热稳定天冬酰胺酶变体以及对其进行编码的多核苷酸的制作方法
【专利说明】热稳定天冬酰胺酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
[0003]发明背景 发明领域
[0004] 本发明涉及天冬酰胺酶变体、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以 及使用这些变体的方法。本发明进一步涉及使用一种或多种发酵生物从植物材料生产糖、 糊精和发酵产品的方法。
[0005] 相关技术说明
[0006] 熟知的是，可以通过减少食物材料中的天冬酰胺的量的处理来减少加热食物 产品中的丙烯酰胺形成，例如通过使食物材料经受天冬酰胺酶的作用（参见例如，W0 2004/026042)〇
[0007] 已经鉴定了多种真菌天冬酰胺酶；参见例如，W0 2004/030468或TO 2004/032648。已经描述了用于改进其特性的此类天冬酰胺酶的蛋白质工程。TO 2008/128974、W0 2008/128975和W0 2011/134916披露了来自黑曲霉的在更碱性的pH下 具有改进活性的天冬酰胺酶变体。W0 2008/110513披露了来自米曲霉的具有改进的热稳定 性的天冬酰胺酶变体。然而，在天冬酰胺酶的某些工业应用中，例如，在法式炸薯条的生产 中，甚至更高的热稳定性是所希望的。
[0008] 本发明的一个目的是提供与其亲本相比具有改进的特性的天冬酰胺酶变体。
[0009] 现今，通过发酵生物生产大量难于合成地生产的商业产品。此类产品包括醇类 (例如，丁醇、乙醇、甲醇、1，3-丙二醇）；有机酸类（例如，乙酸、柠檬酸、葡糖酸盐、葡糖酸、 衣康酸、乳酸、琥珀酸、2, 5-二酮-D-葡糖酸）；酮类（例如，丙酮）；氨基酸（例如，谷氨酸）； 气体（例如，H2和C02);以及更复杂的化合物，包括例如抗生素（例如，青霉素和四环素）； 酶；维生素（例如，核黄素、B12、P-胡萝卜素）；以及激素。发酵也通常被用于可食用酒精 (例如，啤酒和白酒）、乳制品（例如，用于生产酸奶酪和干酪）、皮革以及烟草工业中。
[0010] 在本领域已知大量通过由含淀粉材料的降解提供的糖进行发酵来生产发酵产品 (例如，乙醇）的方法。
[0011] 然而，从此类植物材料中生产糖、糊精和发酵产品（例如乙醇）仍成本太高。因此， 对提供可以增加发酵产品的产率并且由此减少生产成本的方法存在需要。
[0012] 本发明的一个另外的目的是提供用于生产发酵产品的改进方法。
[0013]发明概述
[0014] 在一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体在对应于SEQIDN0:2的 位置140或241的一个或多个位置处包括取代，或在对应于SEQIDNO: 2的位置27的位置 处包括缺失，其中该变体与SEQIDN0:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50%序列一致 性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
[0015]在另一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体在对应于SEQIDN0:2 的位置 122、140、197、238、239、240、241、253、258、259、297 或 373 的一个或多个位置处包括 取代，或在对应于SEQIDNO:2的位置27、28或29的一个或多个位置处包括缺失，其中该 变体与SEQIDN0:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80%序列一致性，并且其中该变体 具有天冬酰胺酶活性。
[0016] 在另一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体包括（i)以下取代中 的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQIDN0:2中的位置：T71C、T74C、K122A、V139G、T140D、K194L、D197E、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258Y、R259C、R259V、S334W、 S338W、G356D、K363R或E373H，或（ii)缺失，该缺失位于对应于SEQIDN0:2的位置27的 位置处；其中该变体与SEQIDN0:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50%序列一致性， 并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
[0017] 在另一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体包括（i)以下取代中 的一个或多个，其中每个位置都对应于SEQIDN0:2中的位置：T71C、I74A、T74C、K122A、K122R、V139G、T140D、K194L、D197E、I228M、S238C、N239C、K240R、P241E、K253R、I258V、 I258Y、R259C、R259V、S297V、S299A、T314A、P333L、S334P、S334W、E337S、S338G、S338W、 G356D、K363R或E373H，或（ii)缺失，该缺失位于对应于SEQIDNO: 2的位置27、28或29 的一个或多个位置处；其中该变体与SEQIDN0:2或4的任一个的成熟多肽具有至少80% 序列一致性，并且其中该变体具有天冬酰胺酶活性。
[0018] 在另一个方面中，本发明涉及一种天冬酰胺酶变体，该变体具有至少76 °C，优选至 少77°C、至少78°C、至少79°C或至少80°C，例如至少81 °C、至少82°C、至少83°C、至少84°C或至少85°C的解链温度Tm，其中该Tm是通过差示扫描量热法确定，并且该变体与SEQID N0:2或4的任一个的成熟多肽具有至少50%序列一致性。
[0019] 本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建 体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。
[0020] 本发明还涉及在食物产品的生产中使用这些变体的方法。
[0021] 本发明还涉及获得这些变体的方法。
[0022] 本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括：
[0023] (a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用a_淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊 精；
[0024] (b)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
[0025] (c)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
[0026] 本发明还涉及一种生产糖的方法，包括：
[0027] (a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用a_淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊 精；并且
[0028] (b)用糖化酶将该糊精糖化为糖。
[0029] 本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括：
[0030] (a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
[0031] (b)用a_淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；
[0032] (c)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
[0033] (d)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
[0034] 本发明还涉及一种生产糊精的方法，包括：
[0035] (a)在本发明的天冬酰胺酶的存在下，用a _淀粉酶将一种含淀粉材料液化为糊 精；并且
[0036] (b)回收该糊精。
[0037] 本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括：
[0038] (a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
[0039] (b)用a _淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；
[0040] (c)用糖化酶将该糊精糖化为糖；并且
[0041] (d)使用发酵生物发酵该糖，以生产该发酵产品。
[0042] 本发明还涉及一种生产糖的方法，包括：
[0043] (a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；
[0044] (b)用a _淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精；并且
[0045] (c)用糖化酶将该糊精糖化为糖。
[0046] 本发明还涉及一种生产糊精的方法，包括：
[0047](a)用本发明的天冬酰胺酶处理一种含淀粉材料；并且
[0048] (b)用a _淀粉酶将该处理的含淀粉材料液化为糊精。
[0049] 本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括用a_淀粉酶将一种含淀粉材料转 化为糊精；用葡糖淀粉酶将该糊精糖化为糖；并且在本发明的天冬酰胺酶的存在下，使用 发酵生物在低于该含淀粉材料的初始凝胶化温度的温度下以一个单一步骤发酵该糖。
[0050] 本发明还涉及一种生产发酵产品的方法，包括
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