真空中脱除有机溶剂，将水层加到用水调节的StrataC18-ESPE筒体（10g，55ym;Giga Tubes，Phenomenex)的顶部。用水（150mL)冲洗所述筒体，然后通过抽吸氮气流经过筒体而 进行干燥，最后，用甲醇（IOOmL)洗脱。所述SPE筒体脱除了甲酸痕量物以防质子催化的糖 苷配基的释放。在真空中脱除有机流出物中的溶剂，将残余物悬浮于水（5mL)中并且冷冻 干燥而得到柠檬苦素-17-P-D-吡喃葡糖苷，为白色的无定形粉末，纯度高于99%。
[0080]柠檬苦素-17-0-〇-吡喃葡糖苷，图1中的1:群八15(乙腈/水；?112.5): 入_=220nm;LC/MS(ESI +) :m/z 649([M-H] ) ;LC/MS(ESI) :m/z 668([M+NH4]+)，673([M +Na]+)，689([M+K]+) !1H NMR (400MHz，MeOD-d4, COSY) :5 0.66 [s，3H，H-C (24)] ,0.98 [s，3H， H-C (25b)], I. 21 [s, 3H, H-C (25a)], I. 40 [s, 3H, H-C (18)], I. 66 [m, 1H, H-C (12)], I. 78 [m, 2 H，H-C(11)], 1.99 [m, 1H, H-C (12)] ,2.43 [dd, 1H,J= 7.4,22. 1Hz, H-C (6)] ,2.55 [dd, 1H,J =5. 6, 19. 0Hz, H-C (6) ] , 2. 68 [d, 1H,J= 4. 3Hz, H-C (9) ] , 2. 7 I [d, 2H,J= 4. 1Hz, H-C (2)],2. 79 [dd, 1H,J= 5. 6, 14. 7Hz, H-C (5)],2. 94 [s, 1H, H-C (15)],3. 11 [m, 2H, H-C (2'），H-C (5'）]，3. 20 [m, 1H, H-C (4'）]，3. 27 [m, 1H, H-C (3'）]，3. 48 [m, 1H, H-C (6'）]，4. 20 [s, 1H, H-C(I)],4. 29 [d, 1H,J= 7. 6Hz, H-C (I') ],4. 40 [d, 2H,J=8. 1Hz, H-C (19)],5. 42[s, IH1H-C(17)], 6. 53[d, 1H,J=L3Hz, H-C(21) ],7. 24[s, 1H, H-C(23) ],7. 63 [s, 1H, H -C (22)] ；13C NMR(100MHz, MeOD-d4, HMQC,HMBC)：8 17. I [C, C (11) ],18. 4 [C, C (24) ],20. 8 [C ,C (25b) ],24. 7 [C, C (18) ],26. 8 [C, C (12) ],29. 2 [C, C (25a) ],35. 2 [C, C (2) ],36. 4 [C, C (6)] ,44. 8 [C, C (13) ],45. I [C, C (9) ],45. 2 [C, C (10) ],50. 7 [C, C (8) ],54. 8 [C, C (5) ],59. 8 [C, C ( 15)], 61. 7[C, C(6')], 63. 8[C, C(19)], 69. I [C, C(14) ],70. 4[C, C(4') ],75. 4[C, C(2') ],76 ?〇[C, C (5') ],76. 9 [C, C (3') ],78. I [C, C (17) ],78. 4 [C, C(I)], 80. 8 [C, C (4) ],104. 3 [C, C (I ')],112. 3[C, C(21)], 125. 4 [C, C (20)], 140. 3 [C, C (22) ],142. 3[C, C(23)], 173. 0 [C, C (3), C(16)]，209. 6[C, C(7)]。
[0081]实施例2-从柠檬苦素-17- g -D-吡喃葡糖苷牛成柠檬苦素
[0082] 为了研究橙汁贮藏过程中柠檬苦素从柠檬苦素-17-0 -D-吡喃葡糖苷中推定的、 非酶促释放，把被调节到新榨橙汁的PH值（pH3.5)或调节到见于橙汁浓缩物的pH值范围 (pH2.0和3.0)的吡喃葡糖苷水溶液在20°C下在暗处保持14周之久。以一定的时间间隔， 从模型溶液取出等分试样，并借助按MRM方式操作的HPLC-MS/MS分析了从吡喃葡糖苷释放 的柠檬苦素的量。如图2中所示，与模型溶液的pH值无关，柠檬苦素随着增加的贮藏时间 而生成，但是降低pH值有助于苦味化合物的产生。例如，在pH2.0下保持时，从吡喃葡糖 苷释放出0. 85%mol的柠檬苦素，而在pH3. 5下保持时，仅仅生成0. 25%的苦味化合物。
[0083] 为了研究温度对柠檬苦素生成的影响，把调节到pH3. 0的吡喃葡糖苷水溶液在 4、20和30°C下在暗处保持14周之久。以一定的时间间隔，借助按MRM方式操作的HPLC-MS/ MS测定了柠檬苦素的量。图3中所示的结果清楚地证明了，与分别在4和20°C下保持的模 型溶液相比，在30°C下加速了从柠檬苦素-17-0-D-吡喃葡糖苷释放柠檬苦素。例如，在 30 °C下保温时，柠檬苦素以接近4. 0 %的产率从其前体释放，而在4°C下贮藏前体溶液14周 之后，仅仅可以检测到0. 2%的苦味化合物。
[0084] 特别是，将通过添加痕量的盐酸（lmol/L)而分别调节到2. 0、3. 0和3. 5的pH值 的柠檬苦素-17-0-〇-吡喃葡糖苷水溶液（〇.3511^/1)在不同的温度（4、2〇、3〇°(：)下在暗 处在密闭的小瓶中保持14周之久。以一定的时间间隔，用注射器取出样品（5yL)，借助在 SynergiFusion, 150x2mmi.d.，4ym柱（Phenomenex)的LC-MS/MS分析了梓檬苦素的生 成。为此，以250yL/min的流量进行色谱法，开始时用0.I%甲酸水溶液与乙腈的混合物 (80/20,v/v)，在IOmin内升高乙腈含量至40%，然后在5min内升高至80%，保持5min，最 后，在5min内升高至100%。采用负电喷雾电离，按多反应监测（MRM)方式，用质量跃迀m/ z469 - 229,分析了柠檬苦素。通过比较为质量痕量物（masstrace)获得的峰面积与柠 檬苦素在甲醇中的规定标准溶液的峰面积，进行了定量分析。
[0085] 图4表明，LC-MS/MS色谱不只是显示柠檬苦素-17-P-D-吡喃葡糖苷⑴和柠檬 苦素（3)，而是意外地显示出第三个峰（4)，该峰在16. 59min处洗脱并且显示与柠檬苦素中 发现的相同的质量跃迀m/z469 - 229,于是暗示着柠檬苦素立体异构体的存在。由于到目 前为止该化合物的化学结构还没有通过NMR光谱实验被明确地确认，所以附加实验旨在为 了进行光谱实验而产生合适量的化合物4。
[0086] 实施例3-柠檬苦素和异柠檬苦素（化合物4)的鉴宙从柠檬苦素-17-g-D-吡喃 葡糖苷释放
[0087] 为了确定在实施例2中鉴定且在图4中图解的化合物4的化学结构，将调节到 pH1. 5的柠檬苦素-17-P-D-吡喃葡糖苷水溶液在60°C下保温4h，借助半制备HPLC分离 和提纯了化合物4,其化学结构借助LC-MS/MS和1D/2D-NMR实验来确定。在图5中所示 的1HNMR谱图中，观察到21个信号，其中显示出化学位移Sl.44、1.72、2. 00、2. 25、2. 66、 2. 66、2. 73、2. 75、2. 91和4. 14ppm的十个信号与柠檬苦素的烷基质子H-C(12a)、H-C(Il)、 H-C(12b)、H-C(6a)、H-C(2a)、H-C(5)、H-C(2b)、H-C(9)、H-C(6b)和H-C(1)的共振非常一 致。借助同核（COSY)和异核相关实验（HMQC，HMBC)明确地确认了这些信号的分配。在4. 51 和4.78ppm处共振的非对映异构的质子与亚甲基质子H-C(19)非常一致，于是表明完整 的A-环存在于梓檬苦素中。在6. 62、7. 60和7. 70ppm处观察到的关于咲喃质子H-C(21)、 H-C(22)和H-C(23)的共振信号同样证明了与柠檬苦素的结构类似性。然而，化合物4在 质子H-C(15)、H_C(17)和H-C(18)的化学位移方面显不出与梓檬苦素的明显差异。质子 H-C(17)显示出从5.48ppm(3)到5.05ppm(4)的高场位移，而质子H-C(15)和H-C(18)显示 出分别从4. 21和I.Ilppm(3)到4. 50和I. 48ppm(4)的低场位移。此外，2D-NMR实验鉴定 出对于柠檬苦素（3)在77. 9/20.Oppm处和对于化合物4在85. 1/27.Ippm处共振的C(17) / C(IS)的化学位移的差异，于是指出了在化合物4的结构中的位置C(17)处柠檬苦素的差向 异构化。把所有光谱数据都考虑进去，首次将化合物4明确地鉴定为柠檬苦素的C17-差向 异构体，该异构体显示出在C(17)处(6-取向的呋喃环而不是柠檬苦素的a-取向。虽然 被称为C17-表柠檬苦素或异柠檬苦素的化合物4已经被推测为柠檬苦素-17- 0 -D-吡喃葡 糖苷的人血浆代谢物，但是第一次基于光谱数据确认该柠檬苦素差向异构体的结构，并且 证明了它由吡喃葡糖苷水解释放。
[0088] 特别是，用痕量的盐酸（lmol/L)将柠檬苦素-17-0 -D-吡喃葡糖苷（35mg)在水 (20mL)中的溶液调节到pH1.5,并且在60°C下保温4h。冷却后，把溶液加到用水调节的 StrataC18-ESPE筒体（IOg,