1-2周，且阳性检出率高。
以下结合本发明的三个实施例对本发明作进一步说明实施例一制备每1000克结核菌快速培养基的方法，它依次包括如下步骤制糊将17克的马铃薯粉加167.5克牛肉或牛、猪心消化液后，置于沸水浴中加热，时加搅拌，使成均匀糊状，自然降至室温后备用；混合调配将1.36克的磷酸二氢钾、0.136克的硫酸镁、0.3克的枸橼酸镁、0.028克的柠檬酸铁铵、2.06克的天门冬酰胺、6克的中性甘油加167.5克牛肉或牛、猪心消化液后，置于沸水浴中加热溶解，待冷至40℃时，加入570.32595克的新鲜鸡蛋液、56克的羊血清、0.4克的辅酶A、0.04克的三磷酸腺苷、0.045克的细胞色素丙、0.25克的长效维生素B12、0.05毫克的α-萘乙酸、0.05克的2,4-二氯苯乙酸、5毫克的6-糠基氯基嘌呤，充分搅匀后，再加入184.5克的马铃薯糊及11克的2％孔雀绿水溶液，并经充分搅匀后得1000克混合物。
分装及密封
将混合物分装于大试管中，每管分装5克，置成长斜面后，熔封；灭菌采用血清凝固器对大试管进行灭菌，灭菌条件为头日，85℃,30分钟；次日，80℃,30分钟；第三日，80℃,30分钟，即得成品。
实施例二制备每1000克结核菌快速培养基的方法，它依次包括如下步骤制糊将17.25克的马铃薯粉加155克水后，置于沸水浴中加热，时加搅拌，使成均匀糊状，自然降至室温后备用；混合调配将1.38克的磷酸二氢钾、0.138克的硫酸镁、0.35克的枸橼酸镁、0.029克的柠檬酸铁铵、2.08克的天门冬酰胺、7克的中性甘油加155克水后，置于沸水浴中加热溶解，待冷至45℃时，加入591.052925克的新鲜鸡蛋液、58克的牛血清、0.6克的辅酶A、0.06克的三磷酸腺苷、0.06克的细胞色素丙、0.075毫克的α-萘乙酸，充分搅匀后，再加入172.25克的马铃薯糊及12克的2％孔雀绿水溶液，并经充分搅匀后得1000克混合物；分装及密封(略)；灭菌(略)。
分装及密封、灭菌的工艺步骤及其工艺条件与实施例一相同。
实施例三制备每1000克结核菌快速培养基的方法，它依次包括如下步骤制糊将17.5克的马铃薯粉加150克水后，置于沸水浴中加热，时加搅拌，使成均匀糊状，自然降至室温后备用；混合调配将1.4克的磷酸二氢钾、0.14克的硫酸镁、0.4克的枸橼酸镁、0.03克的柠檬酸铁铵、2.1克的天门冬酰胺、8克的中性甘油加150克水后，置于沸水浴中加热溶解，待冷至48℃时，加入596.4749克的新鲜鸡蛋液、60克的猪血清、0.8克的辅酶A、0.08克的三磷酸腺苷、0.075克的细胞色素丙、0.1毫克的α-萘乙酸，充分搅匀后，再加入167.5克的马铃薯糊及13克的2％孔雀绿水溶液，并经充分搅匀后得1000克混合物；分装及密封(略)；灭菌(略)。
分装及密封、灭菌的工艺步骤及其工艺条件与实施例一相同。
权利要求
1.结核菌快速培养基，其特征在于它是由基础物质、能量物质、植物生长刺激物质混合配制而成，基础物质中有磷酸二氢钾、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、枸橼酸镁、柠檬酸铁铵、天门冬酰胺、中性甘油、马铃薯粉、新鲜鸡蛋液、2％孔雀绿水溶液、水、动物血清，能量物质中有辅酶A、三磷酸腺苷、细胞色素丙，植物生长刺激物质中有α-萘乙酸，每1000克结核菌快速培养基中各组分的含量为磷酸二氢钾 1.36-1.4克 新鲜鸡蛋液 560-600克硫酸镁 0.136-0.14克 2％孔雀绿水溶液11-13克枸橼酸镁 0.3-0.4克 水 300-340克柠檬酸铁铵 0.028-0.03克 动物血清 56-60克天门冬酰胺 2.06-2.1克 辅酶A0.4-0.8克中性甘油 6-8克 三磷酸腺苷 0.04-0.08克马铃薯粉 17-17.5克 细胞色素丙 0.045-0.075克α-萘乙酸 0.05-0.1毫克。
2.一种制备结核菌快速培养基的方法，其特征在于制备每1000克结核菌快速培养基的方法，它依次包括如下步骤(a)、制糊将17-17.5克的马铃薯粉加150-170克水后，置于沸水浴中加热，时加搅拌，使成均匀糊状，自然降至室温后备用；(b)、混合调配将1.36-1.4克的磷酸二氢钾、0.136-0.14克的硫酸镁、0.3-0.4克的枸橼酸镁、0.028-0.03克的柠檬酸铁铵、2.06-2.1克的天门冬酰胺、6-8克的中性甘油加150-170克水后，置于沸水浴中加热溶解，待冷至50℃以下时，加入560-600克的新鲜鸡蛋液、56-60克的动物血清、0.4-0.8克的辅酶A、0.04-0.08克的三磷酸腺苷、0.045-0.075克的细胞色素丙、0.05-0.1毫克的α-萘乙酸，充分搅匀后，再加入167-187.5克的马铃薯糊及11-13克的2％孔雀绿水溶液，并经充分搅匀后得1000克混合物；(c)、分装及密封将混合物分装于大试管中，每管分装5克，置成长斜面后，熔封；(d)、灭菌采用血清凝固器对大试管进行灭菌，灭菌条件为头日，85℃,30分钟；次日，80℃,30分钟；第三日，80℃,30分钟。
3.根据权利要求1所述的结核菌快速培养基，其特征在于所述水用同等重量的牛肉或牛、猪心消化液代替，所述能量物质中有长效维生素B12，所述植物生长刺激物质中有2,4-二氯苯乙酸和6-糠基氯基嘌呤，每1000克结核菌快速培养基中上述组分的含量为长效维生素B12 0.25-0.75克 2,4-二氯苯乙酸 0.05-0.15克6-糠基氯基嘌呤 5-15毫克。
4.根据权利要求2所述的一种制备结核菌快速培养基的方法，其特征在于2中(a)、(b)同时用(e)、(f)代替(e)、制糊将17-17.5克的马铃薯粉加150-170克牛肉或牛、猪心消化液后，置于沸水浴中加热，时加搅拌，使成均匀糊状，自然降至室温后备用(f)、混合调配将1.36-1.4克的磷酸二氢钾、0.136-0.14克的硫酸镁、0.3-0.4克的枸橼酸镁、0.028-0.03克的柠檬酸铁铵、2.06-2.1克的天门冬酰胺、6-8克的中性甘油加150-170克牛肉或牛、猪心消化液后，置于沸水浴中加热溶解，待冷至50℃以下时，加入560-600克的新鲜鸡蛋液、56-60克的动物血清、0.4-0.8克的辅酶A、0.04-0.08克的三磷酸腺苷、0.045-0.075克的细胞色素丙、0.25-0.75克的长效维生素B12、0.05-0.1毫克的α-萘乙酸、0.05-0.15克的2,4-二氯苯乙酸、5-15毫克的6-糠基氯基嘌呤，充分搅匀后，再加入167-187.5克的马铃薯糊及11-13克的2％孔雀绿水溶液，并经充分搅匀后得1000克混合物。
全文摘要
本发明提供一种结核菌快速培养基及其制备方法,它属于结核菌存在测定的特殊培养基技术领域,主要由磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸镁、柠檬酸铁铵、天门冬酰胺、中性甘油、马铃薯粉、新鲜鸡蛋液、2%孔雀绿水溶液、水、动物血清、辅酶A、三磷酸腺苷、细胞色素丙和α－萘乙酸,通过大规模混合生产技术,经制糊、混合调配、分装及熔封、灭菌步骤配制而成,具有贮存期长,易于标准化生产,检测快速,阳性检出率高的优越性。
文档编号C12Q1/04GK1226602SQ98110068
公开日1999年8月25日 申请日期1998年2月20日 优先权日1998年2月20日
发明者刘照云 申请人:刘照云