专利名称：分离的与hla－b35分子结合的肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及由MHC分子提呈，从而导致被细胞毒T细胞识别的肽。更具体地，本发明涉及与HLA-B35分子结合的肽，其为九聚体。
背景技术：
及现有技术哺乳动物免疫系统识别外来或外源物质并与之反应的过程比较复杂。此系统的一个重要方面是T细胞应答。该应答要求T细胞识别被称之为人类白细胞抗原(“HLA”)或主要组织相容性复合体(“MHC”)的细胞表面分子与肽形成的复合物并与之相互作用。肽是从大分子经同样呈现HLA/MHC分子的细胞加工而成。这方面参见Male等，高级免疫学(Advanced Immunology)(J.P.Lipincott Company，1987)，特别是第6-10章。T细胞与HLA/肽复合体之间的相互作用是受限的，它需要特异性针对HLA分子与肽的特定组合的T细胞。若没有特异性T细胞，则即使有其对应的复合体存在也不会发生T细胞应答。类似地，如果有T细胞存在但缺乏特异性复合体也没有应答。该机制与免疫系统对外来物质的应答、自身免疫病理状况、以及对细胞异常的应答相关。很多研究关注的是蛋白质被加工成HLA结合肽的机制。这方面参见Barinaga，科学257880(1992)；Fremont等，科学257919(1992)；Matsumura等，科学257927(1992)；Latron等，科学257964(1992)。
癌症中也涉及T细胞识别细胞异常的机制。例如，在1992年5月22日提交、并于1992年11月26日公开的PCT申请PCT/US92/04354(已引入本文作为参考)中，公开了一个被加工成肽并被表达在细胞表面，导致肿瘤被特异性CTL裂解的基因家族。现称这些基因编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，由它们衍生的肽被称为“肿瘤排斥抗原”或“TRA”。参见Traversari等，免疫遗传学35145(1992)；van der Bruggen等，科学2541643(1991)，这两篇文献均引入本文作为该基因家族的更详细资料的参考。
在已引入本文作为参考的美国专利第5,405,940号中阐述了与HLA-A1分子结合的九肽。该专利指出，如果已知特定肽对特定HLA分子的特异性，则希望特定肽优先与其中一种特定HLA分子结合，而不是优先与其它分子结合。这一点很重要，因为不同个体具有不同的HLA表型。结果是，尽管对作为某种特定HLA分子或某类HLA分子之配偶体的特定肽的鉴定具有诊断和治疗意义，但这些意义仅涉及具有该特定HLA表型的个体。对该领域仍需作进一步研究，因为很多细胞异常并不限于一种特定HLA表型，而靶向治疗也要求对目标异常细胞的表型有一定了解。
酪氨酸酶催化酪氨酸转变成脱羟基苯丙氨酸即“DOPA”而且似乎选择性表达在黑色素细胞中(Muller等，欧洲分子生物学组织杂志72715(1988))。对这一人类酶的cDNA的早期报道见Kwon，美国专利第4,898,814号。其后Bouchard等，实验医学杂志1692029(1989)报道了一种略有差异的序列。大量工作是对该酶的抑制物进行鉴定，因为这与色素沉着疾病有关。这方面的部分实例包括Jinbow，WO9116302；Mishima等，美国专利第5,077,059号以及Nazzaropor，美国专利第4,818,768号。本领域人员应对阐述类似物质的其它文献很熟悉。
已引入本文作为参考的各种美国专利指出，酪氨酸酶可能以类似于对外来抗原或TRAP分子的处理方式受到处理一即，有人发现在某些细胞异常情况如黑色素瘤中，酪氨酸酶受到加工，由它衍生的肽与某些异常细胞上的HLA分子形成复合体。这些复合体可被细胞毒T细胞(“CTL”)识别，随后这些CTL裂解提呈细胞。
例如，得到准许的专利申请流水号08/583,238(1996年1月5日提交)阐述了衍生自酪氨酸酶的肽，以及与HLA-A2和HLA-B44分子结合成复合体的肽。衍生自酪氨酸酶并由HLA分子提呈的肽的其它资料可参考美国专利第5,487,974号，以及于1994年2月28日提交的美国专利申请流水号08/203,054，于1993年6月23日提交的流水号08/081,673，于1992年12月22日提交的流水号07/994,928，其目前已被放弃。所有这些文献均引入本文作为参考。
已知HLA-B35分子可提呈肽，所形成的复合体被CTL识别。这方面参见已于1996年9月26日提交并得到准许的美国专利申请流水号08/718,964，其已引入本文作为参考。关于HLA-B35分子所实施的提呈的其它资料参见如Rammensee等，免疫遗传学41171(1995)，具体在第207页，已引入作为参考。亦参见已引入作参考的Mason等，组织抗原51417-465(1998)。第458页列出了HLA-B35的已知等位基因的氨基酸序列，并显示它们之间存在很大的同一性。
已鉴定出结合至HLA-B35分子随后被CTL识别的新的肽。本发明包括这些肽，以及它们的应用。
本发明的肽因衍生自酪氨酸酶，故无需再从酪氨酸酶衍生，对这一点本领域技术人员应能理解，亦可见于在下文中。
优选实施方案详述实施例1如Degiovanni等，欧洲免疫学杂志18671-676(1988)所述的黑色素瘤细胞系LG2-MEL由自体细胞毒T淋巴细胞识别。至少有三种抗原呈现在LG2-MEL细胞表面并由这些CTL识别；但尚未对这些抗原中的任何一种进行分离或描述。这些实验描述了如何对“CTL 35-24”所识别的肽进行鉴定。
首先，在本文未描述的实验中，将两种抗HLA-B和HAL-C分子的单克隆抗体与CTL 35-24以及细胞系LG2-MEL结合。这些抗体述于Rebai等，组织抗原22107-117(1983)和Yang等，免疫遗传学19217-231(1984)，这两篇文献均引入本文作参考。已发现这些抗体可抑制CTL 35-24对LG2-MEL的裂解。本质上，这是通过将稀释的抗体(1/3-1/8)加至细胞毒性试验中而实现的。由于此前的HLA分型已将HLA-A24、A32、B35、B44以及Cw*04鉴定为黑色素瘤细胞系所提呈的HLA分子，显然提呈分子可以是B35、B44、Cw*04中的任何一种。
众所周知，提呈亲代癌症细胞系上部分HLA分子的癌症细胞亚系可衍化生成。LG2-MEL的这样一种亚系，即LG2-MEL 220现为已知，它已不再表达HLA-B35。CTL 35-24不能裂解该亚系，提示其中的提呈分子是HLA-B35。
随后，分离HLA-B35分子的cDNA并对其测序，发现其为等位基因亚型HLA-B*3503。该亚型与其它已知的HLA亚型之间存在微小差异，见Mason等，出处同上。因此认为该等位基因亚型同样可用于肽的提呈。
实施例2如“背景”部分所述(见上文)，已知黑色素瘤细胞表达很多在正常细胞中不表达或只有少数正常细胞表达的基因。这些基因包括MAGE基因、BAGE、GAGE(1-6)、RAGE(1-4)、LAGE、PRAME、酪氨酸酶、Melan-A、NY-ESO-1、pme/17、CASP-8、MUM-1和gp100。已进行了试验，以确定由HLA-B35分子提呈的抗原是否自这些基因加工而成。为此，按标准方法获得了上述各种基因的cDNA，并制备了载体。将载体用于转染COS细胞，对这些细胞还用LG2-MEL所表达的HLA-B*3503的cDNA转染。所用cDNA(即HLA-B*3503的cDNA)从BB 49-SCCHN细胞所制备的cDNA文库获得。该细胞系由Mandruzzato等，实验医学杂志186(5)785-793(1997)描述，该文献已引入本文作参考。用50ng上述各种构建体以众所周知的DEAE/葡聚糖方法实施转染。转染后24小时，加入CTL 35-24(1500个细胞)，24小时后用标准方法测定TNF的产生。参见Traversari等，免疫遗传学35145-152(1992)。所用对照包括LG2-MEL 5-35细胞系(阳性对照)，和仅用HLA-B*3503或黑色素瘤相关基因转染的COS细胞。只有同时表达酪氨酸酶和HLA-B*3503的细胞能刺激TNF的产生。
实施例3将酪氨酸酶鉴定为已加工的分子后，便进行研究以确定HLA-B*3503所提呈的肽的特性。为此，按Wofel等，欧洲免疫学杂志24759-764(1994)，和Brichard等，欧洲免疫学杂志26224-230(1996)，以及美国专利第5,487,974号所述制备酪氨酸酶的cDNA片段(以上三篇文献均引入本文作参考)。在上述专利中的SEQ ID NO1即本申请中的SEQ ID NO40。
使用上文实施例2中所述的TNF试验，不同的是用酪氨酸酶cDNA片段而不用完整cDNA分子。这些片段为阳性，它们对应于酪氨酸酶cDNA中编码区的1-1086位、427-1134位、以及703-1134位核苷酸。对应于574-831位的片段为阴性，从中得出结论831-1086位核苷酸编码所提呈的抗原。这些对应于已知氨基酸序列的酪氨酸酶的270-362位氨基酸。将该氨基酸序列与结合HLA-B*3501的已知肽、以及它的结合基元进行比较，如Rammensee等，出处同上所述，已引入本文作参考。该文献描述了HLA-B35的一种九肽的结合基元，其中Pro在第2位，而Tyr在第9位。Ramensee等所述的十肽以P2和Y10为结合点。用HLA-B*3501是因为本领域未见关于HLA-B*3503的任何资料。Ramensee等还将Phe，Met，Leu，和Ile作为P9位的辅助结合点。由氨基酸序列LPSSADVEF(SEQ ID NO1)所定义的肽满足这些要求，并出现在酪氨酸酶的312-320位氨基酸上。对其刺激裂解的能力通过合成该肽，将该肽加入表达HLA-B*3503的自体淋巴母细胞样细胞系LG2-EBV，然后加CTL 35-24进行检验。还检验了细胞系HA7-EBV。该细胞系表达HLA-B*3501。用到51Cr释放试验，其中将细胞与不同浓度的SEQ IDNO1肽一起温育。该试验的细节参见美国专利第5,519,117号，已引入本文作参考。将51Cr标记的细胞与所述肽一起温育30分钟，然后以5∶1的效应物(CTL)靶(LG2-EBV)比加入CTL 35-24。3.5小时后测定51Cr的释放。
结果示于
图1。显然所述肽激发了对两类细胞的裂解，这表明所述肽与HLA-B*3501和B*3503均可以结合。1nM肽使对LG2-EBV细胞的裂解达到最高水平的一半，约10nM肽使对HA7-EBV细胞的裂解达到最高水平的一半。
在前实施例描述了本发明，其为结合HLA-B35分子的肽。这些肽具有通式Leu Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Phe(SEQ ID NO2)在这类肽中，优选那些第3位为Ser，第4位为Ser，第5位为Ala，或第6位为Asp的肽(SEQ ID NO3-6)。根据本发明的肽可能具有如上定义的第3-6位中的一或多个。第7和第8位可以是任何氨基酸。本发明还包括对应于以上参照肽，但在N和C末端侧翼不超过酪氨酸酶的270-312位和321-362位氨基酸。或者说，所述肽为所含氨基酸由不多于第270-311位的氨基酸，连接SEQ ID NO2，后者再连接第321-362位的氨基酸而组成。因此，由例如酪氨酸酶的290-311位氨基酸，后随SEQ ID NO2，接着为酪氨酸酶的321-340位氨基酸所组成的肽也为本发明的一部分。优选地，长度不超过约16个氨基酸且包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO1，或SEQ ID NO4-6之任一的肽亦为本发明的一部分。
本发明还包括肽组合，其含有至少SEQ ID NO2的肽，优选SEQ IDNO1和3-6中任一个的肽，并同时另含有一或多个MHC或HLA结合肽。已知不同个体在其细胞表面通常表达六种不同的HLA分子。如“背景”部分对本领域的回顾所指出，结合其它HLA分子的肽均为已知，结合HLA-B35分子的其它肽也已知。可据此“定制”包含两种或多种MHC结合肽的组合物，其中至少这些结合肽中的一种为SEQ ID NO1-6所定义的肽。
本发明还包括编码本发明所述肽的核酸分子，如由编码不超过酪氨酸酶270-362位的氨基酸，且不少于SEQ ID NO2所定义的肽，或更优选不少于SEQ ID NO1和3-6中任一所定义的肽的核苷酸组成的核酸分子。可将这些核酸分子插入表达载体中，所述核酸分子或载体可用于转化或转染细胞、细胞系、以及细胞株，这些细胞可以是真核或原核细胞。它们还可与编码MHC分子(如象HLA-B*3501或HLA-B*3503这样的HLA-B35分子)的核酸分子联合应用。
本发明的肽和核酸分子具有各种用途，这些用途也是本发明的一部分。例如，除了它们可用于治疗，如体外或体内产生特异性裂解病原菌细胞的细胞毒T细胞以外，所述肽还可用于鉴定HLA-B35阳性细胞，或从含有HLA-B35阳性细胞的混合物中取出这些细胞。特别是所述核酸分子可作为探针用于鉴定表达酪氨酸酶的细胞。
本发明还包括一种多组分复合体，其可用于如从样品中分离特异性针对特定靶的细胞毒T细胞。该复合体包含一个第一结合配偶体和一个第二结合配偶体，其中所述第一和第二结合配偶体互为特异。它们可以是如亲和素或链亲和素和生物素、特异性针对生物素的抗体或抗体的结合部分等。关键特征是所述第二结合配偶体需结合由MHC分子、β2微球蛋白分子以及特异性结合该MHC分子的肽组成的多个复合体，且所述多组分复合体需被标记。MHC分子优选为HLA分子，如HLA-B35分子，但本领域普通技术人员应理解任何HLA分子均可利用。就目的肽而言，很多参考文献包括综述文章、美国和非美国专利等描述了除SEQ ID NO2-6以外的肽以及它们的结合配偶体HLA分子。所有这些均包括在本发明中。肽以及它们的HLA分子配偶体的实例在本申请的后文中呈现。
优选地，所述第二结合配偶体为生物素，但也可以是如特异性针对HLA/β2微球蛋白/肽复合体的一个组分的抗体，如HLA特异性抗体、或一种β2微球蛋白特异性抗体。类似地，所述第一结合配偶体可以是如重组或天然蛋白L、重组或天然蛋白A、或甚至一种第二抗体。该复合体可以是可溶形式，或结合形式，如结合在可除去的固相如磁珠上。
本发明大分子的HLA/β2微球蛋白/肽复合体数可以变化。它包含至少两个复合体，优选至少四个，但也可能更多。
利用本领域已知的任何标记技术可以对结合配偶体与HLA/β2微球蛋白/肽的复合体进行标记。荧光标记的实例已在上文给出。酶标记如碱性磷酸酶、金属颗粒、由合成材料制成的着色塑料、放射性标记等等全都可以使用。
还可使用一种特异性结合上述第一结合配偶体的第三结合配偶体。例如，如果第一结合配偶体为链亲和素，第二结合配偶体为生物素，那么第三结合配偶体可以是链亲和素特异性抗体。当用到三个或更多个结合配偶体时，上述标记可附着于任一种结合配偶体，只要与HLA/β2微球蛋白/肽复合体的结合不受损即可。
所述复合体可用于，如鉴定或分离样品中出现的特异性针对HLA/β2微球蛋白/肽复合体的细胞毒T细胞。如实施例所示，这类细胞毒T细胞可结合本发明的免疫复合体。在一优选实施方案中，待检样品用特异性结合细胞毒T细胞的反应物处理，其中所述标记提供一种可检测的信号。然后使含有标记的CTL的样品与复合体接触，发生结合，然后可通过任何标准的、众所周知的细胞分离方法分离该样品。优选地，用FACS，但本领域技术人员还知晓其它分离方法。所用肽留待技术人员需要时用，并将取决于如所研究的特定MHC系统的性质，其CTL为已知的肽的非限制性实例列表如下。它们也示于SEQ ID NO7-38。
基因 MHC 肽 序列号MAGE-1 HLA-A1 EADPTGHSY 7HLA-Cw16SAYGEPRKL 8MAGE-3 HLA-A1 EVDPIGHLY 9HLA-A2 FLWGRPALV10HLA-B44 MEVDPIGHLY 11BAGEHLA-Cw16AARAVFLAL12GAGE-1，2 HLA-Cw16YRPRPRRY 13RAGEHLA-B7 SPSSNRIRNT 14GntVHLA-A2 VLPDVFIRC(V) 15MUM-1 HLA-B44 EEKLIVVLF16EEKLSVVLF17CDK4HLA-A2 ACDPHSGHFV 18ARDPHSGHFV 19B-catenin HLA-A24 SYLDSGIHF20SYLDSGIHF21Tyrosinase HLA-A2 MLLAVLYCL22
HLA-A2 YMNGTMSQV 23HLA-A2 YMNGTMSQV 24HLA-A24 AFLPWHRLF 25HLA-B44 SEIWRDIDF 26HLA-B44 YEIWRDIDG 27HLA-DR4 QNILLSNAPLGPGFP 28HLA-DR4 DYSYLQDSDPDSFQD 29Melan-AMart-1HLA-A2 (E)AAGIGILTV 30HLA-A2 ILTVILGVL 31gp100Pme1117HLA-A2 KTWGQYWQV 32HLA-A2 ITDQVPFSV 33HLA-A2 YLEPGPVTA 34HLA-A2 LLDGTATLRL35HLA-A2 VLYRYGSFSV36DAGE HLA-A24 LYVDSLFFL 37MAGE-6 HLA-Cw16 KISGGPRISYPL 38
可能会发现其它肽，如在美国专利申请流水号08/672,351、08/669,590、08/487,135，以及目前的美国专利08/530,569、08/880,693、08/718,964号，目前的美国专利第＿＿＿＿＿号，所有这些均引入本文作参考。
本发明的另一方面是所谓的“小基因”，其携有由这类小基因所转染的细胞直接合成肽所必需的信息。可将小基因设计为编码一或多种抗原肽，还可进一步将小基因通过质粒转染、或通过克隆至痘苗病毒或腺病毒而转移至宿主细胞基因组。参见如Zajac等，国际癌症杂志71496(1997)，已引入本文作参考。
本发明的肽可与来自其它肿瘤排斥抗原的肽一起形成“polytope”。肽的实例包括本申请上文中所列的那些。
其它可利用的肽为以下参考文献中所述的肽，所有文献均引入本文作参考美国专利5,405,940；5,487,974；5,519,117；5,530,096；5,554,506；5,554,724；5,558,995；5,585,461；5,589,334；5,648,226；和5,683,886；PCT国际
发明者安妮·奥姆斯, 杰勒德·德乔万尼, 桑德拉·莫里尔, 贝努特·范登艾恩德, 西里·布恩－法勒 申请人:路德维格癌症研究院