专利名称：血小板混悬液的光动力学处理和紫外线b照射的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过联合应用光动力学处理和紫外线B照射，在血小板混悬液中灭活病毒和杀死白细胞的方法。
已知治疗性应用血制品潜在着血制品受者被病毒感染的危险。可列举的例如肝炎病毒B(HBV)和C(HBC)以及爱滋病病原体HIV-1和HIV-2。只要在血制品的制备过程中没有应用病毒灭活或病毒消除的步骤，便始终存在这样的危险。
在提纯的血浆蛋白浓缩品例如白蛋白、VIII因子和IX因子制品中应用了病毒灭活或病毒消除的方法，所以这些制品已经被认为是安全无病毒的。即使新鲜血浆也可以通过应用各种方法至少是减小病毒感染的危险性。例如有一种方法叫做检疫储藏，即，将血浆低温冷冻储藏3-6个月，除非对该供血者的新血样重新检验其HBV、HCV、HIV-1和HIV-2的常规项目并且结果为阴性才提取出来使用。这种方法不适合于细胞性的血制品例如红细胞和血小板浓缩品，因为它们的储存期约为7周至5天。出于可想而知的原因也不能通过溶剂洗涤剂处理方法使细胞性血制品变成安全无病毒，这些方法只可用于血浆蛋白浓缩品也可以用于血浆，而红细胞和血小板用此方法会被溶解。
大量的工作在于借助于光动力学方法使细胞性血制品去污染。光动力学病毒灭活的原理在于，将该制品在溶剂或混悬液中，在一种光活性物质即一种光敏剂存在的条件下，进行照射。照射光的波长必须能被光活性物质所吸收。由此被激活，激活能量或者直接转移至一种基体，该基体因此被分解或破坏，或者转移至氧分子激活的氧分子类，即氧自由基或单氧具有很强的杀病毒作用。合适的是所应用的光活性物质对病毒成分，例如对病毒的核酸具有强大的亲和力，和对相关制品中所含有的其它成分只有很小的亲和力。这样病毒被灭活而其它成分没有改变。其它应用方法目前仅见于按照欧洲专利0 491757-B1(H.Mohr和B.Lambrecht，血和血制品中病毒的灭活方法)的光动力学方法，应用于新鲜血浆的病毒灭活。在技术应用中主要以吩噻嗪染料亚甲基蓝作为光活性物质。还可以应用甲苯胺蓝代替亚甲基蓝。还有亚甲基蓝的甲基化产物，也就是说，天青染料A、B和C以及硫堇为光动力学活性，适用于光动力学病毒灭活。
美国专利5 545,516(S.J.Wagner吩噻嗪-5-鎓染料加光，对血液和血液成分中的细胞膜外包封病毒的灭活)说明了借助于吩噻嗪染料联合应用可见光进行细胞外病毒的灭活。根据美国专利5,545,516在进行光动力学处理前先采用一种特殊的滤器将制品除去白细胞，因为病毒灭活方法对与细胞结合的病毒或原始病毒无效。该方法同样也不能将血液中小的无包膜的病毒，例如肝炎A病毒(HAV)灭活。与之不同的是，按照本发明方法可以灭活具有脂质膜的游离病毒，例如爱滋病病原体HIV-1和肝炎病毒B和C(HBV，HCV)。
血制品中的白细胞可以用紫外线照射将其杀死。对此已经证明，在血小板混悬液中用紫外线B(波长范围290-320nm)照射具有意义，因为排除白细胞所需能量一般为1-3J/cm2便足够，同时血小板又还不太受损伤、尚可应用于治疗。
能量大于10J/cm2的紫外线B照射还可附加杀死病毒(K.N.Prodoux；J.C.Fratanoni，E.J.Boone和R.F.Booner，血液中，70(2)，589-592(1987)利用紫外线激光进行血制品中病毒灭活)。当然这样血小板受到损害而其可应用性必将受到质疑(J.C.Fratanoni和K.N.Prodoux，输血30(6)；480-481(1990)血制品中的病毒灭活)。
因此本发明的任务是，研究出一种可行的有效方法，用于人类病原性病毒和血小板混悬液尤其是血小板浓缩品(TK)中白细胞的灭活。血小板浓缩品由供血通过差速离心法或直接由供血者通过机械性血小板转移而获得。
令人惊异地已经发现，联合应用光动力学处理和紫外线B照射可以在血小板混悬液或血小板浓缩品中有效地控制了可进行光动力学病毒灭活的病毒，同时还可以将介质中所含有的白细胞杀死，这样便排除了细胞结合病毒或原始病毒的感染危险性。此外还令人惊异地发现，采用联合法后杀死白细胞所需要的紫外线B照射剂量明显小于单独用紫外线B照射。同样令人惊异的是，用一定强度的紫外线B附加处理血小板混悬液，虽然该强度单独时几乎起不到病毒灭活的作用，却可明显提高光动力学处理的效能。
本发明方法用于处理血小板混悬液，具有如下特征(A)在一种或多种光活性物质存在的条件下，以波长范围400-750nm，优选550-700nm的射线照射混悬液，这些光活性物质在此波长范围内具有一个或多个吸收高峰，和(B)以波长范围270-330nm，优选290-320nm的射线照射混悬液，其中步骤(A)和(B)可以任意顺序应用，即首先(A)然后(B)，或者首先(B)然后(A)，和/或两者可以时间上重叠应用。优选的实施形式为从属权利要求中的内容。
血小板混悬液浓度优选为5×108血小板/ml以上，尤其优选109血小板/ml以上。血小板可以例如混悬在血浆中或在一种任意血浆含量的血小板储藏剂中。
步骤A包括将血小板混悬液在一种光活性物质存在的条件下以可见光进行光动力学处理，步骤B包括将制剂 -即含血小板的混悬液-以紫外线B波长范围的光进行照射。本发明所指紫外线B范围的照射为270-330nm的波长范围。
所应用的光活性物质浓度以及光照和紫外线B照射的能量大小应能使可能存在的病毒灭活和使血小板混悬液中存在的白细胞杀死，但又能保持血小板的功能。
用作处理血小板混悬液的容器，使用紫外线B可穿透的容器，优选由塑料制成和例如袋样形式。但是也可以是分别在不同的容器中进行光动力学处理和紫外线B处理。
还可以在将血小板混悬液由一种容器转到另一种容器时进行血小板混悬液的紫外线B处理。
作为光活性物质，例如可以应用吩噻嗪染料亚甲基蓝、天青染料A、B、C以及硫堇。其它的光活性物质，例如按照文献已知的用于血制品病毒灭活的浓度，同样适于应用。应用吩噻嗪染料如硫堇时，可以考虑的浓度范围约为0.1-10μM之间，优选为约0.5-5μM或1-5μM。
作为光动力学处理的光源，尤其是应用硫堇时，优选低压钠蒸气灯，其最大光发射为590nm。这约相当于硫堇在水溶剂中的最大吸收约为595nm。当然还可以考虑其它的光源，尤其是当所应用的光活性物质吸收例如硫堇以外的其它波长范围的光源时。
用紫外线B照射时，可以应用特制的发射约270-330nm波长范围紫外线光的管、灯或激光。紫外线B照射的能量在0.1-10J/cm2范围之间，优选在0.3-6J/cm2范围之间，特别优选在0.5-3J/cm2范围之间。
实施例1.总论以下说明的实验是用血小板浓缩品进行的，它们由各个供血分离出来后混悬于血浆中。所应用的光活性物质为硫堇(Th)。当然用其它的光活性物质也获得类似的结果，例如吩噻嗪染料亚甲基蓝及其衍生物天青染料A、B和C。本发明只是以这些实施例加以说明，但其范围并非仅限于此。
2.材料和方法实验中所应用的血小板浓缩品在血小板旋转器中储藏至多5天。储藏容器为商店可获得的PVC袋。进行光动力学处理和紫外线B处理时将血小板浓缩品转移至聚烯烃塑料袋内，该塑料袋的薄膜材料可透紫外线B。在硫堇存在下进行照射时，应用设有低压钠蒸气灯的装置。将血小板浓缩品从二面进行照射。用紫外线B照射时，应用装置有紫外线管的平面照射仪，其发射的紫外线光主要在290-320nm波长范围内。
作为受测病毒一般应用水泡性口炎病毒(VSV)，该病毒易于在细胞培养皿中繁殖，因此也可以进行定量细胞变性效果测定。在实验1中此外还应用了一系列其它病毒。在Vero细胞中繁殖水泡性口炎病毒。这些细胞还用于传染性测定，以此来确定病毒效价。所应用的细胞培养基为含10％胎牛犊血清和抗菌素的RPMI培养基1640。在微量滴定板中进行测定。将相应样品在1-3步骤中稀释，每次稀释测定8个复制品。病毒效价以log10TCID50(TCID＝组织培养基感染剂量)表示，并且根据Kaerber和Spearman的预定指标进行计算(G.Kaerber在Naunym-Schmi edebers的病理药理学实验汇集162，480-483(1931)关于药理学序列实验中共同处理的专题报告；C.Spearman在英国心理学杂志2，277-282(1908)中不用mulae高斯的“正确和错误实例”(“恒定刺激”)的方法)。
应用低压冲击反应和胶原诱导的集聚作用进行血小板功能试验。
采用密度梯度离心分离法由供血中分离出单核细胞。在相关实验中将这些细胞以5×105/ml的浓度添加至血小板混悬液中。在光动力学处理和紫外线B照射后，将混悬液的等份进行低转速离心分离(1500rpm，4分钟)。将造球的细胞用细胞培养基(含10％胎牛犊血清和抗菌素的RPMI培养基1640)洗涤3次，然后在同一培养基中再混悬。将细胞浓度调节至5×105/ml。在增生测定时，将细胞用刀豆素A(ConA，2μg/ml)激活，然后以200μl等份液在37℃下在CO2烟熏的孵化器中孵化3-4天，然后添加至细胞培养皿中。4小时后在450nm波长(OD450)下以光谱测光法测定BRDU嵌入率(BRDU＝溴-去氧尿苷)。消光值与BRDU嵌入以及与细胞活性成比例。
实验1通过硫堇/光源处理使血小板浓缩品的病毒灭活通过试验观察一些病毒是否以及多大范围地能够被硫堇/光处理灭活。光活性物质的浓度为1μM。正如表1概括的结果所显示，不同病毒其敏感性也不一样人类肝炎C病毒、BVDV和CSFV的模式病毒以及Toga病毒SFV在5分钟照射后便已完全灭活，而VSV和SV-40的传染性在30分钟照射后仍没有被完全消除。
试验2通过紫外线B照射使血小板浓缩品的VSV灭活由表2可知VSV对紫外线B照射非常稳定，在60分钟或约20J/cm2能量的照射后病毒仍然没有被完全灭活。与此相反地，从约10分钟或3J/cm2开始，紫外线B照射对血小板的功能和贮存能力起着负作用(未显示)。
病毒 VSV CSFV BVDV SFV科杆 黄素 黄素 Toga基因组ssRNA ssRNA SSRNA SSRNA照射时间(分钟)30 5 5 5病毒效价的减低4.4 ≥5.5 ≥4.9 ≥5.2病毒 HIV-1 SHV-1 SV-40科后 疱疹 乳多泡病毒群基因组ssRNA dsDNA DsDNA照射时间(分钟)30 1030病毒效价的减低* ≥5.7 ≥3.6 ≥3.9表1通过硫堇/光处理使血小板浓缩品中病毒光动力灭活。VSV＝水泡性口炎病毒；CSFV＝古典猪发热病毒；BVDV＝牛病毒性腹泻病毒；SFV＝Semliki Forest病毒；HIV-1＝人类免疫缺陷病毒，1型；SHV-1＝Suid疱疹病毒，1型；SV-40＝猿猴病毒40；ssRNA＝单链RNA；dsDNA＝双链DNA；*病毒效价的减低以log10TCID50表示。
紫外线B病毒效价 减低因子分钟J/cm2 (log10TCID50) (log10TCID50)00 6.44010 3.255.480.9620 6.5 4.531.9130 9.754.352.09
4013 3.283.165016.252.334.116019.5 1.614.83表2通过紫外线B照射使血小板浓缩品中VSV灭活试验3通过联合应用吩噻嗪/光和紫外线B照射，使血小板浓缩品中VSV灭活在该试验中硫堇的浓度仍然为1μM、光照时间为30分钟。紫外线B照射能量为2.4J/cm2(照射时间8分钟)。仅仅通过光动力学照射便可将传染性降低4或4.42 log10，仅仅通过紫外线B照射便可将传染性降低1.97或2.21 log10。联合应用时，在第一项试验中传染性被完全排除(≥7.04log10)，在第二项试验中降低6.26log10(参见表3)。
传染性(log10LTCID50)硫堇/光 紫外线B 试验1 试验2--7.28±0.29 6.68±0.21+-2.86±0.31 2.68±0.12-+5.07±0.12 4.71±0.17++≤0.24±0.00 0.42±0.21表3通过硫堇/光、紫外线B和联合应用二步骤，使血小板浓缩品中VSV灭活。
试验4联合应用硫堇/光和紫外线B进行处理时对血小板功能的影响。
如表4和5所示，血小板浓缩品的低压冲击反应和胶原诱导的集聚作用，受到硫堇/光和紫外线B联合处理过程(试验条件见试验3)的影响，比较受到单独光动力学处理的影响，并没有明显增加。处理号试验1试验2 试验3第1天、第3天 第1天、第3天 第1天、第3天1对比 71.98 63.07 66.71 60.78 78.16 62.592硫堇/光 65.49 49.16 56.24 52.61 69.30 55.493紫外线B 61.06 57.09 56.26 48.80 65.67 52.49(2.4J/cm2)4硫堇/光+ 47.86 51.16 42.37 30.26 54.45 48.31紫外线B表4应用硫堇光±紫外线B处理血小板混悬液后第1天和第3天所测对低压冲击反应的影响(以％表示)。处理号 试验1 试验2 试验3第1天、第3天 第1天、第3天 第1天、第3天1对比 88.00 23.00 83.33 30.00 79.67 30.332吩噻嗪/光 73.25 13.75 84.67 27.67 69.67 15.673紫外线B76.25 11.25 73.33 24.50 75.67 20.00(2.4J/cm2)4吩噻嗪/光+ 69.75 16.75 76.67 53.50 58.33 30.33紫外线B表5应用硫堇/光±紫外线B处理血小板混悬液后第1天和第3天所测对胶原诱导的集聚作用的影响(以％表示)。
试验5血小板浓缩品中T淋巴细胞被紫外线B灭活；受到硫堇/光的影响。
向血小板浓缩品中添加5×105/ml浓度的单核细胞，然后在不同时间用紫外线B照射，或者单独或附加与硫堇/光一起进行处理(染料浓度2μM，照射时间；30分钟)。正如表6概括的结果所显示，完全灭活细胞需要至少4分钟(1.2J/cm2)的照射时间。如果附加应用硫堇/光进行处理血小板浓缩品，则时间可缩短至约3分钟，虽然硫堇/光单独不会对细胞的增生产生影响。号 紫外线B硫堇/光 刀豆素A吸收备注(J/cm2) 激活 OD450nm10 0 - 0.276负对比20 0 + 0.269对比30.6- + 1.76740.9- + 0.74751.2- + 0.29760.6+ + 1.02070.9+ + 0.38781.2+ + 0.240表6通过紫外线B照射使血小板浓缩品中T淋巴细胞灭活。预先用硫堇/光处理30分钟有强化作用，照射或硫堇/光处理后细胞用含刀豆素A激活。OD450nm值为3次测定数值的平均值，它们表示3天细胞培养后BRDU嵌入细胞的嵌入率。
权利要求
1.血小板混悬液的处理方法，包括以下步骤(A)在一种或多种光活性物质存在的条件下，用波长范围为400-750nm的射线照射混悬液，这些光活性物质在此波长范围内具有一个或多个吸收高峰，和(B)以波长范围270-330nm的射线照射混悬液，其中步骤(A)和(B)可以任意顺序应用和/或两者时间上重叠应用。
2.按照权利要求1的方法，其特征为，光活性物质为吩噻嗪染料。
3.按照权利要求2的方法，其特征为，作为吩噻嗪染料，可应用硫堇、亚甲基蓝、甲苯胺蓝和/或天青染料A、B和C。
4.按照权利要求2或3之一的方法，其特征为，光活性物质在步骤(A)中应用时浓度为0.5-10μM之间，优选为0.5-5μM。
5.按照上述权利要求之一的方法，其特征为，步骤(B)中照射的强度大小应能使血小板浓缩品中所含有的T淋巴细胞的增生能力至少降低50％，优选降低75％以上。
6.按照上述权利要求之一的方法，其特征为，步骤(B)的能量为在0.1-10J/cm2范围之间，优选在0.5-3J/cm2范围之间。
7.按照上述权利要求之一的方法，其特征为，步骤(B)中不存在于步骤(B)照射波长范围内具有最大吸收的光活性物质。
8.按照上述权利要求之一的方法，其特征为，血小板混悬液为血小板浓缩品。
9.按照上述权利要求之一的方法，其特征为，血小板混悬液或血小板浓缩品由供血获得或通过血小板转移而获得。
10.按照上述权利要求之一的方法，其特征为，按照步骤(A)和/或(B)在相应照射可穿透的塑料容器中进行混悬液处理。
11.按照上述权利要求之一的方法，其特征为，按照步骤(A)和/或(B)在相应照射可穿透的可流通容器中进行混悬液处理。
12.按照上述权利要求之一的方法，其特征为，混悬液的病毒浓度被降低至少5log10，优选至少6log10级别。
全文摘要
本发明内容为一种通过联合应用光动力学处理和紫外线B照射，在血小板混悬液中灭活病毒和杀死白细胞的方法。
文档编号A61L2/00GK1440297SQ01812297
公开日2003年9月3日 申请日期2001年7月4日 优先权日2000年7月4日
发明者H·莫尔 申请人:德国红十字会联邦州协会供血站下萨克森、萨克森－安哈特、图林根、奥尔登堡和不来梅有限公司