55ym,GigaTubes,Phenomenex)的顶部，然后用水(1 .SOmT,) 冲洗，接着是水/甲醇混合物（50/50,v/v;100mL)，和甲醇（150mL)。在真空中给甲醇级分 脱除溶剂，溶于甲醇与1 %甲酸水溶液的混合物，借助在Microsorb-MV,RP-18, 250xIOmm i.d., 5ym柱（Varian,Germany)上的半制备HPLC对等分试样（IOOyL)进行分离。借助 UV-检测器在220nm处并且借助ELSD监测流出物，通过在3. 5mL/min的流量下操作的溶剂 梯度进行色谱法，开始时采用乙腈与0.I%甲酸水溶液的混合物（30/70,v/v)，在15min内 将乙臆含量提到尚40 %，然后在IOmin内提尚到80 %，最后在IOmin内提尚到100 %。两个 峰是可检测的；将每个峰的流出物分别收集在冰冷却的烧瓶中，在真空中脱除溶剂，然后冷 冻干燥。借助LC-MS和NMR实验，将分离的化合物鉴定为柠檬苦素以及它的以前没有报道 过的立体异构体C17-表梓檬苦素，也被称为异梓檬苦素。
[0089] 柠檬苦素，3 :UV/VIS(乙腈 / 水；pH2.5)Xnax= 220nm;LC/MS(ESI+)m/ z509 ( [M+K]+) ,493 ( [M+Na]+) ,488 ( [M+NH4]+) ;LC/MS(ESI) :m/z469 ( [M-H] )!1H NMR(400MHz，DMS0-d6,COSY) :SI. 〇〇 [s，3H，H-C(24) ]，I. 02 [s，3H，H-C(25b) ]，I. 11 [s，3H，H -C(18)],I. 19 [s, 3H,H-C(25a)],I. 23 [m, 1H,H-C(12)],I. 73 [m, 2H,H-C(Il)],I. 83 [m, 1H,H -C(12) ], 2. 27 [dd, 1H,J= 3. 0, 14. 7Hz,H-C(6) ], 2. 46 [dd, 1H,J= 3. 0, 15. 7Hz,H-C(5)], 2. 55 [m, 1H,H-C(9) ],2. 62 [m, 1H,H-C(2) ],2. 77 [d, 1H,J= 16. 4Hz,H-C(2) ],3. 10 [t, 1H,J =15. 5Hz,H-C(6)], 4. 11 [m, 1H,H-C(I)], 4. 12 [s, 1H,H-C(15)], 4. 48 [d, 1H,J= 12. 9Hz,H-C(19) ],4. 92 [d, 1H,J= 12. 9Hz,H-C(19) ],5. 48 [s, 1H,H-C(17) ],6. 51 [s, 1H,H-C (22)], 7. 66[s, 1H,H-C(21)], 7. 72[s, 1H,H-C(23)]；13CNMR(100MHz,MeOD-d6,HMQC,HMBC)： 8 17. 4 [C,C(24)], 18.I[C,C(11) ],20. 0 [C,C(18) ],20. 4 [C,C(12) ],22. 3 [C,C(25b) ],30.I [C,C(25a) ],35. 9 [C,C(2) ],36. 5 [C,C(6) ],37. 5 [C,C(13) ],45. 7 [C,C(10) ],46. 9 [C,C(9)] ,50. 5 [C,C(8) ],54. 3 [C,C(15) ],58. 2 [C,C(5) ],65. 3 [C,C(19) ],67. 4 [C,C(14) ],77. 9 [C,C(17) ],78. 9 [C,C(I)], 80. 4 [C,C(4) ],110. 9 [C,C(22) ],120. 6 [C,C(20) ],141. 9 [C,C(23)], 143. 9 [C,C(21) ]，168. 7 [C,C(16) ]，170. 9 [C,C(3) ]，208. 5 [C,C(7)]。
[0090]C17-表柠檬苦素，或异柠檬苦素4 :UV/VIS(乙腈/水；pH2. 5)入mx= 220nm;LC/ MS(ESI+)m/z509 ([M+K]+),493 ([M+Na]+),488 ([M+NHJ+) ；LC/MS(ESI) ：m/z469 ([M-H])； 1HNMR(400MHz,DMS0-d6,COSY) :S〇? 99 [s, 3H,H-C(24) ]，0? 99 [s, 3H,H-C(25b) ]，I. 19 [s, 3H ，H-C(25a)]，1.44 [m, 1H,H-C(12)]，1.72 [m，2H,H-C(11)] ,2.00 [m, 1H,H-C(12)] ,2.25 [dd,I H,J= 3. 7, 16. 2Hz,H-C(6) ],2. 66 [m, 1H,H-C(2) ],2. 66 [m, 1H,H-C(5) ],2. 73 [m, 1H,H-C(2) ],2. 75 [m, 1H,H-C(9) ],2. 91 [t, 1H,J= 15. 8Hz,H-C(6) ],4. 14 [d, 1H,J= 3. 68Hz,H-C(I)], 4. 50 [s, 1H,H-C(15) ],4. 51 [d, 1H,J= 13. 2Hz,H-C(19) ],4. 78 [d, 1H,J= 13. 2Hz,H-C(19)] ,5. 05 [s, 1H,H-C(17) ],6. 62 [s, 1H,H-C(22) ],7. 60 [s, 1H,H-C(21) ],7. 70 [s, 1H,H-C(23)]；13CNMR(100MHz,MeOD-d4HMQC,HMBC) :S18. 3 [C,C(II) ]，19. 3 [C,C(24) ]，22.I[C,C(12) ]，2 2.I[C,C(25b) ],27.I[C,C(18) ],30. 6 [C,C(25a) ],36. 6 [C,C(2) ],36. 9 [C,C(6) ],40. 3 [C,C (13) ],45. 0 [C,C(9) ],45.I[C,C(10) ],47. 6 [C,C(8) ],56. 3 [C,C(5) ],56. 6 [C,C(15) ],65. 4 [C,C(19)], 70. 4[C,C(14)], 79.I[C,C(I) ],79. 9 [C,C(4) ],85. 1[C,C(17)], 112. 9 [C,C(22) ],122. 4 [C,C(20) ],143. 8 [C,C(21) ],144. 2 [C,C(23) ],168. 8 [C,C(16) ],170. 5 [C,C(3) ],2 08. 3 [C,C(7)]。
[0091] 尽管本发明人不想受理论的束缚，但是图6图解了一条反应途径，该途径显示了 从柠檬苦素-17-P-D-吡喃葡糖苷形成柠檬苦素（3)和异柠檬苦素或C17-表柠檬苦素（4)。 因为葡萄糖是良好的离去基团，所以在酸性条件下己糖从1的亚糠基的Q位散落下来，于 是导致作为主要的瞬变中间体的离域亚糠基阳离子的释放。然后，由羧基官能的亲核攻击 诱导的分子内环化产生了带有a-取向的呋喃环的柠檬苦素（3)以及在C(17)处显示出 P-取向的咲喃环的异梓檬苦素/C17-表梓檬苦素。
[0092] 此外，还已经证明，在pH为3的水溶液中保温柠檬苦素并不产生大量的异柠檬苦 素，所以异柠檬苦素不是通过柠檬苦素的直接差向异构化来形成的。
[0093] 实施例4 一棬汁中的柠檬苦素和异柠檬苦素的宙量
[0094] 为了研究橙汁贮藏过程中柠檬苦素和异柠檬苦素/C17-表柠檬苦素的生成，将新 榨橙汁（pH3. 5)在4和20°C下贮藏达四周之久，然后，借助采用MRM方式的HPLC-MS/MS定 量地确定了梓檬苦素和异梓檬苦素/C17-表梓檬苦素。如图7A中所不，分别在4和20°C下 保持2周时，在贮藏过程中，橙汁中柠檬苦素的浓度从新榨果汁中的70. 0yg/100g稍稍增 加到80和85yg/100g。橙汁的贮藏还引起C17-表柠檬苦素浓度的升高，例如，分别在4和 20°C下保持四周的样品中，观察到C17-表柠檬苦素的量（图7B)增加到1.5倍或2倍。对 比贮藏引起的柠檬苦素量的增加与异柠檬苦素量的增加清楚地证明了，贮藏橙汁时，与柠 檬苦素的C17-差向异构体的形成相比，对柠檬苦素的形成更有利，于是支持了文献中的发 现，S卩，在贮藏过程中，在酸催化下，果汁中存在的柠檬苦素酸A-环内酯被缓慢地转化成柠 檬苦素。
[0095] 在第二组实验中，研究了热处理对梓檬苦素和异梓檬苦素/C17-表梓檬苦素的生 成的影响。为此，将新榨橙汁在70°C下热处理lOmin，而且，为了对这些化合物的最大释放 速率有些了解，在95°C下处理240min之久。HPLC-MS/MS(MRM)分析显示，在新制备的、未加 热过的果汁中，柠檬苦素和异柠檬苦素的浓度分别为70. 0和I. 3yg/100g图8A)。热处理 后，两种萜类化合物的浓度都显著升高，例如，在70°C下加热IOmin导致异柠檬苦素的量提 高到五倍而达到6.Iyg/100g的浓度，而柠檬苦素的浓度达到100yg/100g的浓度。
[0096] 在95°C下加热所述橙汁对柠檬苦素和异柠檬苦素的量的影响更大。在95°C下加 热所述果汁IOmin已经将C17-表柠檬苦素的量提高到十倍（图8A)。分别加热30和60min 后，生成了 20和30iig/100g的C17-表梓檬苦素。在加热60min后，梓檬苦素的浓度从70 升高到115yg/100g，并且在4h之后达到最大值140yg/100g。计算加热后的橙汁样品中 两种柠檬苦素类化合物之间的比值显示出，C17-表柠檬苦素/柠檬苦素比随着加热时间的 延长而显著地变化并且在240min之后达到最大值0. 50 (图8B)。<