专利名称：水蛭素口服缓(控)释剂型的制作方法
本专利涉及一种水蛭素的口服缓(控)释新剂型的设计及制备工艺。
水蛭素(Himdin)是由环节动物门蛭纲医蛭属(Himdomedicinalis)水蛭唾液腺分泌的一种小分子蛋白质，是迄今所知天然存在的最强的凝血酶抑制剂。由于水蛭素能直接有效地抑制凝血酶活性，它被认为是一种有望成为用于防治心脑血管疾病的新药。但天然水蛭素来源有限而且产量太少，所以近年来利用基因工程合成重组水蛭素得到广泛的重视。目前为止，人们已经从大肠杆菌和酵母表达系统中得到了具有生物活性的重组水蛭素。
水蛭素是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽，是一种由多种异型体组成的“家族”。异型体间高度的同源性，仅有几个氨基酸残基的差异，平均分子量为7,000D。氨基酸序列分析表明，水蛭素分子中含Arg，Met，Trp富含Glu，Asp，Gln，Asn。其C端富含Glu，Asp，形成酸性末端；Tyr63被硫酸化；肽中部有Pro46-Lys47-Pro48特异序列片段，不易被一般蛋白酶水解，且在与凝血酶作用中发挥重要作用。重组水蛭素Tyr63未被硫酸化，活性比天然水蛭素稍低。根据动物实验和临床研究报告，水蛭素在生物体内有多种生物功能它能够高效抗凝血，抗血栓形成，阻止凝血酶催化的凝血因子活化和血小板聚集反应，抑制凝血酶诱导的多种细胞增殖。根据与其它抗凝药物对比实验，结果表明水蛭素抗凝效果远远强于其他常规抗凝药物，如肝素、阿司匹林、柠檬酸三钠等。水蛭素和肝素比较，抗凝效果水蛭素比肝素强几百倍，且用量少得多。
国内外已经有较多的水蛭素类药物应用于临床上对心脑血管疾病的治疗。国内仅有一些以水蛭素为主要成分的中成药制品，如重庆多泰制药公司生产的“脉血康”等。它们都是以水蛭直接入药制成胃肠道直接释解给药方式的胶囊等口服制剂。国外已经有好几家基因工程重组水蛭素类药物进入临床或上市销售，如德国的Hoest Marion公司的Leprudin、美国HMR公司的水蛭素、欧洲Novartis公司的水蛭素等，但他们在剂型设计上都是肌肉注射或静脉滴定。
本专利针对水蛭素在临床应用上的一些特点，发明了对大多数慢性高凝状态患者长期抗凝治疗相适应的水蛭素口服缓(控)释新制剂。口服缓(控)释制剂是指口服药物在胃肠道中按设计要求缓慢非恒速(或恒速)释放，每日用药次数与响应普通制剂比较至少减少一次或用药时间间隔有所延长的制剂。理想的缓(控)释制剂应该是这样药物迅速在作用部位(受体)达到理想的有效浓度，并维持该浓度适当的时间，在机体其它部位则无药物分布或药物浓度仅在最低浓度范围，一旦达到治疗目的，药物立即从作用部位消除。为达到此目的，须根据药物动力学原理，对缓(控)释制剂的释药速度，速释和缓释部分的剂量比例加以合理的设计、计算，使制剂具有长久的、平衡的血药浓度。
本专利所涉及缓释制剂的工艺原理主要基于使主药溶解度减少和使主药扩散速度减慢。1.减少溶出度为主要原理的工艺。
1-1.在保持水蛭素活性的前提下，修饰成溶解度小的盐或脂。
1-2.在保持水蛭素活性的前提下，将水蛭素与某些大分子载体通过共价键结合，可以得到具有缓释功能的水蛭素释放系统。
1-3.药物的表面积与药物的溶出速度有关，增大药物粒子的表面积可以减缓药物的释放。
1-4.将水蛭素包藏于溶蚀性骨架中，即用脂肪、蜡、氢化植物油、硬脂酸丁脂等主要基质制成缓释片。水蛭素溶于或混悬于这些热的基质中，冷后粉碎成粉末或小粒，装在胶囊中或制成片剂，其中脂肪酸酯被水解难易程度决定释放速度。
1-5.将水蛭素包藏于亲水性胶体物质中。即以亲水性胶体为骨架，加入乳糖等稀释剂，制成片剂在胃肠道溶液中，药片逐渐吸水膨胀，水蛭素逐渐扩散到表面而溶于胃肠液中。常用的亲水性胶体用甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基淀粉、PVP、卡波普等。2.减小扩散系数为主要原理的工艺2-1.包衣。这是制备缓释制剂的主要方法，即将含水蛭素的小丸或片剂用包衣阻滞材料包衣。包衣阻滞材料可分为两类肠溶材料和阻滞剂。
2-1-1.肠溶材料包衣。用邻苯二甲酸醋酸纤维素(CAP)、EudragitL、EudragitS、聚乙烯醚/马来酸酐半脂等肠溶材料包衣包被在水蛭素主药表面上，这些材料可以抵抗胃酸的作用而在肠液中却可以溶解。
2-1-2.阻滞剂包衣。用虫胶等疏水性高分子物质与水蛭素主药混合制粒压片或者用赋形剂制备成小丸，在包衣锅内撒入水蛭素药物细粉，成为药物衣小丸，然后再用阻滞剂包衣。
2-2.使用微囊技术制备缓(控)释制剂是较新的方法。微囊膜为半透膜，在胃肠道中，水分可以渗透进入囊内，溶解囊内水蛭素药物，形成饱和溶液，然后扩散于囊外的消化液中而被机体吸收，释放速度由囊厚度、微孔孔径、微孔弯曲度等因素决定。
2-3.制备成不溶性骨架片剂。把水蛭素主药与不溶性塑料(无毒聚氯乙烯、聚乙烯、聚乙烯乙酸酯、聚甲基丙烯酸酯、硅橡胶等)混匀，加入塑料的有机溶剂溶液润湿、拌匀，制备成软材，制粒。药物的溶解度、骨架的孔率、孔径和孔的弯曲度影响释放药物的速度。
2-4.如制剂为液体剂型，可以加入明胶、PVP等增加溶液粘度以延长药物作用时间。
2-5.如制剂为液体剂型，可以制备成水/油型乳剂，在体内有长效作用。
实例说明I酵母表达系统的构建水蛭素基因经化学合成三段DNA，应用递归PCR法连成全长基因序列，序列以日本医蛭唾液腺水蛭素HV2为基础，将编码47位Asn序列改为编码Lys的序列。选用酵母编好密码子，以分泌型表达载体构建重组质粒，经过多次筛选后得到了可高效表达重组水蛭素的Pichia酵母菌种。Pichia酵母分泌型表达系统通过甲醇诱导水蛭素的高效表达，在经72小时的发酵后，每升发酵液可获得重组水蛭素1.5g。经过离心、超滤后分泌液中的水蛭素浓度可提高10倍。以离心交换和反相高效液相纯化后，水蛭素纯度大于95％，比活力在11000ATU/mg左右，收率大于60％。热原含量小于2EU/mg蛋白。纯化水蛭素经过8M尿素SDS-PAGE电泳测定其分子量为7000道尔顿左右，与理论值相符；聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳显示其等电点为3.5～4.0之间，符合理论值；N-末端15个氨基酸序列分析证明其序列完全正确，氨基酸组份分析、肽图、HPLC等分析也与设计值一致，并且其抑制凝血酶的比活力较高，均提示重组水蛭素的结构和理化性质的正确性。实例说明II缓释措施的建立国外(Hoechst公司)的水蛭素剂型为冻干粉剂，静脉滴注。基于水蛭素分子量小，可被肠中蛋白酶水解等特点，针对大多数慢性高凝状态患者长期抗凝治疗的需要，本研究为了达到应用水蛭素方便、有效并可长期预防凝血、血栓的效果，采用了独特的口服剂型。首先，研究了普通的口服肠溶胶囊剂型，进行大鼠体内动物实验，发现血液凝血指标有明显改善，不过所需的剂量较大，这可能是水蛭素体内半衰期相对短的缘故。为此，改用缓释有保护肠衣的肠溶胶囊，其释放时间约在10-12小时左右，可大大提高药物的利用效率。水蛭素经冻干后，用肠溶材料包被在水蛭素主药表面上，可以抵抗胃酸的作用而在肠液中得以溶解。实例说明III动物实验结果按照卫生部抗凝血药物的动物实验要求和国内外相应文献，我们进行重组水蛭素的体内动物药效初步实验(委托华西医科大学药理教研室完成)。口服重组水蛭素给药剂量分别为100和400ATU/kg，3天后7天内血液的抗凝指标明显改善，给药组动物的静脉血栓形成大大减少，并且药效与剂量正相关。急性毒性实验以昆明小鼠为实验材料，发现口服剂量为10mg/kg时是安全的。实验证明其安全性和有效性，口服新型重组水蛭素剂型胃肠利用度佳，稳定性好，口服后体内抗凝抗栓作用明显。
权利要求
1.一种以天然水蛭素或基因工程重组水蛭素为主药，辅以必要的辅料，经过缓(控)释制剂工艺所得的具有缓(控)释作用的口服水蛭素缓(控)释剂型。
2.条款1中所述天然水蛭素包括从环节动物门蛭纲所有能分泌水蛭素的水蛭中所提取的水蛭素；该水蛭素可以是纯品，也可以是以该水蛭素为必要或主要成分的一定纯度的混合物。
3.条款1中所述的重组水蛭素包括各种水蛭素的变异型和突变型，其表达宿主包括细菌，酵母，哺乳动物细胞系，昆虫细胞系及动植物。
4.条款1中所述必要的辅料包括以下方面4.1.油脂性渗入剂。如单硬脂酸甘油脂、氢化蓖麻油、矿油、聚硅氧烷、二甲基聚硅氧烷等。4.2.亲水胶体。如纤维素衍生物(CMC-Na，HPC，HPMC)，PVP，阿拉伯胶，海藻酸钠，卡波谱等。4.3.包衣阻滞剂。如EC，HPMC，PVP，CAP，丙烯树脂。4.4.PVA(聚乙烯醇)。4.5.EVA(乙烯-醋酸乙烯共聚物)。4.6.聚丙烯。4.7.聚乳酸。4.8.其他聚合物。如聚乙二醇，聚醋酸，聚乙醇酸，聚氨基酸等。4.9.其它常用辅料。如糖等。
5.条款1所述缓(控)释制剂工艺包括以下方面5.1.制成溶解度小的复合物；5.2.与高分子化合物生成难溶性化合物；5.3.控制药物粒子大小，增大粒子表面积；5.4.将药物包藏于溶蚀性骨架中；5.5.将药物包藏于亲水性胶体中；5.6.用包衣阻滞剂包衣；5.7.制成微囊；5.8.制成不溶性骨架片剂；5.9.增加粘度，减少扩散系数；5.10.制成乳剂；5.11.制成渗透泵控释片。
6.条款1中所述口服缓(控)释作用指口服药物在指定的溶剂中按要求缓慢地非恒速(或恒速)地释放每日用药次数与相对普通制剂比较至少减少一次或用药时间间隔有所延长。
7.条款1中所述缓(控)释作用时间范围为6～24小时。
8.条款1中所述口服缓(控)释剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、微丸剂、微球剂、微囊剂、胶束、水剂、乳剂、脂质体、糊精包合物等口服制剂。
9.条款1中所述天然水蛭素和重组水蛭素具体体内功能为抗凝血，抗血栓形成的作用。
全文摘要
水蛭素是迄今为所知最强的凝血酶抑制剂，天然水蛭素和应用基因工程技术生产的重组水蛭素都已经应用于临床上心脑血管方面疾病的治疗。现存的国内外水蛭素类药物在剂型设计上都是胃肠道直接溶解给药和注射给药。给药后药物在体内寿命较短，有效血药浓度仅能维持1小时左右，难以适应大多数慢性高凝状态疾病患者长期抗凝治疗的需要。本专利发明的口服水蛭素缓(控)释新剂型延长了水蛭素在体内的寿命，有效血药浓度维持可达6－24，并有较好的生物利用度，具有潜在新一代口服抗凝药物的价值。
文档编号A61K38/58GK1393266SQ0112159
公开日2003年1月29日 申请日期2001年6月26日 优先权日2001年6月26日
发明者游自立, 黄秀东, 张俊山, 吕志强, 张高侠, 肖建国 申请人:梅伯皋