专利名称：植烷酸用于治疗糖尿病的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植烷酸衍生物以及它们用于糖尿病的治疗和/或预防的用途。
本发明涉及一种新的治疗和/或预防优选为非胰岛素依赖型(NIDDM或所谓的II型)糖尿病的方法，尤其是植烷酸衍生物用于所述的治疗和/或预防的用途。
NIDDM是主要在成人中发生的糖尿病形式，这些成人中有足量的胰岛素可供使用，然而在周围组织胰岛素介导的葡萄糖利用和代谢方面有缺陷。明显的NIDDM特征是三种主要的代谢异常血糖浓度升高、对胰岛素介导的葡萄糖处理有抗性、肝脏葡萄糖产生过度。
先前的口服抗糖尿病药物(如普通使用的磺酰脲)的作用机制主要是基于增加从胰腺的β细胞释放胰岛素，这种机制长期可能导致加速消耗糖尿病患者内源性产生的胰岛素。现代成年期发生的糖尿病病理生化观点因而强调在此种情况中需要治疗外周胰岛素抗性。
人类饮食含有植醇，它是叶绿素分子的代谢产物。植醇代谢为植烯酸和植烷酸(见图6)。内肠道从饮食的叶绿素中摄取植醇被证明是最少的[Baxter，J.H.和Steinberg，D.(1967)大鼠中从饮食的叶绿素中摄取植醇，脂类研究杂志(J Lipid Res.)8，615-20，Baxrer，J.H.(1968)正常和Refsum病患者叶绿素中植醇的摄取，脂类研究杂志.9，636-41]。
大鼠中，植醇的摄取远不如植烷酸[Baxter，J.H.，Steinberg，D.，Mize，C.E.和Avigan，J.(1967)胸导管法研究大鼠内肠道对均一14C-标记的植醇和植烷酸的摄取和代谢，生物化学与生物物理学学报(Biochim Biochphys Acta)，137，277-90]。
对人类而言，人类饮食中的乳制品和反刍动物的脂肪是主要的植烷酸来源。正常的饮食每天含50-100mg的植烷酸[Steinberg.(1995)新陈代谢中的Refsum病及遗传性代谢紊乱的分子基础pp.2351-2369，McGraw-Hill，New York]。在正常人血清中的植烯酸和植烷酸水平为2μM和6μM[Avigan，J.(1996).正常人和动物血浆中植烷酸的存在，生物化学与生物物理学学报，116，391-4]。植烷酸在多神经炎型遗传性运动失调(Refsum病)的患者中可能升高50倍，Refsum病是一种遗传性代谢紊乱，其特征是阻止了植烷酸转化为降植烷酸的α羟化酶基因缺陷[Verhoeven，N.M.，Wanders，R.J.，Poll-The，B.T.，Saudubray，J.M.和Jakobs，C.(1998)人类植烷酸和降植烷酸的代谢综述，遗传性代谢疾病杂志(J Inherit Metab Dis.)，21，697-718]。
成年小鼠饲服0.5％植醇饮食21天，可观察到血清甘油三酯水平降低40％。然而，血清胆固醇水平保持不变[Van den Branden，C.，Vamecq，J.，Wybo，I.和Roles，F.(1986)植醇和过氧化物酶体的增殖，儿科学研究，20，411-5]。进一步地观察到，已知的参与β氧化和由过氧化物酶体增殖激活的受体(PPAR)调节的酶类表达被上调。最近研究显示，植烷酸是9-顺-视黄酸受体[RXR]，也是PPARα的配体[Kitareewan，S.，Burka，L.T.，Tomer，K.B.，Parker，C.E.，Deterding，L.J.，Stevens，R.D.，Forman，B.M.，Mais，D.E.，Heyman，r.，McMorris，T.和Weinberg，C.(1996)植醇代谢物是活化核受体RXR的循环饮食受体，细胞分子生物学(MolecularBiology of the Cell)7，1153-66.；Lemotte，P.K.，Keidel，S.和Apfel，C.M.(1996)植烷酸是视黄醛(retinoid)X受体配体，欧洲生物化学杂志(Eur J Biochem)，236，328-33；Wolfrum，C.，Ellinghaus，P.，Fobker，M.，Seedorf，U.，Assmann，G.，Borchers，T.，和Spener，F.(1999)植烷酸是小鼠肝脂肪酸结合蛋白的配体和转录激活物，脂类研究杂志，40，708-14.；Ellinghaus，P.，Wolfrum，C.，Assmann，G.，Spener，F和Seedorf，U.(1999)植烷酸激活固醇运载蛋白2-/固醇运载蛋白X-缺陷小鼠中过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)，生物化学杂志(J Biol Chem)，274，2766-72和WO 97/09039]。
观察到的RXR受体的结合和转录作用的EC50和IC50分别为3μM和2.3μM。植烷酸作为PPARα配体的Kd值据报导为10nM[Ellinghaus等，同上]。与9-顺式-视黄酸活化RXR和所有反式-视黄酸受体(RAR)(EC50为2.5nM和13nM)相反，植烷酸活性只局限于RXR受体。植烷酸活化PPARα和RXR以及对视黄醛受体的专一性可导致与在其他脂肪酸观察到的模式不同的基因诱导模式。
肝是次于骨骼肌的最重要的葡萄糖代谢组织，因此是血浆葡萄糖水平的重要的调节物。众所周知，抗糖尿病药四氢噻唑二酮(如曲格列酮、瑞格列酮和匹格列酮)活化PPARγ导致II型糖尿病胰岛素敏感性的恢复[Berger，J.，Bailey，P.，Biswas，C.，Cullinan，C.A.，Doebber，T.W.，Hayes，N.S.，Saperstein，R.，Smith，R.G.和Leibowitz，M.D.(1996)四氢噻唑二酮引起过氧化物酶体增殖体激活的受体γ的构象变化结合和活化与db/db小鼠中的抗糖尿病作用相关，内分泌学(Endocrinology)137，4189-95；Lehman，J..M.，Moore，L.B.，Smith-Oliver，T.A.，Wilkison，W.O.，Wilson，T.M.和Kliewer，S.A.(1995)抗糖尿病药四氢噻唑二酮是过氧化物酶体增殖体激活的受体PPARα的高亲和力配体，生物化学杂志，270，12953-6.12，13]。在啮齿动物和人类肝脏中可见PPARα和PPARγ表达[Mukherjee，R.，Jow，L.，Croston，G.E.和Paterniti，J.R.，Jr.(1997)人类过氧化物酶体增殖激活的受体(PPAR)异构体PPARγ2相对于PPARγ1的鉴定、表征及组织分布，以及视黄醛X受体激动剂和拮抗剂的活化，生物化学杂志.272，8071-6.，Lemberger，T.，Braissant，O.，Juge-Aubry，C.，Keller，H.，Saladin，R.，Stales，B.，Auwerx，J.，Burger.，A.G.，Meier，C.A.，和Wahli，W.(1996)PPAR的组织分布和与其他激素信号传导旁路的相互作用，纽约科学院年鉴(Ann N Y Acad Sci.)804，231-51；Palmer，C.N.，Hsu，M.H.，Griffin，K.J.，Raucy，J.L.和Jognson，E.F.(1998)过氧化物酶体增殖体激活受体α在人肝中的表达，分子药理学(Mol Pharmacol)，53，14-22.；Vidal-Puig，A.J.，Considine，R.V.，Jimenez-Linan，M，A.，Pories，W.J.，Caro，J.F.Flier，J.S.(1997)过氧化物酶体增殖体激活的受体基因在人组织中的表达。肥胖、减重以及由胰岛素和糖皮质激素调节的效果，临床研究杂志，99，2416-22]。
植烷酸现今被描述为RXR和PPARα两者的配体[Kitareewan等人，(同上)；Lemotte等人，(同上)；Ellinghaus等人，(同上)和WO97/09039]。Decaux等人(Decaux，J.F.，Juanes，M.，Bossard，P.和Girard，J.1(1997)三碘甲状腺氨酸和视黄酸对新生大鼠肝细胞葡糖激酶基因表达的影响，分子细胞内分泌学(Mol Cell Endocrinol.)，130，61-67)]，在大鼠肝细胞原代培养物中证实，由视黄酸引起的葡糖激酶mRNA的上调。同时发现，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)基因与其他效应元件一起由PPAR效应元件(PPRE)所调节[Juge-Aubry，C.，Pernin，A.，Favez，T.，Burger，A.G.，Wahli，W.，Meier，C.A.和Desvergne，B.(1997)在各种天然过氧化物酶体增殖体效应元件中过氧化物酶体增殖体激活受体亚型的DNA结合性质。5’-侧翼区的重要性，生物化学杂志272，25252-9；Hanson，R.W.和Reshef，L.(1997)磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(GTP)基因表达的调节，生物化学年度综述(Annu Rev Biochem.)66，581-611]，RXR/PPAR介导的肝细胞中葡萄糖内流的上调可能是合理的解释。PPAR与RXR形成允许的异二聚体，意味着任一配偶体可以通过与其自身配体相互作用而调节转录活性。用PPAR和RXR的配体共处理细胞导致加性效应。进一步地，发现RXR选择性配体可活化PPRE驱动的报告基因[Kliewer，.S.A.，Umesono，K.，Noonan，D.J.，Heyman，R.A.和Evans，R.M.(1992)9-顺式视黄酸和过氧化物酶体增殖体信号传导旁路通过其受体的异二聚体形式而汇聚，自然(Nature)，358，771-4；Gearing，K.L.，Gottlicher，M.，Teboul，M.，Widmark，E和Gustafson，J.A.(1993)过氧化物酶体增殖体激活受体和视黄醛X受体的相互作用，美国国家科学院院报(Proc Natl Acad Sci U S A)90，1440-4；Keller，H.，Dreyer，C.，Medin，J.，Mahfoudi，A.Ozato，K和Wahli，W.(1993)脂肪酸和视黄醛通过活化过氧化物酶体增殖激活受体-视黄醛X受体异二聚体而控制脂类代谢，美国国家科学院院报，90，2160-4]。
在糖尿病和肥胖小鼠体内观察对RXR激动剂的胰岛素敏感性，这与已知的四氢噻唑二酮效果相似[Mukherjee，R.，Davis，P.J.，Crombie，D.L.，Bischoff，E.D.，Cesario，R.M.，Jow，L.，Hamann.L.g.，Boehm.M.F.，Mondon，C.E.，Nadzan，A.M.，Pateriti，J.R.，Jr和Heyman，R.A..(1997)视黄醛X受体激动剂引起的糖尿病和肥胖小鼠对胰岛素的敏感性，自然.386，407-10]。
然而，在现有技术中未表明植烷酸衍生物优选植烷酸对NIDDM本身具有益效果。
令人惊讶的是，实验显示植烷酸衍生物，优选地植烷酸，可增加和刺激葡萄糖转运蛋白和葡糖激酶基因的转录，从而导致肝细胞中葡萄糖摄取的增加。
更进一步地，植烷酸衍生物使葡萄糖水平正常化并增加葡萄糖水平，而无伴随低血糖的危险，因此极为适合用于治疗和/或预防糖尿病。
本发明目的因而是一种新的用于治疗和/或预防优选为NIDDM的方法。
本发明之目的是通过使用植烷酸衍生物来治疗和/或预防糖尿病，优选为II型糖尿病本身而实现。在一个特别的实施方案中优选植烷酸的应用。
本发明证明，在原代肝细胞培养物中葡萄糖的摄取为比血浆中的浓度高一个数量级的植烷酸衍生物显著诱导。参与葡萄糖摄取的酶是促进葡萄糖转运蛋白(GLUT)家族的多个成员GLUT-1、GLUT-2和GLUT-4(见[Olson，A.L.和Pessin，J.E.(1996)哺乳动物中促进葡萄糖转运蛋白基因家族的结构、功能和调节，营养学年度综述(AnnuRev Nutr.)16，235-56])和葡糖激酶。在本发明中观察到的GLUT-1和GLUT-2的mRNA水平的上调伴随着2-脱氧-D-葡萄糖摄取的增加。肝型葡萄糖转运蛋白GLUT-2与其他GLUT同I型不同之处在于，它是有着高周转率的低亲和力葡萄糖转运蛋白[Gould，G.W.，Thomas，H.M.，Jess，T.J.和Bell，G.I.(1991)人葡萄糖转运蛋白在爪蟾卵母细胞中的表达红细胞、肝和脑同I型的动力学特征和底物专一性，生物化学(Biochemistry)，30，5139-45]。
低亲和力葡萄糖转运蛋白的存在确保在肝中葡萄糖流出正比于血浆葡萄糖浓度。进一步地，在肝细胞中GLUT-2与葡糖激酶提供的调节的磷酸化活性相偶联。因此在糖原合成时，葡糖激酶上调，且可增加细胞内葡萄糖-6-磷酸的形成，从而维持胞内游离葡萄糖的低浓度[Magnuson，M.A.，Andeson，T.L.，Printze，.L.，Koch，S.和Granner，D.K.(1989)大鼠葡糖激酶基因结构和胰岛素的调节，美国国家科学院院报.86，4838-42]。
因此，本发明的又一方面涉及能够用作调节物的植烷酸衍生物，所述调节物具有诱导或刺激上述酶的基因表达并通过提高肝葡萄糖的摄取来增加血清葡萄糖清除的活性。
“植烷酸衍生物”是指最优选地植烷酸本身或其前体(如图6所示)，其中植烷酸本身和植醇本身为优选的。更进一步地，其衍生物，如(但不局限于)羟基植烷酸或羟基植烯酸，尤其是2-羟基植烯酸或2-羟基植烯酸酯、羟基植烷酸酯、植酸酰胺类、植烯酸酰胺类、羟基植酸酰胺类、羟基植烯酸酰胺类、烃基酯类、磷脂类和三酰甘油类，其中长链n-烷基酯类，优选C12-C22为优选的。
当然，所有这些列出的酸和衍生物都是药学可接受的或生理上可应用的衍生物。在此方面，本发明也涉及药学可接受的其衍生化合物。进一步地，药学可接受的植烷酸和/或植烯酸或其衍生物的盐类是碱金属、碱土金属、铵和烷基铵盐类，如钠、钾、镁、钙或四甲基铵盐，或其药学可接受的溶剂化物。合适的药学可接受的盐包括酸加成盐类。合适的酸加成盐类包括药学可接受的无机盐类，如硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐、硼酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐，以及药学可接受的有机酸加成盐类，如醋酸盐、酒石酸盐、马来酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、苯甲酸盐、抗坏血酸盐、薄荷烷-磺酸盐、α-酮基戊二酸盐、和α-甘油磷酸盐。合适的药学可接受的溶剂化物包括水合物。
在此使用的术语“药学可接受的”或“生理上可应用的”包括人用和兽(如猪，牛，鸡和火鸡)用的化合物、组合物和成分，它们以有效的药学剂量施用于人或动物。
糖尿病患者常常遭受整体代谢完全紊乱之苦，其特征是高脂血症、胆固醇增加(高胆固醇血症，高甘油三酯血症)、高血压，肥胖和高胰岛素血症，其临床实质是称作代谢综合征或X综合征，导致范围很广的后期并发症。除了减少血胰岛素过多症，植烷酸和/或植烯酸或其衍生物额外地可减少甘油三酯、胆固醇和纤维蛋白原，因此极为适合治疗代谢综合征。因此，植烷酸和/或植烯酸或其衍生物也用于治疗和/或预防与糖尿病相关的病症。在本文里，本发明包含尤其是治疗和/或预防所谓的损伤的葡萄糖耐受性和相关的肥胖。
在本发明的又一个实施方案中，植烷酸衍生物也用于与其他已知的活性化合物联合作用来伴随或支持胰岛素疗法。
在上述治疗和/或预防中，植烷酸衍生物可以本身形式施用或优选地作为包含药学可接受的载体的药学组合物而施用。
据此，本发明也提供了用于治疗和/或预防II型糖尿病的药学组合物，所述组合物包含植烷酸衍生物和药学可接受的载体。
如果需要，组合物可以呈伴随书写或打印的使用方法的包装的形式。本发明的药学组合物常常加工成适于口服或肠胃外施用的形式。尽管也构思了通过其他途径给药，如注射和透皮摄取。对口服尤其适合的组合物是单位剂量形式，如片剂和胶囊。其他固定的单位剂量形式如小囊中的粉剂也可使用。与传统的药学实践相一致，载体可包括稀释剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、润滑剂、芳香物、显色剂或其他常规佐剂。例如，典型的载体包括结晶纤维素、淀粉、淀粉乙交酯钠、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯基聚吡咯酮、硬脂酸镁、月桂基硫酸酸钠或蔗糖。最适合的组合物以单位剂量形式配制。这种单位剂量将常规地包含0.1至1000mg范围内的活性组分的量，更为常见的是0.1至500mg，更为特殊的是0.1至100mg。常规地，活性组分可以如前面定义的药学组合物施用，这形成本发明特别方面。在上述治疗方案中，植烷酸衍生物可以采用上述剂量，以一天1至6次的方式，使得对70公斤的成人每日总剂量一般在0.1至6000mg范围，更常见地约1至1500mg，一般地在0.5至10mg。活性化合物的每日剂量常常为0.1至50mg/kg体重。通常，0.5至40mg/kg/天，优选为1.0至20mg/kg/天，每天一至几次给药是有效的，以达到期望的效果。当然，给药剂量依赖于接受者的年龄、健康状态和体重、病情的程度和可同时进行的额外治疗的类型和所期望作用的类型。
在最为优选的实施方案中，将植烷酸衍生物优选的植烷酸本身，施予人或动物，由此潜在的靶细胞(如肝细胞)接触到10至100μM的药物浓度。
当活性化合物按上述方式给药时未观察到不可接受的毒理学作用。
本发明更进一步优选的实施方案是食品添加物，它可以称作天然组合物来预防非胰岛素依赖型糖尿病，其中该组合物包含植烷酸衍生物作为食品或饲料添加剂或组分，和进一步地添加剂和/或佐剂。
本发明一些最重要的结果总结在图中。
图1.植烷酸衍生物对细胞生活力的影响。大鼠原代肝细胞在含多种剂量的植烷酸的培养基中于37℃培养24小时。随后细胞生活力以中性红摄取法来测定。数据以3批独立实验的平均值±标准误来表示。
图2.肝细胞中葡萄糖的摄取。大鼠原代肝细胞在含10μM(□)和100μM的植烷酸(■)、100μM棕榈酸(●)、100μM DHA(○)和对照(▲)的培养基中，37℃培养24小时。随后，在培养15、30和60分钟后测定[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖的摄取。数据以3批独立实验的平均值±标准误来表示。
图3.在以100μM植烷酸刺激大鼠原代肝细胞后用TaqManTM来测定不同时间点的GLUT-1(○)、GLUT-2(↓)、葡糖激酶(△)和PEPCK(□)的mRNA水平。mRNA的水平以β肌动蛋白的表达标准化，并以相对于未处理细胞来表示。数据以3批独立实验的平均值来表示。误差限如实施例3计算。
图4.大鼠原代肝细胞用100μM植烷酸、棕榈酸和DHA刺激24小时后，以TaqManTM来测定GLUT-1、GLUT-2、葡糖激酶和PEPCK的mRNA水平。mRNA水平以β肌动蛋白的表达标准化，并以相对于未处理细胞来表示。数据以3批独立实验的平均值±标准误来表示。误差限如实施例3计算。
图5.大鼠原代肝细胞以10μM植烷酸、棕榈酸和DHA刺激24小时后，以TaqManTM方法来测定ApoA1、ApoE、Cyp7a、Cyp4a1、HMG-CoA还原酶LCAT、LDLR、LFABP、LPL和TNFα的mRNA的水平。mRNA水平以β肌动蛋白的表达标准化，并以相对于未处理细胞来表示。数据以3批独立实验的平均值来表示。误差限如实施例3计算。
图6.植烷酸前体和代谢物。代谢过程是从植醇经植烯酸至植烷酸。
图7.在分别施用150mg植烷酸/kg饲料(P-10，阴影条)和750mg植烷酸/kg饲料(P-10，实心条)或对照(对照，空心条)后不同的血浆胰岛素浓度。雄性Wistar大鼠在适应2天后，饲服相应的物质。测定值为平均值±标准误(参见实施例4)。
下述实施例用来对本发明进行更详细的解释，而不是将下面内部局限于实施例中描述的产品和实施方案。
各种植烷酸浓度对细胞生活力的影响以中性红摄取法来测定(图1)。以高达100μM的植烷酸与肝细胞一起温育24小时未显示出对细胞生活力的影响。在1mM植烷酸浓度下，与未处理的相比，只有54±17％的细胞存活。实施例2 2-脱氧-D-葡萄糖的摄取在24孔板中培养的细胞用植烷酸、棕榈酸和DHA处理24小时。随后移去培养基，以预温的pH7.4的磷酸缓冲盐液(PBS)洗涤2次。往细胞中加入500μl预温的葡萄糖反应混合物(溶于PBS中的0.01mM 2-脱氧-D-葡萄糖和3μCi/mi的[3H]-2-脱氧-D-葡萄糖)。反应混合物在37℃培养不同的时间间隔。通过移去反应混合物和以冰冷的10mM溶于PBS的2-脱氧-D-葡萄糖洗涤2次以终止反应。细胞以500μl 1％的十二烷基硫酸钠溶解，将其中400μl转移至含5ml Quickszint 1(Zinsser Analytic，Frankfurt，德国)的液体闪烁计数小瓶中。用Tri-Carb 2500(Packard，Meriden，CT)液体闪烁计数仪来计数放射性。剩余裂解物以BCA蛋白测试试剂盒(Pierce，Rockford，IL)来测定蛋白含量。数据以3批独立实验的平均值±标准误来表示。
在研究的时程中，测定大鼠原代肝细胞培养物对2-脱氧-D-葡萄糖的摄取，显示出与对照、棕榈酸或DHA相比，用100μM的植烷酸处理的肝细胞显著增加对2-脱氧-D-葡萄糖的摄取(图2)。在用低于100μM浓度的植烷酸处理的细胞中，未观察到可测出的对2-脱氧-D-葡萄糖摄取的影响。实施例3 定量RT-PCR应答于植烷酸的mRNA表达为对表达水平进行定量，我们采取了应用复合方法之新的实时定量TaqManTMPCR。用QIAGEN(Valencia，CA)的RNeasy试剂盒分离总RNA。在20μl反应体系中，从5μg总RNA中以SuperScriptIITM反转录试剂盒(Life technologies Inc.，Coralville IA)和100ng随机6聚体引物按前述的反应条件[Zimmermann，U.Fluehmann，B.，Born，W.，Fischer，J.A.和Muff，R.(1997)新的胰岛淀粉样多肽结合位点与降钙素受体在人乳腺癌Mcf-7细胞中共存。内分泌学杂志，155，423-431]合成cDNA第一条链。接着将cDNA稀释至500μl。在50μl的反应体系中，使用Universial Master Mix(PEBiosystems，Foster City，CA)和浓度分别为300nM和100nM的下述PCR引物和TaqManTM探针，在7700序列检测器(PE Biosystems，Foster City，CA)中扩增10μlcDNA，参照基因β肌动蛋白的PCR引物和TaqManTM探针浓度为50nM。GLUT-1 5’-GGTTCATCATCAGCATGGAGTTC-3’，5’-GGGCATGATTGGTTCCTTCTC-3’，5’-FAM-CCTGCCAAAGCGATTAACAAAGAGGCC-Tamra-3’，GLUT-2 5’-CGCCCTCTGCTTCCAGTACA-3’，5’-AGGACCACCCCAGCAAAAA-3’，5’-FAM-CGGACTTCCTCGGGCCTTACGTGT-Tamra-3’，葡糖激酶5’-CGTGGATGGCTCCGTGTAC-3’5’-TGTCAGCCTGCGCACACT-3’，5’-FAM-AGCTGCACCCGAGCTTCAAGGAGC-Tamra-3’，PEPCK 5’-CGCTGGATGTCAGAAGAGGAC-3’，5’-ACATGGTGCGGCCTTTCAT-3’，5’-FAM-AAAGCATTCAACGCCAGGTTCCCG-Tamra-3’，ApoA1 5’-GCCACTGTGTATGTGGATGCA-3’，5’-TTGCCCAAAGTGGAGGATTC-3’，5’-FAM-ACAGCGGCAGAGACTATGTGTCCCAGTTT-Tamra-3’，ApoE 5’-GGTCCAGGAAGAGCTGCAGA-3’，5’-CCGTCATAGTGTCCTCCATCAG-3’，5’-FAM-CTCCCAAGTCACACAGGAACTGACGGT-Tamra-3’，Cyp7a 5’-GACTGGAAAAAATTTCATTACACTACTTCT-3’，5’-CGTGGTATTTCCATCATTTGGG-3’，5’-FAM-CGAAGGCATTTGGACACAGAAGCATTG-Tamra-3’，Cyp4a15’-GCAGTTCCCATCACCTCCCT-3’，5’-TGCTGTAGTTCTTTGTCACCTTGAA-3’，5’-FAM-CCACTGGTTCTTTGGGCACAAGCA-Tamra-3’，HMG-CoA还原酶5’-TGGCTGGTGAGTTGTCCTTG-3’，5’-TTATCTTTGATCTGTTGTGAACCATG-3’，5’-FAM-ATGTCCTGCTGCCAATGCTGCCA-Tamra-3’，LCAT 5’-CATGCGGATCCTGGCCT-3’，5’-TCTCTCAGCTTTATGTTGGACATGA-3’，5’-FAM-AGGTGACAACCAGGGCATCCCG-Tamra 3’，LDLR 5’-GGTGGTCAGCAGCCCCT-3’，5’-CAGCTGCGATGGATACACTCA-3’，5’-FAM-CCTCCCTCGAGTTCCACTGTGGCAGTA-Tamra-3’，LFABP 5’-CAAGGTGATCCACAATGAGTTCA-3’，5’-GACCTTTTCCCCAGTCATGGT-3’，5’-FAM-TGGGGGAGGAGTGCGAACTGGAGA-Tamra-3’LPL 5’-TCGGGCCCAGCAACTT-3’，5’-GGCCACATCATTTCCCACC-3’，5’-FAM-TCCAGTGTCTGCCGGCTATACCAAGC-Tamra-3’，TNFα 5’-TCGTAGGTCAAACCACCAAGC-3’，5’-ATTGGCCAGGAGGGCGT-3’，5’-FAM-AGGAGCAGCTGGAGTGGCTGAGCCAG-Tamra-3’，β肌动蛋白5’-GACAGGATGCAGAGGAGATTACTG-3’，5’-CCACCGATCCACACAGAGTACTT-3’，5’-VIC-TCAAGATCATTGCTCCTCCTGAGCGC-Tamra-3’.
基因表达的诱导和相应的误差限按厂家的手册以ΔCT法从3个独立的实验中计算得出。
编码参照基因β肌动蛋白、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、次黄嘌呤核糖转移酶(HPRT)和18S核糖体RNA的mRNA水平与以100μM植烷酸处理24小时和未处理的细胞相比较。β肌动蛋白和18S核糖体RNA的mRNA水平不受植烷酸的影响(未显示)。因此，所有结果都标准化至β肌动蛋白mRNA水平。测定100μM植烷酸作用下GLUT-1和PEPCK的mRNA水平显示，6小时后最大分别为5.6(5.1至6.2)倍和4.4(3.4至5.7)倍的诱导(图3)。GLUT-2和葡糖激酶的mRNA水平在植烷酸刺激24小时后达到最大。在分别以100μM植烷酸和棕榈酸刺激24小时的肝细胞中，GLUT-1的mRNA水平的诱导分别为2.2(1.6至2.9)倍和2.4(1.7至3.1)倍(图4)。较低浓度植烷酸和棕榈酸及高至100μM的DHA不影响GLUT-1的mRNA水平。以植烷酸(0.01至100μM)处理细胞24小时后，GLUT-2的mRNA水平诱导至少2倍，最大诱导为3.2(2.7-3.8)倍(100μM)(图4)。然而，在低浓度棕榈酸下，观察到GLUT-2最小的mRNA水平诱导。相比较，DHA不影响GLUT-2的mRNA水平。葡糖激酶和PEPCK的mRNA水平被100μM植烷酸诱导3.0(2.5至3.4)倍和2.5(1.7至3.6)倍。葡糖激酶和PEPCK的mRNA转录为100μM的植烷酸和DHA所降低。在植烷酸处理(100μM，24小时)后，我们观察到细胞色素P450/4A1(Cyp4a1)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶、脂蛋白脂酶(LPL)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、PEPCK和肿瘤坏死因子α(TNFα)转录物的增加。相比较，编码载脂蛋白A1(ApoA1)和载脂蛋白E(ApoE)的mRNA为植烷酸所下调。肝脂肪酸结合蛋白(LFABP)、胆固醇7α-羟化酶和葡糖激酶(Cyp7a)的mRNA水平不变(图5)。实施例4 植烷酸效能的体内研究为确定植烷酸对血浆胰岛素水平的有益效果，使用雄性Wistar大鼠进行研究。动物适应2天后，分别饲服对照食物，150mg植烷酸/kg饲料(P-10)和750mg植烷酸/kg饲料(P-50)。在第7天，取血样，随后测定血浆之胰岛素浓度(图6)。应用不同浓度的植烷酸可降低血浆胰岛素。缩写载脂蛋白A1(ApoA1)和载脂蛋白E(ApoE)、细胞色素P450/4A1(Cyp4a1)、胆固醇7α-羟化酶和葡糖激酶(Cyp7a)、二十二碳六烯酸(docohaxaenoic acid)(DHA)，促进性葡萄糖转运蛋白(GLUT)，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶、脂蛋白脂酶(LPL)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、肝脂肪酸结合蛋白(LFABP)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)、PPAR应答元件(PPRE)、全反式视黄酸受体(RAR)、9-顺式-视黄酸受体(RXR)、肿瘤坏死因子α(TNFα)
权利要求
1.一种制备产品的方法，所述产品用于治疗和/或预防非胰岛素依赖型糖尿病和相关疾病，如X综合征，高脂血症，高血压，高胰岛素血症，高胆固醇血症，高甘油三酯血症，尤其是损伤的葡萄糖耐受和相关肥胖，其中植烷酸或其衍生物与药学可接受的添加剂和/或佐剂一起配制。
2.一种用于治疗和/或预防非胰岛素依赖型糖尿病的药学组合物，其包含植烷酸或其衍生物和药学可接受的载体，及进一步的添加剂和/或佐剂。
3.按权利要求2的药学组合物，它包含0.1至1000mg，优选为0.1至500mg的量的植烷酸或其衍生物。
4.一种用于预防非胰岛素依赖型糖尿病的食品添加物，它包含植烷酸或其衍生物作为食品或饲料添加剂或成分，和进一步的添加剂和/或佐剂。
5.植烷酸或植烯酸或其衍生物或前体用作食品或饲料的药学化合物或添加物的用途，其用于治疗和/或预防人或动物中非胰岛素依赖型糖尿病。
6.按权利要求5的用途，其中所述的衍生物或前体选自植醇，羟基植烷酸，植酸酯类，植酸酰胺类，羟基植酸酯类，羟基植酸酰胺类，羟基植烯酸，植烯酸酯类，植烯酸酰胺类，羟基植烯酯类和羟基植烯酸酰胺类。
7.按权利要求5或6的用途，其中所述的衍生物或前体有调节物的活性，所述调节物用于诱导葡萄糖转运蛋白家族基因以增加细胞葡萄糖摄取。
8.按权利要求7的用途，其中所述的基因选自GLUT-1、GLUT-2、GLUT-4和葡糖激酶。
9.一种治疗和/或预防人或动物的糖尿病和糖尿病相关病症的方法，它包含向人或动物施用药学可接受量的植烷酸或衍生物或其前体的施用。
10.按权利要求9的方法，其中所述的衍生物或前体衍生自植烷酸或植烯酸。
11.按权利要求10的方法，其中所述的衍生物或前体选自植醇，羟基植烷酸，植酸酯类，植酸酰胺类，羟基植酸酯类，羟基植酸酰胺类，羟基植烯酸，植烯酸酯类，植烯酸酰胺类，羟基植烯酸酯类和羟基植烯酸酰胺类。
12.按权利要求9或11任一种的方法，其中植烷酸或衍生物或其前体具有调节物的活性，所述调节物用于诱导葡萄糖转运蛋白家族基因以增加细胞葡萄糖摄取。
13.按权利要求12的方法，其中所述基因选自GLUT-1、GLUT-2、GLUT-4和葡糖激酶。
14.按权利要求9或13任一种的方法，其中剂量优选为0.1至50mg/kg/天(体重)，最优选的为1.0至20mg/kg/天(体重)。
全文摘要
本发明涉及一种新的治疗和/或预防优选为非胰岛素依赖型(NIDDM或所谓的II型)糖尿病,或其他与损伤的葡萄糖耐受相关的病症如肥胖的方法,尤其是植烷酸衍生物用于所述的治疗和/或预防的用途。
文档编号A61K31/201GK1365667SQ01124878
公开日2002年8月28日 申请日期2001年8月3日 优先权日2000年8月4日
发明者B·弗鲁曼, M·海姆, W·亨吉克, P·韦伯 申请人:罗切维他命股份公司