专利名称：抗原致敏的人gm－csf基因修饰的人树突状细胞、其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)基因修饰后免疫激发功能增强的树突状细胞(dendritic cells，DC)、及其制备方法，还涉及该基因修饰的DC在多种肿瘤和肝炎等感染性疾病治疗中的应用。
从分子生物学角度，基因治疗可被理解为将正常有功能的基因置换或增补缺陷基因的方法，从更广义的疾病治疗角度，可以认为凡是将新的遗传物质转移到某个体内使其获得治疗效果的方法均属基因治疗。近年来，随着分子生物学、免疫学等相关学科的发展和交叉渗透，该方面研究取得了重大进展，已为广大学者所接受并已从实验研究及基础研究过渡到临床试用阶段。目前世界上已有数百项基因治疗临床研究项目正在试验中，可以预见基因治疗作为一种全新的疾病治疗手段，将一定程度地改变人类疾病治疗的历史进程。
基因治疗可分为两种方式，一种为基因矫正和置换，即将基因的异常序列进行校正和精确的原位修复，例如通过同源重组可以用正常基因置换缺陷的基因，目前这种方式尚无突破性进展；另一种方式是基因添加和增补，即不去除异常基因，而是通过具有治疗意义的外源基因作定点的整合，使其表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，目前绝大多数基因治疗属于此种。
基因治疗的策略主要包括in vivo(直接体内法)和ex vivo(可理解为离体法)。目前研究最多的是ex vivo，即先在体外将外源基因导入载体细胞，然后将基因转染后的细胞回输给受者，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产物以达到治疗目的。在体外可将外源基因导入载体细胞的方法有很多，目前应用较为广泛的重组腺病毒载体具有其它载体如逆转录病毒等所不具备的优点。腺病毒为一DNA双链无包膜病毒，基因组为36Kb，基因背景比较清楚。腺病毒已在美国应用多年，证实对人类是无害的。腺病毒载体有较大的宿主范围，可以感染非分裂细胞，在invivo的基因转移上有很大的优势，同时由于腺病毒感染细胞时其DNA不整合到宿主染色体中，因此没有潜在的致癌危险。腺病毒载体的构建一般采用同源重组，E1区及E3区可被外源基因取代，从而使外源基因的插入可达7.5Kb。由于E1区是病毒复制所必需的，E1缺陷型病毒载体只能在辅助细胞中复制，目前肿瘤基因治疗中所应用的腺病毒载体一般缺失整个E1a和部分E1b基因，必须由293细胞提供E1蛋白，复制出具有感染能力的病毒，这些重组病毒可在许多细胞中表达外源基因，却不能在E1-的细胞中复制。in vivo即将外源性基因直接导入受者体内有关的器官组织或细胞内以达到治疗目的，这是一种简便易行的方法，如肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等，但是基因转染率太低，近年来随着腺病毒等基因治疗载体的改进和发展，此方面进展较大，直接将携带外源基因的腺病毒注射至宿主治疗肿瘤的方法引起较为广泛的关注。
目前基因治疗的范围已从过去罕见的单基因疾病扩大至常见的单基因疾病和多基因疾病，已从治疗遗传性疾病扩展至治疗恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫性疾病(如关节炎等)、感染性疾病(如爱滋病、肝炎等)。由于肿瘤患者的种类和数量众多，缺乏有效的治疗手段，预后差，其对于基因治疗这类新型治疗方法的临床迫切性较强，患者和家属易于接受，伦理学问题较少，故肿瘤基因治疗的研究最为热门，且最受瞩目，目前大多数基因治疗临床项目是肿瘤的基因治疗，且部分临床项目取得了肯定的疗效。
肿瘤基因治疗研究项目被正式批准试用于临床，表明其已经过大量基础性研究，在理论上和技术方面已相当成熟，也有巨大的社会效益和经济效益。目前国际上有百余项肿瘤基因治疗临床项目大致可分为免疫基因治疗(Immuno-genetherapy)、药物抵抗(主要是MDR)、药物敏感(自杀基因疗法)、肿瘤抑制基因、基因标记研究等。其中，免疫基因治疗占绝大多数，而肿瘤的免疫基因治疗的研究又多集中于细胞因子基因治疗(cytokine gene therapy)研究。虽然随着生物高技术的发展，人们已经制备纯化出了多种可供临床大量应用的基因工程细胞因子，但是大量的临床试用资料表明，需要给肿瘤患者反复多次注射高剂量细胞因子方能取得一定疗效且患者往往表现出严重的副作用。细胞因子基因治疗在一定程度上克服了以往细胞因子注射疗法需反复多次应用、副作用严重等缺点，也取得了细胞因子注射疗法所不具备的疗效。
在众多细胞因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，GM-CSF)GM-CSF是一个具有多项潜能的造血生长因子，不仅能够促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，而且对其他的细胞，如抗原递呈细胞(APC)、成纤维细胞、角质细胞、皮肤粘膜细胞等，均有着不同程度的刺激作用。由于GM-CSF对骨髓抑制的修复作用，目前在临床上的用途主要是用于治疗恶性肿瘤因放、化疗所致的白细胞减少症，GM-CSF在升高白细胞方面的作用已经比较肯定。
近年来有许多研究报道表明，GM-CSF在抗病毒、抗真菌感染等的治疗中也有着良好的疗效。目前，真菌感染已成为肿瘤患者的主要死亡原因之一，近些年来的尸体解剖结果表明，肿瘤患者真菌感染的发生率逐年增高，主要是因为肿瘤患者强烈化疗导致严重骨髓抑制，以及免疫机能的下降等(Clin Infect Dis，1994，1825，Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1997，1656)。另外，广谱抗生素、糖皮质激素的长期应用，静脉输液装置的采用等也有助于病菌的入侵而发生感染。有文献报道，对于持续发热并伴有白细胞低下的患者，经抗生素治疗1周后，系统性真菌感染的发生率约为33％，而对于骨髓移植患者，侵入性真菌感染的发生率也高达15％～30％(J Infect Dis，1990，161381，Clin Infect Dis，1994，18273)。这些现象已经明确地显示，真菌感染对恶性肿瘤患者的预后产生了严重的影响。现在临床上常用的抗真菌制剂主要有两性霉素、制霉菌素、克霉唑、氟康唑、酮康唑等，这些药物都有着一定的抗真菌作用，但是它们同时均有着一个严重的副反应——骨髓抑制，以致许多患者不得不终止治疗。
GM-CSF是一种具有多项潜能的造血生长因子，它不仅能够促进造血前体细胞的增殖、分化和成熟，恢复因肿瘤化疗所致的骨髓抑制，而且对机体免疫机能的调节也起着一定的作用。鉴于此，GM-CSF在治疗真菌感染中能够发挥良好的作用。Peter等对145例进行自体干细胞移植患者的真菌感染情况进行了回顾性分析，发现采用rhGM-CSF治疗的70例患者中有2例存在真菌感染，发生率为2.9％；而在对照组，75例患者中有9例发生真菌感染，发生率为12％，两者之间存在明显差异。另外，还发现有10例死亡患者，其中5例的死亡原因是真菌感染，且这5例中有4例是未用rhGM-CSF治疗的(Bone Marrow Transplant，1996，1893)。
对慢性肝炎的治疗仍以“干扰素”为首选药物，其作用机理是除直接抑制病毒复制外，还直接或间接地作用于细胞因子网络，调节宿主的免疫反应，从而减轻肝脏损伤的程度，防止疾病的进一步发展。但是，近些年的许多研究和观察表明，干扰素对病毒性肝炎的治疗效果不甚理想，尤其在治疗过程中产生的骨髓抑制等副作用，使得治疗不得不停止，因此寻找新的、更有效的药物已是势在必行。GM-CSF作为免疫调节剂可以增强抗病毒药物的疗效以及增强宿主对肝炎疫苗的应答反应。1993年Martin等他们对9例HBeAg和HBV DNA均阳性的慢性乙型肝炎患者给予GM-CSF治疗，结果表明，GM-CSF能够使患者血清HBV DNA水平显著地下降，有4例患者的血清HBV DNA和HBeAg完全消失，且其中有2例出现抗HBe抗体。随着GM-CSF治疗时间的延长，升高的转氨酶也会逐渐恢复正常水平若在治疗慢性乙型肝炎时联合应用GM-CSF与干扰素(IFN)，则HBVDNA水平的下降将更为明显，说明GM-CSF与IFN对杀灭乙肝病毒有协同作用(Hepatology，1993，18775)。Philip等将108名健康志愿者随机分为两组实验组81例，给予GM-CSF；对照组27例，采用安慰剂。结果显示，实验组有11例出现对乙肝病毒的保护性抗体(抗HBs)，滴度为10mIU/ml；而对照组无1例产生这种抗体，两者之间存在明显差异。表明，GM-CSF能够促进慢性乙肝患者产生保护性抗体(抗HBs)。以上研究说明，GM-CSF在真菌、病毒等感染的治疗中具有良好的应用前景(Vaccine，1996，141199)。
GM-CSF基因治疗肿瘤的研究和应用也非常引人注目。研究表明，GM-CSF基因修饰的瘤苗能比其它细胞因子基因修饰的瘤苗在体内更有效地诱导出抗肿瘤免疫反应，其原因之一是瘤苗免疫部位浸润了较多数量的抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)，尤其是树突状细胞(dendnritic cells，DC)。Dranoff等比较了绝大多数细胞因子基因转染瘤苗的治疗效果，发现GM-CSF基因转染的瘤苗治疗效果最佳，并由此提出将GM-CSF基因转染瘤苗用于临床试治晚期患者。Ogawa等(2000)通过腺病毒载体的介导，将鼠GM-CSF基因转移至鼠胰腺癌细胞HPD1NR，将此细胞经X线照射和制备成瘤苗后发现，此类瘤苗在体内诱导机体产生了较强的抗肿瘤免疫反应，预先接种此类瘤苗的动物模型对未转染GM-CSF基因的肿瘤细胞产生了抵抗作用(J Hepatobiliary Pancreat Surg，2000；7306)。Dunussi-Joannopoulos等(1997)也曾发现，GM-CSF基因修饰的白血病细胞制备的瘤苗对于荷瘤小鼠也有一定的治疗作用。此外，有学者发现，将GM-CSF基因转入造血干细胞中可以促进放化疗后造血损害的恢复(J Pediatr Hematol Oncol，1997；19536)。
目前，也有部分GM-CSF基因治疗项目已应用于临床治疗晚期肿瘤患者，如Mastrangelo等(1999)将携带人GM-CSF基因的重组腺病毒载体直接瘤体内注射治疗了6例黑色素瘤患者，其中3例出现了治疗反应，瘤体缩小，转移减弱。表明该疗法具有一定的治疗作用(Cancer Gene Ther，1999；6409)。国外已将GM-CSF基因疗法试用于临床治疗包括前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤及肉瘤等多种肿瘤患者，正在对其疗效作长期观察。
同理，基因疗法也可应用于感染性疾病的预防和治疗，其原理是通过理化或生物学的方法，把目的基因导入机体的适当靶细胞内，间接或直接抑制病原微生物的复制，或是提高机体的免疫功能，以期治疗和预防感染。如部分治疗HIV、HBV感染的基因治疗方案已经进入到临床I期试验。
依据将细胞因子及其受体基因导入体内的途径和原理不同，可将细胞因子基因治疗分为多种类型，包括免疫效应细胞介导的细胞因子基因治疗、成纤维细胞等载体细胞介导的细胞因子基因治疗、以抗原提呈细胞为基础的细胞因子基因治疗等。其中，被认为很有希望的是以抗原提呈细胞(主要为树突状细胞)为基础的细胞因子基因治疗的研究。
树突状细胞相关的肿瘤及感染性疾病治疗方法的研制和应用树突状细胞(dendritic cells，DC)是已知的机体内功能最强的抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)，是目前发现的唯一一种能直接激活初始型T细胞的APC。DC在激活、启动机体免疫应答尤其是细胞免疫应答反应中起着十分重要的作用。作为肿瘤细胞(或病原微生物感染细胞)与特异性免疫效应细胞之间的“桥梁”，DC所具有的处理、加工和提呈抗原的功能在抗原诱导宿主免疫反应，尤其是T细胞介导的抗肿瘤或抗感染免疫功能的过程中所发挥的作用极为重要。近年来，随着对DC研究的不断深入，尤其是DC大量扩增技术的建立，以DC为基础的特异性免疫治疗和基因治疗的研究成为相当热门的研究课题，并显示出良好的基础研究及临床应用前景，有望为肿瘤或感染性疾病的治疗提供新的途径。
近年来，在该方面最引人嘱目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏(pulsing)DC，然后将之回输或免疫接种至荷瘤或感染宿主，进行免疫治疗，已证明该疗法能显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应并能治疗荷瘤或感染宿主。但其疗效有待提高。
目前，应用各种形式的肿瘤抗原(肿瘤细胞、亚细胞组分、重组抗原蛋白、重组肿瘤抗原多肽)，在体外致敏DC，然后将载有肿瘤抗原的DC作为新型瘤苗体内接种或回输治疗肿瘤的方法经过临床I/II期试验，已证明疗效确切，且在临床上尚未观察到患者发生自身免疫性疾病等毒副作用。
许多感染的发生与持续是由于DC数量和功能的缺失，无法诱导初次免疫应答及激活特异性的CTL，同时也可能导致记忆性T、B细胞的缺失，使机体无法对病原产生再次免疫应答。因此，在体外扩增DC后采用抗原触发，然后回输体内，可以诱导机体对病原特异性的免疫。Ludewig等采用淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)特异性肽GP33-41冲击DC诱导LCMV特异性的抗病毒免疫，结果在接种抗原冲击多肽的第二天，小鼠就获得了对LCMV感染的完全保护，免疫后4天体外可以检测到特异性的细胞毒活性，60天后，小鼠仍然可以抵抗LCMV的感染，表明采用抗原冲击DC诱导特异性的抗病毒免疫有效、快速、持久，是一种有效的主动性抗病毒免疫治疗方法(J Virol，1998，723812)。Kundu等采用HLA相似的同种异体DC，用HIV-1的gp160或Env、gag、pol的合成肽冲击DC后，注入AIDS患者体内6-9次，结果表明，部分患者体内env特异性的CTL数量明显增加，淋巴细胞增殖反应增强，IFN-γ和IL-2的产量也增加(AIDS Res Hum Retroviruses，1998，14551)。
虽然，人们在与肿瘤作斗争的过程中已取得了不少进步，然而目前现有的治疗方法和治疗剂仍不能满足高效、副作用小等需要。因此，本领域迫切需要开发新的治疗剂和治疗方法。
本发明的目的就是提供一类通过粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因修饰后免疫激发功能增强的树突状细胞(dendritic cells，DC)，这类树突状细胞可用于治疗肿瘤或感染时，不仅高效，而且副作用小。
本发明的另一目的是提供所述的基因修饰的树突状细胞的制备方法，还涉及该基因修饰的DC在多种肿瘤和肝炎等感染性疾病治疗中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种树突状细胞，它被携带GM-CSF基因的腺病毒修饰过，从而表达GM-CSF。
较佳地，所述的腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列；而且，在腺病毒表面结合有双特异性抗体，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对树突状细胞表面的受体分子。
更佳地，所述腺病毒为Ad5型腺病毒；且所述的受体分子选自下组CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
在一实施例中，所述的腺病毒是重组5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC
在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，它包括有效量的树突状细胞和药学上可接受的载体或赋形剂，所述的树突状细胞被携带GM-CSF基因的腺病毒修饰过，从而表达GM-CSF。
在本发明的第三方面，提供了一种制备GM-CSF修饰的树突状细胞的方法，它包括步骤(a)用重组腺病毒转染树突状细胞，所述的腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列，而且，在腺病毒表面结合有双特异性抗体，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对树突状细胞表面的受体分子；(b)分离出表达GM-CSF的树突状细胞。
在附图中，
图1是本发明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40转染后，在用抗原冲击致敏之前的树突状细胞的电镜照片；图2是本发明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40转染后，在用抗原冲击致敏之前的树突状细胞的流式细胞仪分析的表型分析结果。
图3是本发明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40转染后，在用抗原冲击致敏之前的树突状细胞的混合淋巴细胞反应曲线图。
图4是本发明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40转染后，并用抗原冲击致敏之后的树突状细胞的电镜照片；图5是本发明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40转染后，并用抗原冲击致敏之后的树突状细胞的流式细胞仪分析的表型分析结果。
图6是本发明用腺病毒Ad.GM-CSF/CD40转染后，并用抗原冲击致敏之后的树突状细胞的混合淋巴细胞反应曲线图。
进一步提高DC治疗肿瘤或感染的效果以最大程度地满足临床的要求是目前该方面研究的热门课题，以DC为基础的肿瘤或感染性疾病的基因治疗被人们寄予厚望。该方面研究的主要策略是将能增强DC功能的细胞因子基因导入DC中以提高其抗原提呈的效率和激活T细胞免疫应答的能力，从而取得更好的疾病治疗效果。
在众多的细胞因子中，对DC功能影响最大的当属GM-CSF。以往曾发现GM-CSF基因修饰的瘤苗能比其它细胞因子基因修饰的瘤苗在体内更有效地诱导出抗肿瘤免疫反应，研究表明，其原因之一就是瘤苗免疫部位浸润了较多数量的DC。而且GM-CSF不仅是DC维持生存所必需，还对DC的功能具有极为重要的影响。意大利Colombo小组(1999)用GM-CSF和CD40L基因共同修饰C26小鼠结肠腺癌细胞，发现其肿瘤接种部位内浸润有大量DC并存在大量肿瘤细胞凋亡小体，将肿瘤浸润性DC分离纯化后研究表明，其能诱导出针对C-26抗原AH-1和KSP的特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，由此提出肿瘤局部浸润的DC可通过摄取肿瘤凋亡小体，在局部成熟并将抗原提呈给T细胞(JExp Med 1999；190125)。曹雪涛等研究表明，GM-CSF基因修饰的脾脏DC的抗原提呈能力增强，体内应用后可诱导更显著的抗肿瘤免疫反应(Science in China，1997；40(5)539-545)。Curiel-Lewandrowski等(1999)观察了小鼠骨髓来源的非成熟鼠DC经GM-CSF体外基因修饰后，其体内外的分化发育、迁移能力及抗原提呈能力，发现体内应用后能显著地诱导出抗原的初次免疫应答，此效果与其迁移能力增强有关(J Immunol，1999；163174-83)。
同理，病原微生物抗原触发的GM-CSF基因修饰DC在体内也必然能诱导机体产生更强的抗感染免疫。
本发明人研究发现，用各种抗原冲击致敏后的GM-CSF基因修饰DC，可以获得出乎意料的高抗肿瘤效果，尤其是用改进过的腺病毒转染DC使其被GM-CSF修饰后，进一步提高了治疗的针对性和效率。在此基础上，完成了本发明。
在本发明中，术语“粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列(GM-CSF)”指天然存在的或人工合成的GM-CSF编码序列，该编码序列可以编码天然形式的GM-CSF，也可以编码各种变异形式的GM-CSF(例如GM-CSF的保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体，或其活性片段)，只要该变异形式的GM-CSF具有GM-CSF的生物活性。
在本发明中，术语“粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒”指含有GM-CSF编码序列以及表达所需元件的序列组件，表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒还可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于增强子、分泌信号肽序列等。较佳地，在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒含有双拷贝或多拷贝的GM-CSF编码序列。一种实现双拷贝表达的方法是利用IRES序列将GM-CSF的cDNA进行串联融合，从而实现双拷贝表达。
在本发明中，术语“细胞表面受体分子”指在哺乳动物细胞(尤其是树突状细胞)的细胞表面上，可用作抗体结合位点的分子。代表性的例子包括各种CD分子，例如CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子等。CD40是一种主要表达于树突状细胞、B细胞、单核细胞等细胞表面的膜分子，在其对应的配体分子CD40L左右下，介导细胞活化信号。
在本发明中，对于树突状细胞的来源没有特别限制，例如所述的树突状细胞包括(但并不限于)下列细胞外周血单核细胞培养的DC、骨髓来源的DC、脐带血来源的DC。
在本发明中，可以适用于人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，例如巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子等其它适用于真核表达的启动子。
在本发明中，用GM-CSF基因修饰DC的方法包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、脂质体、电穿孔等介导的GM-CSF基因转移。较佳地，是用腺病毒载体介导的GM-CSF基因转移。
在本发明中，可供使用重组腺病毒可以是任何一种血清型的腺病毒，较佳地，为了防止在制备过程产生亲本的复制型腺病毒，宜采用E1区缺失型腺病毒。更佳地，使用E1区和E3区都缺失的腺病毒。此外，宜采用已研究得较为透彻的腺病毒类型，例如Ad2和Ad5型腺病毒。
在获得了GM-CSF修饰的DC之后，用各种不同抗原来致敏DC，其中包括抗原蛋白、抗原多肽、细胞或细菌裂解物、放射性照射的细胞或细菌、抗原RNA、抗原cDNA等。更具体地，树突状细胞可被选自下组的抗原冲击致敏(a)食管癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、脑胶质瘤的细胞、或细胞组份；(b)乙肝抗原、疟原虫抗原、结核杆菌蛋白抗原、真菌抗原。
在本发明中，针对DC表面分子的靶向性基因转染，可以利用DC表达的各种表面分子如CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子等而实现。即利用双特异性抗体，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对树突状细胞表面的受体分子(例如CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子)，从而使腺病毒靶向性地与树突状细胞结合，从而实现靶向性基因转染。
在本发明的一个实施例中，构建了一种高效的树突状细胞CD40靶向性的表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的双拷贝型重组腺病毒(AdGM-CSF/CD40)，其依据是DC高表达CD40，故CD40可作为DC基因导入的靶分子，通过改造重组腺病毒衣壳蛋白，使之具有与CD40分子结合的特点，构建成高效靶向性DC基因转染的重组腺病毒载体AdGM-CSF/CD40，AdGM-CSF/CD40能比常规制备的GM-CSF重组腺病毒更有效地将GM-CSF基因导入DC，使基因修饰的DC更有效地表达分泌GM-CSF。并且，将GM-CSF基因修饰的DC经不同抗原触发致敏后免疫机体，以打破机体对该种抗原的免疫耐受。
在本发明中，将GM-CSF基因修饰的DC经肿瘤抗原触发致敏后，可用于治疗各种恶性肿瘤，其中包括(但并不限于)食管癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、脑胶质瘤等。
将GM-CSF基因修饰的DC经病原微生物抗原触发致敏后用于治疗和预防多种感染性疾病。例如，经HBsAg触发后治疗或预防乙肝、经疟原虫抗原触发后治疗或预防疟疾、经结核杆菌蛋白触发后治疗或预防结核、真菌抗原触发后治疗真菌感染等。
本发明的优点在于(1)构建了一种高效的树突状细胞CD40靶向性的表达人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的双拷贝型重组腺病毒(AdGM-CSF/CD40)。AdGM-CSF/CD40能比常规制备的GM-CSF重组腺病毒更有效地将GM-CSF基因导入DC，使基因修饰的DC更有效地表达分泌GM-CSF。在应用其它携带人GM-CSF基因的载体转染GM-CSF基因至人DC时发现，其转染效率很难达到50％，这大大地影响了GM-CSF基因修饰DC在肿瘤及感染性疾病治疗中的应用。
(2)已知CD40抗体与CD40的结合是对DC的有效活化，因此，通过AdGM-CSF/CD40将GM-CSF基因导入DC的同时，DC获得了多重功能增强因素的刺激，可使DC的功能得到明显的增强。
(3)已知GM-CSF是影响DC分化发育的重要因子，可维持DC的存活、促进DC表达对其抗原提呈功能具有影响的表面分子的表达、增强其刺激T淋巴细胞增殖的能力，因此，DC高表达的GM-CSF对于其抗原提呈功能具有明显的增强作用。
(4)GM-CSF是一种具有多种免疫调节作用的细胞因子，能增强抗病毒药物的治疗效果，增强宿主对肝炎疫苗的应答反应，还能增强宿主的免疫功能，因此，目前已用于病毒性肝炎的治疗；作为一种具有造血促进作用的细胞因子，GM-CSF对于抗真菌制剂所引起的免疫抑制具有明显的治疗作用。因此，DC分泌的GM-CSF在体内除了对DC的功能具有增强作用外，还可发挥多种其它效应包括造血调控作用、免疫增强作用等。
(5)、应用不同类型的抗原触发致敏DC，因而可用于多种疾病的治疗。对于肿瘤抗原，可针对各种不同的肿瘤分别采用不同形式的肿瘤抗原包括肿瘤细胞、肿瘤蛋白、肿瘤抗原多肽、肿瘤抗原基因转染等；对于病原微生物也可采用不同的抗原致敏DC以诱导机体产生免疫反应(如针对乙肝的治疗可采用乙肝表面抗原、针对疟疾的治疗可采用疟原虫蛋白抗原、针对结核病的治疗可采用结核杆菌蛋白抗原等)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，比如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人外周血来源的树突状细胞的大量培养和扩增取患者或HLA配型的健康献血员抗凝外周全血，通过血细胞分离机及淋巴细胞分离液(p＝1.077)分离外周血单个核细胞，洗2遍后给以无血清RPMI1640培养基培养2小时，洗弃非贴壁细胞，给以含2.5％人血清、GM-CSF(1000U/ml)、IL-4(1000U/ml)的RPMI1640培养基培养5～7天，获得人外周血来源的未成熟树突状细胞，其特征是高表达CD1a、CD80、CD86、CD40等表面分子，具有吞噬功能，但刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱。对以上特征鉴定后可置于液氮保存。
实施例2人CD34+干细胞来源的树突状细胞的大量培养和扩增取HLA配型的健康孕妇抗凝脐带血，通过淋巴细胞分离液(p＝1.077)分离单个核细胞，洗2遍后通过免疫磁珠分离CD34+干细胞，给以含2.5％人血清、IL-3(10ng/ml)、IL-6(100ng/ml)及SCF(10ng/ml)培养7天，再给以GM-CSF(1000U/ml)、IL-4(100ng/ml)的RPMI1640培养基培养14～21天，获得人CD34+干细胞来源的未成熟树突状细胞，其特征是高表达CD1a、CD80、CD86、CD40等表面分子，具有吞噬功能，但刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱。对以上特征鉴定后可置于液氮保存。
实施例3CD40靶向性、高效表达人GM-CSF重组腺病毒Ad.GM-CSF/CD40的制备(1)人GM-CSF cDNA的克隆通过RT-PCR从活化的人T淋巴细胞中扩增人GM-CSF cDNA。首先用人T细胞分离柱(Biotex公司)从健康人外周血中分取T细胞，体外经有丝分裂原ConA(10μg/ml，Sigma公司)刺激培养24小时后，用Trizol试剂(Gibco公司)提取细胞总RNA；用AMV逆转录酶(Promega公司)合成cDNA第一链，以其为模板进行PCR扩增。
PCR扩增采用的上游引物和下游引物序列为5’cggaattctagaccaccATGTGGCTGCAGAGCCTG 3’(SEQ ID NO4)5’cgggatccTCACTCCTGGACTGGCTCCC 3’(SEQ ID NO5)在上游引物中设计了EcoRI和XbaI位点，下游引物中设计了BamHI位点。所扩增产物包括人GM-CSF的全部编码序列，预计大小为456bp。PCR反应体积为50μl，其中引物浓度为0.3μM，扩增参数为94℃1’、58℃1’、72℃2’，20个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经EcoRI和BamHI酶切后，定向克隆至pGEM-3Z载体(Promega公司)，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，得到的重组载体记为pGEM-hGM，用M13-21和SP6引物进行全自动测序(ABI373，PE公司)。经测序分析，所扩增到的人GM-CSFcDNA序列完全正确，包含全部编码序列(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。
(2)IRES cDNA的克隆以质粒pIRES-hrGFP(Stratagene公司)为模板进行PCR扩增。上游引物为5’gg GGA TCC cgg GAC GAC TGC ATA GGG TTAC(SEQ ID NO6)，其中设计了BamHI位点；下游引物为5’gGAA TTC CTG CAG CCA TTA TCA TCG TGTTTTTC(SEQ ID NO7)，其中设计了EcoRI位点；所扩增产物预计大小为620bp。PCR反应体积为50μl，其中引物浓度为0.3μM，扩增参数为94℃1’、52℃1’、72℃2’，25个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经EcoRI和BamHI酶切后，定向克隆至pBluescript II-KS载体(Stratagene公司)，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，得到的重组载体记为pKS-IRES，用T7和T3引物进行全自动测序(ABI373，PE公司)。经测序分析，所扩增到IRES序列完全正确(SEQ ID NO3)。
(3)双拷贝人GM-CSF融合基因的构建首先从pGEM-hGM载体中切出GM-CSF的XbaI/BamHI片段，插入pKS-IRES，使GM-CSF cDNA位于IRES的上游，得到重组载体pKS-GM-IRES；再从pGEM-hGM载体中切出GM-CSF的EcoRI/SalI片段，插入pKS-GM-IRES，使该GM-CSFcDNA位于IRES的下游，这样得到GM-CSF双拷贝融合基因，重组载体命名为pKS-GM-DC，融合基因序列见SEQ ID NO3。
(4)双拷贝人GM-CSF腺病毒载体的构建所采用的腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV购自Stratagene公司，含有Ad5腺病毒的左右同源臂，其中含有多个供外源基因插入的克隆位点。从pSK-GM-DC载体中切出双拷贝GM-CSF融合基因的NotI/XhoI片段，克隆至pShuttle-CMV的NotI/XhoI位点，连接产物转化DH5α菌，得到重组腺病毒穿梭载体pShuttle-GM-DC。
重组腺病毒穿梭载体pShuttle-GM-DC经PacI线性化和去磷酸化处理后，取1μg与100ng的pAdEasy-1载体(Stratagene公司)混合，电穿孔法共转化BJ5183感受态细菌(Stratagene公司)，经BJ5183细菌的同源重组，得到GM-CSF的重组腺病毒，阳性克隆经PacI酶切鉴定后，记为pAd.GM-DC。
阳性克隆pAd.GM-DC进一步转化XL-10感受态细菌(Stratagene公司)，进行DNA的大量扩增。用高浓度肉汤TB培养基500～1000ml大量扩增阳性克隆菌，碱裂法抽提粘粒DNA，溶于4ml TE中，加入44.4g CsCl(Gibco公司)、0.4ml溴化乙锭(10mg/ml)混合，置5ml离心管(Beckman)梯度离心(VTi65.1转头，55,000rpm，20℃，16h)，收集超螺旋条带，用等体积Butanol(Sigma)抽提4～6遍，4℃下用TE透析过夜，或直接加入3倍体积无菌去离子水、8倍体积无水乙醇，于4℃沉淀DNA(3～5小时)，干燥后DNA溶于无菌TE，用分光光度计检测其浓度和纯度。
(5)重组腺病毒的包装重组腺病毒DNA载体pAd.GM-DC经磷酸钙DNA共沉淀法转染293细胞(ATCC公司)，经胞内包装产生人GM-CSF重组腺病毒。转染前一天，待转染的293细胞更换新鲜培养基。于500μl体积中将5μg经PacI线性化处理的重组腺病毒载体pAd.GM-DC、CaCl2(终浓度为0.25M)混合后，加入500μl的2×BBS缓冲液(50mM BES(N，N-bis(2-hydroxyethl)-2-aminoethane-sulfonic acid)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(pH6.95))，混合后置室温作用10～20分钟，逐滴加入293细胞，置37℃、5％CO2培养12～24小时。将共转染的293细胞与未经转染的293细胞按1∶1、1∶10和1∶100等不同比例混合，分别接种至96孔培养板(100μl/孔)，此后的第4天和第8天各补加DMEM培养基(50μl/孔)。于转染后的第12~14天，收集阳性克隆孔的细胞及其培养液，超声破碎后的病毒上清为第一代种子病毒(1st seed)，于-80℃保存。第一代种子病毒用病毒上清(10μl/孔)感染24孔培养板中的293细胞，每个克隆设2个复孔；3～4天收集一个复孔的细胞行细胞基因组DNA的酶切分析，另一复孔中的细胞经超声破碎后收集病毒上清，为第二代种子病毒(2nd seed)，留作扩增用。结果，在转染的12～14天，在1∶10的96孔培养板中收集到病变死亡的293细胞克隆95个，经酶切鉴定得到双拷贝GM-CSF的重组腺病毒克隆。
(6)重组腺病毒的扩增、纯化与滴度检测酶切鉴定正确的重组克隆的第二代种子病毒上清(2nd seed)，用于感染293细胞扩增病毒，3～4天后，超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，病毒上清经CsCl梯度离心(25,000rpm，4℃，2h)，浓缩的病毒液进行第二次CsCl梯度离心(35,000rpm，4℃，3h)纯化，最后将收集病毒液对含10％甘油的PBS缓冲液透析过夜，过滤除菌后分装，速冻保存于-80℃。
以293细胞为靶细胞、用微量细胞病变法检测病毒滴度。96孔板中先加入50ml培养液/孔，前8孔加入25ml经104稀释的病毒液，开始行3倍的倍比稀释，共11个稀释度，每一稀释度设8复孔，每孔加50μl 293细胞，FCS的终度为5％，同时设细胞对照，此后第4天和第8天分别补加50μl含10％FCS的DMEM培养基，12～14天后判定结果。对其中的一个阳性克隆进行扩增，所扩增的人GM-CSF重组腺病毒滴度为7.67×1010pfu/ml。用注射用水稀释、分装成5×1010pfu/ml，保存于-80℃。
该腺病毒被命名为“双拷贝表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC”，2001年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏编号为CCTCC No.V200103。
(7)抗腺病毒和人CD40分子双特异性抗体的制备小鼠抗Ad5腺病毒纤维蛋白(fiber)单抗1D6.14和抗人CD40单抗G28.5分别从其杂交瘤细胞株(ATCC公司)的培养上清中，经Protein A(Pharmacia公司)亲和层析纯化制备后，用木瓜蛋白酶(Pierce公司)消化、Protein A(Pharmacia公司)亲和层析纯化抗体的Fab片段。这两种单抗的Fab片段用N-succinimidyl 3-(2-pyridldithio)propionate(SPDP)偶联，制备得到抗Ad5腺病毒和人CD40的双特异性抗体。具体方法参照文献(Production ofbispecific antibodies.in Current Protocols in Immunology，New York，1997；p2.13.1)。
(8)CD40靶向性腺病毒的制备GM-CSF重组腺病毒中加入10ng/106pfu双特异性抗体，于4℃孵育1小时，双特异性抗体通过其抗腺病毒的结合位点与GM-CSF重组腺病毒结合，而其中的抗CD40的结合位点仍然预留着，能与细胞膜表面的人CD40分子特异性结合，这样就制备成功CD40靶向性的人GM-CSF重组腺病毒，记为Ad.GM-CSF/CD40。
实施例4制备人GM-CSF基因修饰的人树突状细胞复苏冻存的DC或取新鲜培养的DC，给以无血清培养(5％CO2，37℃)，加入腺病毒AdGM-CSF/CD40(MOI＝50)，每10分钟轻轻摇动1分钟，1小时后洗2遍，继续培养24小时，鉴定细胞的活力、表型及功能。此时细胞仍表现出未成熟DC的特征(图1，2，3)。
实施例5肿瘤抗原或病原微生物抗原在体外触发致敏人树突状细胞在培养的DC中加入TNFα(100ng/ml)培养24小时，收集培养的DC，置于50ml离心管，加入蛋白抗原，置于37℃水浴中，缓慢瑶动，2小时后1000g离心10分钟，弃上清，加入生理盐水，配制成1×107/ml悬液备用。其特征是低表达CD1a，高表达CD80、CD86、CD40、CD83等表面分子，无吞噬功能，但刺激T淋巴细胞增殖的能力较强，此时细胞表现出相对成熟DC的特征(图4，5，6)。
实施例6皮下多点注射免疫患者于患者左右两臂及左右大腿近淋巴结处皮下分别多点注射DC悬液，每2周1次，共3次，每次2×106～5×107细胞。
序列表<110>上海华康生物技术有限公司<120>抗原致敏的人GM-CSF基因修饰的人树突状细胞、其制法和用途<130>011976<160>7<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>456<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(16)..(450)<400>1gaattctaga ccacc atg tgg ctg cag agc ctg ctg ctc ttg ggc act gtg51Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val1 5 10gcc tgc agc atc tct gca ccc gcc cgc tcg ccc agc ccc agc acg cag 99Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln15 20 25ccc tgg gag cat gtg aat gcc atc cag gag gcc cgg cgt ctc ctg aac147Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn30 35 40ctg agt aga gac act gct gct gag atg aat gaa aca gta gaa gtc atc195Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile45 50 55 60tca gaa atg ttt gac ctc cag gag ccg acc tgc cta cag acc cgc ctg243Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu65 70 75gag ctg tac aag cag ggc ctg cgg ggc agc ctc acc aag ctc aag ggc291Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly
80 85 90ccc ttg acc atg atg gcc agc cac tac aag cag cac tgc cct cca acc339Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr95 100 105ccg gaa act tcc tgt gca acc cag act atc acc ttt gaa agt ttc aaa387Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys110 115 120gag aac ctg aag gac ttt ctg ctt gtc atc ccc ttt gac tgc tgg gag435Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu125 130 135 140cca gtc cag gag tga ggatcc 456Pro Val Gln Glu<210>2<211>144<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile1 5 10 15Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His20 25 30Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp35 40 45Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe50 55 60Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys65 70 75 80Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met85 90 95Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
100 105 110Cys Ala Thr Gln Thr Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys115 120 125Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu130 135 140<210>3<211>1538<212>DNA<213>双拷贝GM-CSF编码序列<400>3gcggccgctc tagaccacca tgtggctgca gagcctgctg ctcttgggca ctgtggcctg 60cagcatctct gcacccgccc gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa120tgccatccag gaggcccggc gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatgaa180tgaaacagta gaagtcatct cagaaatgtt tgacctccag gagccgacct gcctacagac240ccgcctggag ctgtacaagc agggcctgcg gggcagcctc accaagctca agggcccctt300gaccatgatg gccagccact acaagcagca ctgccctcca accccggaaa cttcctgtgc360aacccagact atcacctttg aaagtttcaa agagaacctg aaggactttc tgcttgtcat420cccctttgac tgctgggagc cagtccagga gtgaggatcc cgggacgact gcataggtta480cccccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg540tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc600cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa660ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga720caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc780ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc840cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac900aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 960tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 1020gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatggct gcaggaattc tagaccacca 1080tgtggctgca gagcctgctg ctcttgggca ctgtggcctg cagcatctct gcacccgccc 1140gctcgcccag ccccagcacg cagccctggg agcatgtgaa tgccatccag gaggcccggc 1200gtctcctgaa cctgagtaga gacactgctg ctgagatgaa tgaaacagta gaagtcatct 1260cagaaatgtt tgacctccag gagccgacct gcctacagac ccgcctggag ctgtacaagc 1320agggcctgcg gggcagcctc accaagctca agggcccctt gaccatgatg gccagccact 1380acaagcagca ctgccctcca accccggaaa cttcctgtgc aacccagact atcacctttg 1440aaagtttcaa agagaacctg aaggactttc tgcttgtcat cccctttgac tgctgggagc 1500cagtccagga gtgaggatcc tctagagtcg acctcgag 1538<210>4<211>35<212>DNA<213>合成的引物<400>4cggaattcta gaccaccatg tggctgcaga gcctg 35<210>5<211>28<212>DNA<213>合成的引物<400>5cgggatcctc actcctggac tggctccc 28<210>6<211>30<212>DNA<213>合成的引物<400>6ggggatcccg ggacgactgc atagggttac 30<210>7<211>33<212>DNA<213>合成的引物<400>7ggaattcctg cagccattat catcgtgttt ttc 3权利要求
1.一种树突状细胞，其特征在于，它被携带GM-CSF基因的腺病毒修饰过，从而表达GM-CSF。
2.如权利要求1所述的树突状细胞，其特征在于，所述的腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列，而且，在腺病毒表面结合有双特异性抗体，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对树突状细胞表面的受体分子。
3.如权利要求3所述重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒为Ad5型腺病毒；且所述的受体分子选自下组CD1a、CD40、CD44、CD54、CD80、CD83、CD86、MHC分子。
4.如权利要求1所述的树突状细胞，其特征在于，所述的受体分子是CD40。
5.如权利要求1所述的树突状细胞，其特征在于，所述的腺病毒是重组5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC No.V200103。
6.如权利要求1所述的树突状细胞，其特征在于，所述的树突状细胞被选自下组的抗原冲击致敏(a)食管癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤、脑胶质瘤的细胞、或细胞组份；(b)乙肝抗原、疟原虫抗原、结核杆菌蛋白抗原、真菌抗原。
7.如权利要求1所述的树突状细胞，其特征在于，所述的树突状细胞包括下列细胞外周血单核细胞培养的DC、骨髓来源的DC、脐带血来源的DC。
8.一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的树突状细胞和药学上可接受的载体或赋形剂，所述的树突状细胞被携带GM-CSF基因的腺病毒修饰过，从而表达GM-CSF。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，该腺病毒是表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的重组5型腺病毒Ad.GM-CSF-DC，CCTCC No.V200103。
10.一种制备GM-CSF修饰的树突状细胞的方法，其特征在于，它包括步骤(a)用重组腺病毒转染树突状细胞，所述的腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子编码序列和聚腺苷酸化信号序列，而且，在腺病毒表面结合有双特异性抗体，该抗体既特异性地针对腺病毒表面的结合位点，又特异性地针对树突状细胞表面的受体分子；(b)分离出表达GM-CSF的树突状细胞。
全文摘要
本发明提供了一类通过粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte－macrophage colony－stimulatingfactor,GM－CSF)基因修饰后免疫激发功能增强的树突状细胞(dendritic cells,DC)、及其制备方法。还涉及该基因修饰的DC在多种肿瘤和肝炎等感染性疾病治疗中的应用。
文档编号A61P1/00GK1381562SQ0110597
公开日2002年11月27日 申请日期2001年4月13日 优先权日2001年4月13日
发明者王建莉 申请人:上海华康生物技术有限公司