专利名称：靶向性、高表达人粒细胞巨噬细胞集 落刺激因子的重组腺病毒及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗领域。更具体地，本发明涉及一种新的靶向性的、高表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒，该重组腺病毒的制备方法和用途，以及含有该重组腺病毒的药物组合物。
集落刺激因子(Colony stimulating factor，CSF)是一类造血生长因子，能刺激骨髓多能造血干细胞向各系祖细胞集落分化，并使其发育成为成熟的粒细胞、巨噬细胞等终末细胞。CSF包括多能集落刺激因子(multipotent CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，简称为“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等。GM-CSF体外、体内均能促进粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的增殖分化(Metcalf D.Science，1985；22916-22)。在体内给予GM-CSF后，观察到持续性的白细胞升高。此外，除了作用于未分化成熟的造血细胞，GM-CSF对已分化成熟的免疫细胞也有重要的调节作用，如抑制中性粒细胞运动、增强中性粒细胞趋化、吞噬和增强单核-巨噬细胞抗肿瘤和抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)等(Gasson JC et al.Blood，1991；771131)。近年来尤其受到广泛重视的是，发现GM-CSF能增强巨噬细胞和树突状细胞的抗原提呈功能等，显示其在抗肿瘤和抗感染免疫治疗中也具有广阔的临床应用前景。动物实验表明，GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞在体内能诱导长期、有效的特异性抗肿瘤免疫排斥反应，有显著的治疗作用(Dranoff G.etal，Proc Natl Acad Sci USA，1993，903539)。目前GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞作为一种新型有效的肿瘤瘤苗，已用于临床试验，治疗黑色素瘤、肾癌和前列腺癌等晚期肿瘤患者(Roth J and Cristiano R.J Natl Cancer Inst.1997；8921-39)。
自从成功克隆到人GM-CSF的cDNA序列(Wong G et al.Science，1985；228810.Burgess A et al.J Biol Chem，1987；2521991)以来，GM-CSF作为第一个利用重组DNA技术生产的造血因子(Vlich TR et al.Blood，1990；75846)，显示了其巨大的临床应用价值。体内应用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子刺激白细胞的增多，主要是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的增多，而淋巴细胞仅偶尔有轻度增多。临床上，重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子被广泛用于癌症放疗化疗(Silver GM et al.Surgery，1989；106452-455，Salgaller ML et al.J Surg Oncol 1998；68122-138)、骨髓异常增生综合症(Vadhan-Raj S et al.Blood，1989；741491-1498)、AIDS(Baldwin GC et al.Blood，1989；741673-1667)、骨髓移植(NemunaitisJ et al.Blood，1988；72834-836)等疾病的治疗或辅助治疗。此外，GM-CSF对慢性和遗传性中性粒细胞缺乏症、寄生虫感染、再生障碍性贫血等亦具有较为显著的疗效。
基因重组技术生产的人GM-CSF现已正式应用于临床，治疗各种原因导致的急性和慢性骨髓造血功能低下的患者，并收到显著疗效。其主要的临床适应症包括化疗和放疗引起的粒细胞减少、骨髓增生异常综合症(MDS)、再生障碍性贫血、AIDS以及促进骨髓移植患者的造血恢复等等(Biotherapy 1998，10299；Int J Hematol.1996，6517；Med Oncol.1996，13155；Cancer 1996，771149)。
Tarr等人在1996年进行了人体试验，在该实验中将重组HBV疫苗(注射一次)与rhGM-CSF(注射一次)合用，两者被注射至同一部位以希望GM-CSF能激活局部的抗原提呈细胞(如郎罕氏细胞)，从而利于抗原的摄取加工与提呈。结果发现，在对照组的27例志愿者只有一例出现低滴度保护性的抗HBV抗体反应，而皮下注射GM-CSF的实验组人中，27例中有5例产生保护性的高滴度抗体反应。接受肌肉注射GM-CSF的实验组中，27例患者6例产生保护性的高滴度抗体反应(Tarr PE，et al.Vaccine 1996，141199-204)。这一实验说明，GM-CSF作为一种有效的免疫佐剂，可有效增强瘤苗的免疫效果。
然而，在将GM-CSF直接用于临床时，仍存在一些问题。例如GM-CSF的体内半衰期较短，因而治疗时需要每天注射一次或多次，再加上GM-CSF制剂本身成本较高，所以导致治疗费用十分昂贵而且治疗效率也不高。此外，在局部施用GM-CSF(如治疗肿瘤时)，需要在同一部位附近反复进行注射，使病人非常痛苦。因此，本领域迫切需要一种成本低，使用方便的施用GM-CSF的方法以及相关的制剂。传统的GM-CSF基因疗法具有成本低廉、使用方便等优点，但往往基因转染不高、且靶向性差。
本发明的目的就是提供一种新颖的在临床上施用GM-CSF的方法和相关制剂，从而克服现有技术中的上述缺点，使得临床施用GM-CSF不仅成本低廉、使用方便，而且效率更高、体内外能靶向性感染特定细胞群体。
在本发明的第一方面，提供了一种靶向性的表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列；而且，在腺病毒表面结合有双特异性抗体，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对细胞表面的受体分子。
较佳地，所述腺病毒为Ad5型腺病毒；且所述的受体分子选自下组CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
在另一优选例中，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒中所含的启动子序列包括选自下组的真核表达启动子巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子。在另一优选例中，在表达盒中有双拷贝的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它包括有效量的上述的靶向性的且表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒和药学上可接受的载体或赋形剂。
在本发明的第三方面，提供了一种制备靶向性的、表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒的方法，该方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，其中该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列；(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；(d)筛选阳性克隆；
(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。
(f)将步骤(e)中的腺病毒与双特异性抗体结合，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对细胞表面的受体分子，从而获得靶向性的、表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒。
较佳地，在步骤(c)中共转染方法是磷酸钙DNA共沉淀转染法，该宿主细胞是293细胞，而且人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒中所含的启动子序列选自下组巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子；所述的受体分子选自下组CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子；表达盒中有双拷贝的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
在本发明的又一方面，提供一种制备表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒的方法，该方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，其中该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列；(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；(d)筛选阳性克隆；(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。
在附图中，
图1.人GM-CSF cDNA序列图2.人GM-CSF双顺反子融合基因及其编码蛋白序列图3.pShuttle-CMV穿梭载体物理图谱图4.pAdEasy-1腺病毒载体的物理图谱图5.细菌内同源重组产生重组腺病毒示意图在本发明中，术语“粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列(GM-CSF)”指天然存在的或人工合成的GM-CSF编码序列，该编码序列可以编码天然形式的GM-CSF，也可以编码各种变异形式的GM-CSF(例如GM-CSF的保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体，或其活性片段)，只要该变异形式的GM-CSF具有GM-CSF的生物活性。
在本发明中，术语“粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒”指含有GM-CSF编码序列以及表达所需元件的序列组件，表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒还可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于增强子、分泌信号肽序列等。较佳地， 在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒含有双拷贝或多拷贝的GM-CSF编码序列。一种实现双拷贝表达的方法是利用IRES序列将GM-CSF的cDNA进行串联融合，从而实现双拷贝表达。
在本发明中，术语“细胞表面受体分子”指在哺乳动物细胞(尤其是树突状细胞、B细胞、单核细胞或其他与免疫有关的细胞)的细胞表面上，可用作抗体结合位点的分子。代表性的例子包括各种CD分子，例如CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子等。CD40是一种主要表达于树突状细胞、B细胞、单核细胞等细胞表面的膜分子，在其对应的配体分子CD40L左右下，介导细胞活化信号。
在本发明中，可以适用于人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，例如巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子等其它适用于真核表达的启动子。
在本发明中，可供使用重组腺病毒可以是任何一种血清型的腺病毒，较佳地，为了防止在制备过程产生亲本的复制型腺病毒，宜采用E1区缺失型腺病毒。更佳地，使用E1区和E3区都缺失的腺病毒。此外，宜采用已研究得较为透彻的腺病毒类型，例如Ad2和Ad5型腺病毒。
下面详细描述本发明的可用于临床的复制缺陷型人GM-CSF重组腺病毒和相关药物组合物(制剂)的制备过程和方法。
1、腺病毒的病毒生物学和分子生物学特性腺病毒是一种无包膜的DNA病毒，病毒颗粒呈正二十面体，直径为80-90nm。腺病毒主要有三种结构蛋白六邻体，构成20面体的表面；五邻体，位于蛋白质外壳中的12个顶角；纤维蛋白，每个五邻体上的一条纤维突起。
腺病毒基因组为双螺旋线性双链DNA，约有36000个碱基对(bp)，在两端结合有55kDa末端肽(Terminal peptide，TP)。传统上将病毒基因组划分100个基因图距单位(mu)，1mu相当360bp。基因组两端各有一个约100bp的末端倒置反向重复DNA序列(ITR)。在基因组左端载有病毒包装信号。基因组分为早期转录区(分为E1-E4)和晚期转录区(分为L1-L5)，每个转录区在病毒生活周期中都起重要作用。此外，还有几个小的中间区和晚期区。
人腺病毒有近50种血清型，其中Ad2和Ad5基因组结构和基因表达的研究较为广泛和深入，现已确定这两型腺病毒的全部核苷酸序列，目前构建的腺病毒载体大多源于这两种血清型。
腺病毒基因组中的E1区，在病毒基因组一进入宿主细胞核中即被激活，从而编码起始因子，调节病毒的早期活动，因此E1区为病毒复制所必需。
E2区编码的蛋白与病毒DNA的复制有关，包括病毒DNA末端结合蛋白(TP)，DNA结合蛋白(DBP)和DNA聚合酶，DBP与转录调控有关。
E3区编码的多肽与病毒逃避宿主抗病毒免疫反应有关，比如，E3编码的一个19kDa糖蛋白，可抑制I类主要组织相容性抗原(MHC)提呈到感染细胞表面，使细胞毒性T淋巴细胞(CTL)不能有效识别和杀伤感染细胞；此外，E3编码的10.4kDa、24.5kDa、14.7kDa蛋白可抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)的细胞毒作用。E3区缺失对腺病毒的感染性无明显影响。
E4区编码产物参与病毒DNA复制、晚区基因表达、病毒蛋白合成和宿主蛋白合成终止等活动。主要晚期基因产物是病毒结构蛋白，而由pIX编码的小结构蛋白，有助于大于34kb的基因组包装。
腺病毒通过经介导吸附和介导内吞的两种不同受体而进入宿主细胞。病毒先通过纤维蛋白与未知的某种受体结合从而吸附到细胞表面。介导病毒内吞入内体(endosomes)的受体已被鉴定为αv整合素(αv integrins)。在内吞过程中，内体的酸化引起病毒外壳蛋白构象改变，从而导致病毒冲破内体进入胞浆，进一步在外壳蛋白的核靶向信号引导下进入细胞核。E1区编码的蛋白质首先上调自身表达和激活其他早期区基因表达，8小时后，病毒DNA开始复制，随后晚期蛋白表达并在感染细胞核中进行子代病毒颗粒的装配。腺病毒可抑制宿主细胞DNA的转录和翻译，而促进自身的蛋白合成。被感染约30-40小时后，宿主细胞溶解，释放出子代病毒颗粒。临床上，腺病毒一般可引起上呼吸道感染、角结膜炎、胃肠炎、肺炎、支气管炎、肝炎和膀胱炎，多数为轻度的自限性疾病。近20年来，腺病毒口服活疫苗已被广泛使用，从使用过的一千多万人的结果来看，疗效显著且无明显的毒副作用。
2、腺病毒载体的特点基因转移技术和导入途径是影响基因治疗效果的重要因素。虽然逆转录病毒载体仍是目前基因转移和基因治疗中应用最广的载体系统，具有稳定整合表达等优点，但它只能感染分裂期的细胞，感染效率较低，一般不能用于体内(in vivo)途径，临床应用中难免受到限制。
腺病毒载体是继逆转录病毒载体后在基因治疗方面应用开发得较早的一种基因载体，由于其本身的特点及载体系统不断改进，近年来在基因治疗中得到日益广泛的应用。腺病毒载体首先应用于纤维囊性变(Cystic Fibrosis，CF)和a1抗胰蛋白酶缺陷型肺气肿的基因治疗，现广泛应用于其他疾病的治疗，如嗜血杆菌A和B、Duehene肌营养不良、家族性胆固醇血病、血管成形术后动脉再狭窄、表面活性蛋白B缺乏、红细胞生成素缺陷和各种肿瘤，显示其具有良好的应用前景和开发价值。1995年，美国食品与药品管理局(FDA)批准腺病毒介导的p53基因疗法进入临床，试用于晚期肿瘤病人的治疗，收到显著疗效，且无明显的毒副作用。
腺病毒载体具有以下几个特点①其宿主范围广，感染率高，包括静息细胞和终末细胞；②病毒的滴度高，可达109～1010空斑形成单位(pfu)/ml，由于其理化性质较稳定，可以通过沉积、柱层析或超离心纯化获得高滴度病毒载体；③腺病毒无胞膜，对补体介导的灭活作用不敏感，体内更稳定；④目前应用的腺病毒载体多为Ad2和Ad5，对啮齿动物无致瘤性，临床上通常仅引起轻度的上呼吸道反应，甚至对于免疫抑制病人亦如此；⑤腺病毒通常不整合入宿主细胞基因组内，适用于基因的短期表达，理论上讲就不会引起宿主细胞的插入突变，比逆转录病毒更为安全。
3、腺病毒载体的构建策略目前的腺病毒载体大多来源于腺病毒Ad2和Ad5这两种血清型。适用于基因治疗应用的腺病毒载体属于复制缺陷型病毒。由于E1编码的蛋白功能是其他所有腺病毒基因有效表达所必须的，因此最常见的策略就是用外源DNA替代病毒E1区序列，通过包装细胞反式提供E1区序列而产生的复制缺陷腺病毒载体。
可用于本发明的宿主包装细胞是可以表达腺病毒E1区基因的任何宿主细胞，因为该细胞能够提供复制缺陷型腺病毒复制所需的E1区基因表达产物。一种优选的常用包装细胞是293细胞，该细胞由人胚肾细胞经Ad5腺病毒DNA片段转化而成，载有整合入细胞基因组的腺病毒E1区等病毒基因片段，并持续表达E1区蛋白，能为E1区置换型腺病毒载体提供反式补偿。
利用E3区缺失不影响病毒感染性，切去E3区可增加载体外源性DNA容量。切去E1和E3区，外源基因插入容量可达约8kb。而克隆更大的外源DNA片段则需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通过互补细胞系或辅助病毒反式提供。
本发明的重组腺病毒的方法可以用多种方法产生，其中主要有以下四种共转染入互补细胞系通过体内同源重组而产生重组腺病毒的方法更为常用，更佳地是用COS/TPC共转染同源重组法产生的。
(1).细胞外病毒DNA直接连接法(也称Stow方法)此法是选d1309腺病毒基因组在3.7mu(E1区内)的XbaI限制内切酶点，切断和分离3.7-100mu病毒基因组大片段(称XbaI片段)，然后将载有外源DNA的腺病毒基因组的最左端0-1.3mu，用连接酶连到XbaI大片段上。连接产物可用于转染293细胞以制备重组腺病毒。
(2).细胞内病毒DNA同源性重组与Stow方法很类似，将载有外源DNA的腺病毒基因左端0-1.3/9.8-16mu片段与XbaI大片段同时转染到293细胞内，通过同源性重组来制备病毒载体。
(3).细胞内质粒DNA同源重组此法利用质粒的形式，将腺病毒基因组DNA的倒置末端相连形成环状，能在细菌内复制，从而简化了XbaI大片段的制备手续。环状腺病毒DNA由于细菌质粒插入其总基因组长度超过包装限度，在细胞内不会被包装成病毒颗粒，仅提供病毒DNA同源重组的所需片段。构建E1替代型腺病毒载体时，首先将外源DNA插入细菌质粒(如pΔElsp1A)中，该质粒含腺病毒基因组左端序列(包括ITR、包装信号和部分缺失的E1区)。含外源DNA的穿梭质粒与含腺病毒基因组其余序列的DNA共转染293细胞，通过体内的同源重组产生重组腺病毒。这种含其余序列、用于同源重组的腺病毒基因组DNA可有不同的形式，或是通过体外经限制性内切酶消化无感染性的病毒DNA，或者来源于重组质粒pJM17或pBHG系列质粒。该方法目前较为常用，但缺点是重组效率还不构理想。
(4).COS/TPC共转染同源重组腺病毒DNA的两端各共价结合有一个55kDa的末端肽(Terminal peptide，TP)，结合有末端肽的腺病毒DNA导入允许细胞后产生的空斑数是裸腺病毒DNA的100倍以上(Horwitz M.FundamentalVirolgy，2nd edition，edited by Fields B et al.Raven Press，Ltd.NewYork，1991；771)，表明TP的存在对腺病毒DNA的感染能力有着重要的影响。Miyake等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996，931320)首先采用含有TP的腺病毒DNA-TP复合物(TPC)进行同源重组，建立了COS/TPC同源重组法制备重组腺病毒，并且证明该法的重组效率可提高近百倍，而且几乎不产生亲代病毒。
(5).细菌内同源重组将穿梭载体与腺病毒DNA共转化至具有重组能力的细菌，如BJ5183，通过细菌内的同源重组，产生重组腺病毒DNA载体，然后通过293细胞的包装，获得重组腺病毒。该方法的优点是省时、高效。
在本发明的一个优选实施例中，应用细菌内同源重组法来制备复制缺陷型人GM-CSF重组腺病毒载体，具体过程如下首先将人GM-CSF双顺反子插入穿梭载体pShuttle-CMV，置于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制之下，通过与腺病毒DNA载体pAdEasy-1在细菌BJ5183中的同源重组获得GM-CSF的重组腺病毒载体，最后通过293细胞的包装获得人GM-CSF的复制缺陷性重组腺病毒，滴度达8.67×1010pfu/ml；并证明了所制备的人GM-CSF重组腺病毒体外能有效表达人GM-CSF(100～900ng/106细胞/24h)。在此基础上，与抗腺病毒和CD40的双特异性抗体偶联，制备CD40靶向性的人GM-CSF重组腺病毒。
在制得本发明的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子重组腺病毒之后，就可以将所需纯度的重组腺病毒与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.，Ed.，)，以冻干形式或水溶液形式进行混合，可以制得本发明的重组腺病毒的治疗制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者而言在所用的剂量和浓度下应是无毒的，并且可含有缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸缓冲液；抗氧化剂如维生素C；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。作为例子，水和生理盐水就可作为本发明重组腺病毒制剂中的载体。
本发明制备的靶向性的复制缺陷型人GM-CSF重组腺病毒具有巨大的应用价值和优势，主要体现在以下几方面(1).体外感染肿瘤细胞(如B淋巴瘤等)，制备GM-CSF基因转染的肿瘤瘤苗，进行肿瘤的主动免疫治疗，肿瘤细胞可来源于肿瘤患者的新鲜瘤体标本或肿瘤细胞株。
(2).体外靶向性感染经肿瘤抗原刺激的抗原提呈细胞(如树突状细胞或巨噬细胞)，进行肿瘤的主动免疫治疗，其中树突状细胞可从患者的外周血单核细胞或CD34+造血干细胞扩增。
(3).体外感染自体皮肤成纤维细胞等载体细胞，借助于载体细胞将GM-CSF导入机体，促进造血恢复。
(4).作为佐剂与抗原一起注射，增强免疫效果。
(5).通过瘤体内或感染部位直接注射GM-CSF重组腺病毒等体内途径直接导入体内，用于肿瘤、感染等疾病的治疗。
(6)治疗成本低，比直接注射GM-CSF进行治疗低至少50％，较佳地可低至少80％。
(7)注射次数稍少，通常只需数周(如1-2周)注射一次，从而减少了进行注射治疗的痛苦，并便于使用。
(8)通过感染细胞而在细胞内较长时期地局部表达GM-CSF，与生理条件下生物体局部分泌GM-CSF的情况更为接近，从而可高效和长期地发挥GM-CSF的功效(尤其在需要局部施用GM-CSF的场合，如肿瘤治疗时)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，比如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.人GM-CSF cDNA的克隆通过RT-PCR从活化的人T淋巴细胞中扩增人GM-CSF cDNA。首先用人T细胞分离柱(Biotex公司)从健康人外周血中分取T细胞，体外经有丝分裂原ConA(10μg/ml，Sigma公司)刺激培养24小时后，用Trizol试剂(Gibco公司)提取细胞总RNA；用AMV逆转录酶(Promega公司)合成cDNA第一链，以其为模板进行PCR扩增。
PCR扩增采用的上游引物和下游引物序列为5’cggaattctagaccaccATGTGGCTGCAGAGCCTG 3’(SEQ ID NO4)5’cgggatccTCACTCCTGGACTGGCTCCC 3’(SEQ ID NO5)在上游引物中设计了EcoRI和XbaI位点，下游引物中设计了BamHI位点。所扩增产物包括人GM-CSF的全部编码序列，预计大小为456bp。PCR反应体积为50μl，其中引物浓度为0.3μM，扩增参数为94℃1’、58℃1’、72℃2’，20个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经EcoRI和BamHI酶切后，定向克隆至pGEM-3Z载体(Promega公司)，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，得到的重组载体记为pGEM-hGM，用M13-21和SP6引物进行全自动测序(ABI373，PE公司)。经测序分析，所扩增到的人GM-CSFcDNA序列完全正确，包含全部编码序列(图1，SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
实施例2.IRES cDNA的克隆以质粒pIRES-hrGFP(Stratagene公司)为模板进行PCR扩增。上游引物为5’gg GGA TCC cgg GAC GAC TGC ATA GGG TTAC(SEQ ID NO6)，其中设计了BamHI位点；下游引物为5’gGAA TTC CTG CAG CCA TTA TCA TCG TGTTTTTC(SEQ ID NO7)，其中设计了EcoRI位点；所扩增产物预计大小为620bp。PCR反应体积为50μl，其中引物浓度为0.3μM，扩增参数为94℃1’、52℃1’、72℃2’，25个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经EcoRI和BamHI酶切后，定向克隆至pBluescript II-KS载体(Stratagene公司)，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，得到的重组载体记为pKS-IRES，用T7和T3引物进行全自动测序(ABI373，PE公司)。经测序分析，所扩增到IRES序列完全正确(对应于图2中间小写字母部分)(SEQ ID NO3)。
实施例3.双拷贝人GM-CSF融合基因的构建首先从pGEM-hGM载体中切出GM-CSF的XbaI/BamHI片段，插入pKS-IRES，使GM-CSF cDNA位于IRES的上游，得到重组载体pKS-GM-IRES；再从pGEM-hGM载体中切出GM-CSF的EcoRI/SalI片段，插入pKS-GM-IRES，使该GM-CSFcDNA位于IRES的下游，这样得到GM-CSF双拷贝融合基因，重组载体命名为pKS-GM-DC，融合基因序列及其编码氨基酸见图2。
实施例4.双拷贝人GM-CSF腺病毒载体的构建所采用的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV购自Stratagene公司，含有Ad5腺病毒的左右同源臂，其中含有多个供外源基因插入的克隆位点(图3)。从pSK-GM-DC载体中切出双拷贝GM-CSF融合基因的NotI/XhoI片段，克隆至pShuttle-CMV的NotI/XhoI位点，连接产物转化DH5α菌，得到重组腺病毒穿梭载体pShuttle-GM-DC。
重组腺病毒穿梭载体pShuttle-GM-DC经PacI线性化和去磷酸化处理后，取1μg与100ng的pAdEasy-1载体(Stratagene公司，图4)混合，电穿孔法共转化BJ5183感受态细菌(Stratagene公司)，经BJ5183细菌的同源重组(图5)，得到GM-CSF的重组腺病毒，阳性克隆经PacI酶切鉴定后，记为pAd.GM-DC。
阳性克隆pAd.GM-DC进一步转化XL-10感受态细菌(Stratagene公司)，进行DNA的大量扩增。用高浓度肉汤TB培养基500～1000ml大量扩增阳性克隆菌，碱裂法抽提粘粒DNA，溶于4ml TE中，加入44.4g CsCl(Gibco公司)、0.4ml溴化乙锭(10mg/ml)混合，置5ml离心管(Beckman)梯度离心(VTi65.1转头，55,000rpm，20℃，16h)，收集超螺旋条带，用等体积Butanol(Sigma)抽提4～6遍，4℃下用TE透析过夜，或直接加入3倍体积无菌去离子水、8倍体积无水乙醇，于4℃沉淀DNA(3～5小时)，干燥后DNA溶于无菌TE，用分光光度计检测其浓度和纯度。
实施例5.重组腺病毒的包装重组腺病毒DNA载体pAd.GM-DC经磷酸钙DNA共沉淀法转染293细胞(ATCC公司)，经胞内包装产生人GM-CSF重组腺病毒(图5)。转染前一天，待转染的293细胞更换新鲜培养基。于500μl体积中将5μg经PacI线性化处理的重组腺病毒载体pAd.GM-DC、CaCl2(终浓度为0.25M)混合后，加入500μl的2×BBS缓冲液(50mM BES(N，N-bis(2-hydroxyethl)-2-aminoethane-sulfonicacid)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(pH6.95))，混合后置室温作用10～20分钟，逐滴加入293细胞，置37℃、5％CO2培养12～24小时。将共转染的293细胞与未经转染的293细胞按1∶1、1∶10和1∶100等不同比例混合，分别接种至96孔培养板(100μl/孔)，此后的第4天和第8天各补加DMEM培养基(50μl/孔)。于转染后的第12~14天，收集阳性克隆孔的细胞及其培养液，超声破碎后的病毒上清为第一代种子病毒(1st seed)，于-80℃保存。第一代种子病毒用病毒上清(10μl/孔)感染24孔培养板中的293细胞，每个克隆设2个复孔；3～4天收集一个复孔的细胞行细胞基因组DNA的酶切分析，另一复孔中的细胞经超声破碎后收集病毒上清，为第二代种子病毒(2nd seed)，留作扩增用。结果，在转染的12～14天，在1∶10的96孔培养板中收集到病变死亡的293细胞克隆95个，经酶切鉴定得到双拷贝GM-CSF的重组腺病毒克隆。
实施例6.重组腺病毒的扩增、纯化与滴度检测酶切鉴定正确的重组克隆的第二代种子病毒上清(2nd seed)，用于感染293细胞扩增病毒，3～4天后，超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，病毒上清经CsCl梯度离心(25,000rpm，4℃，2h)，浓缩的病毒液进行第二次CsCl梯度离心(35,000rpm，4℃，3h)纯化，最后将收集病毒液对含10％甘油的PBS缓冲液透析过夜，过滤除菌后分装，速冻保存于-80℃。
以293细胞为靶细胞、用微量细胞病变法检测病毒滴度。96孔板中先加入50ml培养液/孔，前8孔加入25ml经104稀释的病毒液，开始行3倍的倍比稀释，共11个稀释度，每一稀释度设8复孔，每孔加50μl 293细胞，FCS的终度为5％，同时设细胞对照，此后第4天和第8天分别补加50μl含10％FCS的DMEM培养基，12～14天后判定结果。对其中的一个阳性克隆进行扩增，所扩增的人GM-CSF重组腺病毒滴度为7.67×1010pfu/ml。用注射用水稀释、分装成5×1010pfu/ml，保存于-80℃。
该腺病毒被命名为“双拷贝表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC”，2001年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏编号为CCTCC No.V200103。
实施例7.抗腺病毒和人CD40分子双特异性抗体的制备小鼠抗Ad5腺病毒纤维蛋白(fiber)单抗1D6.14和抗人CD40单抗G28.5分别从其杂交瘤细胞株(ATCC公司)的培养上清中，经Protein A(Pharmacia公司)亲和层析纯化制备后，用木瓜蛋白酶(Pierce公司)消化、Protein A(Pharmacia公司)亲和层析纯化抗体的Fab片段。这两种单抗的Fab片段用N-succinimidyl 3-(2-pyridldithio)propionate(SPDP)偶联，制备得到抗Ad5腺病毒和人CD40的双特异性抗体。具体方法参照文献(Production ofbispecific antibodies.in Current Protocols in Immunology，New York，1997；p2.13.1)。
实施例8.CD40靶向性腺病毒的制备GM-CSF重组腺病毒中加入10ng/106pfu双特异性抗体，于4℃孵育1小时，双特异性抗体通过其抗腺病毒的结合位点与GM-CSF重组腺病毒结合，而其中的抗CD40的结合位点仍然预留着，能与细胞膜表面的人CD40分子特异性结合，这样就制备成功CD40靶向性的人GM-CSF重组腺病毒，记为Ad.GM-CSF/CD40。
实施例9.人GM-CSF重组腺病毒的体外表达用重组人GM-CSF和IL-4(Sigma公司)培养人外周血单核细胞，制备树突状细胞。收集培养第7天的人树突状细胞，弃培养液、洗两遍后，按不同的重复感染度(Multiplicity of Infection，MOI)加入双拷贝的人GM-CSF的重组腺病毒或CD40靶向性的双拷贝人GM-CSF重组腺病毒，1小时后洗弃病毒液，加入正常培养液，48小时后收集培养上清，用ELISA试剂盒(美国R&D公司)检测GM-CSF含量，以ng/106细胞/24小时表示。
表1.GM-CSF重组腺病毒感染人树突状细胞后分泌GM-CSF水平分组 GM-CSF水平(ng/106细胞/24h)MOI＝5 MOI＝20 MOI＝100LacZ对照腺病毒未检出 未检出 未检出Ad.GM-DC 49±4.5 163±18 359±13Ad.GM-CSF/CD40106±11 472±16 889±45检测结果表明，未感染腺病毒树突状细胞的培养上清中未检测出GM-CSF(＜5pg/ml)，CD40靶向性的双拷贝人GM-CSF重组腺病毒(Ad.GM-CSF/CD40)感染树突状细胞后，能比双拷贝的人GM-CSF的重组腺病毒(Ad.GM-DC)产生更高水平的人GM-CSF(100-800ng/106细胞/24h)，而且GM-CSF的表达水平与感染时的MOI值呈正相关，表明所制备的CD40靶向性人GM-CSF重组腺病毒能更有效介导人树突状细胞的基因转移与表达，在树突状细胞介导的免疫治疗中具有应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海华康生物技术有限公司<120>靶向性、高表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒及其制法和用途<130>011975<160>7<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>456<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(16)..(450)<400>1gaattctaga ccacc atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc act gtg51Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val1 5 10gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc acg cag 99Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln15 20 25ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac147Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn30 35 40ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc195Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile45 50 55 60tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg243Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu65 70 75gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc291Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly
80 85 90ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc339Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr95 100 105ccg gaa act tcc tgt gca acc cag act atc acc ttt gaa agt ttc aaa387Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys110 115 120gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag435Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu125 130 135 140cca gtc cag gag tga ggatcc 456Pro Val Gln Glu<210>2<211>144<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile1 5 10 15Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His20 25 30Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp35 40 45Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe50 55 60Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys65 70 75 80Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met85 90 95Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys115 120 125Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu130 135 140<210>3<211>1538<212>DNA<213>双拷贝GM-CSF编码序列<400>3gcggccgctc tagaccacca tgtggctgca gagcctgctg ctcttgggca ctgtggcctg 60cagcatctct gcacccgccc gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa120tgccatccag gaggcccggc gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatgaa180tgaaacagta gaagtcatct cagaaatgtt tgacctccag gagccgacct gcctacagac240ccgcctggag ctgtacaagc agggcctgcg gggcagcctc accaagctca agggcccctt300gaccatgatg gccagccact acaagcagca ctgccctcca accccggaaa cttcctgtgc360aacccagact atcacctttg aaagtttcaa agagaacctg aaggactttc tgcttgtcat420cccctttgac tgctgggagc cagtccagga gtgaggatcc cgggacgact gcataggtta480cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg540tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc600cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa660ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga720caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc780ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc840cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac900aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 960tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 1020gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatggct gcaggaattc tagaccacca 1080tgtggctgca gagcctgctg ctcttgggca ctgtggcctg cagcatctct gcacccgccc 1140gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa tgccatccag gaggcccggc 1200gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatgaa tgaaacagta gaagtcatct 1260cagaaatgtt tgacctccag gagccgacct gcctacagac ccgcctggag ctgtacaagc 1320agggcctgcg gggcagcctc accaagctca agggcccctt gaccatgatg gccagccact 1380acaagcagca ctgccctcca accccggaaa cttcctgtgc aacccagact atcacctttg 1440aaagtttcaa agagaacctg aaggactttc tgcttgtcat cccctttgac tgctgggagc 1500cagtccagga gtgaggatcc tctagagtcg acctcgag 1538<210>4<211>35<212>DNA<213>合成的引物<400>4cggaattcta gaccaccatg tggctgcaga gcctg 35<210>5<211>28<212>DNA<213>合成的引物<400>5cgggatcctc actcctggac tggctccc 28<210>6<211>30<212>DNA<213>合成的引物<400>6ggggatcccg ggacgactgc atagggttac 30<210>7<211>33<212>DNA<213>合成的引物<400>7ggaattcctg cagccattat catcgtgttt ttc 3权利要求
1.一种靶向性的、表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列，而且，在腺病毒表面结合有双特异性抗体，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对细胞表面的受体分子。
2.如权利要求1所述重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒为Ad5型腺病毒；且所述的受体分子选自下组CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
3.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒中所含的启动子序列包括选自下组的真核表达启动子巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子。
4.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，在表达盒中有双拷贝的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
5.如权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒是重组5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC No.V200103。
6.一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的权利要求1所述的靶向性的、表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒和药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该重组腺病毒为Ad5型腺病毒，且所述的受体分子选自下组CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，该腺病毒是表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC No.V200103。
9.一种制备靶向性的、表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒的方法，其特征在于，该方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，其中该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列；(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；(d)筛选阳性克隆；(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。(f)将步骤(e)中的腺病毒与双特异性抗体结合，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对细胞表面的受体分子，从而获得靶向性的、表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中共转染方法是磷酸钙DNA共沉淀转染法，该宿主细胞是293细胞，而且人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒中所含的启动子序列选自下组巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子；所述的受体分子选自下组CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子；表达盒中有双拷贝的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。
全文摘要
本发明提供了一种新的靶向性的、高效表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组腺病毒,该重组腺病毒的制备方法和用途,以及含有该重组腺病毒的药物组合物。将这种新的重组腺病毒用于临床,具有成本低、使用方便、效率高等优点,尤其适用于肿瘤、感染性疾病的免疫治疗等其它GM－CSF适应症。
文档编号A61P31/00GK1381582SQ0110597
公开日2002年11月27日 申请日期2001年4月13日 优先权日2001年4月13日
发明者王建莉 申请人:上海华康生物技术有限公司