专利名称：Vntr等位基因的提取与利用的制作方法
技术领域：
本发明领域是检测复杂基因组的多态变异，它是所有生物中遗传性状研究的主要内容。由于多基因性状的价值远比单基因性状重要，容许一齐分离多个个体复合基因组中数个信息丰富的多态性的方法可为遗传性状的研究提供极其有力的工具。
本发明根本上不同于所有其他先前已使用的技术，其不同之处是(i)容许快速和容易的从DNA大量产生VNTRs(ii)产生既与一种性状连锁又是性状信息丰富的多态性；(iii)再生和保留多态性等位基因，就如同其在基因组中表现的那样；(iv)消除其他聚合酶链反应为基础的技术所特有的问题，包括引发丢失现象，反应污染和生成假产物；(v)不需要将研究限制到密切相关个体的家系；(vi)容许进行多基因性状分析；(vii)很少需要DNA起始物。
因此本发明代表生物医学领域工作人员迅速而准确的筛选简单或复合基因组的与有利或有害单基因或多基因遗传性状共分离的多态性能力之较大提高。通过产生与社会或经济重要的遗传病或性状共分离的多态性标记，在改进医药，兽医，法医，农业，畜牧业和生物技术方面存在着巨大潜力。本发明还将用于便利所有相关生物的突变分析。
引言DNA是一种由四种单核苷酸单位重复组成的一种双链线形聚合物。这些单位在其中排列产生遗传密码的序列被称为基因组。虽然一个物种内所有个体的基因组基本上是同源的，仍存在着影响个性的细微变异。可存在一个以上序列变异的基因组的位置被称为多态性，所述序列的每个变异体代表一个等位基因。形成配子的生发细胞中的多态性通过随后子代的增殖而遗传。通过研究一个个体的基因组中多态性组合，可指定一个独特的编码(‘指纹’)并可确定该个体的祖先。另外，被发现与一种具体遗传性状或遗传病连锁和共分离的一个多态性可被用做遗传筛选其他个体中该性状或疾病的一个标记。
复合基因组中的有利或有害性状的研究由于其经济，医学与社会的应用，已成为密切关注的课题。建立能比较复合基因组中核酸序列和那些序列的子集所特有的差异之分离的方法是这个领域的研究的一种基本需要。
在动物和植物中已使用许多方法比较核酸序列和那些序列在个体之间的差异之分离。这些方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)，随机扩增的多态DNA标记(RAPD)，扩增的片段长度多态性(AFLP)，代表性差异分析(RAD)，基因组错配扫描(GMS)，和可变数目的串联重复序列的连锁分析(VNTR)。这些方法通过检测一个基因组中总DNA序列变异的子集检测多态性。通过RFLP，AFLP和RDA检测的多态性取决于从凝胶电泳产生的指纹阶梯图，它反映出片段长度的变异。RAPD多态性产生于引物结合部位的序列变异和引物结合部位之间的长度差异。GMS多态性产生于包含两个相关个体衍生的限制性片段之杂合分子内的序列变异。连锁分析包括检测可变数目的串联重复序列(VNTRs)的长度变异和等位基因与目的性状的共分离。RFLPRFLP分析依赖于通过限制性内切核酸酶进行的核酸序列的切割和凝胶电泳所产生的片段的分离。所述片段被印迹在膜上并与标记的探针杂交以能够检测片段长度变异。这个技术在研究单分离的基因座位或基因片段方面可能是有用的，但在研究不限于一个分离的序列时，该技术就不够用。进一步的限制是只有少量所产生的多态性可能是信息丰富的，因此十分需要DNA起始物，并且这种方法工作量大。RAPD
RAPD在基因组指纹法和各种研究中，特别对植物物种而言是一种常规使用的PCR为基础的多态标记技术。该技术包括使用单一‘任意引物’，所述引物引起基因组DNA序列(从5’到3’的方向)与所述任意引物之间有足够同源性的基因组区段的扩增。其扩增产物通过凝胶电泳进行分离。这种方法的细微修改方法包括任意引发的-PCR(AP-PCR)和DNA扩增指纹法(DAF)。然而，通过PCR进行的任意引发和DNA扩增的原理对所有方法而言是共同的。与RFLP比较的优点是，这些方法更快速，需要的DNA少，并且不需要序列的背景知识。与RFLP一样受到的限制是每种分析仅能比较两个个体的基因组。虽然数个基因座位可通过该方法同时评估，多态性检测需要通过凝胶电泳观察带型的变异并可发生类似电泳迁移率的不同等位基因的重叠错误。许多条带可能是微弱而难于把握，并且难于在重复实验中得到一致结果。与多数PCR技术一样，实验结果易于因反应条件的细微改变，试剂的污染和不一致的带型的产生而发生错误。这种可靠程度的缺乏限制了这种技术在个体‘分型鉴定’中的应用。AFLPAFLP分析(EP，A，0534858；Zabeau M等)包括DNA的限制性内切核酸酶的消化和所产生的限制性片段与衔接子的连接。使用与衔接子序列互补的引物，通过PCR扩增所述限制性片段，并通过凝胶电泳显示多态性的带型差异分离所述产物。微卫星-AFLP(WO96/22388；Kuiper M等)是所述技术的一种修改方法，其中用两种或两种以上的限制酶(其中至少一种在单一序列重复区切割)将DNA切成片段，以便与衔接子连接。所述片段用与所述衔接子序列互补的引物扩增。与RAPD相同，通过这种方法可同时评估数个基因座位，但检测多态性需要观察凝胶电泳的带型变异，而且会出现类似电泳迁移率的不同等位基因的重叠错误。在AFLP指纹图谱上记录条带的能力受到其中有些可能会十分微弱和难于辨认的大量条带产生的不良影响。而且，所述技术易于出综上所述所有PCR为基础的方法共有的错误。并且不能同时分析多个复合基因组。综合由于对模板DNA的不完全限制酶解所产生的带，则未反映出真实的多态性。因此AFLP和RAPD分析共有许多同样的限制。另一个问题是AFLPs不是均匀散布在所述基因组中，而是据报道在中心粒周围簇集。因此，若它们位置远离中心粒，则该方法可能不容许产生与目的序列差异共分离的多态性。这个问题反映在与如连锁分析等技术相比多态性检测率的降低。而且，通过AFLP取得的实验数据的复杂性随着被分析的基因组的复杂性的增加而加大。因此，尽管可能通过AFLP分析研究某些植物物种的基因组，高等真核生物物种的相对复杂的基因组可能超出了这个技术的应用性。RADRAD包括DNA的限制性内切核酸酶消化，所述片段与衔接子的连接和PCR扩增。被比较的基因组之间的差异通过扣除杂交法的连续循环和动力学富集进行筛选以便选出差异明显的区域。这种技术因受反应污染和假产物的产生而易于得到错误结果。此外RDA的基本需要是要有可利用的密切相关个体的家族，其中某些个体有明显的目的性状。在任何非密切相关或高度近亲婚配的基因组进行RDA的情况，对简洁而有用的分析而言差异的多重性太大。GMSGMS是对鉴别两个相关个体的祖籍身份的区域做图的技术。因为基因组样品没有被扩增，在对DNA要求高的单杂交中对完整基因组进行比较。无须事先的图谱资料，常规引物或凝胶电泳可能是其优点。然而，所述方法限于使用两个相关个体的基因组。
将两个基因组的限制性片段进行杂交，其中之一已被甲基化以便杂交分子可通过其对Dpn I和Mbo I的抗性来鉴别，它们分别只切割完全甲基化的和未甲基化的分子。筛选含缺乏错配同源双链的异源杂交并用于探测一系列被做图的克隆。虽然在此技术中使用的错配蛋白质可分析点突变，却检测不出含超出该系统限制的更大量错配的多态性。因此，与RFLP，AFLP，RAPD，和RDA一致的是，GMS倾向于分析可有较低信息提供能力的双多态性。
在上述全部技术中，为检测多态性，就必须在引物结合位点或内切核酸酶限制位点处或之间的核苷酸序列存在差异。这就使这些方法的主要限制更加明显，因为在许多情况下，产生遗传性状的突变将不产生通过改变结合引物或限制酶消化可测出的序列差异。因此，与目的性状连锁的多态性用这些方法将鉴定不出。GMS检测那些限制性位点所伴随的多态性并且不受所述其他方法的某些限制。然而，与VNTR多态性相比，所有这些技术所检测的大多数多态性不是信息丰富的。连锁分析连锁分析是一种间接的分子遗传学策略，它包括将多态VNTRs的遗传性与存在目的性状的家庭中的目的性状比较，包括小卫星和微卫星序列(全部是简单序列元件的重复特征)。它们的多态性是由于每个元件的重复次数的变异，而产生等位基因长度上的变异。因为几种可替换的等位基因可存在于任何一个基因座位，与基于引物结合或限制酶消化的多态性相比，VNTR多态等位基因有更高的提供丰富信息能力。因此，在一个性状与一个具体的VNTR等位基因共分离的情况，所述等位基因可被用做所述性状的一个标记，或可被用做便利鉴别所述性状的分子遗传学基础的载体。微卫星遍布于所有真核生物基因组中。因此，用微卫星进行的连锁分析与所述遗传筛选方法最高的多态性检测率相关。确实，系统的微卫星分析已证明对理解某些常见癌症有许多优越之处。因此，连锁分析与结果高度可重复性差异分析的其他相关方法比较是有优点的。然而，连锁分析非常费时，费事和昂贵。而且，由于许多分析是单独进行，对DNA的整体需要十分高。这在没有为筛选均匀分布在所述基因组中的信息丰富之微卫星可用的基因组物理图谱时尤其如此。连锁的证明需要精心设计的统计程序和强有力的计算机软件以分析所述实验数据。这个技术正好适合单基因缺陷，因为多基因性状所要求的统计分析特别复杂。遗憾的是，多因子遗传性状比单基因缺陷普遍得多，而使连锁分析成为一种研究大多数遗传性状的烦琐技术。
就分离与复合基因组中的疾病共分离的多态性而言，理想的方法之特征包括(i)同时并可靠的从数个个体的复合基因组分离多态性的能力(ii)同时分离数个多态性的能力，从而容许分析多基因性状(iii)与所有真核生物物种中序列差异(包括如点突变所产生的细微差异)共分离的多态性的高检出率
(iv)不需要与要研究目的性状的个体密切相关的的大家族(v)不需要基因组的物理图谱或基因组序列的背景知识(vi)需要少量的核酸样品进行分析(vii)不需要昂贵的专业实验室仪器或计算机程序的应用简单性(viii)广泛应用于全部动物和植物界的潜力(ix)精确，准确和可靠的健全效果。
目前可用的技术中没有满足这些理想特征中多数特征的。所有技术受到几种限制中的至少一种限制的制约，所述限制包括昂贵；速度慢；需要大量DNA；低的多态性检出率；不能检出如点突变的小的序列变异；人工操作和假结果的影响；不能同时分析数个复合基因组；不能同时解决多个基因座位的多态性；严格需要密切相关的基因组以供分析；需要序列的预先知识；和需要昂贵的仪器和计算机软件进行分析的复杂性。此外，这些依赖于密切相关个体的大家族的技术进一步受到系谱中存在的差异的限制，以致父系测试可能成为建立每个接受分析的家族成员的完整资料所必需的初步研究。
本发明本发明是从基因组DNA或合成DNA产生全部VNTRs，同时保留每个等位基因及其侧翼序列的一种方法。这些等位基因可被用于通过凝胶电泳产生‘指纹图谱’，或它们可被用做确定个体基因型的方法中或分离与遗传性状共分离的多态标记的方法中的起始物质。后者可通过错配鉴别实现以产生表现一个具体性状的全部个体共同的等位基因库。用未表现所述性状的个体的等位基因对这些选出的等位基因进行的进一步错配鉴别(未固定或已固定在一批等位基因)使得纯化出带有与所述具体性状既连锁又是信息丰富的等位基因的VNTRs。因此，这些终产品被称为性状信息丰富的等位基因总代表(TRAIT)。
一方面，本发明提供制造目的物种的一个或多个成员的基因组DNA之VNTR等位基因及其侧翼区域的混合物的方法，所述方法包括步骤a)将目的物种的基因组DNA分成片段，b)每个片段的每个末端与一个衔接子连接，由此形成以衔接子为末端的片段之混合物，所述片段中每个3’端被封闭以防止酶催化的链延长，c)用一部分衔接子为末端的片段之混合物作为模板，用一种衔接子引物和一种VNTR引物构建5’侧翼的VNTR扩增引物的混合物，d)用一部分衔接子为末端的片段混合物作为模板，用一种衔接子引物和一种VNTR反义引物构建3’侧翼的VNTR扩增引物混合物，e)用目的物种的一个或多个成员之基因组DNA作为模板，用5’侧翼VNTR扩增引物的混合物和3’侧翼VNTR扩增引物的混合物作为引物制造所需要的VNTR等位基因及其侧翼区的混合物。
所述目的物种可以是植物和动物界的任何真核生物物种。虽然它们不以完全相同的方式显示重复序列，原核生物仍被考虑在内。例如一个物种的一个成员可以是一种植物或一种微生物或一种动物如哺乳动物。
另一方面，本发明提供一个目的物种的一个或多个成员之基因组DNA的一部分，所述部分基本上含一个选定的VNTR序列及其侧翼区之等位基因的代表性混合物。
术语“等位基因的代表混合物”不必意味着一个选定VNTR序列的全部可能的等位基因，或甚至大多数这些可能的等位基因的存在。具体的等位基因存在与否(例如在通过上面定义的方法所产生的混合物中)可能取决于步骤a)中所使用的限制酶的性质和取决于其他因素。
本发明还提供目的物种的一部分基因组DNA，所述部分基本上包含一个选定的VNTR序列的3’侧翼区的代表混合物，所述混合物的每个成员在其3’端携带一个衔接子。
本发明还提供目的物种的一部分基因组DNA，所述部分基本上包含一个选定的VNTR序列的3’侧翼区的代表混合物，所述混合物的每个成员在其5’端携带一个衔接子。
本发明还提供一种处理多态性等位基因的混合物的方法，例如一个选定的VNTR序列及其侧翼区，或一个以某种方式如AFLP，微卫星-AFLP，GMS或RAPD产生的一种混合物，所述混合物是表现目的性状的那些等位基因的代表，所述方法包括分离，然后再退火所述混合物的链，并分离和遗弃去任何错配。所述方法优选包括的附加步骤，例如将所述混合物与选定的VNTR序列及其侧翼区的相应多态等位基因杂交，或与某种其他方式如AFLP，微卫星-AFLP，GMS或RAPD(它们是不显示目的性状的那些等位基因的代表)产生的混合物杂交，并筛选错配以提供有目的性状之特征的多态等位基因的混合物。
本发明还提供包括进行本文所描述的方法之方案和试剂的试剂盒。
本发明的突出特点可被描述为(i)利用PCR，NASBA或其他方法富集的此类产物，通过基因组DNA限制性片段的双重阳性筛选降低所述基因组的复杂性，所述片段均与一个选定的衔接子连接并含与选定引物同源的序列；(ii)将所筛选的富集的片段引入一个基因组模板，引入的方式容许重建在所述模板内有侧翼序列的VNTRs，同时保留所述等位基因，从而保留等位基因和每个座位的丰富信息。
(iii)进行所产生的VNTR等位基因的错位鉴别以除去扩增的任何假产物，所述假产物发生在引发遗漏(miss priming)事件，反应污染和反应条件的细微变化过程中；(iv)只筛选那些对表现一种具体性状的所有个体是共同的合成VNTRs等位基因或那些在如此一群个体中占优势的等位基因。通过链解离与杂交，产生含在所述个体之间不同的任何基因座位的等位基因异源双链的错配来达到上述目的。这些复合物可通过错配鉴别排除。呈现所述性状并在所述群体中占优势的个体所共有的这些富集的等位基因对在其他利用多态等位基因的以DNA为基础的研究中作为起始物使用而言是足够纯净的；(v)排除那些对表现一种特定性状的所有个体是共有的等位基因或对在所述性状没有出现的个体也是共有的群体中占优势的所有个体是共有的那些等位基因。这可通过所述VNTR等位基因的链解离与杂交，随后进行下一轮错配鉴定而实现，所述等位基因对表现具体目的性状的个体是共有的或对在携带没有所述性状出现的个体的VNTR等位基因的群体中占优势的个体是共有的。在这种情况下，筛选从表现所述遗传性状的个体获得的含错配的异源双链或同源双链。这些代表多态VNTRs，该VNTRs具有与感兴趣的特定性状共同分离的富含信息的等位基因。从表现出感 兴趣的性状的个体DNA扩增这些VNTRs可产生用作DNA标记的富含信息的等位基因。
本发明提供了一种选择遗传元件的方法，该文件对于一组个体是共有的但在第二组个体中不存在或以较低水平存在。在该主题中一个明显的变化是在该程序的过程中经过明智地选择带有或不含错配的等位基因双链体来选择在一组个体中不存在但在第二组中存在的遗传元件。
至于简便性，该方案可在三个不同的部分得到体现VNTR等位基因的产生；错配的辨别和富含性状信息的等位基因的选择。本文采用了许多图表进行说明以利于本发明的描述。VNTR等位基因的产生本方案描述一种精确产生有其完整侧翼序列的VNTR等位基因的方法，所述等位基因来自一个个体的DNA或数个个体累积的DNA。其初始步骤包括以物理，化学或酶促方式切割基因组DNA成为片段，其目的是要获得含全部具有可扩增长度的VNTRs之基因组片段。使用一个或多个限制酶产生所述基因组样品的均一片段并构成优选技术。通过谨慎选择经常用于切割的限制酶，有可能产生完整的每个在基因组或基因组库中选定类型的VNTR，因为实际上所有片段将是足够小以用于有效的扩增。应注意到个体表型对用于这种片段化的基因组DNA的作用是不重要的。的确，限于此法的基因组可能不需要从任何个体或个体库获得，它们已根据其用于研究具体目的性状的表型而被筛选。含VNTRs目的物种的一个或多个个体的基因组DNA
所述限制酶片段被连接到一个衔接子，通过该衔接子，所述片段可被扩增或处理。被包含在所述衔接子内部的较长寡核苷酸序列被选出以使其作为一种引物被加入到含基因组为模板的扩增反应中时不能产生任何产物。用物理，化学或酶促方法引入末端到全部可用3’端以防止其在DNA聚合酶的影响下延长。它们可以数种方式之一被引入，包括(A)在连接前添加末端；(B)连接后添加末端；(C)连接期间添加末端。适合此目的的可用末端的范围包括(但不限于)双脱氧核苷三磷酸。
(A)在连接之前用双脱氧核苷三磷酸实现全部3’末端被终止的方法是在选定的脱氧核苷三磷酸的存在下，通过DNA聚合酶(包括末端脱氧核苷酸转移酶)进行反应。
然后用含适当5’凹陷的衔接子进行连接，所述凹陷与每条链的双脱氧核苷酸三磷酸末端相适应。
(B)在连接之前用双脱氧核苷三磷酸实现全部3’末端终止的方法是在选定的双脱氧核苷三磷酸的存在下，通过DNA聚合酶进行反应。
(C)使被连接的3’末端在所述连接过程期间可达到终止的方法是通过在寡核苷酸合成期间将适当的3’末端和5’磷酸结合到较短的寡核苷酸上，以使这种寡核苷酸将与基因组片段在酶如T4DNA连接酶的影响下与基因组片段形成共价键。另一方面，适当的末端包括但不限于双脱氧核糖核苷磷酸，还有各种其他修饰物和脱氧核苷酸类似物在DNA聚合酶的影响下防止3’端的延伸。
其中，方法(A)被发现是最可靠的，因为每个实现与一个衔接子连接的基因组片段被保证有一个适当的末端。此外，它保证了片段间的连接是不可能的。方法(C)还保证每个连接的3’端有一个末端。然而，与方法(A)的情况不同，可发生片段间的连接。
由于很可能有些片段含DNA链有缺刻的位点，为防止源于这些位点的多态性，优选将它们掺入到适当的末端。这可通过几种方式实现，包括但不限于在全部双脱氧核苷三磷酸存在下与DNA聚合酶一起温孵被终止的和连接的基因组片段。
衔接子内含的较长寡核苷酸可在扩增反应物中被用做所述衔接子引物，其中含已适当连接的基因组片段，并且所述片段通过在全部可能发生聚合反应的部位加入末端而被封闭。然而，没有从另一个核苷酸序列的‘内部’引发，扩增DNA是不可能的。但是，若另一个核苷酸序列成功退火并且扩增达到衔接子的限度，则衔接子引物结合位点被创建。所述衔接子引物的结合将使DNA的聚合达到所述退火核苷酸序列的限度。如果所述核苷酸序列代表一个引物，或代表一个含引物结合位点的核苷酸序列，所述衔接子引物和‘内部引物’的引入使有可能仅从与衔接子连接并含与退火核苷酸序列同源之DNA的那些片段进行产物的特异性指数式扩增。
如果带有一条选定VNTR之同源序列的一个寡核苷酸被用做内部引物，则只有那些与所述衔接子成功连接并含被导向的VNTR之片段将适合于扩增。这产生位于每个VNTR侧翼的‘扩增引物’，所述VNTR包含被选定限制酶限制位点限制的基因组序列和带有与选定VNTR引物同源的VNTR序列。
已经在各物种范围中鉴定了许多不同类型的VNTR序列。在其他物种中，这些序列包括双核苷酸重复序列，三核苷酸重复序列和四核苷酸重复序列。由于(AC)n双核苷酸重复序列构成在大多数物种中出现的最常见的VNTR，可选择适当序列之引物以产生该VNTR的扩增引物。可以认为引入一个(AC)n引物将产生表现所述VNTRs一个侧翼序列的扩增引物，而引入一个(GT)n引物将产生表现这些VNTRs另一侧翼的扩增引物。然而，含长重复序列长度的VNTRs由于其较多数目的引物结合部位而比较短VNTRs将在扩增引物库中有相对高的表现。同样，较长等位基因由于其较多数目的引物结合部位而比同样VNTR的较短等位基因有相对高的表现。这个问题由于在所述VNTR引物上引入防止退火引物聚合的变性3’末端而被消除，除非它们与侧翼序列的起始序列相匹配。因此，全部VNTRs和全部等位基因的扩增将不会因它们的重复序列长度而有偏向性。在双核苷酸重复序列(AC)n的情况，可使用下述引物(AC)nB，其中B＝C+G+T(CA)nD，其中D＝A+G+T(GT)nH，其中H＝A+C+T
(TG)nV，其中V＝A+C+G或者，通过引入适当的含变性3’端的靶专一性引物的方式可产生其他VNTR序列的扩增引物。的确，可以同样方式产生组成含或侧翼于任何靶专一性结合部位之基因组序列的扩增引物。
在(AC)n双核苷酸重复的情况，通过(AC)nB与(CA)nD变性寡核苷酸引发的反应获得的扩增引物可被积蓄。一个明显的可选方法是通过用所述(AC)nB与(CA)nD变性寡核苷酸一起引发而产生一个扩增引物库。然而，这就有可能比分别进行所述反应的效率低。同样，(GT)nH与(TG)nV引发的反应也可合在一起，或可进行含这两种变性引物的反应。因此，可创建两个扩增引物库，每个库表现仅来自每个VNTR一个侧翼的序列。
由于全部VNTRs的两个侧翼序列中只有一个在各扩增引物库中产生(没有全长的等位基因长度)扩增的产物是非信息丰富的。然而，通过将所述扩增引物与所述基因组DNA杂交并随后聚合退火的序列，可从基因组DNA全部精确重建所述全长等位基因及其侧翼序列。这样，呈现具体目的性状的个体之全长‘受累的’VNTR等位基因可通过将所述扩增引物与这些个体的基因组DNAs杂交而获得。同样，无所述性状之个体的相互反应将使得产生全长的‘野生型’VNTR等位基因及其侧翼序列正如其在那些个体基因组中所发生的那样。因此，可产生VNTR的两个库，其中含从‘受累’DNA获得的等位基因和从‘野生型’DNA获得的等位基因。优选在所述应用中使用高加工性DNA聚合酶以尽可能降低产生‘打滑带’的可能性，所述打滑带是聚合时带的滑拖的结果。
为限制由于在杂交期间扩增引物链的非特异性结合过程中发生的‘串音(cross talk)’而产生假产物的可能性，优选从所述扩增引物移除VNTR重复序列，因为这些重复序列将与大部分此类串话有关。这个过程可通过几种方法启动，包括但不限于(A)用有3’到5’外切核酸酶活性的酶消化；(B)用有5’到3’外切核酸酶活性的酶消化；(C)用尿嘧啶DNA糖基化酶消化含尿嘧啶的引物产生的扩增引物库；(D)用RNA酶消化RNA引物产生的扩增引物库。
(A)如果衔接子引物的5’端具有所表现的全部四种核苷酸，则其互补链会有相似的表现。这样，与有3’到5’外切核酸酶活性的酶(例如在只有两种脱氧核苷三磷酸存在，12℃时的T4 DNA聚合酶)一起温孵不会导致衔接子引物3’互补链的明显缩短。然而，如果所述反应在其所缺少的脱氧核苷酸存在时发生，将通过T4 DNA聚合酶移除与VNTR引物互补的3’链。所述酶的外切核酸酶消化反应将在出现在所述反应混合物中的第一个脱氧核苷酸被计数时停止。所产生的5’突出部分可用单链特异的外切核酸酶或内切核酸酶(包括但不限于外切核酸酶VII)消化已使全部重复序列被移除。图解描绘了(AC)n与(GT)n引发扩增引物的情形
如果一种三核苷酸VNTR被定向，在只有一种脱氧核苷酸存在时将需要T4 DNA聚合酶的适当消化。就四核苷酸重复序列而言，这种方法是不适合的，而应采用另一种方法。
(B)可用5’到3’的外切核酸酶，如T7基因6外切核酸酶消化所述重复序列。硫代磷酸键阻碍该酶的活性。四个连续的键被认为是抑制性的。因此，如果所述衔接子引物已被合成为在其5’端有至少四个硫代磷酸键，如果硫代磷酸键合成不完全，将对T7基因6外切核酸酶的5’到3’外切核酸酶活性有抗性。如果合成的VNTR引物在其3’有四个硫代磷酸键，T7基因6外切核酸酶的反应将消化VNTR引物而产生四种核苷酸的重复序列。所述互补序列可用单链特异性外切核酸酶或内切核酸酶消化，包括但不限于外切核酸酶I，以使全部重复序列从除了每条链中的四种核苷酸外的扩增引物中移除。这种长度短的重复序列不可能诱使杂交时由于链末端的非特异性相互作用而产生假产物。
(C)含尿嘧啶的VNTR引物的合成，例如(GU)nH和(UG)nV，容许在适当的扩增引物库中通过尿嘧啶DNA糖基化酶降解这些引物。将被消化的扩增引物与单链特异性内切核酸酶(包括但不限于S1核酸酶)一起温孵导致所述含单链间隔的VNTR引物进一步降解并最终导致移除互补序列以致全部重复序列被移除。
(D)使用有逆转录酶活性的DNA聚合酶，用基于VNTR序列的RNA引物产生扩增引物库，使通过RNA酶反应降解所述VNTR引物成为可能。通过单链特异性外切核酸酶或内切核酸酶可移除所述互补序列。有几种方法可使被消化的扩增引物与一或多个个体的基因组DNA杂交而完整并精确的产生VNTR等位基因，如同在其模板中所发生的一样。这些方法包括(A)将扩增引物库以分别连续的方式或一起与可能或可能没有被片段化的基因组DNA杂交和聚合；(B)将构成每个VNTR仅一个侧翼序列的扩增引物与已被物理，化学或酶促片段化的基因组DNA杂交和聚合，然后终止并连接以产生一个衔接子，所述衔接子可能是或可能不是用于产生所述扩增引物库的衔接子。在各种情况下，添加多种杂交加速剂中的一种即促进杂交速率。特别是在严紧杂交条件下，使用这类加速剂可能是优选的。可加速杂交的方法数目是巨大的，而方法中包括结合酚排除法，阳离子去污剂如鲸腊三乙基溴化铵(CTAB)，和体积排阻试剂如葡聚糖硫酸酯。应注意的是如果CTAB被选为杂交加速剂，杂交混合物中的盐浓度要低以防止其沉淀。
(A)给出一种扩增引物与基因组DNA杂交以容许通过DNA聚合酶在其基因组模板中再生VNTR等位基因的图解
第二种扩增引物库的杂交容许使用衔接子引物进行全部VNTR等位基因的完整扩增。
(B)给出一个扩增引物库与已被片段化，终止并连接到一个衔接子的基因组DNA杂交图解，所述衔接子可能与扩增引物库中存在的是相同或不同的。
从扩增引物移除重复序列容许两个扩增引物库与基因组DNA进行伴随杂交而限制了非特异性链结合产生假产物的可能性。通过使构成每个侧翼序列的扩增引物分别连续的进行杂交，进一步减少假产物的产生。这使得引入进一步的步骤以控制非特异性链结合，包括通过在两次杂交之间与单链特异性外切核酸酶或内切核酸酶一起温孵移除未杂交链。在优选的方法中，只有一个扩增引物库(包括每VNTR中的一个侧翼序列)与终止的并连接衔接子的基因组片段杂交。这样，消除了任何不同库的扩增引物链之间非特异性结合的可能性。如果每个扩增引物库分别以这种方式进行杂交与聚合，在每个反应中产生的产物应该是一致的。因此，这些产物可被合并。
扩增引物与富集的数个个体基因组的杂交使得产生其所包含的VNTR等位基因。如果这是在表现一种具体性状之个体的富集基因组中进行的，并且其中的一些个体缺乏该性状，则可合成在这些富集基因组中存在的‘受累’和‘野生型’等位基因，优选从限定群体中筛选受累个体，以致同基因型对所有给定表型的个体而言是共有的。然而，即使这些个体是从一个杂交繁育的群体中筛选的，而所述群体中存在产生一种表型的数个基因型，这些与所述表型基因座位共分离的等位基因在受累个体的汇集基因组中存在的频率将比在野生型个体的交互汇集基因组中存在的频率更高。这些等位基因将通过错配，断裂和扩增的连续重复而汇集。为防止等位基因频率被人为曲解，优选有大量的个体的基因组DNA参与到每个库中。这保证了在受累群体和野生型群体中的等位基因频率趋于与获得它们的一般群体相等，以致在这两者中的差别是所述性状连锁不平衡的结果而非另外的原因。然而，如果受累和野生型个体的数目受到限制，则对被配合的同胞配对的筛选(每对成员之一是受累成员而另一个是野生型个体)将进行一段时间以使有关具体性状不同的被汇集基因组的等位基因频率之间达到平衡。错配鉴别如果从受累个体和野生型个体产生的VNTR等位基因被变性并使其在分开的反应中再退火，将导致有或无错配的双螺旋DNA分子。由于VNTR特异性侧翼序列和杂交的严紧条件，只有具有相同VNTR的等位基因将再退火。因此，有错配的双螺旋含相同VNTR等位基因，它们具有不等的大小或它们含扩增的假产物。再退火的类似大小的等位基因将形成完好的双螺旋。
含错配的分子可用对单链化DNA起作用的酶或能检测DNA中构像不规则性的酶进行消化。适当的酶包括但不限于S1核酸酶和T4内切核酸酶VII。
在这两种酶中，T4内切核酸酶已被证明在这个应用中是最可靠的和最有效的酶，并且已发现其在一定范围的DNA聚合酶缓冲液中的高效消化，并耐受从杂交反应遗留的CTAB。它既切开含错配分子的两条链，留下交错末端，每条链被切开在错配的3’端。
切割似乎发生在重复序列内，产生可在随后扩增过程中发生非特异性相互作用的末端并导致产生假产物。为避免这个问题，所述重复序列可从断开的双螺旋中消化掉。这可由数种方法实现，包括(A)通过3’到5’的外切核酸酶反应，包括但不限于外切核酸酶III，和单链特异性外切核酸酶或内切核酸酶，用保护性末端包括但不限于α-硫代磷酸基或一个3’突出部分在T4内切核酸酶VII消化前保护所有的DNA链；(B)通过5’到3’外切核酸酶的反应包括但不限于T7基因6外切核酸酶，和一种外切核酸酶或一种内切核酸酶，用保护性基团包括但不限于硫代磷酸酯键掺入到衔接子引物中而在T4内切核酸酶消化前保护全部DNA链。
通过包含硫代磷酸键在衔接子引物中，将使全部含所述衔接子引物分子的5’端对5’到3’外切核酸酶活性的T4基因6外切核酸酶有抗性。然而，由T4内切核酸酶VII切割产生的5’端易受该酶酶解。
很可能有些分子将避开T4内切核酸酶VII的完全切割，而仅获得一个单链缺口。然而，这类切口易受T7基因6外切核酸酶的消化，尽管若以协同方式使用的该酶是一种单链特异性外切核酸酶，只有所述切口链被消化。另一方面，单链内切核酸酶(包括但不限于S1核酸酶)会切割在分子中T7基因6内切核酸酶反应所接触的互补单链，得到单链缺口，以致两条链均被切断。因此，与T7基因6外切核酸酶有关的酶如S1核酸酶会导致全部T4内切核酸酶对分子的完全消化，而不管切的是一条还是两条链。
S1核酸酶已被证明在这个作用上是有效的，在T7基因6外切核酸酶缓冲液所建立的碱性条件下能有效消化单链DNA。然而，用这个酶可发生一些DNA的非特异性消化。因为这些通过T4内切核酸酶作用而获得单链缺口的分子很可能没有几个，可优选使用少有可能以这种方式起作用的单链特异性外切核酸酶。在这些酶中包括外切核酸酶I和外切核酸酶VII。缺少错配的分子对这种消化体制是有抗性的并且可通过扩增而富集。为使由于链的滑拖导致的‘打滑’带的产生并使扩增反应期间聚合酶的错误达到最小，扩增周期数应不超过得到足够产物量的周期数。
除T7基因6外切核酸酶外，外切核酸酶III可起作用在DNA分子中的缺刻处。在所述衔接子引物内没有硫代磷酸酯键时，该酶在消化反应完成时在缺刻的分子中产生长的3’突出部分。因此，包括能移除这些突出部分的单链特异性内切核酸酶和外切核酸酶会致使消除断裂的分子，而不管T4内切核酸酶VII是否切断含错配双螺旋的一条还是两条链。然而，为了避免需要包含在错配切割前保护全部DNA分子的3’端的附加步骤，优选使用T7基因6外切核酸酶，因为用这种酶所需要的5’端保护容易通过掺入硫代磷酸酯键到衔接子引物中而实现。
另一种可移除断裂分子的方法是在切断部位加入半抗原，包括但不限于生物素-16-dUTP，然后通过半抗原对另一种化学物质的亲和层析分离断裂的分子。这可通过在错配切割方法前终止全部分子的3’端而实现，以致它们在DNA聚合酶存在时是惰性的。适合的终止剂包括但不限于双脱氧核苷三磷酸，它可通过DNA聚合酶包括但不限于末端脱氧核苷酸转移酶被掺入。随后与生物素-16-dUTP一起在DNA聚合酶(如末端脱氧核苷酸转移酶)存在下温孵，将由此使只有缺少终止3’末端的那些分子进行生物素化。然后可通过结合到链霉抗生物素蛋白的方法分离生物素化的分子。
同样，由于被T4内切核酸酶VII切开的分子有一个3’突出部分，这些分子可通过单链结合蛋白或对单链化DNA有亲和力的化学试剂的捕获而被移除。很可能T4内切核酸酶VII产生的突出部分对用这种方法切割的分子的有效筛选将是太小。然而，它们可通过在一种或多种脱氧核苷三磷酸存在下与DNA聚合酶(包括但不限于末端脱氧核苷酸转移酶)一起温孵而被特异性加长，从而在用赋予它们在DNA聚合酶存在时的惰性的适当终止剂进行的错配切割前终止全部DNA的3’端。
物理分离DNA分子是十分不方便的并且与酶法比较而言是相对无效的。而且，有单链缺刻的分子的移除可能是不成功的。因此，优选DNA品种的酶鉴别方法。
反复数个轮回的变性，杂交与错配切割成功的消除了全部扩增假产物。而且，减少到全部VNTR纯合状态以致只留下每个VNTR的最共同的等位基因，或者倾向于消除那些许多等位基因都以相等频率存在的VNTRs。从变性温度快速转变成退火温度对防止同样大小的等位基因的优先退火是必要的。如果变性温度向退火温度的转变的时间被延长，则可有上述被防止的现象发生。可加入杂交加速剂以促进杂交的效率。这个过程在‘受累’VNTR等位基因与‘野生型’VNTR等位基因中平行进行，并倾向于达到减少到纯合状态并产生平衡的等位基因频率。然而，就VNTR数目而言，在受累和野生型群体中的等位基因频率在错配切割方法的终末将是明显不同的。假如目的性状是区别两组作为NVTR来源的个体的唯一特征，在受累组等位基因的表达高于野生型组的表达的等位基因必与所述性状共分离。这些是所述性状的标记并应被选择。
反复错配切割对一个VNTR的等位基因频率的影响可用忽略消化效率，忽略聚合酶错误以及杂交的二级动力学的影响的基本方案来解释。就一种VNTR而言，其中存在的三个等位基因如下起始方案等位基因 A B C等位基因频率 2/4 1/4 1/4比率 2 1 1如果等位基因被变性和容许再退火成双螺旋，将产生有或无错配的分子。形成完整双螺旋的每个等位基因的比例将取决于其等位基因频率。理论上全部含错配的分子将易于被T4内切核酸酶VII消化并被消除。因此，在第一轮错配切割后，剩下的每个等位基因的数量是等位基因 A B C留下的数量 4/16 1/16 1/16总存留的量 6/16比率 4 1 1等位基因频率 4/6 1/6 1/6
在第二轮错配切割后，等位基因频率将进一步改变为等位基因 A B C留下的数量 16/36 1/36 1/36总留下的量 18/36比率 161 1等位基因频率 16/18 1/18 1/18第三轮之后，理论上等位基因频率将是如下等位基因 A B C留下的数量 356/324 1/324 1/324总留下的量 258/324比率 256 1 1等位基因频率 256/258 1/258 1/258因此，在两轮之后，一个等位基因将显著占优势。再一轮之后，该等位基因成为实际上唯一存在的基因。与错配切割前仅存在一个等位基因的VNTR相比，留下的这种VNTR的总量的比例是6/16×18/36×258/324∶1/1×1/1×1/1＝43/288∶1按同样方式，经过足够轮数的错配切割之后，任何VNTR的最常见的等位基因将占优势。四轮可足以降低VNTR到几乎纯合状态，但是酶解效率，聚合酶错误的产生和杂交动力学均是影响这方面的因素。如果不平衡足够大，则受累的和野生型的VNTR的等位基因频率的差别将导致每组中不同等位基因的富集。如果无论性状如何，这些等位基因一般在群体中都占优势的话，这类等位基因就目的性状而言是信息丰富的，但必须从其他富集的等位基因中筛选，所述等位基因可在受累和野生型群体中均是一致的。
不同方案下的错配鉴别的实施例在附录中给出。筛选一种性状信息丰富的等位基因。
与目的性状连锁的等位基因的筛选可有数种方法实现。在连续数轮错配切割方法中留下来的每个VNTR之等位基因大小差异的鉴别方法是可通过来自每个个体群的这些等位基因与一系列已知长度和体积分离的VNTR等位基因杂交以致能检测其间的差别。的确，有可能以类似的方式实现与一批等位基因的定量杂交，所述方式产生有关两组中的等位基因频率的信息而无须错配切割方法。
不太复杂的方法包括从另一组中的等位基因中减去一个组的等位基因以鉴定等位基因频率的差异。然而，由于两种方案提示带有目的性状的连锁平衡不稳，这个方法必须不仅区分一个等位基因存在于一个组中而没有等位基因在其他组中存留的VNTR，而且要鉴定在每个组中存留的等位基因均不相同的VNTR。这可通过物理，化学或酶学方式实现。如果选用酶法筛选，优选扩增由缺乏硫代磷酸键之衔接子引物的错配切割方法富集的等位基因，以便酶的消化过程能进行完全。
以酶为基础的适当筛选方法包括添加保护末端(包括但不限于至少四个核苷酸的3’突出部分或一个α硫代磷酸酯键)到一组个体的存留的等位基因并用外切核酸酶III扣除其它组存留的过剩等位基因。在多数情况下，需要从没有所述性状的那些个体中鉴定出不能存活的受累个体所存留的任何等位基因。为此，添加保护末端应该仅加入到从受累个体来的VNTRs。显然，替代策略是可能的。可有许多方法创建3’突出部分，包括但不限于(A)一个衔接子的连接，或(B)通过DNA聚合酶非模板加入核苷酸。当然，方法(B)被发现是更有效的，可通过使用如末端脱氧核苷酸转移酶实现。在单一脱氧核苷酸磷酸存在时一起温孵，该酶可产生数百核苷酸的3’突出部分。通过加入保护性脱氧核苷酸类似物，用包括但不限于末端脱氧核苷酸转移酶的DNA聚合酶可掺入一个α硫代磷酸酯键。适当的类似物包括α硫代脱氧核苷酸三磷酸。由于这些类似物可抑制随后的DNA分子的消化或处理，优选加入3’突出部分以传达保护。另一个不十分优选的传达保护免受外切核酸酶III活性的方法是通过激活外切核酸酶(包括但不限于T7基因6外切核酸酶)5’到3’的活性以在双链DNA中产生5’缩进。在用于扩增DNA分子的衔接子引物内部适当掺入硫代磷酸酯键可保证防止T7基因6外切核酸酶的消化，而所述消化已超出了传达对外切核酸酶III的抗性所述需求的范围。同样，通过在可用如尿嘧啶DNA糖基化酶的一类酶消化的衔接子引物内部掺入尿嘧啶丰富的5’末端可产生5’缩进。
由于产生了3’突出末端，所产生的分子对外切核酸酶III的消化是有抗性的。如果适当的VNTR的一个等位基因以野生型组的形式存留，则与过剩的存留野生型等位基因杂交保证了全部受累等位基因异源双链的形成。
如果没有从这些受累组中扣除野生型等位基因，则会产生在每个末端有一个3’突出部分的同源双链分子(分子1)。如果VNTR的存留等位基因在两个组中是不同的，则产生含一个错配的异源双链分子(分子2)。两组中有同样大小的存留等位基因会引起没有错配的异源双链分子(分子3)。从杂交产生的其他种类的DNA包括可含或可不含错配的野生型等位基因同源双链(分子4)和不能杂交的单链分子。作用于单链DNA或构像不规则性DNA的酶(包括但不限于T4内切核酸酶VII)对这些不同类型的分子的消化作用导致那些含一个错配双螺旋的断裂并伴随产生断裂端的3’突出部分。
随后的外切核酸酶III的消化形成单链化的全部双螺旋或在两端没有3’突出部分的双螺旋片段。
由于外切核酸酶III的对所作用的分子的消化易于完成，用单链特异性外切核酸酶或内切核酸酶的进一步消化消除了所有单链化的DNA种类并移除了存留分子上的3’突出部分。因此，只有靶分子在消化中存留下来。外切核酸酶I适合这个任务，但通常留下一个单核苷酸3’突出部分，而若选择平头末端克隆作为回收靶分子的方法，则必须移除这个3’突出部分。
就完整的同源双链而言，信息丰富的等位基因存在于所述同源双链内并可通过克隆和测序鉴定。由于T4内切核酸酶VII切割外切核酸酶III与外切核酸酶I消化过的片段，通过将所述片段与片段化的，终止衔接子连接的基因组DNA杂交，然后以类似于前述的方式扩增可得到全长VNTRs。用根据其侧翼序列设计的VNTR特异性引物，通过测定表现与这些VNTRs有关的目的性状之个体的基因型可鉴定信息丰富的等位基因。
显然，除了以各种不同方式产生的VNTRs的那些等位基因外，这种扣除的方法同样适合于其他等位基因。这样，鉴定DNA库成分的差别的方法可更广泛的用于筛选其他类型的多态序列以及其他种类的DNA，所述DNA可存在于一个库中但在另一库中不以同样形式存在。
这种方法在适合研究多基因以及单基因遗传性状方面是独一无二的。很可能在遗传性状的研究中产生显著的影响，显著减少与这个领域的研究所伴随的困难，时间和费用。优选实施方案(i)用单一限制酶对被研究物种的一个个体(但在该研究中并非必须是一个个体)的基因组DNA进行片段化。
(ii)通过末端脱氧核苷酸转移酶在双脱氧核苷三磷酸存在下终止全部3’端。
(iii)通过在T4 DNA连接酶存在下温孵，随后终止单链化的缺口，将终止的片段与衔接子连接。
(iv)纯化从ddNTPs连接的产物并在含如下成分的反应物中扩增(a)衔接子引物和一个(AC)←nB引物，其中B＝G+T+C；(b)衔接子引物和一个(CA)←nD引物，其中D＝G+A+T；(c)衔接子引物和一个(GT)nH引物，其中H＝A+T+C；(d)衔接子引物和一个(TG)nV引物，其中V＝G+A+C。扩增产物从成功连接到选定衔接子并含一个与选定引物同源的VNTR之基因组片段产生。
(v)在dATP和dCTP的存在下通过T4 DNA聚合酶消化(AC)nB和(CA)nD引发的产物，随后通过外切核酸酶VII除去全部VNTR序列和过剩的VNTR引物。
(vi)在dGTP和dTTP存在下，通过T4 DNA聚合酶消化(GT)nH和(TG)nV引发的产物，随后通过外切核酸酶VII除去全部VNTR序列和过剩的VNTR引物。可进行大小筛选以获得最佳分子量范围的产物。
(vii)用过量的(AC)nB与(CA)nD结合引发的产物或(GT)nH与(TG)nV结合引发的产物与足量的表现具体目的性状的个体来源的基因组DNAs杂交。
(viii)与Taq DNA聚合酶一起温孵杂交产物以使退火的全部3’端单链延伸。
(ix)添加衔接子引物并通过在Taq DNA聚合酶存在下的热循环从’基因组模板’产生VNTR等位基因。
(x)纯化所产生的VNTR等位基因，然后在严紧条件下解链并再退火。
(xi)用T4内切核酸酶VII消化含错配的双螺旋分子，所述双螺旋分子产生于VNTR等位基因与扩增的假产物的杂交或产生于表现具体目的性状的被研究个体之间不同VNTR等位基因的杂交。
(xii)通过用S1核酸酶与T7基因6外切核酸酶一起进行进一步消化，以从切开的分子除去VNTR序列或完全消除它们。
(xiii)通过在Taq DNA聚合酶的存在下的热循环，进行存留DNA分子的扩增。
(xiv)反复进行存留DNA分子的杂交，消化与扩增。这富集了表现具体目的性状的所有个体共有的VNTR等位基因，或富集了在此类组中占优势的那些等位基因并除去了扩增的任何假产物。
(xv)通过在一种dNTP存在下与末端脱氧核苷酸转移酶一起温孵，添加3’突出部分到表现具体性状的个体组中选出的等位基因。
(xvi)将表现具体性状的个体组的有3’突出部分的选出的VNTR等位基因与过量的没有这种性状之个体的VNTR等位基因杂交，而后者已从其基因组DNA用与(i)到(xiv)完全或部分类似的方法产生。
(xvii)用T4内切核酸酶VII消化含错配双螺旋分子。
(xviii)用外切核酸酶III进一步消化以除去无3’突出部分保护的双螺旋分子中的链。
(xix)在移除或灭活外切核酸酶III后，用外切核酸酶I进一步消化，移除单链化的DNA。这导致消除了除与所述具体性状有关的VNTR以外的全部分子。就完整的VNTRs而言，存在着信息丰富的等位基因。就外切核酸酶III和外切核酸酶I消化后存留的切开的VNTRs而言，通过Taq DNA聚合酶与片段化的，末端化的，衔接子连接的基因组进行杂交并进行链延伸可获得所述完整的VNTR序列，以致VNTR特异性引物可根据使能对受累个体基因型进行测定的侧翼序列进行设计，以使信息丰富的等位基因与所述性状联系起来。第二个实施方案(i)产生VNTR等位基因的方法不包括通过用衔接子引物和VNTR引物对片段化并连接起来的基因组DNA进行扩增，将所产生的产物与表现具体性状的个体基因组‘模板’DNA杂交、和通过从那些DNAs模板产生相应的VNTR等位基因的方法。这些可包括但不限于(a)用对个体反应中每个VNTR侧翼区特异的引物从基因组或合成的DNA扩增VNTRs；(b)用复合系统从基因组或合成的DNA扩增VNTRs，由此容许使用衔接的VNTR特异性引物扩增完整的复合VNTRs。
(c)使用在VNTR序列内或附近切割的内切核酸酶从基因组或合成的DNA扩增VNTRs以使衔接子与被消化的DNA进行连接并用于扩增所述VNTR等位基因；(d)通过从没有所述性状的那些个体扣除的方法从表现具体性状的个体产生VNTRs库。
(ii)通过链的解离和再退火在严紧条件下进行所产生的VNTR等位基因的纯化。
(iii)用T4内切核酸酶对含错配的双螺旋进行消化，所述双螺旋产生于VNTR等位基因与扩增假产物的杂交或产生于在表现具体目的性状的被研究个体之间各不相同的VNTR等位基因的杂交。
(iv)在T7基因6外切核酸酶和S1核酸酶的存在下温孵杂交的等位基因以致消除被消化的双螺旋DNA分子和单链DNA分子。
(v)通过扩增对消化有抗性的无错配双螺旋进行富集。
(vi)反复进行杂交，消化和筛选无错配的分子。该过程富集了所有表现具体目的性状所共有的VNTR等位基因中的反应物并移除了任何扩增的假产物。
(vii)将被筛选的VNTR等位基因(表现具体性状的全部个体所共有的)与没有所述性状的个体的等位基因进行杂交，后者已用与(i)到(vi)完全或部分类似的方法从其基因组DNA产生。
(viii)用T4内切核酸酶VII消化含错配的双链并随后顺序与外切核酸酶III和外切核酸酶I一起温孵。
(ix)从无5’突出部分的存留分子的混合物进行分离。这些完整的VNTRs或VNTR片段与具体目的性状连锁。可通过测序建立与目的性状相关的完整VNTRs的信息丰富等位基因。可通过与片段化，末端化和衔接子连接的基因组DNA杂交，然后与Taq DNA聚合酶一起温孵产生所述全长序列的VNTR片段。通过各种方法包括但不限于用根据侧翼序列设计的VNTR特异性引物对表现所述目的性状的个体进行基因型测定可建立信息丰富的等位基因。
本领域技术人员应意识到从无错配的双螺旋(消散状态或排列起来的)鉴别含错配双螺旋有数种方法。上面实施方案中描述的方法仅代表这些方法之一。
本领域技术人员应意识到本发明同样很好的适合于任何VNTR，包括但不限于双核苷酸重复例如(CA)n和(GT)n，三核苷酸重复例如(AAT)n，(AGC)n，(AGG)n，(CAC)n，(CCG)n和(CTT)n，以及四核苷酸重复，例如(CCTA)n，(CTGT)n，(CTTT)n，(TAGG)n，(TCTA)n和(TTCC)n。此外，本发明可用于样品生物的微卫星，包括但不限于(AT)，(CC)，(CT)和(GA)丰富的重复区片段。
本领域技术人员应意识到多态性等位基因(VNTR的除外)可与本发明一起使用以产生无扩增假产物并且是表现具体性状的全部个体所共有的等位基因。这些多态等位基因可与固定排列的全部可能的等位基因(或其子系列)杂交，或与从无所述性状的个体衍生的等位基因库杂交。通过错配鉴别，这些与一种性状连锁并信息丰富的等位基因可被鉴定。
本领域技术人员应意识到来自单一个体或多个个体基因组的等位基因(表型与基因型未知)可以通过错配鉴别移除扩增假产物的精确度进行扩增，并与固定排列的等位基因杂交，或与消散的等位基因库杂交，以确定该个体的基因型或表型。
本领域技术人员应意识到错配鉴别可用非T4内切核酸酶VII的酶或化学试剂进行。这些替代方法包括但不限于S1核酸酶，绿豆核酸酶，突变测定蛋白质(例如突变S)，四氧化锇和羟胺。
本领域技术人员应意识到被扩增的多核苷酸序列本身是有价值的并且可被用于除测定与遗传性状共分离的VNTRs以外的方法，包括但不限于基因型确定，作图，定位克隆，基因座位定量，祖先与进化的研究，群体研究，系统发生学，VNTRs及其间隔序列的体外与体内研究。
本领域技术人员应意识到如果非遗传性体细胞突变中包括了VNTR，则本发明可用于鉴定该突变。
本领域技术人员应意识到被确定的并与衔接子连接的基因组片段可用于再生和扩增与其杂交的有与任何已知或未知核苷酸序列同源序列之基因组片段。
本领域技术人员应意识到所述方法代表从PCR产物中纯化共有序列以致消除扩增假产物的方法。
本领域技术人员应意识到所述方法代表从任何一种或多种类型的DNA分子库纯化共有序列的方法。
本发明完全不同于所有先前的技术，因为被产生的基因组片段不反映其从中衍生的基因座位的多态变异。而且，这些片段不需要从特定研究的个体中产生，而可从适当物种的任何个体中产生。然而，这些片段与被研究和错配的个体之基因组‘模板’的杂交容许精确扩增所述基因组模板内的等位基因，同时解决了产生假产物的问题，后者是其他PCR为基础的方法的一个特点。如果所述基因组片段是从单一个体衍生的，每个VNTR侧翼序列内多态变异的问题则被消除，因为这些序列对被研究的所有个体都是一致的。由于本发明保留了每个带有其侧翼序列的VNTR，这些等位基因保持高度的信息丰富性。在这方面，本发明是独一无二的。而且，这个产生VNTRs的新方法是快速，廉价的，不需要预先的序列知识，并且不需要复杂的仪器，它对避免通常分离VNTRs所需要的时间与经费上的高投入具有极大的重要意义。因此，依赖于尚无可用VNTR被分离之物种的技术应用将成为可能，而这在先前是不可能的。从所有物种快速，有效，廉价而又精确的产生大量VNTRs的能力是本发明对生物医学领域的工作人员的一个重大贡献。
总之，本发明涉及一种产生VNTRs的方法，包括DNA限制酶消化，片段与衔接子的连接，和通过引入带有与选定VNTR同源序列之引物，仅扩增那些以选定内切核酸酶限制酶位点及VNTR为侧翼的片段。这些片段对每个VNTR的等位基因是非代表性的，并且不需要从任何被研究的具体个体产生。这些带有被研究个体基因组DNA的片段重建了完整的带有侧翼序列的VNTR等位基因，如同其在基因组中存在的那样。这本身构成生物医学领域工作人员能够快速，有效，廉价和精确的在所有依靠VNTRs可用性(包括但不限于DNA指纹法和连锁分析)为目的的物种中产生VNTRs的主要步骤。结合错配鉴别方法解决了引发丢失的问题和由于污染以及反应条件的细微改变所产生的假产物的问题(这是所有PCR为基础的技术的缺陷)并使得排除了未表现具体性状的被研究个体所共有的等位基因。第二轮错配鉴别移除存在于未表现所述性状的个体基因组中的非信息丰富性等位基因。这个方法被称为对一种性状信息丰富的等位基因总代表(TRAIT)。因此，本发明比先前的方法明显优越，包括AFLP，GMS，RDA和RAPD的分析速度，和连锁分析的高多态性检出率，而又消除了对来自密切相关个体之DNA的需要以及亲权认定的需要。本发明还解决了PCR为基础的技术特有的问题，包括引发丢失和反应污染以及反应条件的细微改变形成的假产物。而且，不需要昂贵的仪器和复杂的统计计算机软件。所述分析将使连锁并信息丰富的等位基因唯一出现在或高频率出现在表现目的性状的个体中，但却在无所述性状的个体中不存在或存在的频率低。在这方面，本发明以其优势成为所有其他方法所不能相比的。
本发明容许通过同时比较来自多个个体的简单或复合基因组，同时进行多基因座位的多态性检测，并且完全不同于先前已经使用的所有其他技术。本发明代表生物医学领域工作人员除了筛选与遗传性状共分离的多态性复合基因组之外在从任何物种的基因组快速，有效，廉价和精确产生VNTRs的能力方面的较大提高。本方法的应用将因此便利工作人员在遗传筛选时发现遗传病，或在所有生物中有益的单基因或多基因性状。本发明应用方法实施例下面的阐述描述了应用本发明的实施例而非指明任何本发明范围限制或应用本发明的不同方式的限制。
实验资料实施例1用(CA)13和(GU)13引物制备扩增引物2微克DNA用3微升RsaI在100微升总体积中被完全消化8.5微升基因组DNA(相当于3微克DNA)10微升10X反应缓冲液3微升Rsal(10单位/微升；Promega)78.5微升蒸馏水100微升反应物在37℃温孵过夜，然后在70℃加热温孵20分钟灭活。通过微离心(Mictocon-100；Amicon)从所述缓冲液中分离DNA。回收体积10微升。
合并构成衔接子的2nmoles 48聚体和2nmoles 12聚体寡核苷酸15.9微升48聚体(相当于2nmoles)13.7微升12聚体(相当于2nmoles)10微升10x连接酶缓冲液(NEB)48.4微升蒸馏水88微升混合物被加热到50℃并使之在1小时内冷却到10℃。
向88微升的退火衔接子中加入10微升消化的DNA并进行所述衔接子与基因组片段的连接88微升退火衔接子连接酶缓冲液(含ATP)10微升DNA2微升T4 DNA连接酶(400NEBu/微升)100微升所述反应物在16℃温孵过夜，然后在70℃温孵20分钟加热灭活。
通过微量浓缩(Microcon-100；Amicon)将衔接子-连接的DNA片段与缓冲液和未连接的衔接子分开。回收12微升体积的DNA。
用Taq DNA聚合酶在双脱氧核苷三磷酸存在下与衔接子连接的DNA片段一起温孵以防止衔接子和未连接的DNA在随后的操作中的3’延伸
12微升微量浓缩的DNA3微升10x NH4反应缓冲液1微升50mM氯化镁1微升10mM ddATP1微升10mM ddCTP1微升10mM ddGTP1微升10mM ddTTP1微升Taq DNA聚合酶(5单位/微升；Bioline)9微升蒸馏水30微升反应物在72℃温孵2小时。
被终止3’端的衔接子连接的引物用酚/氯仿提取并微离心纯化。回收体积到40微升并通过凝胶电泳测量DNA浓度。测定的浓度为75ng/微升。
(CA)引发的扩增引物和(GU)引发的扩增引物在分开的反应中产生10微升10xNH4反应缓冲液8微升50mM氯化镁1.5微升10mM dNTPs1微升被终止3’端的衔接子连接的DNA4微升(CA)或(GU)引物(25pmol/微升)73.5微升蒸馏水98微升所述反应物用矿物油覆盖并加热到95℃持续2分钟，在此期间，加入1微升Taq DNA聚合酶(5单位/微升；Bioline)和2微升衔接子引物(50pmol/微升)。
热循环进行如下95℃持续30秒，然后72℃持续45秒共进行20个循环，随后72℃持续5分钟。
向100微升的(CA)引发的产物中加入5微升外切核酸酶I(10单位/微升)以移除剩余的(CA)引物。所述反应被温孵在37℃持续30分钟。
向100微升的(GU)引发的产物加入10微升的尿嘧啶DNA糖基化酶(1单位/微升；NEB)以消化所有掺入到PCR产物中的尿嘧啶。所述反应在37℃温孵2小时。加入1微升的10mM dNTPs，随后加入2微升的T4 DNA聚合酶(5单位/微升；Epicentre实验室)以移除伸出的与被消化(GU)序列互补的(CA)链。该反应在37℃温孵5分钟。进行两个库的扩增引物的酚/氯仿提取并微量浓缩(Microcon-100；Amicon)。对每个库，回收体积到500微升，其中取5微升用分光光度计分析以测定DNA的浓度。
使等量的(CA)和(GU)引发的扩增引物与单一个体的基因组‘模板’DNA在热循环前进行杂交。为检测扩增引物与基因组‘模板’DNA的最适比例，用各种数量的‘模板’DNA进行数个反应，而保持扩增引物的量恒定在‘模板’DNA(ng)0 0.1 1 101001000结合的扩增引物 1 1 1 1 1 15摩尔氯化钠(微升) 0.22 0.220.22 0.22 0.22 0.22蒸馏水(微升) 终体积为5.55微升每个反应液用矿物油覆盖并在98℃温孵5分钟，然后温度在4小时内逐步降低到78℃。
下列物质加入到每个杂交反应中5微升10X NH4反应缓冲液4微升50mM氯化镁0.75微升10mM dNTPs0.5微升衔接子引物(50pmol/微升)34.2微升蒸馏水在微离心机中简单离心每个反应液。使其加热到72℃持续2分钟并加入0.5微升Taq DNA聚合酶(5单位/微升；Bioline)。使反应液在72℃进一步温孵10分钟，然后提高温度到95℃持续2分钟。终止热循环如下进行95℃持续30秒，然后72℃持续1分钟，共进行10个循环。
就每个反应液而言，加入扩增了10次循环的10微升产物到40微升的反应混合物中并在同样条件下扩增又22个循环。扩增反应的5微升终产物在琼脂糖凝胶电泳上进行电泳。发现含100ng基因组‘模板’DNA的反应液产生的扩增产物最多，相当于100∶1的基因组‘模板’DNA扩增引物。
本发明通过克隆扩增产物被证实。培养被成功转化的大肠杆菌的两个克隆，在晚些时候从中收获质粒。对这些质粒测序并发现它们在多克隆部位含VNTR序列。进一步实验资料在下述实验中，使用了犬基因组DNA或从犬基因组DNA扩增的克隆化VNTR等位基因。克隆的等位基因被连接进入pUC18MCS的Smal位点，在质粒特异性引物的任何一端被酶解以便随后进行所述质粒插入片段的扩增
全部试剂购自Amersham Pharmacia Biotech，或其分公司，除非另有说明。
从Genset Corp.，France购得寡核苷酸。VNTR引物(AC)11B，(CA)11D，(GT)11H和(TG)11V构成11个以括号显示的重复序列，后接的一个变性碱基是B＝C+G+T，D＝A+G+T，H＝A+C+T，和V＝A+C+G。实施例2用(a)衔接子连接前终止和(b)终止前衔接子连接产生衔接子连接的，双脱氧核苷酸终止的基因组片段(a)用HaeIII使5微克犬基因组DNA片段化，消化反应在37℃，12小时进行到完全；4.4微升1.135微克/微升基因组DNA10微升10x限制缓冲液2微升10单位/微升HaeIII84微升蒸馏水
100微升通过一份反应液在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上电泳确认消化反应。
提取DNA(GFX纯化柱)并在50微升5mM Tris pH8.5中洗脱，其中30微升与末端脱氧核苷酸转移酶一起37℃温孵3小时30微升DNA30微升5x末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液4.5微升10毫摩尔ddGTP10微升9单位/微升末端脱氧核苷酸转移酶75.5微升蒸馏水150微升通过在离心间隔期间连续添加蒸馏水进行微量浓缩(Microcon-30；Amicon)，从低分子量溶质分离DNA。回收35微升体积。
通过两个寡核苷酸24聚体(GsCsAsGs GAGACATCGAAGGTATGAAC，其中’s’代表硫代磷酸酯键)和12聚体(TTCATACCTTCG)之间的退火制备衔接子。
7.6微升197pmol/微升24聚体9.2微升162pmol/微升，12聚体1.87微升10x T4 DNA连接酶缓冲液18.7微升。
所述混合物被加热到55℃并使之在一小时内冷却到10℃。
所述衔接子被连接到终止的基因组片段中35微升DNA18.7微升衔接子4.3微升10x T4 DNA连接酶缓冲液1.5微升10单位/微升T4 DNA连接酶2.5微升蒸馏水62微升反应液在16℃温孵过夜，然后在70℃加热20分钟灭活。伴随在离心间隔连续添加蒸馏水进行微量浓缩(Micron-30；Amicon)从低分子量溶质分离DNA。回收体积是54微升。
为防止在自单链缺刻部位引发过程中产生假产物，通过与热测序酶一起温孵对其终止化54微升DNA4.4微升热测序酶缓冲液1.4微升10mM ddATP1.4微升10mM ddCTP1.4微升10mM ddGTP1.4微升10mM ddTTP0.5微升32单位/微升热测序酶5.5微升蒸馏水70微升所述混合物用矿物油覆盖并在74℃温孵2小时。
所述DNA被提取(GFX纯化柱)并在50微升5mM Tris pH8.5中洗脱。
(b)5微克犬基因组DNA用Mbo I片段化，在37℃消化进行到完全4.4微升1.135微克/微升基因组DNA10微升10x限制缓冲液2.5微升10单位/微升Mbo183微升蒸馏水100微升通过在溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上进行一份反应液的电泳确认消化反应。
70℃温孵20分钟后，通过在离心间隔时连续添加蒸馏水的微量浓缩(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质中分离DNA。回收体积为32微升，其中一半与衔接子连接通过退火两个寡核苷酸，一个24聚体(GsCsAsGsGAGACATCGAAGGTATGAAC，其中’s’代表硫代磷酸键)和一个16聚体(GATCGTTCATACCTTC)制备衔接子引物6.3微升197pmol/微升24聚体8.5微升147pmol/微升16聚体1.65微升10x T4 DNA连接酶缓冲液16.5微升所述混合物被加热到55℃并在1小时内使其冷却到10℃。
将衔接子与所述基因组片段连接16微升DNA16.5微升衔接子2.4微升10x T4 DNA连接酶2微升10单位/微升T4 DNA连接酶3.1微升蒸馏水40微升所述反应在16℃温孵过夜，然后在70℃加热20分钟灭活。伴随在离心间隔连续添加蒸馏水进行微量浓缩(Micron-30；Amicon)从低分子量溶质分离DNA。回收体积是40微升。
用热测序酶终止衔接子连接的片段40微升DNA4.4微升热测序酶缓冲液1.4微升10mM ddGTP0.5微升32单位/微升热测序酶24微升蒸馏水70微升反应液用矿物油覆盖并在74℃温孵1小时。为防止在单链缺刻部位进行引发过程中产生假产物，通过进一步与热测序酶一起温孵并加入剩余的ddNTPs进行终止1.4微升10mM ddATP1.4微升10mM ddCTP1.4微升10mM ddTTP0.3微升热测序酶缓冲液4.8微升在74℃温孵所述反应又一小时。
提取DNA(GFX纯化柱)并在50微升5mM Tris pH8.5中洗脱。
通过扩增如下反应液中有或无‘内部’引物时所产生的片段进行基因组片段的衔接子连接与终止的方法(a)和(b)之比较5微升5微升5微升10x Taq PCR缓冲液5微升5微升5微升10x dNTPs1微升1微升1微升25pmol/微升24聚体
1微升1微升0微升50pmol/微升(AC)11B50ng0ng 50ng GFX提取的DNA到50微升 蒸馏水每个反应液用矿物油覆盖并加热到95℃2分钟。
0.5微升5单位/微升Taq DNA聚合酶被加入到每个反应液中，在95℃30秒，65℃30秒，72℃1分钟重复25次进行扩增，随后一次最终的72℃5分钟延伸反应。
每7.5微升反应液在溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳。无DNA的阴性对照反应液无产物产生，而含全部成分的反应液产生各种分子量的一片产物。相比之下，含DNA但无内部引物的反应液不能产生产物。这些结果证实衔接子已被成功连接，而所有能在DNA聚合酶存在下延伸的3’端已被终止。优选的方法是在连接前终止，因为(i)这保证了所有成功连接的片段均被终止和(ii)片段间的连接机会很少。从终止的，衔接子连接的基因组片段扩增5’和3’侧翼序列扩增反应在含下列成分的每个VNTR引物中进行5微升5微升10x Taq PCR缓冲液5微升5微升10x dNTPs2微升2微升25pmol/微升24聚体2微升2微升25pmol/微升(AC)11B或(CA)11D或(GT)11H或(TG)11V2微升0微升片段化的，终止的，衔接子连接的基因组(约50ng/微升)34微升36微升蒸馏水50微升50微升此外，制备出除了VNTR引物之外含全部成分的平行反应液。
全部反应液用矿物油覆盖并加热到95℃2分钟。0.5微升5单位/微升Taq DNA聚合酶被加入到每个试管中，而扩增反应通过95℃30秒，65℃45秒，72℃45秒的18次重复热循环进行，随后在72℃最终延伸5分钟。
将每反应液5微升，和分子量标记上载到溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶上。含全部成分的反应液产生一片产物，范围从约100到500bp，每个反应液的分子量密度与分布是可比的。相当于无DNA的那些反应的泳道和无VNTR引物的泳道不含任何扩增产物。实施例3评估T4 DNA聚合酶消化VNTR引发的PCR产物之重复序列的效率通过Taq DNA聚合酶扩增克隆的VNTR等位基因并通过离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质分离所述等位基因。回收40微升体积，通过琼脂糖凝胶电泳判断的浓度是130ng/微升，约1.3pmol/微升。
用蒸馏水制备1.5单位/微升的T4 DNA聚合酶。浓度为0.3pmol/微升的扩增的DNA用各种浓度的T4 DNA聚合酶在12℃进行消化1.5微升10x T4 DNA聚合酶缓冲液0.75微升10mM dATP0.75微升10mM dCTP3.5微升DNA0，0.5，1，2，或4微升1.5单位/微升的T4 DNA聚合酶到15微升蒸馏水制备无dNTP的平行反应液。所述反应液在12℃温孵1小时，随后在70℃加热20分钟。
每反应7.5微升在溴化乙锭染色的2.5％琼脂糖凝胶上进行电泳。在无dNTPs的情况下，全部DNA用超过0.05单位/微升的酶浓度消化。作为对照，在有dNTPs存在时，任何浓度的T4 DNA聚合酶均无可辨认的DNA损失。评估T7基因6外切核酸酶对VNTR引发PCR产物的重复序列的消化效率在[α-33P]dATP存在下通过Taq DNA聚合酶，用质粒特异性有义引物和(GT)11H引物扩增克隆的VNTR等位基因。进行含或缺少四个连续硫代磷酸酯键的引物的平行反应。在含硫代磷酸酯键的引物对中，它们位于质粒特异性引物的5’端和(GT)11H引物的3’端。
通过在离心间隔期间连续加入蒸馏水进行微量浓缩(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质分离扩增的DNA。等量的扩增反应液用T7基因6外切核酸酶在37℃消化15和30分钟，DNA的浓度约为0.1pmol/微升3.6微升DNA2微升5x T7基因6外切核酸酶缓冲液1微升10单位/微升T7基因6外切核酸酶3.4微升蒸馏水10微升对照反应在无酶情况下在37℃温孵15分钟。
全部反应液在95℃变性2分钟，加入5微升甲酰胺上载染料。每个样品10微升在8％聚丙烯酰胺变性凝胶上电泳。在固定与干燥后用放射自显影(Biomax MR；Kodak)胶片对所述凝胶曝光。
发现在无硫代磷酸酯保护的DNA温孵15分钟后已被完全消化。相反，硫代磷酸酯键的存在保留了DNA，尽管见到一些非特异性DNA丢失，每个分子的一条链被酶消化而缩短。比较T4内切核酸酶VII和S1核酸酶的消化效率和特异性重复长度有4个核苷酸不同的相同VNTR之克隆化的VNTR等位基因在[α-33P]dATP存在下分别扩增。从较短等位基因衍生的产物被均等分配在两个试管中。向一个试管加入等量的较长等位基因，而所述混合物通过98℃变性2分钟并在75℃退火150分钟，在100mM氯化钠和200微摩尔CTAB中杂交。
通过在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩(Microcon-30；Amicon)从其它低分子量溶质分离DNA的杂交与非杂交库。
在所提供的稀释缓冲液中，T4内切核酸酶VII被稀释到250单位/微升。S1核酸酶的稀释液用蒸馏水制备。等量的杂交DNA或非杂交DNA用50单位/微升的T4内切核酸酶VII在Taq DNA聚合酶缓冲液中消化或通过各种浓度的S1核酸酶在所提供的缓冲液中被消化。将S1核酸酶加入到反应液中以达到终浓度0.01单位/微升，0.03单位/微升，0.1单位/微升，和0.3单位/微升。在每种情况下，制备无酶的对照反应液。所述反应液在37℃进行30分钟。
在完成消化时，加入EDTA终止反应并加热灭活。加入相当于一半反应体积的甲酰胺上载染料并通过在95℃温孵5分钟变性每个反应。每个样品取12微升进行8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳。放射自显影胶片(Biomax MR；Kodak)对固定并干燥的凝胶曝光。
T4内切核酸酶VII被发现切割衍生自相同VNTR的约等量之两个不同等位基因杂交所产生的全部DNA的约一半分子，产生相应于切割时重复序列内错配位置上被切割产物的特征带型。因此，从尚未杂交的单一等位基因衍生的DNA以及包含错配的游离双链化DNA不受T4内切核酸酶VII的影响。相比之下，用T4内切核酸酶VII切割所见的产物特征带型在结合使用S1核酸酶时在任何反应条件下均看不见。这样，T4内切核酸酶VII被认为是此应用中的两个酶中较好的一个。
用各种浓度的酶在1X Taq PCR缓冲液，1x Pfu缓冲液(Stratagene)和1xT7基因6外切核酸酶缓冲液中重复T4内切核酸酶VII反应30分钟和1小时消化证实在一定反应条件下酶的消化是可预见的和可重复的，在直到200单位/微升浓度时对DNA的可测出的非特异性消化仍是不明显的。所述酶被发现切割含一定范围大小的错配的杂交分子。
在重复序列内的一个错配所产生的被S1核酸酶切割的产物之特征带型只有当大量DNA上载到聚丙烯酰胺凝胶上时才看得见。这是在用四个核苷酸的错配时所见到的。发现S1核酸酶对化解一个双核苷酸的错配的能力是不足的。评估酶浓度对T4内切核酸酶VII切割含错配双链体DNA的效率的影响两个2核苷酸长度差别的克隆化VNTR等位基因被分别用质粒特异性引物扩增，其中一个已用T4多核苷酸激酶标记[γ-33P]ATP。通过在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩(Microcon-30；Amicon)使每个扩增的等位基因与低分子量溶质分开。
从较小等位基因扩增得到的半数DNA被储存。向另一半加入约等量的较大等位基因扩增的DNA。该混合物在98℃变性2分钟，然后在75℃在100mM氯化钠和200微摩尔CTAB存在下退火2小时，温度的变化要快速。反复进行微量浓缩从低分子量溶质分离退火的DNA。
在所提供的稀释缓冲液中制备T4内切核酸酶VII的系列稀释液。未变性的较小等位基因和已变性并退火的混合物中的等位基因在TaqDNA聚合酶缓冲液中各自用终浓度为0单位/微升，50单位/微升，100单位/微升和150单位微升的T4内切核酸酶VII消化6微升DNA1微升10x Taq PCR缓冲液3微升T4内切核酸酶VII10微升在37℃进行温孵30分钟，然后每个反应液被加热到95℃2分钟同时加入5微升甲酰胺上载染料。取10微升进行8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳，然后所述凝胶被固定，干燥并对放射自显影胶片(Biomax MR；Kodak)曝光。
在未变性的较小等位基因几乎没有检测到消化反应。所见的很少有消化被推测其发生原因是由于在聚合酶出错部位的消化或最后扩增循环期间打滑带的退火的结果。在对应于退火等位基因混合物的泳道中，见到消化的特征带型发生在T4内切核酸酶VII存在时。虽然100单位/微升的消化量似乎比50单位/微升稍高些，每个酶浓度的消化程度被发现几乎是一致的。
类似的实验用各种浓度的T4内切核酸酶VII在Pfu缓冲液(Stratagene)和T7基因6外切核酸酶缓冲液中进行。对含错配DNA的有效消化被发现发生在两种反应缓冲液中，最大化的消化程度是在T4内切核酸酶50单位/微升到100单位/微升之间。无错配的双螺旋DNA在这些条件下对T4内切核酸酶VII是有抗性的。评估在T7基因6外切核酸酶缓冲液中S1核酸酶消化的效率和特异性用质粒特异性引物扩增克隆化的VNTR，其中之一用T4多核苷酸激酶标记了[γ-33P]ATP。通过在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩方法(Micron-30；Amicon)使扩增的产物从低分子量的溶质中分离开。回收的DNA体积被分成30微升被储存作为双链DNA，而剩下的30微升DNA被用于在98℃变性2分钟，然后在冰水中快速冷却而单链化。
S1核酸酶的稀释液用蒸馏水制备。等体积的双链DNA或单链DNA在T7基因6外切核酸酶缓冲液中37℃，在0单位/微升，0.1单位/微升，0.3单位/微升，1单位/微升和3单位/微升的S1核酸酶终浓度下消化5分钟。在消化完成时，通过加入500mM pH8 EDTA到终浓度25mM终止反应。
通过加入甲酰胺上载染料并加热到95℃3分钟使反应物变性，然后每份进行8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳。所述凝胶被混合，干燥并对放射自显影胶片(Biomax MR；Kodak)曝光。
发现在T7基因6外切核酸酶缓冲液中1单位/微升的S1核酸酶产生最佳的单链化DNA消化，在此浓度时双链化DNA没有明显丢失。S1核酸酶与T7基因6外切核酸酶一起消化DNA的评估为评估T7基因6外切核酸酶和S1核酸酶，用在5’端带有4个硫代磷酸酯键的质粒特异性有义引物和在3’端含四个硫代磷酸酯键的(AC)11B引物或缺少这样的键的(AC)11B引物从克隆的VNTR等位基因扩增DNA。所扩增的产物通过在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩方法(Microcon-30；Amicon)与低分子量溶质分开。每种情况的回收体积测量为40微升。这些被发现分别含约1.3pmol/微升和0.35pmol/微升的有或无硫代磷酸酯键的VNTR引物引发的反应物。
T7基因6外切核酸酶被稀释成10单位/微升的蒸馏水溶液。
S1核酸酶被稀释成10单位/微升的蒸馏水溶液。
每个扩增产物(浓度约为0.1pmol/微升)被T7基因6外切核酸酶消化。此外，产生的有(AC)11B引物含硫代磷酸酯键的DNA被T7基因6外切核酸酶与S1核酸酶一起消化无PT键 有PT键 有PT键4μl 4μl 4μl 5xT7基因6缓冲液l5.7μl 1.6μl1.6μl DNA0，2，4，8μl 0，2，4，8μl0，2，4，8μl10u/μlT7基因6外切核酸酶0μl 0μl 2μl 10u/μl s1核酸酶to 20μl to 20μl to 20μl dH2O
每个反应液在37℃温孵10分钟，然后加入1微升500mM EDTA pH8到每个试管中，随后在70℃温孵20分钟。
取每个消化物10微升进行2.5％琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色。对应于无酶的泳道含所预期分子量的分开的带。较低分子量带的外观(对应于单链化的DNA)被观察到位于浓度在1单位/微升的T7基因6外切核酸酶处，该酶作用于缺乏硫代磷酸酯键保护的(AC)11B引物引发的DNA。浓度超过此水平时，实际上全部DNA均被单链化。相比之下，每个末端被硫代磷酸酯键保护的DNA在任何T7基因6外切核酸酶浓度均不显示出分子量的明显改变，但随着浓度的增加，DNA的量明显减少。类似的，在每个末端被保护的DNA对T7基因6外切核酸酶与S1核酸酶的联合消化是有抗性的。在含约0.1pmol/微升DNA的T7基因6外切核酸酶缓冲液中，1单位/微升T7基因6外切核酸酶和1单位/微升S1核酸酶的浓度似乎给出最好的结果。用包括同样VNTR的三个等位基因与一个第二VNTR的单一等位基因的模型系统评估错配鉴别方法制备分别含同样VNTR，(AC)10，(AC)11，和(AC)18的三个比例为2∶1∶1等位基因的VNTR等位基因混合物。此外，一定量的第二VNTR(CA)16等位基因(相当于(AC)11和(AC)18等位基因))被加入到所述混合物中。用PfuDNA聚合酶(Stratagene)，通过PCR在含60pmoles的每种质粒特异性引物(所述有义引物已用[γ-33P]ATP标记)的100微升反应体积中扩增1ng的混合物。热循环在95℃30秒，65℃30秒，72℃45秒中反复17次，随后72℃5分钟最后的延伸反应。
通过在离心间隔期间加入蒸馏水的微量浓缩方法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质中分离扩增的DNA。回收的DNA在98℃变性2分钟，然后在75℃，100mM氯化钠和200微摩尔CTAB中退火2小时，温度转变快速进行。
通过在离心间隔期间加入蒸馏水的微量浓缩方法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质中分离杂交的DNA，并用T4内切核酸酶VII在含50单位/微升的总体积为36微升的酶之Taq DNA聚合酶缓冲液中进行消化。消化在37℃进行1小时，然后所述反应在75℃温孵15分钟。
通过在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩方法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质中分离消化的DNA。进一步的消化在T7基因6外切核酸酶缓冲液中含1单位/微升T7基因6外切核酸酶和1单位/微升S1核酸酶的50微升反应液中，在37℃进行10分钟。通过加入2微升500mM EDTA pH8并加热到75℃10分钟终止反应。
通过在离心间隔期间加入蒸馏水进行微量浓缩(Microcon-30；Amicon)。回收体积48微升，其中4微升通过PCR进行扩增如前。然后进行第二轮错配鉴别法。
在每轮错配鉴别前和后每份扩增的DNA进行8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳。此外，为比较每个产物的分子量，在每次分离中扩增的每个等位基因的PCR产物被上载到所述凝胶。
发现Pfu在每个扩增反应液中产生大量的滑拖带。错配鉴别前的混合物中(AC)10等位基因的量约是所有其他等位基因量的两倍。这些其他等位基因以大致相等的量存在。在第一轮错配鉴别后，(AC)10等位基因被发现明显富集。这被第二轮错配鉴别所加强，而导致一条非常强的与(AC)10等位基因对应的带，而(AC)11与(AC)18等位基因则显著减少。虽然相对于第二VNTR的(CA)15等位基因带在第二轮错配鉴别后出现，它不如富集的(AC)10等位基因的带那样明亮。这被认为反映了所述混合物中的每个VNTR之总DNA中的不均衡性和所产生的遵循二级动力学之杂交反应的相对低效率。该实验证实错配鉴别富集高频率的同样VNTR等位基因混合物中的等位基因。实施例4用被富集的数只狗的基因组评估本方法在没有受累或未受累于一种遗传性状的个体之DNA样品时，本发明在为模仿VNTR连锁不平衡方案而设计的模型系统上得到证实，所述不平衡被预期以一种隐性性状存在。
总共测定了43只狗的基因型具有先前用VNTR特异性引物在狗中分离到的相关VNTR。所述VNTR引物对包括(CACTTGGGACTTTGGATTGGTCA)有义引物和(GTCTTTGTTTCCATTCTTGCTTGC)反义引物。
通过PCR，扩增反应在含20ng基因组DNA和4pmoles每个VNTR特异性引物的10微升体积中进行。在各反应中，所述VNTR特异性有义引物被标记并加入到扩增反应总混合物中1.5微升10x T4多核苷酸激酶缓冲液2.4微升50pmol/微升VNTR特异性有义引物4.5微升[γ-33]ATP1微升三分之一稀释的30单位/微升T4多核苷酸激酶5.6微升蒸馏水15微升所述反应在37℃温孵1小时，然后90℃持续5分钟。
所述T4多核苷酸激酶反应被加入到PCR总混合物中15微升T4多核苷酸激酶反应液45微升10x Taq DNA聚合酶缓冲液45微升10x dNTPs2.4微升50pmol/微升VNTR特异性反义引物4.5微升5单位/微升Taq DNA聚合酶293微升蒸馏水405微升每只狗，加入1微升20ng/微升基因组DNA到9微升PCR总混合物中，其上覆盖矿物油。每个反应液被放置在预热的95℃热循环仪并温孵2分钟。然后，进行28次重复的95℃变性30秒，65℃退火30秒，和72℃延伸30秒热循环，随后一次72℃最终延伸5分钟。
完成热循环时，取5微升甲酰胺上载染料加入到每个反应液，并在进行60瓦，8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳前在90℃变性3分钟。所述凝胶被混合在10％甲醇/10％冰醋酸中并干燥。放射自显影胶片(BioMax MR；Kodak)对所述凝胶曝光过夜。
记录每只狗的VNTR基因型。10只狗被选出代表个体’受累库’，而10只狗被选出代表’野生型库’。进行所述筛选是为了实现可模拟隐性性状的方案。受累 等位基因频率(AC)n 100％(AC)n+10％(AC)n+20％(AC)n+30％(AC)n+40％(AC)n+50％(AC)n+60％(AC)n+70％野生型 等位基因频率(AC)n 15％(AC)n+10％(AC)n+20％(AC)n+30％(AC)n+435％(AC)n+520％(AC)n+60％(AC)n+730％从单只狗的基因组DNA制备扩增引物。在100微升体积中，取5微克基因组DNA用20单位HaeIII消化，在37℃消化进行12小时到完成4.4微升1.135微克/微升基因组DNA10微升10x限制缓冲液2微升10单位/微升HaeIII84微升蒸馏水100微升通过一份反应液的1％琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色的电泳，证实消化反应。
提取DNA(GFX纯化柱)并在50微升5毫摩尔Tris pH8.5中洗脱，其中在30微升内约含3微克用末端脱氧核苷酸转移酶在37℃温孵3小时
30微升DNA30微升5x末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液4.5微升10mM ddGTP10微升9单位/微升末端脱氧核苷酸转移酶75.5微升蒸馏水150微升所述DNA用在离心间隔期间连续添加蒸馏水的微量浓缩方法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质分离。回收体积为35微升。
通过两个寡核苷酸，一个24聚体(GsCsAsGsGAGACATCGAAGGTATGAAC，其中’s’代表硫代磷酸酯键)和一个12聚体(TTCATACCTTCG)的退火制备衔接子7.6微升197pmol/微升24聚体9.2微升162pmol/微升12聚体1.87微升10x T4 DNA连接酶缓冲液18.7微升所述混合物被加热到55℃并使之在1小时内冷却到10℃。
所述衔接子被连接到终止的基因组片段35微升DNA18.7微升衔接子4.3微升10x T4 DNA连接酶缓冲液1.5微升10单位/微升T4 DNA连接酶2.5微升蒸馏水62微升所述反应液在16℃温孵过夜，然后在70℃加热灭活20分钟。
用在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩方法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质中分离所述DNA。回收体积为54微升。
为防止从单链缺刻部位引发过程中产生假产物，通过与热测序酶一起温孵使其终止54微升DNA4.4微升热测序酶1.4微升10mM ddATP1.4微升10mM ddCTP
1.4微升10mM ddGTP1.4微升10mM ddTTP0.5微升32单位/微升热测序酶5.5微升蒸馏水70微升用矿物油覆盖混合物并在74℃温孵2小时。
提取DNA(GFX纯化柱)并在50微升5mM Tris pH8.5中洗脱。
用VNTR引物从所述DNA制备扩增引物，而衔接子中的24聚体寡核苷酸作为衔接子引物5微升10x Taq DNA聚合酶缓冲液5微升10x dNTPs2微升25pmol/微升衔接子引物2微升25pmol/微升VNTR引物[(AC)11B，(CA)11D，(GT)11H，或(TG)11V]2微升终止的，衔接子连接的DNA片段(约50ng/微升)34微升蒸馏水50微升制备的类似反应液含VNTR引物但没有基因组DNA。此外，进行含基因组DNA而无VNTR引物的单一反应。所有反应液被矿物油覆盖并在95℃温孵2分钟。加入0.5微升的5单位/微升Taq DNA聚合酶到每个反应液中。通过18次重复的95℃30秒，65℃45秒，72℃45秒的热循环进行扩增，随后一次72℃5分钟的最后延伸。
完成扩增时，每个反应液取5微升进行有分子量标准的溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳。在表现含模板DNA和一个VNTR引物的反应液泳道中存在的扩增产物证实发生了基因组片段与衔接子引物的连接。在每个反应中，这些泳道的外观是类似的，有一片扩增产物分布在整个从约100bp到500bp的分子量范围内。全部其他泳道没有扩增产物。含模板DNA但不含VNTR引物的反应事实证实全部3’端已被成功终止，以致防止了Taq DNA聚合酶存在时的链延伸。
合并(AC)11B和(CA)11D引发的反应液。还合并(GT)11H和(TG)11V引发的反应液。用在离心间隔期间加入蒸馏水的微量浓缩法(Microcon-30Amicon)从低分子量溶质分离扩增引物库。通过琼脂糖凝胶电泳定量回收的DNA提示每个含约35ng/微升的扩增引物DNA。
从富集的(AC)11B和(CA)11D引发的产物中用T4 DNA聚合酶和外切核酸酶VII移除重复序列14微升35ng/微升(AC)11B/(CA)11D引发的扩增引物DNA2微升10x T4 DNA聚合酶缓冲液1微升10mM dATP1微升10mM dCTP2微升四分之一稀释的4单位/微升T4 DNA聚合酶20微升所述反应液在12℃温孵1小时然后在70℃灭活20分钟。
向所述反应液中加入1微升10单位/微升外切核酸酶VII，37℃温孵30分钟，然后70℃20分钟。
通过合并选出的狗的等量基因组DNA(通过光密度法定量)，制备被消化的受累和野生型DNA库。对其用酚/氯仿法提取并用离心间隔期间加入蒸馏水的方法微量浓缩(Microcon；Amicon)。
通过HaeIII消化每个基因组DNA库，用末端脱氧核苷酸转移酶终止，并以类似于先前描述的方法与所述衔接子引物连接。通过PCR用所述衔接子引物证实全部3’端的完全终止。通过琼脂糖凝胶电泳定量所述DNA库并发现含大约相等的浓度。
在最小体积中，用T4 DNA聚合酶和外切核酸酶VII消化的2.5微升的35ng/微升(AC)/(CA)引发的扩增引物库在0.6M氯化钠中与约300ng已被片段化，终止和连接到衔接子的受累基因组DNA库杂交。其实现方法是在98℃变性矿物油下的混合物3分钟，然后在10小时内逐步降低温度从80℃到70℃并维持在最终温度又10小时。野生型库以类似的方式平行杂交。
向每个杂交液加入20微升10x Taq DNA聚合酶缓冲液20微升10x dNTPs160微升蒸馏水200微升在每个反应中，含被杂交DNA的总体积被分装在两个反应试管。在矿物油下每个体积被加热到75℃。加入1微升5单位/微升的Taq DNA聚合酶到每个试管中，随后在72℃温孵10分钟。反应液在95℃变性3分钟并加入4微升25pmol/微升的衔接子引物。通过30次重复的95℃30秒，65℃30秒，72℃90秒热循环，最后72℃延伸5分钟实现杂交DNA的扩增。
含受累DNA的反应液被富集，如同含野生型DNA的反应液进行的那样，并加入8微升10单位/微升外切核酸酶VII到每个200微升体积的扩增DNA中。所述反应液在37℃温孵15分钟。
每个反应，用离心间隔期间加入蒸馏水的方法从低分子量溶质(Microcon-30；Amicon)分离DNA。在各反应液中，回收体积为10微升。每个样品中所含等位基因被变性并通过在矿物油下95℃温孵5分钟然后快速降温到75℃使之退火。在75℃加入2M氯化钠和10mM CTAB到给定终浓度分别为50mM和500微摩尔浓度。所述杂交反应液在75℃进一步温孵16小时。
向各杂交反应液加入150微升5mM Tris pH8.5。然后，用在离心间隔期间加入蒸馏水的方法从低分子量溶质(Microcon-30；Amicon)分离被稀释的杂交反应液。判断其含约10pmoles DNA。用浓度为50单位/微升的T4内切核酸酶VII在Taq DNA聚合酶缓冲液中进行100微升体积中的消化。所述消化反应在37℃进行30分钟，然后在65℃温孵15分钟。
用在离心间隔期间加入蒸馏水的方法从低分子量溶质(Microcon-30；Amicon)分离各消化物。在各反应中所回收的体积被分成三个试管，每试管或者在1x Taq DNA聚合酶缓冲液中由0.5单位/微升外切核酸酶I，随后用1单位/微升T7基因6外切核酸酶，70℃加热10分钟灭活后，用0.5单位/微升外切核酸酶I在1x T7基因6外切核酸酶缓冲液中消化，或者1单位/微升T7基因6外切核酸酶与1单位/微升S1外切核酸酶一起在1x T7基因6外切核酸酶缓冲液中消化。每个反应液中的DNA浓度是30微升体积内约含0.1pmol/微升。外切核酸酶I的反应在37℃进行15分钟，然后在70℃加热灭活10分钟。含T7基因6外切核酸酶的反应在有或无S1核酸酶时，在37℃进行10分钟。每个消化方案完成时，提取DNA(GFX纯化柱)并稀释在50微升蒸馏水中。
各提取的DNA样品的四分之三用Taq DNA聚合酶通过PCR进行扩增37.5微升消化的DNA15微升10x Taq DNA聚合酶缓冲液15微升10x dNTPs6微升25pmol/微升衔接子引物76.5微升蒸馏水150微升反应液被分成75微升的等份试样并用矿物油覆盖，向其中加入0.75微升5单位/微升Taq DNA聚合酶，然后在95℃温孵2分钟。通过25次重复的95℃30秒，65℃30秒，72℃90秒热循环，继之以一次72℃最终延伸5分钟。
向每个150微升的扩增DNA中加入6微升10单位/微升外切核酸酶I。所述反应在37℃温孵15分钟。
用在离心间隔期间加入蒸馏水的方法从低分子量溶质(Microcon-30；Amicon)分离各反应液的DNA。在50mM氯化钠和500微摩尔浓度CTAB中重复杂交反应，然后重复消化反应各步骤，然后如上述用Taq DNA聚合酶通过PCR扩增得到的DNA。
各扩增样品按份进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色并使用分子量标记。在相应于T4内切核酸酶VII随后是外切核酸酶I消化的DNA泳道中的扩增产物具有高分子量分布在上样孔的周围。相比之下，对应于被T7基因6外切核酸酶随后被外切核酸酶I或T7基因6外切核酸酶，同时用S1核酸酶消化的扩增产物的泳道含产物的分子量范围在约200bp到750bp之间。在这种情况的分子量分布是类似的。在孔的周围没有观察到成片带说明在无T7基因6外切核酸酶时所见的扩增中的假产物由于该酶的存在而被消除。这样，T7基因6外切核酸酶被认为是错配鉴别方案的一个必要成分，以便从T4内切核酸酶VII切割的分子中移除重复序列，所述被切割的分子还可杂交并产生假DNA分子。
从第二轮错配鉴别产生的被扩增DNA各150微升体积被加入6微升10单位/微升外切核酸酶I并在37℃消化所述反应液15分钟。
用在离心间隔期间加入蒸馏水的方法从低分子量溶质(Microcon-30；Amicon)分离各反应液中的DNA。
对应于‘受累’狗的各反应液，用Taq DNA聚合酶，VNTR特异性引物，在含约25ng DNA的50微升体积中进行扩增反应。通过28次重复的热循环进行扩增，其后上载5微升等份和分子量标记到有溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶上。
在对应于T4内切核酸酶VII和外切核酸酶I消化反应的泳道，所预期分子量的产物十分微弱。此外在孔的邻近看到大量的假产物。在其他所有的泳道，没有见到高分子量的产物。而且，清楚见到扩增的产物作为预期分子量约为130bp的一条分开的带。
对应于T4内切核酸酶VII和外切核酸酶I消化反应的扩增产物被丢弃。留下的反应液用VNTR进一步扩增，其中之一用T4多核苷酸激酶进行[γ-33P]ATP标记。用Taq DNA聚合酶在含10pmoles各引物的20微升体积中的PCR进行扩增反应共35次重复的热循环。此外，在以含40ng的富集的‘受累’和富集的‘野生型’DNA的同样方式中进行反应。在加入10微升甲酰胺上载染料到每个样品后，扩增产物在90℃温孵3分钟。6微升等份的混合物进行8％聚丙烯酰胺变性凝胶电泳。固定并干燥凝胶并对放射自显影胶片曝光。
据发现在第二轮错配鉴别之后，从受累DNA扩增的DNA产物是可见的。这在对应于T7基因6内切核酸酶继而由外切核酸酶I消化的泳道和在对应于由T7基因6外切核酸酶同时用S1核酸酶消化的泳道两者均被观察到。在各反应中，所述产物类似于尚未经过错配切割的，富集的受累DNA之扩增而产生的情况。在第二轮错配鉴别之后扩增的野生型的反应中，没有可辨认出的产物。
这个实验证实从数个个体富集的基因组精确再生出VNTRs(各种情况保留的等位基因)，而错配鉴别起着消除扩增的假产物的作用并富集最高频率的VNTR等位基因。虽然就野生型DNA来源的DNA而言没有可见的产物，用较高上载DNA到聚丙烯酰胺凝胶上，则可能产物将成为可见的。这样，进一步重复错配鉴别方法将对减少两个DNA库中的等位基因到接近纯合是必要的以便能实现最终筛选出信息丰富的等位基因。实施例5证明带有经过与衔接子连接而产生3’突出部分的DNA对外切核酸酶III的抗性通过Taq DNA聚合酶扩增克隆化的VNTR等位基因。用在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质分离被扩增的DNA。
测量回收体积为44微升，其浓度通过琼脂糖凝胶电泳测定为160ng/微升，约为1.6pmol/微升。
扩增的DNA通过T4 DNA聚合酶消化切平。
42微升DNA3.25微升10mM dATP3.25微升10mM dCTP3.25微升10mM dGTP3.25微升10mM dTTP13微升10x T4 DNA聚合酶缓冲液3.25微升4单位/微升T4 DNA聚合酶59微升蒸馏水130微升所述反应液在12℃温孵30分钟，然后在70℃加热20分钟灭活。用在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质分离所述DNA。回收体积为30微升。
用T4多核苷酸激酶磷酸化1600pmoles 21聚体寡核苷酸(CTCGCAAGGATGGGATGCTCG)，在所提供的稀释缓冲液中稀释到10单位/微升。
3.19微升21聚体寡核苷酸1.5微升10x T4 DNA连接酶缓冲液1微升10单位/微升多核苷酸激酶9.3微升蒸馏水15微升所述反应液在37℃温孵30分钟，然后在90℃加热灭活10分钟。
向激酶反应液中加入1600pmoles 12聚体寡核苷酸(CATCCTTGCGAG)。为形成衔接子而进行的所述寡核苷酸的退火通过加热到55℃实现，并使混合物在1小时期间内冷却到10℃。
通过T4 DNA聚合酶切平的半数DNA被储存。向退火的衔接子加入其余的15微升平头DNA以使所述衔接子过量50倍15微升切平的DNA16.2微升退火的衔接子1.9微升10x T4 DNA连接酶缓冲液1微升10单位/微升T4 DNA连接酶34微升所述连接反应液在16℃温孵过夜。
所述连接液在70℃加热灭活20分钟并用在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质分离所述DNA。
回收体积被测量为36微升。
所述连接的DNA和被储存的15微升未连接的DNA通过加入蒸馏水使两者均为约0.75pmoles/微升。通过外切核酸酶III在终浓度DNA约为0.2pmole/微升时消化每个DNA。
10.7微升DNA4微升10x外切核酸酶III缓冲液1微升200单位/微升外切核酸酶III24.3微升蒸馏水40微升所述反应液在37℃温孵5分钟，然后在70℃加热灭活20分钟。
约2pmoles每个消化物被上载到溴化乙锭染色的2％琼脂糖凝胶。通过外切核酸酶III将全部未连接的DNA消化完全以使在琼脂糖凝胶上没有可检测出的DNA。相比之下，虽然有些消化发生，多数连接的DNA发现对消化是抗性的。被消化的那些推测是没能与磷酸化的衔接子连接。所述实验证实衔接子的连接是DNA可以此对外切核酸酶III产生抗性的一种方法，那些没有衔接子的分子被该酶完全消化。用外切核酸酶III在DNA库中筛选与DNA的第二个库杂交的特有序列两个在其重复序列中有四个核苷酸差异的克隆化VNTR等位基因通过PCR用Taq DNA聚合酶扩增。用在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质分离扩增的DNA并通过琼脂糖凝胶电泳测定所产生的DNA浓度。
向较小等位基因的扩增产物部分加入3’突出部分，与末端脱氧核苷酸转移酶一起温孵12.5微升120ng/微升DNA(约1.2pmol/微升)15微升5x末端脱氧核苷酸转移酶缓冲液1.125微升10mM dATP3.3微升9单位/微升末端脱氧核苷酸转移酶43微升蒸馏水75微升所述反应在37℃温孵1小时，然后提取DNA(GFX纯化柱)。
向450ng中加入有3’突出部分的等位基因(i)4.5微升无3’突出部分的同样等位基因；(ii)4.5微升无3’突出部分的较大等位基因。
在每个反应中，总体积通过微量浓缩法(Microcon-30；Amicon)被最小化。这些混合物在98℃变性3分钟并在75℃在0.2M氯化钠和100微摩尔浓度CTAB的存在下退火2小时。
向每个杂交反应中加入10微升10x Taq DNA聚合酶缓冲液10微升500单位/微升T4内切核酸酶VII80微升蒸馏水100微升反应在37℃温孵45分钟，然后在70℃温孵15分钟来灭活。
用在离心间隔期间连续加入蒸馏水的微量浓缩法(Microcon-30；Amicon)从低分子量溶质分离所述DNA。在各反应液中回收体积约40微升，该体积被稀释在含5单位/微升外切核酸酶III的反应混合物中40微升DNA15微升10x外切核酸酶III缓冲液3.75微升200单位/微升外切核酸酶III91微升蒸馏水
150微升所述反应在37℃温孵5分钟，然后将其微量浓缩(Microcon-30；Amicon)全部回收体积在溴化乙锭染色的1.5％琼脂糖凝胶上电泳。此外，将分子量标记，无3’突出部分的小等位基因400ng，和400ng的有突出部分的较小等位基因上载到凝胶上。
通过与分子量标记比较，较小的扩增等位基因的大小被确定为约150bp。在与末端脱氧核苷酸转移酶一起温孵后，被扩增的等位基因的表观大小有所增加。观察到一片产物分布在对应于400bp到750bp双链DNA尺寸范围之间，虽然大多数DNA被限制在两者之间中途的一条未明确的带。在含杂交的已被消化成不等大小之等位基因的泳道中，见到对应于约300bp的双链DNA的一条带的背景是一片产物。这条带被认为是对含错配DNA双螺旋的酶切结果，此处的成片背景被认为是外切核酸酶III消化无3’突出部分保护的分子所产生的单链DNA。在含同样大小的杂交等位基因的泳道中，可见到两个不明确带，衬有一片背景产物。最亮的带看上去类似于与末端脱氧核苷酸转移酶一起温孵之后的较小等位基因的带并被认为代表外切核酸酶III消化的异源双链分子所残留的单链DNA。较模糊的带被认为是酶切有聚合酶错误的分子的结果。如前所述，成片背景被认为是由于无3’突出部分的由外切核酸酶III消化产生的单链DNA分子。这个实验提示一个有3’突出部分的等位基因与一个T4内切核酸酶VII和外切核酸酶III消化的不同重复序列长度的等位基因一起进入异源双链，以致使所述异源双链的片段可被筛选出。
附录考虑一个可使罕见隐性性状典型化的方案。受累组个体是相同等位基因的纯合子。在野生型组中，这种等位基因有相对低的频率。初始方案 受累组 野生型组等位基因 A B C D A B C D等位基因频率 1.00.00.00.00.15 0.35 0.20.3等位基因比率 1 0 0 0 3 7 4 6第一轮后 受累组 野生型组等位基因 A B C D A B C D剩余数1.000 0.000 0.000 0.000 0.023 0.123 0.040 0.090总剩余数 1.0 0.276等位基因比率 1 0 0 0 23 12340 90等位基因频率 1.000 0.000 0.000 0.000 0.083 0.446 0.145 0.326第二轮后 受累组 野生型组等位基因 A B C D A B C D剩余数1.00.00.00.00.006 0.199 0.021 0.106总剩余数 1.0 0.332等位基因比率 1 0 0 0 6 19921 106等位基因频率 1.00.00.00.00.018 0.599 0.063 0.319第三轮后 受累组 野生型组等位基因 A B C D A B C D剩余数1.00.00.00.00.000 0.359 0.004 0.102总剩余数 1.0 0.465等位基因比率 1 0 0 0 0 3594 102等位基因频率 1.00.00.00.00.000 0.772 0.008 0.219第四轮后 受累组 野生型组等位基因 A B C D A B C D剩余数1.00.00.00.00.000 0.596 0.000 0.010总剩余数 1.0 0.606等位基因比率 1 0 0 0 0 5960 10等位基因频率 1.00.00.00.00.000 0.983 0.000 0.017剩余等位基因 1×1×1×1＝10.276×0.332×0.465×0.606＝0.026比率的比较38.5∶1其中的全部是A 其中的无是A因此，即使有大量过量野生型DNA与在错配鉴别方法中存留的受累DNA杂交，十分可能将回收存在于受累组中的等位基因。
考虑另一方案，其中一个等位基因存在于受累组个体中的频率高于野生型组的频率。初始方案 受累组 野生型组等位基因 A B C D E A B C D E等位基因频率 0.050 0.100 0.000 0.150 0.700 0.250 0.200 0.150 0.250 0.150等位基因比率 1 2 0 3 14 5 4 3 5 3第一轮后 受累组 野生型组等位基因 A B C D E A B C D E剩余数0.003 0.010 0.000 0.023 0.490 0.063 0.040 0.023 0.063 0.023总剩余数 0.526 0.212等位基因比率 3 10 0 23 49063 40 23 63 23等位基因频率 0.006 0.019 0.000 0.044 0.932 0.297 0.189 0.108 0.297 0.108第二轮后 受累组 野生型组等位基因 A B C D E A B C D E剩余数0.000 0.000 0.000 0.002 0.869 0.088 0.036 0.012 0.088 0.012总剩余数 0.871 0.236等位基因比率 0 0 0 2 86922 9 3 22 3等位基因频率 0.000 0.000 0.000 0.002 0.998 0.373 0.153 0.051 0.373 0.051第三轮后 受累组 野生型组等位基因 A B C D E A B C D E剩余数0.000 0.000 0.000 0.000 0.996 0.139 0.023 0.003 0.139 0.003总剩余数 0.996 0.307等位基因比率 0 0 0 0 1 13923 3 1393等位基因频率 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000 0.453 0.075 0.010 0.453 0.010第四轮后 受累组 野生型组等位基因 A B C D E A B C D E剩余数0.000 0.000 0.000 0.000 1.000 0.205 0.006 0.000 0.205 0.000总剩余数 1.00.416等位基因比率 0 0 0 0 1 2056 0 2050等位基因频率 0.000 0.000 0.000 0.000 1.000 0.493 0.014 0.000 0.493 0.000剩余等位基因 0.526×0.871×0.996×1＝0.4560.212×0.236×0.307×0.416＝0.006比率的比较76∶1其中的全部是E 其中的无是E因此，即使有大量过量野生型DNA与在错配鉴别方法中存留的受累DNA杂交，十分可能将回收存在于受累组中的等位基因E。参考文献Bruford M W，and Wayne R K(1993)微卫星及其在群体遗传学研究中的应用。Current Opinion in Genetics and Development.3；939-943。
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权利要求
1.制作目的物种的一个或多个成员的基因组DNA之VNTR等位基因及其侧翼区的混合物的方法，所述方法包括步骤(a)将目的物种的基因组DNA分成片段，(b)每个片段的每端连接一个衔接子，由此形成衔接子终止的片段混合物，其中每个3’端被封闭以防止酶促链延伸反应，(c)用部分衔接子终止的片段混合物作为模板，用一个衔接子引物和一个VNTR引物产生5’侧翼VNTR扩增引物的混合物，(d)用部分衔接子终止的片段混合物作为模板，用一个衔接子引物和一个VNTR反义引物产生一个3’侧翼的VNTR扩增引物的混合物，(e)以5’侧翼VNTR扩增引物的混合物和/或3’侧翼VNTR扩增引物的混合物作为引物，用目的物种的一个或多个成员的基因组DNA作为模板制作所需要的VNTR等位基因及其侧翼区的混合物。
2.权利要求1的方法，其中步骤b)通过终止各片段的每个3’端以防止酶促链延伸反应，并连接各片段的各5’端到一个衔接子上，由此形成衔接子终止的片段混合物来进行。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中在步骤c)中从5’侧翼VNTR扩增引物移除所述VNTR重复序列，而在步骤d)中从3’侧翼VNTR扩增引物移除所述VNTR重复序列。
4.权利要求1到3任何之一的方法，其中在步骤c)和/或步骤d)中，使用的衔接子或引物含至少一个硫代磷酸酯键。
5.权利要求1到4任何之一的方法，其中步骤e)或接续或一起使用5’侧翼VNTR扩增引物混合物和3’侧翼VNTR扩增引物混合物作为引物而进行。
6.权利要求1到5任何之一的方法，其中在步骤e)中使用的表现目的性状的目的物种之一个或多个成员的基因组DNA，由此所产生的VNTR等位基因及其侧翼序列的混合物是表现目的性状的那些等位基因代表。
7.权利要求6的方法，其中在步骤f)中VNTR等位基因及其侧翼区的混合物中的链被分离，然后再退火，并分离和丢弃任何错配。
8.权利要求7的方法，其中步骤f)被重复进行以回收单VNTR等位基因及其侧翼区。
9.权利要求6到8任何之一的方法，其中至少一个代表表现目的性状的那些等位基因的VNTR等位基因及其侧翼序列与代表不表现目的性状的那些等位基因的VNTR等位基因及其侧翼序列的混合物进行杂交，而选择至少一个匹配和/或至少一个错配以提供至少一个有所述目的性状特征的VNTR等位基因或其片段。
10.权利要求9的方法，其中给代表表现目的性状的那些等位基因的至少一个VNTR等位基因及其侧翼序列提供3’重叠末端。
11.目的物种的一个或多个成员的一部分基因组DNA，所述部分基本上由所选VNTR序列及其侧翼区的等位基因代表性混合物组成。
12.权利要求11的部分，其中等位基因混合物是那些表现目的性状的等位基因代表。
13.权利要求11或权利要求12所要求的部分，其中所述混合物的各成员在其3’端和其5’端含一个衔接子。
14.目的物种的一个或多个成员基因组DNA的部分，所述部分基本上由单一VNTR等位基因及其侧翼区和一个在其每个3’端与其5’端的衔接子组成，所述等位基因具有表现目的性状的那些等位基因的特性。
15.目的物种基因组DNA的一部分，所述部分基本上由一个选定的VNTR序列之3’侧翼区的一个代表性混合物组成，混合物的每个成员在其3’端携带一个衔接子。
16.目的物种基因组DNA的一部分，所述部分基本上由一个选定的VNTR序列之5’侧翼区的一个代表性混合物组成，混合物的每个成员在其5’端携带一个衔接子。
17.处理多态等位基因的混合物的方法，所述混合物是那些表现目的性状的代表，所述方法包括分离，然后再退火所述混合物的链，并分离和丢弃任何错配。
18.权利要求17的方法，其中多态等位基因的混合物是选定VNTR序列及其侧翼区的等位基因混合物。
19.权利要求18的方法，其中重复所述方法以回收单一VNTR等位基因及其侧翼区。
20.权利要求17到19任何之一的方法，其中将代表那些表现目的性状的那些等位基因的至少一个VNTR等位基因及其侧翼序列与代表那些不表现目的性状的那些等位基因的VNTR等位基因及其侧翼序列的混合物进行杂交，且选择至少一个匹配和/或至少一个错配以提供至少一个有所述目的性状的VNTR等位基因或其片段。
21.权利要求20的方法，其中给代表那些表现所述目的性状的至少一个VNTR等位基因及其侧翼序列被提供3’重叠末端。
22.制备扩增引物混合物的方法，其方法的步骤包括a)将目的物种的一个或多个成员的基因组DNA分成片段，b)连接各片段的每个末端到一个衔接子上，由此形成衔接子终止的片段混合物，其中每个3’端被封闭以防止酶促链延伸反应，和c)用衔接子终止的片段混合物的一部分作为模板，用衔接子引物和一个VNTR引物以产生5’侧翼VNTR扩增引物的混合物，和/或d)用衔接子终止的片段混合物的一部分作为模板，用衔接子引物和一个VNTR反义引物产生3’侧翼VNTR扩增引物的混合物。
23.鉴别与目的性状连锁的等位基因的方法，所述方法包括在杂交条件下一起温孵代表那些表现目的性状的那些等位基因的至少一个多态等位基因及其侧翼序列；和代表那些未表现所述目的性状的多态等位基因及其侧翼序列的混合物；并筛选至少一个匹配和/或错配以提供与所述目的性状连锁的至少一个等位基因及其片段。
24.权利要求23的方法，其中所述等位基因是VNTR等位基因。
25.权利要求23或24的方法，其中给所述代表那些表现目的性状的至少一个等位基因及其侧翼序列提供3’重叠末端。
26.如权利要求14中所要求的基因组DNA部分在诊断检测中的应用。
27.权利要求1到10或17到21任何之一的方法，其中所述VNTR等位基因及其侧翼区，或所述VNTR等位基因及其侧翼区的混合物通过在杂交条件下被用于固定化VNTR等位基因和/或其侧翼区的阵列中而进行分析。
28.一套试剂盒，包括进行权利要求1到10，17到25或27任何之一的方法之方案与试剂。
全文摘要
本发明描述的是提取VNTR等位基因的一种新方法,该方法还通过同时比较多个体的复合基因组,伴随检查多个基因座位上遗传性状的多态标记。所述产品被称为性状信息丰富的等位基因总代表(TRAIT)。这些等位基因可直接被用做遗传标记或可被用做便于精确定位相关序列变化的载体。
文档编号C12Q1/68GK1257551SQ98805349
公开日2000年6月21日 申请日期1998年3月20日 优先权日1997年3月21日
发明者格雷格·弗思 申请人:格雷格·弗思