专利名称：基因重组人血小板第4因子及其新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程手段获取重组人血小板第4因子及其重组人血小板第4因子的新用途。
机体受电离辐射照射前或照射后，早期应用某种药物能减轻或防止其辐射损伤，这类药物称为辐射防护剂。自1949年以来，全世界共筛选了20000多种化合物，其中经过大动物实验的约有100多种，有10多个药物已经过人体试验，它们主要为含硫类化合物和色氨类化合物。辐射防护剂筛选成功的的几率很小，相反淘汰率很高，从筛选药物开始，到进行人体试用，只有千分之二。其原因主要是这些含硫类化合物和色氨类化合物药物有小时短，有效剂量范围较窄、毒性较大，在使用时防护剂量与中毒剂量非常接近，药物也不够稳定，同时还存在剂型的问题，因此至今尚未得到满意的辐射防护剂。
本发明的目的在于提供一种防止辐射损伤和保护造血功能的辐射防护剂，即提供一种基因重组人血小板第4因子并利用其新用途。它在受到辐射时对造血功能的保护具有明显的预防效果，优于目前各种防护药物。
为实现上述目的，本发明的技术方案以如下方式实现(1)利用反转录聚合酶链式反应RT-PCR方式获取人血小板第4因子PF4基因；(2)由所得的人血小板第4因子PF4基因，利用基因工程手段获得人血小板第4因子PF4重组表达产物；(3)通过对所述表达产物的纯化或变复性以及纯化后，获得有生物活性的人血小板第4因子PF4。
上述利用基因工程手段包括利用各种原核系统、酵母系统、真菌系统和真核系统表达的人血小板第4因子PF4。
上述人血小板第4因子PF4基因包括突变体以及目的基因的融合体。
将基因重组人血小板第4因子作为辐射防护剂，用于预防辐射损伤，保护造血功能。
通过体外细胞试验证实适当剂量的重组人血小板第4因子可用于刺激培养细胞产生对射线的防护效应；通过大量动物在体试验证实重组人血小板第4因子具有辐射防护作用，对造血功能的保护作用显著，优于经典的辐射防护剂。可对平时或战时应急性照射及医疗性照射进行辐射防护，对接受照射者的造血系统进行保护。本发明可大规模批量，具有生产周期短，操作简单，产量高，成本低，活性好，纯度高，质量稳定，毒副作用小，使用安全的特点。
下面通过实施例对本发明作进一步说明获得重组人血小板第4因子实施例1.编码人血小板第4因子(rhPF4)基因的获取根据已发表的人血小板第4因子基因全序列或部分序列，设计聚合酶链式反应(PCR)引物，从人血细胞cDNA文库中扩增得编码人血小板第4因子全序列或部分基因序列。2.人血小板第4因子的重组表达将编码人血小板第4因子全序列或部分基因序列克隆到真核表达载体pCDNA和大肠杆菌表达载体Pbv221上，转染COS、CHO细胞和转化大肠杆菌，得到表达人血小板第4因子的工程菌和工程细胞。3.人血小板第4因子基因工程产物的获得用经过合理组织的层析分离手段获得真核人血小板第4因子表达产物；大肠杆菌表达产物经裂菌，层析纯化或包涵体分离、变复性、层析纯化，得到人血小板第4因子的基因工程产物。
用途实施例小鼠经致死剂量7.8Gyγ射线照射后，未预防注射PF4的动物12天内全部死亡，而照射前20小时，分2次，每次间隔6小时，剂量为20ug-60ug/kg，肌肉或腹腔注射PF4的动物照射后30天，存活率60％。对骨髓、脾脏、胸腺及粒-巨噬细胞集落形成的检查都显示治疗组动物的造血系统得到较好的保护，而且未发现明显的毒副作用。经多次系统的实验证明重组人血小板第4因子是一种安全有效的辐射防护剂。
对比实验重组人血小板第4因子与当前国际公认较好的辐射防护剂WR2721和胱氨酸对比实验，实验小鼠随机分为4组空白对照组、PR4治疗组、WE2721治疗组和胱氨酸治疗组。照射前各治疗组以实验所得的各组最佳剂量和最佳使用方法给药，空白对照组给予适量生理盐水。照射剂量7.5Gyγ射线，比较各组30天存活率和对造血系统(骨髓、脾脏、胸腺及粒-巨噬细胞集落形成能力)实验发现，30天存活率方面，PF4治疗组比另外两个治疗组高出25％以上，在对造血系统的保护方面也明显优于另外两个治疗组(P＜0．01)。
权利要求
1.基因重组人血小板第4因子，其特征在于(1)利用反转录聚合酶链式反应RT-PCR方式获取人血小板第4因子PF4基因；(2)由所得的人血小板第4因子PF4基因，利用基因工程手段获得人血小板第4因子PF4重组表达产物；(3)通过对所述表达产物的纯化或变复性以及纯化后，获得有生物活性的人血小板第4因子PF4。
2.根据权利要求1所述的基因重组人血小板第4因子，其特征在于所述利用基因工程手段包括利用各种原核系统、酵母系统、真菌系统和真核系统表达的人血小板第4因子PF4。
3.根据权利要求1所述的基因重组人血小板第4因子，其特征在于所述人血小板第4因子PF4基因包括突变体以及目的基因的融合体。
4.基因重组人血小板第4因子的新用途，其特征在于将基因重组人血小板第4因子作为辐射防护剂，用于预防辐射损伤，保护造血功能。
5.根据权利要求4所述的基因重组人血小板第4因子的新用途，其特征在于将适当剂量的重组人血小板第4因子在射线照射前肌肉或腹腔注射。
6.根据权利要求5所述的基因重组人血小板第4因子的新用途，其特征在于所述适当剂量为20ug-60ug/Kg，射线照射前20小时，间隔6小时，分2次注射。
全文摘要
本发明涉及一种利用基因工程手段获取重组人血小板第4因子及其重组人血小板第4因子的新用途。它包括(1)获取人血小板第4因子基因;(2)利用基因工程手段获取人血小板第4因子重组表达产物;(3)获得有生物活性的人血小板第4因子。同时将基因重组人血小板第4因子作为辐射防护剂,用于预防辐射损伤,保护造血功能。实验证明它是一种安全有效的辐射防护剂。
文档编号C12N15/12GK1283631SQ9911583
公开日2001年2月14日 申请日期1999年8月6日 优先权日1999年8月6日
发明者田琼, 杨岚, 张绍章, 蒲勤, 张发科 申请人:田琼, 杨岚, 张绍章, 蒲勤, 张发科