专利名称：抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的生产方法。
背景技术：
转移因子是从多种抗原致敏的正常动物白细胞中提取出来的一种淋巴因子，或从经某种抗原刺激后的恢复期动物血细胞中提取出来的一种淋巴因子。前者称非特异性转移因子，后者则称特异性转移因子。这两种转移因子在体内外最重要的是可传递细胞免疫功能,作为过继免疫治疗的一种免疫制剂，在免疫系统中发挥多种重要作用。
转移因子目前的制备方法是将动物新鲜或冷冻的脾脏及淋巴结在25°C
左右去除脂肪及结缔组织，然后用纯化水洗净；将洗净的组织切成小块，加入
适量水，用组织捣碎机破碎细胞，制成匀浆，加适量纯化水，混匀，置-2(TC反复冻融5 8次，融化温度不得超过37"C;将冻融的匀浆离心(离心温度4°C)，去沉淀，留上清液备用；上清液装透析袋，透析24-48小时，半成品过滤除菌；成品的配置与检验。
抗菌肽是经诱导，由动物免疫防御系统产生的可对抗外源性病原体的防御性肽类活性物质，分子量小、活性强，具有抗细菌、真菌、病毒和原虫作用，甚至对癌细胞也具有杀伤作用，应用十分广泛。目前的制备方法是以新鲜鸡小肠为原料，去脂肪、浆膜和内容物，称重后冷冻剪碎，捣碎成浆。匀浆后隔水煮沸15分钟，按照l: 1的比例加入5%乙酸，并在4。C条件下搅拌过夜，次日将混合物在4"C温度条件下以8000转/分钟离心30分钟，取上清，保存在4。C环境中。将沉淀物用等体积5%乙酸混合，再置于4。C搅拌浸提过夜，重复上述离心过程，取上清，合并两次上清液，调整pH值，再次离心，弃沉淀，上清液冷冻干燥品即为抗菌肽。
现有技术制备转移因子及抗菌肽的主要缺点是针对疾病没有特异性，治疗效果不稳定。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中制备的抗菌肽及转移因子针对疾病没有
3特异性，治疗效果不稳定等缺点，提供一种生产工艺简单、成本低、产出率高、效果更好的抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法。本发明的技术解决方案概述如下
一种抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，由如下步骤组
成
(1) 用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗0. 25-lmL肌肉注射免疫10日龄实验鸡，在15日龄时，再以同批疫苗0.3mL肌肉注射加强免疫；
(2) 密切监测实验鸡体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时，无菌采取实验鸡脾脏或抗凝血，用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；
(3) 对淋巴细胞单层进行传代培养；
(4) 当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养，即获得抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽。
本发明的优点
本发明以较少的鸡脾脏或外周血为原料，制成淋巴细胞单层，在体外培养，诱导淋巴细胞单层即可生产出大量抗禽流感病毒特异性转移因子和抗菌肽的混合体，本发明的方法制备的抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽无需进一步的提纯，可经超声波及冻融简单处理后直接将混合体用在禽类体内，即可起到抗禽流感病毒及抗菌的作用，提高禽类的免疫力。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1
一种抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，步骤(1).免疫
用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗0. 25mL肌肉注射免疫10日龄实验鸡，同步设立空白对照组，在15日龄再以同批疫苗0.3mL肌肉注射作为加强免疫；
(2)密切监测实验鸡体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时，无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞单层，步骤为A、处理鸡脾脏
取新鲜鸡脾脏置于无菌玻璃容器中，加入PBS(pH为7. 2)溶液浸泡半小时或浸于质量百分浓度为1%的新洁尔灭溶液中，取出以酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用PBS(pH为7. 2)液洗涤一次，再将脾脏-剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成lmm3小块，再用PBS(pH为7. 2) 液洗涤3次，以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞；
B、 消化及分散组织块
将上步清洗过的PBS(pH7.2)液吸掉、将剪碎的组织块移入锥形瓶中，按 组织块体积的5倍量加入0. 25yQ胰蛋白酶液(pH为7. 7)，置37t:水浴中消化 30分钟。每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直 到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶 液，再用PBS(pH为7.2)液洗涤3次，用O. 5%水解乳蛋白——Hanks液洗， 用口径稍大的细管吹打数次，用四层纱布滤过；
C、 细胞计数
采用标有O. lmm字样的血球计数板进行计数，计数方法与白细胞计数相 同； '
D、 细胞悬液的分装和培养
按细胞计数结果，将细胞悬液用营养液调整至60万/毫升细胞悬液。将 细胞悬液分装入细胞培养瓶(100ml)和细胞转瓶，分装量为该瓶容量的1/5， 盖上盖，做好标识，然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶 机上培养；
E、 观察
置于37'C培养的细胞，需逐日进行观察。若细胞己生长，则要观察细胞 的形态特征并判断其所处的生长阶段(游离期、吸附期、繁殖期、维持期和衰 退期)，直至形成淋巴细胞单层。
(3) 对淋巴细胞单层进行传代培养
在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下现察，以确定细胞己长 成单层，即可进行细胞的传代培养。
(4) 当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养 当脾淋巴传代细胞长成单层后，更换维持液同时加入植物血凝素诱导培养。
诱导培养24小时后对产品进行检验-
将细胞培养物经超声破碎后取样检测转移因子和抗菌肽的浓度。 转移因子浓度的测定对转移因子的定量多以多肽含量定量用Folin-酚法或分光光度法测定多肽含量，以多肽含量lmg为一个转移因子单位。此工 艺生产的转移因子含量是常规生产的的4 5倍。
抗菌肽浓度测定采用考马斯亮蓝法测定，以牛血清白蛋白为标准溶液， 所生产的抗菌肽的浓度是常规提取量的10倍。
应用实例
200只15日龄肉鸡(经过健康检查无菌)分为A、 B、 C、 D、 E共5组， 每组40只，B、 C、 D、 E组经过人工感染0. 6ml禽流感病毒强毒攻毒后作实验。 A组为健康组，不感染病毒，不给药；B组阴性对照组，感染病毒，不给药；C 组和D组为本发明的方法制备的产品，C组为低剂量组，按0. 06 g/鸡/天注射； D组为药物组合物高剂量组，按O. 12 g/鸡/天注射；E组为传统"双黄连口服 液"治疗组，按0.1g/鸡/天给药，用药用天。结果表明，采用本发明抗禽 流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法制备的产品对禽流感病毒有着 明显的免疫作用。
实验结果如下:
编号组别死亡率。Z治愈率o^有效率o^
A健康组097. 5(39/40)100.0(40/40)
B阴性对照组55,0(22/40)5.0(2/40)25.0(10/40)
C低剂量治疗组22.5(9/40)42.5(17/40)77. 5(31/40)
D高剂量治疗组10.0(4/40)62. 5(25/40)87.5(35/40)
E"双黄连口服 液"治疗组25.0(10/40)45.0(18/40)75.0(30/40)
结果表明，低剂量治疗组、高剂量治疗组与阴性对照组差异非常显著(p
<0.01)，说明本发明一种抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法 制备的产品对禽流感病毒具有显著的治疗作用；特别是高剂量治疗组应用明显 优于传统"双黄连口服液".治疗组疗效(P<0.01)。
抑菌实验
抑菌实验显示，本发明所生产的产品微克分子浓度能杀死87%以上的革兰 阳性、革兰阴性细菌和真菌。它的抗菌谱广，能抑制葡萄球菌、溶血性链球菌、 大肠杆菌、产气单胞菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、放线菌、分枝杆菌 等十余种近450株分离株，且实验中抑菌圈直径在16mm以上的细菌在87%以 上。半成品和成品的检验
半成品检定半成品进行细菌内毒素、无菌检査、pH值等项检测。 成品检定成品分别作转移因子和抗菌肽的鉴别试验、外观检测、pH值、
多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检査、细菌内毒素、异常毒性等
项检验。
实施例2:
一种抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，步骤-
(1) 免疫
用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗lmL肌肉注射免疫10日龄实验鸡， 同步设立空白对照组，在15日龄再以同批疫苗O. 3mL肌肉注射做为加强免疫;
(2) 密切监测实验鸡体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时， 无菌采取抗凝血，用外周血制备淋巴细胞单层，步骤为-
无菌静脉采取动物全血20毫升，加1%肝素溶液0. 2ml抗凝，静置60分 钟，用带胶球吸管吸取红细胞层以上的所有血浆，特别是紧接红细胞层上的白 细胞层要尽量吸取，分装于消毒离心管内，用PBS(pH为7. 2)液反复洗涤2次， 离心速度1200转/分，然后用含30%犊牛血清水解乳蛋白40毫升进行白细胞 培养，均匀混合后分装于容量100毫升培养方瓶或砖瓶中，塞紧瓶塞，置37 'C恒温箱中或砖瓶机中培养，经2天，白细胞均匀贴壁，即制成淋巴细胞单层。
(3) 对淋巴细胞单层进行传代培养；
在作传代细胞培养前，首先将培养瓶置于显微镜下观察，以确定细胞已长 成单层，即可进行细胞的传代培养。
(4) 当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养。 当脾淋巴传代细胞长成单层后，更换维持液同时加入植物血凝素诱导培养。
转移因子浓度的测定、抗菌肽抑菌实验的方法、半成品和成品的检验项目 均同实施例1。 抗菌肽抑菌实验结果
抑菌实验显示，本发明所生产的产品微克分子浓度能杀死8抓以上的革兰 阳性、革兰阴性细菌和真菌。它的抗菌谱广，能抑制葡萄球菌、溶血性链球菌、 大肠杆菌、产气单胞菌、绿脓杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、放线菌、分枝杆菌 等十余种近450株分离株，且实验中抑菌圈J:径在16mm以上的细菌在84%以上。
实施例3
一种抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，由如下步骤组
成
(1) 用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗0.5 mL肌肉注射免疫10日龄 实验鸡，在15日龄时，再以同批疫苗0.3mL肌肉注射加强免疫；
(2) 密切监测实验鸡体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时， 无菌采取实验鸡脾脏，用脾脏制备淋巴细胞单层；
(3) 对淋巴细胞单层进行传代培养；
(4) 当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养，即获得禽流 感病毒特异性转移因子与抗菌肽。
实施例4
一种抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，由如下步骤组
成
(1) 用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗0. 75 mL肌肉注射免疫10日 龄实验鸡，在15日龄时，再以同批疫苗0.3mL肌肉注射加强免疫；
(2) 密切监测实验鸡体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时， 无菌采取实验鸡抗凝血，用外周血制备淋巴细胞单层；
(3) 对淋巴细胞单层进行传代培养；
(4) 当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养，即获得禽流 感病毒特异性转移因子与抗菌肽。
8
权利要求
1.一种抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，其特征是由如下步骤组成(1)用禽流感病毒H5N1血清亚型灭活疫苗0.25-1mL肌肉注射免疫10日龄实验鸡，在15日龄时，再以同批疫苗0.3mL肌肉注射加强免疫；(2)密切监测实验鸡体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时，无菌采取实验鸡脾脏或抗凝血，用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；(3)对淋巴细胞单层进行传代培养；(4)当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养，即获得抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽。
全文摘要
本发明公开了一种抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽的制备方法，步骤为(1)用禽流感病毒免疫实验鸡；(2)密切监测实验鸡体内疫苗免疫抗体水平，在抗体水平达到高峰值时，无菌采取实验鸡脾脏或抗凝血，用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层；(3)对淋巴细胞单层进行传代培养；(4)当淋巴传代细胞长成单层后，用植物血凝素诱导培养，即获得抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽。本发明的方法制备的抗禽流感病毒特异性转移因子与抗菌肽无需进一步的提纯，可经超声波及冻融简单处理后直接将混合体用在禽类体内，即可起到抗禽流感病毒及抗菌的作用，提高禽类的免疫力。
文档编号C07K14/47GK101684142SQ20081015176
公开日2010年3月31日 申请日期2008年9月25日 优先权日2008年9月25日
发明者王连民, 田杏芳 申请人:天津生机集团股份有限公司