专利名称：共表达人p53基因和人细胞因子基因的重组腺病毒及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗领域。更具体地，本发明涉及一种新的共表达人p53基因和细胞因子(如人白细胞介素2)基因的重组腺病毒，该重组腺病毒的制备方法和用途，以及含有该重组腺病毒的药物组合物。
p53基因被认为是肿瘤抑制基因家族中的主要成员，也是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。人类p53基因定位于人染色体17q13.1，全长16kb-20kb，有11个外显子和10个内含子。p53基因的表达产物为p53蛋白，它是一种磷酸化核蛋白，由393个氨基酸残基组成，相对分子量为53kD。
野生型p53基因在维持细胞正常生长、抑制恶性繁殖中起重要作用。众所周知，环境中的紫外线、放射线和化学物质均可引起DNA的损伤。如果损伤的DNA没有得到修复而继续进行复制并随染色体分离，那么染色体组中将产生大量的突变和染色体畸变，这些突变如果进一步累积将会发展为癌细胞。野生型p53蛋白的作用即是在体内发挥类似“基因卫士”(guardian of genome)的生物学功能，时刻监视着基因组的完整性。一旦细胞DNA遭受损害，p53蛋白即与p21基因上的特异序列结合，活化P21基因的转录，还可与TATA结合蛋白(TATA binding protein，TBP)结合，抑制c-fos、c-jun、Rb、IL-6、PCNA及p53本身的转录，使细胞分裂停滞在G1期节点，同时与RPA(replicationfactor A，复制因子A)相互作用，参与DNA的复制和修复；如果修复失败，p53蛋白又能够启动细胞程序性死亡过程诱导细胞自杀，阻止具有癌变倾向的基因突变细胞产生从而起到防癌作用。1996年发现p53蛋白有时可跨越P21蛋白，直接作用与E2F，促使E2F从Rb蛋白结合的复合物上解离下来，将细胞分裂停滞于G1/S节点处。
p53基因突变是人类肿瘤特别是恶性肿瘤中最为常见的遗传改变，与肿瘤的恶性程度有相当的关联。动物实验表明，不表达正常p53蛋白的小鼠在出生后6～9个月，100％发生肿瘤。大约有50％的人类肿瘤与p53基因突变有关。其中，约70％的结肠癌，50％的肺癌和30％～40％的乳腺癌中含有p53基因的突变，在小细胞肺癌中p53基因突变几乎为100％。这些突变可分为两类；体细胞突变和性细胞突变，其中，体细胞p53基因的突变在肿瘤中极为常见。此外，具有p53基因的突变的肿瘤对放疗和化疗的敏感性差，生存时间短。研究表明，通过导入野生型p53基因，可显著提高这些耐受细胞对放疗和化疗的敏感性。
鉴于p53基因有很强的抑制细胞生长与启动细胞凋亡的能力，p53基因突变与人类肿瘤特别是恶性肿瘤及其恶性程度有如此密切的关系，早在1989年，人们就设想能否给p53缺陷型肿瘤细胞一个野生型p53基因拷贝，从而达到治疗肿瘤的目的。1990年Baker等首先观察到野生型p53导入肿瘤细胞后，肿瘤细胞明显地出现凋亡，Roth等于1993年提出了利用p53等手段治疗非小细胞肺癌的临床方案。嗣后，p53用于各种肿瘤基因治疗的报道越来越多，总结这些报道可以得出p53基因治疗的特点，即毒副作用较小。目前已有多例I/II期临床治疗报告认为，p53基因治疗安全而有效。
大量的有关转染p53基因抑制肿瘤细胞生长，诱导细胞凋亡的体内和体外实验报道，多选用重组腺病毒作为转染载体。其中包括Roth研究组有关重组腺病毒导入野生型p53对头颈肿瘤，人脑胶质瘤细胞的生长抑制(Liu1994Yung 1995)，治疗头颈鳞癌微小残留病灶(Clayman 1995)，腹腔膀胱癌(Werthman 1996；Badie 1995)获得疗效的体内实验报道。程金科等的工作表明，介到p53的重组腺病毒Ad-p53转染人卵巢癌细胞和黑色素瘤细胞可在细胞内表达，并抑制细胞生长70％左右；光学显微镜，流式细胞仪和凋亡细胞原位检测表明p53的导入引起肿瘤细胞的凋亡。SKOV-3细胞裸鼠移植瘤模型瘤内注射Ad-p53，肿瘤生长抑制达76％。Ad-p53对人肺癌细胞系也显示同样作用。近年来研究显示，p53也参与血管形成的调控。研究发现，野生型p53的导入，不仅阻滞肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡，还可通过调节多种基因的转录降低肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)的表达，从而使肿瘤内血管形成受到抑制。Nishizaki(1999)的研究表明，重组腺病毒介导p53(Ad5CMV-p53)导入人非小细胞肺癌A226Br细胞内，36小时可明显抑制血管内皮细胞生长因子VEGF和诱导一种新的血管生成抑制因子BAI1的表达。Western印迹检测同样表明转染48小时后的细胞VEGF蛋白表达下降77％。的Ad-p53转染人p53基因治疗后，肿瘤中血管减少约60％，这个发现解释了p53基因治疗旁观者效应的部分原因。基因在维持细胞正常生长、抑制恶性繁殖中起重要作用。体内实验导入p53基因的方法有多种，常见的有直接瘤内注射，也有经气管、腹腔内动静脉注射等途径。Neilsen(1998)等报道，对腹腔肿瘤移植模型采用腹腔注射Ad-p53，对肺转移癌采用局部输注-静脉注射Ad-p53，结果显示肿瘤负荷明显小于对照组。该结果提示腹腔注射重组腺病毒为临床治疗腹腔癌症提供了一种新途径。总之，野生型p53导入治疗恶性肿瘤的方法备受人们关注，大量的实验从疗效、作用机制、用药方式等方面进行研究，并获得了大量数据，为p53基因临床治疗奠定了基础。
腺病毒因能获得高滴度、感染能力强、靶细胞可以是分裂或非分裂、细胞转染基因不整合进入基因组以及瞬时表达等特点而受到青睐。目前常用的腺病毒载体是一种E1和E3区缺失的复制缺陷型的5型腺病毒载体，用其构建的Ad-p53对正常细胞无毒性，对小鼠无明显毒性，表明其在临床应用中相对安全。作为“基因组卫士”的p53蛋白，有很强的抑制细胞生长与启动细胞凋亡从而稳定细胞基因组的能力。当细胞基因组受到损伤时，p53可使细胞分裂暂停，直到损伤被修复，若损伤不能修复则p53启动细胞自杀程序；细胞内有外源DNA合成(如病毒DNA复制)时，p53也会启动细胞自杀程序。因此，病毒在细胞中的复制必须首先克服p53这一障碍。腺病毒中执行这一功能的主要是E1B-55kD蛋白，E1B-55kD蛋白可与p53蛋白结合，抑制p53正常发挥作用，这一结合是腺病毒复制所必需。基于此，Bischoff等推测，E1B-55KD缺陷型腺病毒将能在p53缺陷的肿瘤细胞中复制，但不能在正常细胞中复制。实验结果支持他们的假设，这就意味着这种E1B缺陷型腺病毒能选择性地在p53缺陷型肿瘤细胞中复制。除了选择性地在p53缺陷型肿瘤细胞中复制从而杀死肿瘤细胞具有治疗肿瘤的价值外，由于重组腺病毒作为载体是目前在肿瘤基因治疗中的首选载体，因此这种能在p53缺陷型肿瘤细胞中选择性复制的E1B缺陷型腺病毒，在肿瘤基因治疗中的应用具有广阔的前景。
尽管腺病毒介导的p53基因治疗在某些肿瘤的临床试验中取得了良好的疗效，但从p53腺病毒治疗肿瘤的机理上，进一步提高其疗效必须是使Ad-p53感染每个肿瘤细胞，而这是目前基因导入系统难以逾越的障碍。另外，Ad-p53的导入，只是抑止肿瘤生长并诱导其调亡，并没有有效地激活机体免疫系统，难以诱导出对机体肿瘤特异性的杀伤活性，这从另一方面影响了p53基因治疗的疗效。
白细胞介素-2(interlukin-2，IL-2)是一种重要的免疫调节因子，在机体的免疫应答中起重要作用，IL-2蛋白的分子量为15-17.2kD，人IL-2含133个氨基酸残基，等电点pI6.8-8.2，有一个链内二硫键(Cys58-Cys105)，Cys125则与IL-2形成二聚体或多聚体有关，二硫键异常配对的IL-2没有活性。人IL-2以单体存在，二级结构有4个反平行α螺旋区。人IL-2有6个α螺旋，N端30个氨基酸残基构成的螺旋A与结合IL-2Rβ链有关。其中Asp20和Leu17高度保守，与IL-2的活性有关。IL-2基因位于染色体4q26-28，长度为3662bp，有3个内含子和4个外显子。外显子1编码5’非翻译区、20个信号肽和前29个氨基酸，外显子2、3分别编码20和48个氨基酸，第四个外显子编码最后36个氨基酸和3’非翻译区。
IL-2通过与多种细胞膜上的受体IL-2R结合，经IL-2Rαβγ转导信号发挥其多种活性。IL-2最重要的作用是诱导T细胞增殖(从G0期进入S期)和分化，同时也具有增强B细胞、NK细胞和单核巨噬细胞的免疫应答在体内抗肿瘤和抗感染免疫中发挥重要作用。研究表明IL-2对T细胞的作用还包括增强CTL的细胞毒活性，增加细胞内pH，诱导c-myz、c-myb和IL-2受体表达，促进细胞移动，增强细胞间的接触和诱导细胞分泌细胞因子(IFN-γ、IL-4、TNF和CFS等)。IL-2能诱导NK细胞增殖，增强NK细胞的活性，诱导LAK细胞和TIL，并刺激它们产生细胞因子。高剂量IL-2能引起单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀肿瘤细胞的作用。IL-2是目前在肿瘤免疫与基因治疗领域疗效最为确实的细胞因子之一。
尽管IL-2的基因治疗取得了较为理想的疗效，但仅限于黑色素瘤、肾癌等免疫原性较高的肿瘤细胞，因此，如何增强IL-2基因治疗的疗效也是目前研究的一个难点。
因此，本领域需要开发新的、更高效的、用于肿瘤基因治疗的药物。
本发明的目的就是提供一种新颖的在临床上施用p53基因和细胞因子(如IL-2)基因治疗的方法和相关制剂，从而克服现有技术中的上述缺点，提高疗效、降低成本、方便使用。
本发明的意义在于，构建了一种共表达人p53基因和人免疫相关细胞因子(如IL-2)基因的重组腺病毒载体，使受感染肿瘤细胞表达p53基因，从而诱导肿瘤细胞的调亡，另一方面IL-2基因转染肿瘤细胞后，可以诱导肿瘤细胞免疫原性的提高，表达IL-2有效激活体内肿瘤特异性的CTL细胞、NK细胞及LAK细胞的活性，同时由于p53基因的导入而调亡的肿瘤细胞可释放出多种肿瘤抗原，在IL-2的参与下，协同诱导肿瘤特异性免疫和非特异性免疫应答。
在本发明的一个方面，提供了一种共表达人p53基因和人细胞因子(如人IL-2)基因的重组腺病毒，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP，并且在E1区位置插入了人p53基因和人细胞因子(如IL-2)基因表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人p53和人细胞因子(如IL-2)基因编码序列，和聚腺苷酸化信号序列。在一个优选实施例中，该腺病毒为Ad5型腺病毒，且所述的人细胞因子包括IL-2、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-3、IL-4、IL-6、TNF。
在另一优选例子中，该人p53基因和人细胞因子(如人IL-2)基因表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且p53编码序列位于IRES之前，人细胞因子(如IL-2)编码序列位于IRES之后。
在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，它包括有效量的表达人p53基因和人细胞因子(如IL-2)基因的重组腺病毒和药学上可接受的载体或赋形剂，其中该重组腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP，并且在E1区位置插入了人p53和人细胞因子(如IL-2)表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人p53基因和人细胞因子(如人IL-2)基因编码序列和聚腺苷酸化信号序列。
在本发明的又一方面，提供一种制备共表达人p53和人细胞因子(如IL-2)的重组腺病毒的方法，该方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人p53基因和人细胞因子(如人IL-2)基因表达盒，其中该表达盒依次包括启动子序列，人p53和人细胞因子(如人IL-2)编码序列，和聚腺苷酸化信号序列；(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；
(d)筛选阳性克隆；(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。
图1.pCIcc真核表达载体的物理图谱；图2.人p53基因和人IL-2基因共表达载体pCI-p53IL20构建流程图；图3.人p53基因和人IL-2基因的融合基因及所编码的氨基酸序列，中间用小写字母表示的是IRES序列；图4.pAx1cw腺病毒载体的结构简图；图5.COS/TPC同源重组法产生人p53-IL-2重组腺病毒的构建示意图；图6.人p53-IL-2重组腺病毒克隆的酶切鉴定分析，其中泳道1为分子量标记物，泳道2为LacZ-293的ClaI酶切产物，泳道3为人p53-IL-2腺病毒克隆的ClaI酶切产物。
图7.人p53-IL-2重组腺病毒体外表达的Western印迹分析，从左至右为泳道1-3。泳道1为分子量标记物，泳道2为LacZ重组腺病毒，泳道3为人p53-IL-2重组腺病毒。
在本发明中，术语“人p53基因编码序列”指天然存在的或人工合成的人p53编码序列。
“人细胞因子基因编码序列”指天然存在的或人工合成的人细胞因子编码序列，人细胞因子的编码序列可以编码各种具有免疫活性的天然的细胞因子，如白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素-12(Interleukin-12，IL-12)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素(IFN)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)，肿瘤坏死因子(TNF)，及其变异形式(例如IL-2的保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体，或其活性片段)。
在本发明中，术语“人p53和人细胞因子表达盒”指含有人p53和人细胞因子(如白细胞介素-2)编码序列以及表达所需元件的序列组件，表达所需的组件包括启动子和聚腺苷酸化信号序列。此外，该表达盒还可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于增强子、分泌信号肽序列等。
以IL-2为例，在本发明中，可以适用于人p53和白细胞介素-2表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，例如巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子等其它适用于真核表达的启动子。
在本发明中，可供使用重组腺病毒可以是任何一种血清型的腺病毒，较佳地，为了防止在制备过程产生亲本的复制型腺病毒，宜采用E1区缺失型腺病毒。更佳地，使用E1区和E3区都缺失的腺病毒。此外，宜采用已研究得较为透彻的腺病毒类型，例如Ad2和Ad5型腺病毒。
下面以IL-2为例，详细描述本发明的可用于临床的复制缺陷型人p53-IL-2重组腺病毒和相关药物组合物(制剂)的制备过程和方法。
1、腺病毒的病毒生物学和分子生物学特性腺病毒是一种无包膜的DNA病毒，病毒颗粒呈正二十面体，直径为80-90nm。腺病毒主要有三种结构蛋白六邻体，构成20面体的表面；五邻体，位于蛋白质外壳中的12个顶角；纤维蛋白，每个五邻体上的一条纤维突起。
腺病毒基因组为双螺旋线性双链DNA，约有36000个碱基对(bp)，在两端结合有55kDa末端肽(Terminal peptide，TP)。传统上将病毒基因组划分100个基因图距单位(mu)，1mu相当360bp。基因组两端各有一个约100bp的末端倒置反向重复DNA序列(ITR)。在基因组左端载有病毒包装信号。基因组分为早期转录区(分为E1-E4)和晚期转录区(分为L1-L5)，每个转录区在病毒生活周期中都起重要作用。此外，还有几个小的中间区和晚期区。
人腺病毒有近50种血清型，其中Ad2和Ad5基因组结构和基因表达的研究较为广泛和深入，现已确定这两型腺病毒的全部核苷酸序列，目前构建的腺病毒载体大多源于这两种血清型。
腺病毒基因组中的E1区，在病毒基因组一进入宿主细胞核中即被激活，从而编码起始因子，调节病毒的早期活动，因此E1区为病毒复制所必需。
E2区编码的蛋白与病毒DNA的复制有关，包括病毒DNA末端结合蛋白(TP)，DNA结合蛋白(DBP)和DNA聚合酶，DBP与转录调控有关。
E3区编码的多肽与病毒逃避宿主抗病毒免疫反应有关，比如，E3编码的一个19kDa糖蛋白，可抑制I类主要组织相容性抗原(MHC)提呈到感染细胞表面，使细胞毒性T淋巴细胞(CTL)不能有效识别和杀伤感染细胞；此外，E3编码的10.4kDa、24.5kDa、14.7kDa蛋白可抑制肿瘤坏死因子α(TNF-α)的细胞毒作用。E3区缺失对腺病毒的感染性无明显影响。
E4区编码产物参与病毒DNA复制、晚区基因表达、病毒蛋白合成和宿主蛋白合成终止等活动。主要晚期基因产物是病毒结构蛋白，而由pIX编码的小结构蛋白，有助于大于34kb的基因组包装。
腺病毒通过经介导吸附和介导内吞的两种不同受体而进入宿主细胞。病毒先通过纤维蛋白与未知的某种受体结合从而吸附到细胞表面。介导病毒内吞入内体(endosomes)的受体已被鉴定为αv整合素(αv integrins)。在内吞过程中，内体的酸化引起病毒外壳蛋白构象改变，从而导致病毒冲破内体进入胞浆，进一步在外壳蛋白的核靶向信号引导下进入细胞核。E1区编码的蛋白质首先上调自身表达和激活其他早期区基因表达，8小时后，病毒DNA开始复制，随后晚期蛋白表达并在感染细胞核中进行子代病毒颗粒的装配。腺病毒可抑制宿主细胞DNA的转录和翻译，而促进自身的蛋白合成。被感染约30-40小时后，宿主细胞溶解，释放出子代病毒颗粒。临床上，腺病毒一般可引起上呼吸道感染、角结膜炎、胃肠炎、肺炎、支气管炎、肝炎和膀胱炎，多数为轻度的自限性疾病。近20年来，腺病毒口服活疫苗已被广泛使用，从使用过的一千多万人的结果来看，疗效显著且无明显的毒副作用。
2、腺病毒载体的特点基因转移技术和导入途径是影响基因治疗效果的重要因素。虽然逆转录病毒载体仍是目前基因转移和基因治疗中应用最广的载体系统，具有稳定整合表达等优点，但它只能感染分裂期的细胞，感染效率较低，一般不能用于体内(in vivo)途径，临床应用中难免受到限制。
腺病毒载体是继逆转录病毒载体后在基因治疗方面应用开发得较早的一种基因载体，由于其本身的特点及载体系统不断改进，近年来在基因治疗中得到日益广泛的应用。腺病毒载体首先应用于纤维囊性变(Cystic Fibrosis，CF)和al抗胰蛋白酶缺陷型肺气肿的基因治疗，现广泛应用于其他疾病的治疗，如嗜血杆菌A和B、Duehene肌营养不良、家族性胆固醇血病、血管成形术后动脉再狭窄、表面活性蛋白B缺乏、红细胞生成素缺陷和各种肿瘤，显示其具有良好的应用前景和开发价值。1995年，美国食品与药品管理局(FDA)批准腺病毒介导的p53基因疗法进入临床，试用于晚期肿瘤病人的治疗，收到显著疗效，且无明显的毒副作用。
腺病毒载体具有以下几个特点①其宿主范围广，感染率高，包括静息细胞和终末细胞；②病毒的滴度高，可达109～1010空斑形成单位(pfu)/ml，由于其理化性质较稳定，可以通过沉积、柱层析或超离心纯化获得高滴度病毒载体；③腺病毒无胞膜，对补体介导的灭活作用不敏感，体内更稳定；④目前应用的腺病毒载体多为Ad2和Ad5，对啮齿动物无致瘤性，临床上通常仅引起轻度的上呼吸道反应，甚至对于免疫抑制病人亦如此；⑤腺病毒通常不整合入宿主细胞基因组内，适用于基因的短期表达，理论上讲就不会引起宿主细胞的插入突变，比逆转录病毒更为安全。
3、腺病毒载体的构建策略目前的腺病毒载体大多来源于腺病毒Ad2和Ad5这两种血清型。适用于基因治疗应用的腺病毒载体属于复制缺陷型病毒。由于E1编码的蛋白功能是其他所有腺病毒基因有效表达所必须的，因此最常见的策略就是用外源DNA替代病毒E1区序列，通过包装细胞反式提供E1区序列而产生的复制缺陷腺病毒载体。
可用于本发明的宿主包装细胞是可以表达腺病毒E1区基因的任何宿主细胞，因为该细胞能够提供复制缺陷型腺病毒复制所需的E1区基因表达产物。一种优选的常用包装细胞是293细胞，该细胞由人胚肾细胞经Ad5腺病毒DNA片段转化而成，载有整合入细胞基因组的腺病毒E1区等病毒基因片段，并持续表达E1区蛋白，能为E1区置换型腺病毒载体提供反式补偿。
利用E3区缺失不影响病毒感染性，切去E3区可增加载体外源性DNA容量。切去E1和E3区，外源基因插入容量可达约8kb。而克隆更大的外源DNA片段则需切去其他的病毒序列，缺失的功能再通过互补细胞系或辅助病毒反式提供。
本发明的重组腺病毒的方法可以用多种方法产生，其中主要有以下四种共转染入互补细胞系通过体内同源重组而产生重组腺病毒的方法更为常用，更佳地是用COS/TPC共转染同源重组法产生的。
(1).细胞外病毒DNA直接连接法(也称Stow方法)此法是选d1309腺病毒基因组在3.7mu(E1区内)的XbaI限制内切酶点，切断和分离3.7-100mu病毒基因组大片段(称XbaI片段)，然后将载有外源DNA的腺病毒基因组的最左端0-1.3mu，用连接酶连到XbaI大片段上。连接产物可用于转染293细胞以制备重组腺病毒。
(2).细胞内病毒DNA同源性重组与Stow方法很类似，将载有外源DNA的腺病毒基因左端0-1.3/9.8-16mu片段与XbaI大片段同时转染到293细胞内，通过同源性重组来制备病毒载体。
(3).细胞内质粒DNA同源重组此法利用质粒的形式，将腺病毒基因组DNA的倒置末端相连形成环状，能在细菌内复制，从而简化了XbaI大片段的制备手续。环状腺病毒DNA由于细菌质粒插入其总基因组长度超过包装限度，在细胞内不会被包装成病毒颗粒，仅提供病毒DNA同源重组的所需片段。构建E1替代型腺病毒载体时，首先将外源DNA插入细菌质粒(如pΔElsp1A)中，该质粒含腺病毒基因组左端序列(包括ITR、包装信号和部分缺失的E1区)。含外源DNA的穿梭质粒与含腺病毒基因组其余序列的DNA共转染293细胞，通过体内的同源重组产生重组腺病毒。这种含其余序列、用于同源重组的腺病毒基因组DNA可有不同的形式，或是通过体外经限制性内切酶消化无感染性的病毒DNA，或者来源于重组质粒pJM17或pBHG系列质粒。该方法目前较为常用，但缺点是重组效率还不构理想。
(4).COS/TPC共转染同源重组腺病毒DNA的两端各共价结合有一个55kDa的末端肽(Terminal peptide，TP)，结合有末端肽的腺病毒DNA导入允许细胞后产生的空斑数是裸腺病毒DNA的100倍以上(Horwitz M.FundamentalVirolgy，2nd edition，edited by Fields B et al.Raven Press，Ltd.NewYork，1991；771)，表明TP的存在对腺病毒DNA的感染能力有着重要的影响。传统的重组腺病毒制备方法中常用蛋白酶将腺病毒DNA的末端肽切除，Miyake等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1996，931320)首先采用含有TP的腺病毒DNA-TP复合物(TPC)进行同源重组，建立了COS/TPC同源重组法制备重组腺病毒，并且证明该法的重组效率可提高近百倍，而且几乎不产生亲代病毒。在该方法中，首先构建了一种含Ad5基因组(其E1或E4区含克隆位点)的E1区替代型粘粒(粘粒)载体，将含外源基因的表达单元(expression cassette)克隆入粘粒腺病毒基因组。然后将其与腺病毒DNA-TP复合物共转染293细胞，其中腺病毒DNA-TPC事先用限制性内切酶消化以减少其感染性，在粘粒和腺病毒DNA重叠序列间进行同源重组而产生重组腺病毒。用EcoT 22I消化DNA-TPC(E3区缺失的腺病毒DNA有7个EcoT22I位点)时，重组发生在最右侧EcoT22I以右的腺病毒DNA和粘粒载体中的同源部分，同源长度达23.2kb，而传统的细胞内质粒DNA同源重组方案是同腺病毒DNA中XhoI酶切后的左末端重组，同源长度仅2.2kb，可发生重组的同源片段长度的增加无疑提高了重组效率。
在构建共表达载体时通常可采用以下3种策略其一是用RNA剪接信号将两目的基因连接，同一启动子转录的一个mRNA前体分子经剪接加工形成两个成熟的mRNA分子，如逆转录病毒载体中将目的基因之一替代env序列，虽能实现共表达，但剪接效率受其上下游序列的影响，较难控制；其二运用内部启动子，使两个编码基因受不同启动子控制，转录合成两个独立的mRNA分子，其缺点是由于启动子之间的相互竞争干扰，往往难以使两个目的基因都得到有效表达；其三是运用mRNA 5’端非编码序列中的内部核糖体结合位点(IRES)，在一个mRNA分子上进行两种不同机制的蛋白转译，产生两种蛋白(Ghattas et al.Mol Cell Biol.991，115848)。目前该策略曾经应用于逆转录病毒共表达载体的构建(IRES载体，Morgan R，et al.Nucl Acids Res，1992，201293)，但是由于逆转录病毒载体感染效率较低，不适合in vivo途径直接体内应用，且稳定整合于宿主基因组中，表达持续时间长，应用于免疫基因治疗存在明显不足。
在本发明的一个实施例中，应用COS/TPC同源重组法来制备本发明的重组腺病毒，具体如下首先通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆人p53和IL-2的全长编码cDNA，并与IRES相连，将融合后的基因置于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制之下，插入E1区替代的腺病毒载体pAx1cw，通过与经EcoT22I酶切、结合末端肽的Ad5腺病毒DNA在293细胞中的同源重组获得共表达人p53基因和人IL-2基因的复制缺陷性重组腺病毒，滴度达9.5×1010pfu/ml；并证明了所制备的共表达人p53基因和人IL-2基因重组腺病毒体外能有效表达具有生物学活性的人IL-2和p53蛋白。
此外，考虑到亲本病毒产生的主要原因是最左端的两个EcoT22I片段发生意外的连接，因此DNA-TPC中存在E1区可能会增加产生亲本病毒的机率。为此，在本发明的一个优选实施例中选用了E1和E3区都缺失的DNA-TPC，从而进一步降低(消除)了产生亲本病毒的可能性，保证了制备的重组腺病毒是缺少E1和E3区的复制缺陷型，并可安全地应用于临床治疗。
在制得本发明的共表达人p53基因和人IL-2基因重组腺病毒之后，就可以将所需纯度的重组腺病毒与任选的生理上可接受的载体、赋形剂、或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，16版，Osol，A.，Ed.，)，以冻干形式或水溶液形式进行混合，可以制得本发明的重组腺病毒的治疗制剂。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者而言在所用的剂量和浓度下应是无毒的，并且可含有缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸缓冲液；抗氧化剂如维生素C；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物如葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；形成盐的反荷离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如Tween、Pluronics或聚乙二醇(PEG)。作为最常见的例子，水和生理盐水就可作为本发明重组腺病毒制剂中的载体。
本发明制备的共表达人p53基因和人IL-2基因复制缺陷型重组腺病毒具有巨大的应用价值和优势，主要体现在以下几方面(1).通过瘤体内直接注射p53-IL-2重组腺病毒等体内途径直接导入体内，用于肿瘤、感染等疾病的治疗，较单纯使用p53腺病毒或单纯使用IL-2腺病毒具有更好的疗效，不仅可以诱导肿瘤细胞的调亡，同时可以增强肿瘤细胞的免疫原性，诱导肿瘤特异性和非特异性免疫应答。
(2)体外感染肿瘤细胞，制备人p53基因和人IL-2基因转染的肿瘤瘤苗，进行肿瘤的主动免疫治疗，肿瘤细胞可来源于肿瘤患者的新鲜瘤体标本或肿瘤细胞株。
(3).作为细胞因子或佐剂一起注射，与DNA疫苗或其他疫苗联合进行免疫接种，以增强免疫效果。
(4)治疗成本低，比直接注射IL-2等细胞因子进行治疗低至少50％，较佳地可低至少80％。可有效地进行局部施用，从而大大降低了施用IL-2时的毒性。
(5)减少注射次数和注射量，可以减少注射腺病毒量至少50％，从而减少了进行注射治疗的痛苦，并便于使用。
(6)具有更明显的“旁观者效应”，诱导机体免疫杀伤未感染病毒的肿瘤细胞。
(7)通过感染细胞而在细胞内较长时期地局部表达IL-2，与生理条件下生物体局部分泌IL-2的情况更为接近，从而可高效和长期地发挥IL-2的功效。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，比如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1.人p53 cDNA的克隆收集外周血白细胞，异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，AMV逆转录酶合成第一链，以其为模板分别进行人p53 cDNA的PCR扩增p53引物上游引物5’atctagaggtcactgcc ATG GAG GAG CCG CAG 3’下游引物5’gggatccggggaacaagaagtggagaatg 3’p53的PCR产物的预计大小为1.2kbp，PCR反应体积为50μl，引物浓度为0.4μM，扩增参数为94℃ 1’、60℃ 1’、72℃ 2’，20个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经酶切后，克隆至pGEM-3Z(Promega)载体，进行全自动测序，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，阳性克隆经全自动测序(ABI373，PE公司)分析，结果表明克隆到的人p53的cDNA与报道一致，包括完整的编码序列。
实施例2 人IL-2 cDNA的克隆分离健康人外周血淋巴细胞，经ConA刺激后异硫氰酸胍一步法抽提总RNA，AMV逆转录酶合成第一链，以其为模板分别进行人p53 cDNA的PCR扩增IL-2 物上游引物5’GAATTCGCTAGCTACCATGTACAGGATGCAACTCCT 3’下游引物5’GAATTCATCAAGTCAGTGTTGAGAT GATGC 3’IL-2的PCR产物的预计大小为485bp，PCR反应体积为50μl，引物浓度为0.4μM，扩增参数为94℃ 1’、50℃ 1’、72℃ 2’，20个循环后产物行2％琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物经酶切后，克隆至pBluescript II-SK(美国Stratagene公司)进行全自动测序，连接产物转化大肠杆菌DH5α(Stratagene公司)，阳性克隆经全自动测序(ABI373，PE公司)分析，结果表明克隆到的人IL-2的cDNA与报道一致，包括完整的编码序列。
实施例3.pCIcc载体的改建为将人p53和人IL-2 cDNA置于CMV启动子的控制之下，选用了pCIcc载体。pCIcc载体系由真核表达载体pCI(Promega公司)改建而来。pCI载体含有CMV启动子/增强子和SV40 polyA， 在CMV启动子与目的基因克隆位点之间含有β珠蛋白的内含子，有助于提高目的基因表达水平。在pCI载体的SV40polyA下游有一个单一的ClaI位点，改建目的是在CMV启动子上游再产生一个新的ClaI位点，便于将表达单元克隆至腺病毒载体的ClaI位点。改建的过程为，将pCI载体进行BglII酶切、T4 DNA聚合酶(BioLab公司)补平后，用T4 DNA连接酶(BioLab公司)连接，这样就使原来的BglII位点失活，产生一个新的ClaI位点(图1)。连接产物转化大肠杆菌MC1061(美国ATCC公司)，筛选阳性重组子pCIcc。
实施例4.人p53和人IL-2 cDNA的融合及人p53-IL-2腺病毒载体的构建在该实施例中，将人p53和IL-2 cDNA加以融合，然后克隆至真核表达载体pCIcc，构建流程见图2。
采用PstI从pIRES1neo载体(Clontech公司)切下IRES片段，插入pBlueScript SK载体；得到pKS-IRES，将XbaI/BamHI酶切的cDNA片段插入pKS-IRES，得到pKS-p53IRES，将RI酶切的人IL-2cDNA插入pKS-p53IRES，得到pKS-p53IREShIL2，采用BamHI/NheI酶切鉴定插入方向，再用XbaI鉴定；采用NotI/EcoRV酶切得到p53IREShIL2片段，补平后于SmaI位点插入pCIcc载体，得到重组载体pCI-p53IL2，融合基因p53-IRES-IL-2的序列见图3，pCI-p53IL2重组载体中，人p53和人IL-2的cDNA由IRES连接，其转录受CMV启动子的控制，后接SV40 polyA信号肽序列，p53和IL-2的蛋白合成分别受帽子依赖性和非依赖性机制控制指导。
所采用的腺病毒载体pAx1cw购自日本Takara公司。pAx1cw系E1区替代的cosmid载体，携带E1区(mu 1.3-9.3)和E3区(mu 79.6-84.8)缺失的Ad5腺病毒基因组DNA，在缺失的E1区插入了ClaI-SwaI-ClaI-SalI-NruI连接子，其中含有SwaI和ClaI两个供外源基因插入的克隆位点(图4)。将含人p53和IL-2表达盒(表达单元)的ClaI片段(4.7kbp)与经去磷酸化的pAx1cw载体ClaI大片段于14℃连接过夜，同时挑DH5a菌落于含0.2％麦芽糖的5ml LB培养基中，振荡过夜，离心收集菌体重悬于2.5ml TM缓冲液(10mM Tris.HCl(pH7.5)，10mM MgSO4)中备用。12.5ml的连接反应液与噬菌体包装蛋白(Strategene公司)混合，室温孵育90分钟，加入100ml TM缓冲液。取DNA溶液和DH5a菌各50ml混合，室温孵育15分钟后，加入1ml氨苄阴性LB培养基，37℃振荡30分钟，取10～100ml涂布于Amp阳性LB平板，37℃过夜。挑取阳性转化子，碱裂法小量制备DNA，酶切分析阳性重组子，重组腺病毒载体记为pAx1cw.CIp53IL2。
用高浓度肉汤TB培养基500～1000ml大量扩增阳性克隆菌，碱裂法抽提粘粒DNA，溶于4ml TE中，加入44.4g CsCl(购自美国Gibco公司)、0.4ml溴化乙锭(10mg/ml)混合，置5ml离心管(Beckman)梯度离心(VTi65.1转头，55,000rpm，20℃，16h)，收集超螺旋条带，用等体积Butanol(Sigma)抽提4～6遍，4℃下用TE透析过夜，或直接加入3倍体积无菌去离子水、8倍体积无水乙醇，于4℃沉淀DNA(3～5小时)，干燥后DNA溶于无菌TE，用分光光度计检测其浓度和纯度。
实施例5.腺病毒DNA-TPC的制备收集经E1和E3区缺失的Ad5腺病毒(序列早已公开)感染的293细胞(表达腺病毒E1A、E1B蛋白的人胚肾细胞株293细胞(ATCC CRL-1573))，超声破碎后，离心去除细胞碎片，病毒上清经CsCl梯度离心(25,000rpm，4℃，2h)，浓缩的病毒液进行第二次CsCl梯度离心(35,000rpm，4℃，3h)，收集病毒液，对含10％甘油的PBS缓冲液透析过夜。透析后的病毒液加入等体积8M盐酸胍(pH7.4)破碎病毒，经CsCl梯度离心(55,000rpm，20℃，16h)纯化Ad5 DNA，所纯化的Ad5 DNA末端带有共价结合的末端肽，经EcoT22I(购自Biolab公司)酶切后分装备用。
实施例6.COS-TPC共转染pAx1cw.Cip53IL2与Ad5 DNA-TPC经磷酸钙DNA共沉淀法共转染293细胞，经同源重组产生人p53-IL-2重组腺病毒(图5)。转染前一天，待转染的293细胞更换新鲜培养基。于500μl体积中将40μg pAx1cw.CIp53IL2与0.5μg Ad5DNA-TPC、CaCl2(终浓度为0.25M)混合后，加入500μl的2×BBS缓冲液(50mM BES(N，N-bis(2-hydroxyethl)-2-aminoethane-sulfonic acid)，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4(pH6.95))，混合后置室温作用10～20分钟，逐滴加入293细胞，置37℃、5％CO2培养12～24小时。将共转染的293细胞与未经转染的293细胞按1∶1、1∶10和1∶100等不同比例混合，分别接种至96孔培养板(100μl/孔)，此后的第4天和第8天各补加DMEM培养基(50μl/孔)。于共转染后的第12-14天，从3块96孔板的共转染细胞克隆中陆续得到246个细胞病变死亡的克隆；收集阳性克隆孔的细胞及其培养液，超声破碎后的病毒上清为第一代种子病毒(1st seed)，于-80℃保存。
第一代种子病毒用病毒上清(10μl/孔)感染24孔培养板中的293细胞，每个克隆设2个复孔；3～4天收集一个复孔的细胞行细胞基因组DNA的酶切分析，对其中7个克隆进行了酶切鉴定，全部为阳性重组克隆(图6)。另一复孔中的细胞经超声破碎后收集病毒上清，为第二代种子病毒(2nd seed)，留作扩增用。
实施例7.人p53-IL-2重组腺病毒Ad.p53-IL-2的制备、扩增与滴度检测酶切鉴定正确的重组克隆的第二代种子病毒上清(2nd seed)，用于感染293细胞扩增病毒，3～4天后，超声破碎细胞，离心去除细胞碎片，病毒上清经CsCl梯度离心(25,000rpm，4℃，2h)，浓缩的病毒液进行第二次CsCl梯度离心(35,000rpm，4℃，3h)纯化，最后将收集病毒液对含10％甘油的PBS缓冲液透析过夜，过滤除菌后分装，速冻保存于-80℃。
以293细胞为靶细胞、用微量细胞病变法检测病毒滴度。96孔板中先加入50ml培养液/孔，前8孔加入25ml经104稀释的病毒液，开始行3倍的倍比稀释，共11个稀释度，每一稀释度设8复孔，每孔加50μl 293细胞，FCS的终度为5％，同时设细胞对照，此后第4天和第8天分别补加50μl含10％FCS的DMEM培养基，12～14天后判定结果。对其中的一个阳性克隆进行扩增，所制备的人p53-IL-2重组腺病毒，记为Ad.p53-IL-2，滴度为9.5×1010pfu/ml。收获后的重组腺病毒用注射用水稀释、分装成5×1010pfu/ml，保存于-80℃。
该腺病毒被命名为“共表达人p53基因和人白细胞介素2基因的重组5型腺病毒Ad.p53-IL-2”，并于2001年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国，武汉，保藏编号为CCTCC No.V200101。
实施例8.人p53-IL-2重组腺病毒Ad.p53-IL-2的体外表达对数生长期的肝癌细胞HepG2(购自美国ATCC公司)或人皮肝成纤维细胞弃培养液后，按100∶1的重复感染度(Multiplicity of Infection，MOI)加入人p53-IL-2的重组腺病毒，1小时后加入培养液，培养48小时后，收集培养上清。检测人p53-IL-2重组腺病毒Ad.p53-IL-2的体外表达IL-2。
人p53表达的检测，采用Western-blot方法，将Ad.p53-IL-2感染H1299细胞，采用Ad-LacZ病毒作为对照，感染24小时后，收集细胞，裂解后行SDS-PAGE，转膜，封闭，采用抗人p53作为一抗，HRP标记的牛抗羊作为二抗，作用后用X射线片曝光，如图7所示，Ad.p53-IL-2感染H1299细胞检测到p53的表达。
人IL-2的生物学活性检测采用CTLL细胞株，采用3H-TdR法检测，以hIL-2标准品作为对照。野生型及转染LacZ基因的细胞不分泌人IL-2，而感染人p53-IL-2腺病毒后分别不同程度地表达人IL-2(表1)。
表1.感染Ad.p53-IL-2重组腺病毒的细胞表达IL-2水平感染细胞 不同MOI值IL-2的表达水平(U/106细胞/24h)0 50 100 200HepG2 0 798±33.9 1636±137.3 2859±239.3皮肤成纤维细胞0 681±82.4 1299±104.4 2678±262.5实施例9.重组腺病毒Ad.p53-IL-2的体内抗肿瘤作用将小鼠乳腺癌细胞接种于小鼠皮下，随机分为6组，3天后，每组小鼠分别注射(1)生理盐水；(2)表达LacZ的腺病毒Ad.LacZ 1×109PFU；(3)单纯表达野生型p53的重组腺病毒Ad.p53 1×109PFU；(4)单纯表达IL-2的重组腺病毒Ad.IL-21×109PFU，(5)共表达p53和IL-2的重组腺病毒Ad.p53-IL-21×109PFU，(6)联合注射Ad.p53 5×108PFU及Ad.IL-25×108PFU，观察肿瘤的生长速度，于治疗后2周。测量肿瘤大小，检测小鼠脾淋巴细胞对小鼠乳腺癌细胞特异性的杀伤活性，并观察荷瘤小鼠的生存期。结果表明(见表2)，Ad.p53-IL-2组肿瘤的生长速度明显较其它对照组慢，第14天肿瘤大小明显小于其它组，生存期明显延长，50％的小鼠未形成肿瘤而长期存活，另外CTL活性的检测结果表明，Ad.p53-IL-2组脾淋巴细胞检测出针对细胞较强的杀伤活性，而对照组均未检出明显CTL活性。
表2.Ad.p53-IL-2小鼠体内抗肿瘤作用
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种共表达人p53基因和人细胞因子的重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒的基因组缺失E1区和E3区，且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP，并且在E1区位置插入了人p53基因和人白细胞介素2基因表达盒，该表达盒依次包括启动子序列，人p53以及人白细胞介素2和多聚腺苷酸化信号序列。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，人p53基因和人细胞因子表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且p53编码序列位于IRES之前，而人细胞因子编码序列位于IRES之后，所述的细胞因子选自下组IL-2、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-3、IL-4、IL-6、TNF。
3.如权利要求1或2所述重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒为Ad5型腺病毒，所述的细胞因子是人白细胞介素2。
4.如权利要求1或2所述的重组腺病毒，其特征在于，人p53基因和人细胞因子表达盒中所含的启动子序列选自巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子。
5.如权利要求4所述的重组腺病毒，其特征在于，该腺病毒是表达人p53基因和人白细胞介素2基因的重组5型腺病毒Ad.p53-IL-2，CCTCC No.V200101。
6.一种药物组合物，其特征在于，它包括有效量的权利要求1所述的共表达人p53基因和人细胞因子基因的重组腺病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该重组腺病毒为Ad5型腺病毒，所述的细胞因子包括人白细胞介素2，且该人p53基因和人细胞因子基因表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且p53编码序列位于IRES之前，而人白细胞介素2基因编码序列位于IRES之后。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，该腺病毒是表达人p53基因和人白细胞介素2基因的重组5型腺病毒Ad.p53-IL-2，CCTCC No.V200101。
9.一种制备共表达人p53基因和人细胞因子基因的重组腺病毒的方法，其特征在于，该方法包括(a)提供腺病毒DNA-TP复合物，在该腺病毒DNA基因组缺失E1区和E3区，并且在腺病毒基因组DNA的两端结合有末端肽TP；(b)提供含腺病毒基因组的粘粒载体，在该粘粒载体中的腺病毒基因组缺失了E1区和E3区，并且在E1区位置插入了人p53基因和人细胞因子基因表达盒，其中该表达盒依次包括启动子序列，人p53基因和人细胞因子基因编码序列，和聚腺苷酸化信号序列；(c)将步骤(a)中的腺病毒DNA-TP复合物和步骤(b)中的粘粒载体共转染表达E1区基因的宿主细胞；(d)筛选阳性克隆；(e)从阳性克隆中分离纯化重组腺病毒。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中共转染方法是磷酸钙DNA共沉淀转染法，该宿主细胞是293细胞，而且人p53基因和人细胞因子基因表达盒中所含的启动子序列选自巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子，且该人p53基因和人细胞因子基因表达盒中还含有内部核糖体结合位点IRES，而且人p53基因编码序列位于IRES之前，而人细胞因子基因编码序列位于IRES之后，且所述的细胞因子选自下组IL-2、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-3、IL-4、IL-6、TNF。
全文摘要
本发明提供了一种新的共表达人p53基因和人细胞因子(如白细胞介素2)基因的重组腺病毒、该重组腺病毒的制备方法和用途、以及含有该重组腺病毒的药物组合物。将这种新的重组腺病毒用于临床,具有成本低、使用方便、效率高等优点,尤其适用于结肠癌、肺癌、乳腺癌等癌症的治疗。
文档编号A61P35/00GK1380392SQ01105969
公开日2002年11月20日 申请日期2001年4月12日 优先权日2001年4月12日
发明者王建莉 申请人:上海华康生物技术有限公司