疫苗组合物的制作方法

专利名称：疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有至少一种抗原和一种免疫刺激物质的疫苗。
背景技术：
宿主免受病原体侵染的防护作用涉及细胞效应器和体液效应器而且该防护作用是非适应性(天然)免疫和适应性(获得性)免疫协同作用的结果。后者建立在由受体介导的特异性免疫识别的基础上，是一种最新认识到的免疫系统，而且仅存在于脊椎动物体内。前者在适应性免疫产生之前就形成了，由遍布机体的各种细胞和分子组成，负责使潜在病原体处于控制之下(Boman，H.(2000))，(Zanetti，M.(1997))。
B和T淋巴细胞是获得性抗原特异性适应性免疫的介质，所述获得性抗原-特异性适应性免疫包括免疫“记忆”的产生，免疫“记忆”的产生是创建有效疫苗的主要目标(Schijns，V.(2000))。抗原呈递细胞(APC)是高度特异性细胞，其能够加工抗原并将抗原的加工片段与淋巴细胞激活所需的分子一起陈列在细胞表面。这意味着APC对于引发特异性免疫反应非常重要。用于T细胞激活的主要APC是树突细胞(DC)、巨噬细胞和B细胞，而用于B细胞的主要APC是小结树突细胞。一般来说，DC是引发免疫应答的最强有力的APC，所述APC刺激休眠原初和记忆B和T淋巴细胞。
外周中的APC(例如DC或朗格汉斯细胞)的固有作用是捕捉并加工抗原，因而使其得到激活而开始表达淋巴细胞共刺激分子，迁移到淋巴器官，分泌细胞因子并将抗原呈递给不同种群的淋巴细胞，从而引发抗原特异性免疫应答。它们不仅在某些情况下激活淋巴细胞，而且还使T细胞对抗原耐受(Banchereau，J.(1998))。
通过T淋巴细胞进行的抗原识别是主要组织相容性复合体(MHC)-限制性的。只有当肽被结合到一种特定MHC分子上时，给定的T淋巴细胞才能识别抗原。一般来说，只有当自身MHC分子存在时，T淋巴细胞才能够得到刺激，而且只有当肽与自身MHC分子结合时，抗原才能得到识别。MHC限制确定了T淋巴细胞对被识别抗原的特异性以及对与其肽片段结合的MHC分子的特异性。
不但在识别方面而且在产生适当应答方面，胞内抗原和胞外抗原对免疫系统具有完全不同的攻击方式。抗原向T细胞的呈递是由两种截然不同类型的分子-I型MHC(MHC-I)和II型MHC(MHC-II)介导的，这两种分子采用了截然不同的抗原加工途径。人们大体上能够分清已经形成的两种主要抗原加工途径。由胞内抗原产生的肽通过I型MHC分子被呈递给CD8+T细胞，然后在实际上所有细胞上进行表达，而由胞外抗原产生的肽通过II型MHC分子被呈递给CD4+T细胞(Monaco，J.(1992)；Harding，C.(1995))。然而，这两种途径也有某些例外。一些研究已经表明由胞吞的颗粒性或可溶性蛋白产生的肽被呈递到巨噬细胞以及树突细胞中的MHC-I分子上(Harding，C.(1996)；Brossart，P.(1997))。因此APC如树突细胞是在体外和体内利用抗原对其进行胞外刺激过程中的目标靶子，所述APC位于外周，具有很高的捕捉和加工胞外抗原的效能并将MHC-I上的抗原呈递给T淋巴细胞。
包括对不同类型白细胞产生刺激作用在内的APC的重要和唯一作用是将其中心部位作为研制有效疫苗的合适策略的目标。从理论上讲，这样做的一种方式是增强或刺激它们的固有作用，即摄取抗原。一旦被所述疫苗定向抵抗的适当抗原刺激后，APC就应该开始对所摄取的抗原进行加工，由此而被激活，开始表达淋巴细胞共刺激分子，迁移到淋巴器官，分泌细胞因子并将抗原呈递给不同种群的淋巴细胞从而启动免疫应答。
被激活的T细胞通常以一种高度可调方式分泌多种效应细胞因子，例如白介素2(IL-2)，IL-4，IL-5，IL-10和γ干扰素(IFN-γ)。细胞毒性T淋巴细胞对特异性抗原(例如肿瘤抗原、一般是指被施用于疫苗当中的抗原)产生应答的功能性检测通常由ELISpot测定法(酶联免疫斑点测定法)，即一种在单细胞水平上分析细胞因子产生的技术来监控。在本发明中，促进细胞因子IFN-γ的细胞免疫的ELISpot测定法被用来监控肽-特异性T细胞的有效激活。
以前已经证明了聚阳离子能够有效增强肿瘤细胞对与I型MHC匹配的肽的摄入，即一种被称作″转运″的肽或蛋白的刺激过程(Buschle，M.(1997))。而且，我们已经证明聚阳离子能够在体内和体外将肽或蛋白“转运”到抗原呈递细胞中(Buschle，M.(1998))。另外，在小鼠模型中共同注射聚-L-精氨酸或聚-L-赖氨酸与作为疫苗的适当肽的混合物能够避免动物体内肿瘤的生长(Schmidt，W.(1997))。这种化学成分确定的疫苗能够诱导产生大量的抗原/肽特异性T细胞。这一点已被证明至少部分归因于由聚阳离子介导的肽向APC中的摄入被增强(Buschle，M.(1998))，表明一旦APC在体内被抗原刺激就能够诱导由T细胞介导的针对被施用抗原的免疫。
与其特征为高度特异性但应答较慢的适应性免疫相反，天然免疫是建立在效应物机制的基础上，所述效应物机制是由相对宿主微生物成分结构的不同而引发的。这些机制能启动非常快的初期应答，结果主要产生对有害物的中和作用。天然免疫反应只是低等动植物类的唯一防御方式并且已被保留在脊椎动物体内作为适应性免疫系统被调动起来之前的第一道宿主防线。
在高等脊椎动物体内，天然免疫的效应细胞是噬中性白细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞并且也可能是树突细胞(Mizukawa，N.(1999))，而该途径中的体液成分是补体级联和多种不同的结合蛋白(Boman，H.(2000))。
天然免疫的快速和有效成分是产生的多种长度通常在约12至约100个氨基酸残基之间的杀微生物肽。在从多孔动物、昆虫到动物和人的多种生物的体内已经分离出了几百种不同的抗微生物肽，表明这些分子分布的广泛性。抗微生物肽也可以由作为一种抵抗竞争生物体的拮抗物的细菌产生。
在EP0905141Al中公开了具有抗病毒活性的鲎抗-LPS因子(LALF)的肽片段。该ALF肽不特异性增强免疫应答但却增强单核细胞的非特异性防御并且还能以预防的方式进行使用或者所述肽还可以被局部涂敷在伤口上以便促使伤口的愈合和修复加快。
抗微生物肽的主要来源是嗜中性白细胞的颗粒体和排列在呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道上的上皮细胞。通常发现它们存在于最易受到微生物侵袭的解剖学部位，并且被分泌到内部体液中或被贮存在消化性吞噬细胞(嗜中性白细胞)的胞质颗粒体中(Ganz，T.(1997)；Ganz，T.(1998)；Ganz，T.(1999)；Boman，H.(2000)；Gudmundsson，GH.(1999))。
在先已经证明(澳大利亚专利申请A1416/2000)天然存在的、由cathelicidin-衍生的抗微生物肽或其衍生物具有免疫应答刺激活性因而成为高效佐剂。

发明内容
本发明的目的在于提供一种能够显著增强针对被共施用的特异性抗原的免疫应答因而成为高效佐剂的佐剂/“载体肽”。
该目的通过含有至少一种抗原和一种具有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽的疫苗来达到，其中-N是一个3至7的整数，优选地是5，-X是一种带正电荷的天然和/或非天然氨基酸残基，-Z是一种选自L，V，I，F和/或W的氨基酸残基，和-R1和R2分别独立地选自-H，-NH2，-COCH3，-COH，具有至多20个氨基酸残基的肽或肽反应基团或者含有或不含肽的肽接头；X-R2还可以是C-端氨基酸残基的酰胺、酯或硫酯。
除了天然存在的抗微生物肽外，还对合成的抗微生物肽进行了生产和研究。合成抗微生物肽KLKLLLLLKLK-NH2已被证明对被金黄色葡萄球菌感染的小鼠具有明显的化学治疗活性；人嗜中性白细胞通过细胞表面钙网蛋白激活后产生超氧阴离子(O2-)。已经发现K和L的准确数目和位置对于合成肽的抗微生物活性是关键的(Nakajima，Y.(1997)；Cho，J-H.(1999))。
目前已经惊奇地证明在本发明的过程中，本发明的含有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽(在下文中被称作“A肽”)能够比包括天然抗微生物肽在内的已知佐剂更加有效地将抗原肽或蛋白转运到APC中，其中，-N是3至7的整数，优选地是5，-X是带正电荷的天然和/或非天然氨基酸残基，-Z是一种选自L，V，I，F和/或W的氨基酸残基，和-R1和R2分别独立地选自-H，-NH2，-COCH3，-COH，具有至多20个氨基酸残基的肽或肽反应基团或者含有或不含肽的肽接头；X-R2还可以是C-端氨基酸残基的酰胺、酯(或甚至硫酯)。本发明的肽还具有很强的免疫应答刺激活性因而成为高效佐剂。
优选地，所述C-端不被修饰(COOH或COO-)，因为这种形式的肽比酰胺化形式的肽甚至更有效。
在本发明的范围内，所述序列的羧基端可以被酰胺化或携带另一个氨基酸序列，然而优选地，所述羧基端是游离的。
而且，在本发明的范围内，含在A肽中的所有X可以代表相同的氨基酸残基。然而优选地，在一种A肽中，X只代表一种特定的氨基酸残基，例如K或R等。同样的情况也适用于Z所述A肽中的所有Z可以是单独一个种类的氨基酸或不同种类的氨基酸例如L或V等。对于所述序列式中间的ZN部分来说尤其是这样，其中ZN可以是例如L5或L3和LVIFW，LILFLLIW，WIF，W3L2，以及这个基元的所有其它组合方式，长度为3至7个氨基酸，优选地为4至6个氨基酸残基，特别优选地为5个氨基酸残基。这些残基对于R1和R2部分也是优选的(例如，如果R1和/或R2是肽的话，则多于50％，优选地多于80％，特别优选地多于90％的R1和/或R2是L，I，F，V和/或W)。优选地R1和R2是相同的，有利地是它们都是H(即游离的氨基-或羧基端)。
在本发明的范围内，术语“非天然的”分别包括不是天然存在的和不存在于天然蛋白质中的任何氨基酸残基。
肽R1-KLKL5KLK-R2是特别优选的，然而R1-KIKL5KIK-R2，R1-KVKL5KVK-R2，R1-KFKL5KVK-R2，R1-KLKL6KLK-R2，R1-KWKW5KLK-R2，R1-KWKWL3WKWK-R2，R1-KLKL4KLK-R2或I，F，V，W和L位置的变换也是有利的。
当然，根据所需要的免疫应答，疫苗可以含有两种或多种抗原。所述抗原也可以是被修饰的以便进一步增强免疫应答。
优选地，由病毒或细菌病原体，由真菌或寄生虫产生的蛋白质或肽，以及肿瘤抗原(癌症疫苗)或被推测在自身免疫疾病中起作用的抗原被用作抗原(包括衍生化的抗原如糖基化的、脂化的、糖脂化的或羟基化的抗原)。而且，碳水化合物、脂类或糖脂本身可以被用作抗原。衍生化方法可包括特异性蛋白质或肽从病原体中的纯化，病原体的灭活以及这种蛋白质或肽的蛋白水解或化学衍生化或稳定化。或者，所述病原体本身也可以被用作抗原。所述抗原优选地是肽或蛋白质、碳水化合物、脂类、糖脂或其混合物。
根据优选的实施方案，T细胞表位被用作抗原。另外，T细胞表位和B细胞表位的组合也可以是优选地。
被用于本发明组合物中的抗原不是关键的。不同抗原的混合物当然也可以被用于本发明。优选地，由病毒或细菌病原体或由真菌或寄生虫产生的蛋白质或肽被用作这类抗原(包括衍生化抗原或糖基化或脂化抗原或多糖或脂类)。另一种优选的抗原来源是肿瘤抗原。优选的病原体选自人免疫缺陷病毒(HIV)，甲型和乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒(HCV)，劳斯肉瘤病毒(RSV)，EB病毒(EBV)，流感病毒，轮状病毒，金黄色葡萄球菌，肺炎衣原体，沙眼衣原体，结核分枝杆菌，肺炎链球菌，炭疽芽孢杆菌，霍乱弧菌，疟原虫属(恶性疟原虫，间日疟原虫等)，曲霉属菌种或白色念珠菌。抗原也可以是由癌细胞表达的分子(肿瘤抗原)。所述衍生化方法可以包括特异性蛋白质从病原体/癌细胞中的纯化，病原体的灭活以及这种蛋白质的蛋白水解或化学衍生化或稳定化。肿瘤抗原(癌症疫苗)或自身免疫抗原也可以同样的方式被用于本发明的药物组合物中。利用这类组合物可以进行肿瘤疫苗接种或自身免疫疾病的治疗。
对于肽类抗原而言，肽类模拟表位(mimotopes)/激动剂/超激动剂/拮抗剂或某些位点被改变而免疫学特性未受影响的肽类或非肽类模拟表位/激动剂/超激动剂/拮抗剂的用途被包括在本发明中。肽类抗原还可以在肽类抗原的羧基端或氨基端含有延长序列从而有利于与聚阳离子化合物或免疫刺激化合物发生相互作用。肽拮抗剂可以被用于自身免疫疾病的治疗。
抗原还可以被衍生化以便包括能够增强抗原呈递和抗原向抗原呈递细胞定向的分子。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物适用于提供对自身免疫疾病中所涉及的蛋白质或蛋白片段和肽的耐受性。在该实施方案中使用的抗原足以耐受免疫系统或降调节针对自身免疫过程中所涉及到的表位的免疫应答。
优选地，所述抗原是一种由5至60个，优选地6至30个，特别优选地8至11个氨基酸残基组成的肽。该长度的抗原已被证明特别适于T细胞的激活。所述抗原可进一步与一个尾部进行偶联，例如参见A657/2000，US5,726,292或WO98/01558。
所述抗原可与本发明的肽进行混合或者具体被配制成例如脂质体、延缓制剂等。所述抗原还可以与本发明的肽进行共价或非共价连接。优选地，所述抗原与肽如R1或R2残基或与肽的氨基酸残基侧链进行共价连接，特别优选地是与K和R侧链进行共价连接。
本发明组合物的组分的相对含量主要取决于每个组合物的需要。优选地，使用10ng至1g的抗原和A肽。每一次疫苗接种的抗原/A肽的优选含量介于0.1至1000μg的抗原以及0.1至1000μg的A肽。本发明的组合物可进一步含有辅助物质，如缓冲剂、盐、稳定剂、免疫刺激剂、抗氧化剂等，或其它有效物质，如抗炎症药物或抗损伤药物。
可以例如以每星期、两个星期或每月的间隔给患者，例如疫苗接种受试者，施用有效量的本发明组合物。准备采用本发明组合物进行治疗的患者还可以反复进行疫苗接种或只接种一次。本发明的一个优选用途是主动免疫，尤其是不能抵抗特异性抗原的人或动物的主动免疫。
本发明的组合物可以以皮下、肌内、直肠、静脉内、皮内、耳廓内、经皮以及口服的形式进行施用。
当然，本发明的疫苗可含有任何其它物质，例如任何其它药用载体等。本发明的疫苗可按照已知的方法被配制成，例如静脉内疫苗，DNA疫苗，经皮疫苗，局部疫苗，鼻内疫苗和组合疫苗。可以通过标准方法来选择已知疫苗的改进疫苗的剂量，然而，比已知疫苗剂量低的剂量可能达到相同的保护作用因而是优选的。
优选地，所述疫苗是以一种贮存稳定的形式来提供的，例如以冻干形式来提供，任选地以与一种合适的重构溶液结合的方式来提供。
本发明的氨基酸残基可以是D-或L-氨基酸。优选地，全部或至少80％以上的残基只属于一个种类(D或L)。最优选地，本发明肽中的全部氨基酸属于相同的种类(D或L)。本发明的某些形式的肽还可以含有被插到A肽序列中的附加氨基酸残基，然而，在所述肽的疏水部分(Z，ZN)中不应当含有A，G和T残基。
优选地，在肽序列中，X是一个选自由K，R，鸟氨酸和/或高精氨酸组成的一组的氨基酸残基。而且，一个A肽中的X可以是选自该组的不同氨基酸残基，然而优选地是在一个A肽中X是K或R或鸟氨酸或高精氨酸。
根据本发明的一个优选实施方案，在肽序列中，X是K。含有该氨基酸如X的A肽已被证明在诱导免疫应答的过程中具有特别强的作用。
优选地，在肽序列中，Z选自L，V，I，F和/或W。就象X一样，在一个A肽中，Z也可代表不同的氨基酸残基。然而，优选地是一个A肽的Z只是一种氨基酸残基，例如是L或V或I或F或W，其中L和I残基是最优选的，接着依次为F，V和W(L＞I＞F＞V＞W)。
更优选地是，在A肽序列中，Z是L(或I，特别是L)。因此，A肽能够诱导特别强的免疫应答。
最优选地是，A肽是H-KLKLLLLLKLK-H。当然，该肽的生理形式(例如具有质子化的N-端(NH3+)和去质子化的C-端(COO-))也应当认为是被包含在该序列式中(就本发明的所有肽而言)。
根据另一个有利的实施方案，在肽序列中，R1和/或R2是10至20个氨基酸残基。因而提供了其长度足以诱导或增强特别强的免疫应答的A肽。
根据本发明的一个有利的实施方案，R1和/或R2的氨基酸残基是不带负电荷的氨基酸残基。
而且，所述氨基酸残基可以是天然的和/或非天然的氨基酸残基。通过在A肽的一端或两端添加不带负电荷的氨基酸残基，该肽显示出很强的增强或诱导免疫应答的能力。
优选地，R1和/或R2形成了A肽的疏水性尾部。因此，R1和/或R2的氨基酸残基优选地选自L，V，I，F和/或W。更优选地是，R1和/或R2的氨基酸残基选自L，I和/或F。最优选地是，所述附加氨基酸残基是L。这些A肽具有特别强的诱导较强的免疫应答的能力。
根据本发明的一个优选实施方案，R1和/或R2的氨基酸残基是带正电荷的天然的和/或非天然的氨基酸残基。优选地，所述附加氨基酸残基选自K，R，鸟氨酸和/或高精氨酸。更优选地，R1和/或R2的氨基酸残基是K。这些A肽还具有特别好的增强免疫应答的能力。
优选地是，R1和/或R2的氨基酸残基选自第一组(由L，V，I，F和/或W组成)或第二组(由带正电荷的氨基酸残基组成)。然而，对于单独一个A肽来说，R1和/或R2的氨基酸残基还可以同时选自两组。
通过正常的肽键或通过肽反应基团或肽接头可以将肽连接到本发明A肽的核心部分。肽反应基团是适于连接肽或蛋白质的化学基团。因此，本发明A肽的N-或C-端可以分别被化学修饰成含有一个能够共价连接肽或抗原的化学修饰基团(例如亚氨基硫烷，3-巯基丙酰，...)。另外，A肽可含有一个合适的肽接头，即一个能够在核心A肽(例如不含R1和/或R2的肽)和例如一种被连接在或可连接在其上的抗原之间形成键的接头分子。本发明的肽可以含有或不含肽/待连接到该肽反应基团上的抗原和/或肽接头。这类化学修饰基团或合适的肽接头对于本技术领域的技术人员来说是容易得到的。
优选地，所述疫苗含有至少一种另外的免疫应答刺激物质。可以使用任何已知起佐剂作用的物质或分子作为免疫应答刺激物质。这类物质被公开在WO93/19768中。其它物质可以例如是聚阳离子，例如聚赖氨酸或聚精氨酸。其它佐剂可以是颗粒状的组分，例如硅胶或葡聚糖珠粒，所述颗粒足够小以便能够进入到细胞中。加入这种另外的免疫应答刺激物质将使疫苗更加有效。
优选地，本发明的药物组合物，特别是疫苗形式的药物组物进一步含有聚阳离子聚合物，优选地含有聚阳离子肽，尤其是聚精氨酸、聚赖氨酸或一种抗微生物肽。
本发明使用的聚阳离子化合物可以是任何具有WO97/30721中所述特有效果的聚阳离子化合物。优选的聚阳离子化合物选自碱性多肽、有机聚阳离子、碱性聚氨基酸或其混合物。这些聚氨基酸应当具有一条长度至少为4个氨基酸残基的链。特别优选地是含有肽键的物质，如聚赖氨酸、聚精氨酸和多肽，该多肽含有20％以上，特别是50％以上的长度为8个以上，特别是20个以上氨基酸残基的碱性氨基酸或其混合物。其它优选的聚阳离子及其药物组合物被记载在WO97/30721(聚乙烯亚胺)和WO99/38528中。这些多肽优选地含有20至500个氨基酸残基，特别优选地含有30至200个残基。
这些聚阳离子化合物可以通过化学或重组的方法来生产或可以得自天然来源。
阳离子(多)肽还可以是聚阳离子的抗菌的微生物肽。这些(多)肽可以是原核生物来源的或真核生物来源的或者可以通过化学或重组的方法来生产。肽还可以属于天然存在的抗微生物肽类。这类宿主防卫肽或防御肽也是本发明的一种优选形式的聚阳离子聚合物。通常，将能够使适应性免疫系统的终产物活化(或降调节)的化合物被用作聚阳离子聚合物，优选地所述活化是通过APC(包括树突细胞)介导的。
被用作本发明的特别优选的聚阳离子物质是由cathelicidin衍生的抗微生物肽或其衍生物(A1416/2000，被引入本文作参考)，特别是由哺乳动物cathelicidins衍生的抗微生物肽，优选地是由人、牛或鼠cathelicidins衍生的抗微生物肽。
而且，神经活性化合物如(人)生长激素(例如WO01/24822中所记载的)也可以被用作免疫刺激剂。
得自天然来源的聚阳离子化合物包括HIV-REV或HIV-TAT(衍生的阳离子肽、触角足肽、脱乙酰壳多糖或壳多糖的其它衍生物)或通过生物化学或重组生产由这些肽或蛋白质得到的其它肽。其它优选的聚阳离子化合物是cathelin或相关的或衍生的cathelicidin物质，特别是鼠、牛或特别是人cathelicidins和/或cathelicidins。相关的或衍生的cathelicidin物质含有具有至少15-20个氨基酸残基的cathelicidin序列的全部或部分序列。衍生化可以包括由20个常规氨基酸以外的氨基酸对天然氨基酸进行的取代或修饰。而且，还可以将其它阳离子残基引入到这类cathelicidin分子中。这些cathelicidin分子优选地是与本发明的抗原/疫苗组合物结合。然而，令人惊奇地是，这些cathelin分子已被证明也能有效作为抗原的佐剂而不需要添加其它佐剂。因此有可能将这类cathelicidin分子作为疫苗制剂中的有效佐剂，所述疫苗制剂含有或不含其它免疫激活物质。
优选地，所述免疫应答刺激物质是一种细胞因子。细胞因子在对B细胞、T细胞和NK细胞、巨噬细胞、树突细胞和各种其它参与诱导免疫应答的细胞进行激活或刺激的过程中起着重要的作用。任何可以额外地增强针对抗原的免疫应答的细胞因子都可以被使用。
优选地，本发明的疫苗进一步含有免疫刺激/免疫原性核酸，优选地含有一种含有脱氧肌苷的寡脱氧核苷酸、一种含有脱氧尿苷的寡脱氧核苷酸、一种含有甲基化的或非甲基化的CG基元的寡脱氧核苷酸或一种含有肌苷和胞苷的核酸分子。
可被用于本发明的免疫原性核酸可以是合成的、原核生物和真核生物来源的。当为真核生物来源时，DNA应当得自基于系统树发育较差的物种(例如昆虫，但也可以是其它的物种)。在本发明的一个优选实施方案中，所述免疫原性寡脱氧核苷酸(ODN)是一种合成生产的DNA分子或这类分子的混合物。还包括ODN的衍生物或修饰物如例如被记载在US5,723,335和US5,663,153中的被硫代磷酸酯取代的类似物(硫代磷酸酯残基取代磷酸酯)和其它衍生物或修饰物，所述衍生物或修饰物优选地稳定免疫刺激组合物而不改变其免疫学特性。一种优选的序列基元是含有(非甲基化的)CpG二核苷酸的六碱基DNA基元，所述CpG二核苷酸的侧面连接着两个5′嘌呤和两个3′嘧啶(5′-Pur-Pur-C-G-Pyr-Pyr-3′)。含在本发明ODN中的CpG基元在微生物的DNA中比在高等脊椎动物的DNA中更常见并且甲基化的模式不同。令人惊奇地是，刺激小鼠APC的序列对于人细胞不十分有效。被用于本发明的优选回文或非回文ODN被公开在例如澳大利亚专利申请A1973/2000，A805/2001，EP0468520A2，WO96/02555，WO98/16247，WO98/18810，WO98/37919，WO98/40100，WO98/52581，WO98/52962，WO99/51259和WO99/56755中，所有这些文献被引入本文作为参考。除了刺激免疫系统之外，某些ODN还中和一些免疫应答。这些序列也被包括在本发明中，例如被用于自身免疫疾病的治疗。ODN/DNA可以通过化学或重组的方法来生产或者可以得自于天然来源。优选的天然来源是昆虫。
或者，基于肌苷和胞苷的核酸(例如PCT/EP01/06437中所记载的)或含有脱氧肌苷和/或脱氧尿苷残基的脱氧核苷酸(被记载在澳大利亚专利申请A1973/2000和A805/2001中，引入本文作为参考)也可以被优选地用作本发明的免疫刺激核酸。
当然，不同免疫原性核酸的混合物也可以被用于本发明。
本发明的另一方面涉及含有如上文定义的序列R1-XZXZNXZX-R2的肽(A肽)用于制备能够增强针对至少一种抗原的免疫应答的佐剂的用途。
根据本发明的一个优选的实施方案，所述佐剂被添加到疫苗中。当然可以直接给哺乳动物施用所述佐剂，例如优选地在接种疫苗之前进行施用。然而，将所述佐剂添加到疫苗中然后同时给哺乳动物施用使施用更加容易。
本发明的另一方面涉及一种对包括人在内的哺乳动物进行疫苗接种从而抵抗一种特异性抗原或一组特异性抗原的方法，所述方法包括给待接种疫苗的包括人在内的哺乳动物施用有效量的本发明的疫苗。或者，所述方法包括施用有效量的含有上述A肽的佐剂，然后再施用疫苗。
本发明将通过下列实施例和附图得到更加详细的描述，但是本发明显然不局限于此。
图2显示了与其它肽相比本发明的肽变异体的有效性。
图3显示了通过采用抗原肽并结合采用(合成的抗微生物)肽KLKLLLLLKLK进行了疫苗接种的小鼠体内存在的IFN-γ-产生细胞的数量。
具体实施例方式
实施例1以合成抗微生物肽作为“载体肽”转运小鼠的巨噬细胞为了测试(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK是否能够作为抗原的“载体-肽”在体外转运APC，也就是说增强抗原向APC中的摄入，将被荧光标记的肽用作抗原肽。将抗原肽与不同浓度的KLKLLLLLKLK和其它上述“载体-肽”按照所示方法进行混合。
为了比较这些不同“载体-肽”的肽递送效率，通过在37℃下将P388D1细胞(小鼠单核细胞-巨噬细胞抗原呈递细胞系；购自ATCC(TIB-63))与恒量的荧光素标记的肽单独或与所示浓度的不同“载体-肽”一起培养1小时来监测摄入到APC中的肽量。在利用流式细胞光度法进行分析之前，对细胞充分进行冲洗从而去掉游离肽。利用流式细胞光度法测定被细胞摄取的被荧光素标记的肽的量。
所使用的抗原肽是一种流感-血细胞凝集素衍生的I型MHC(Kd)结合肽(Buschle，M.(1997))。将2μg的这种抗原肽(FL-LFEAIEGFI)与3种不同量的每种载体肽进行混合，在代表101.7，50.9和5.09nmol正电荷的浓度下对所述载体肽进行了测试。(

图1显示了与只有肽的情况相比肽摄入增强的成倍增加)与下列成分混合的肽FL-LFEAIEGFI(1)+聚-L-精氨酸(pR60；60聚体)(2)+小鼠cathelicidin衍生的抗微生物肽(mCRAMP)；SEQ ID.No.2(3)+LL-37；SEQ ID.No.3(4)+L-indolicidin；SEQ ID.No.4(5)+KLKLLLLLKLK(游离C-端)；SEQ ID.No.1(6)+线性牛十二肽；SEQ ID.No.5(7)+环化牛十二肽尽管已知在只用肽处理的细胞中荧光稀疏(如前面所说明的)，在被作为“载体肽”的(合成的抗微生物)肽KLKLLLLLKLK转运的细胞中却特别发现了“被转运的”细胞的强烈荧光，表明该载体肽能够与抗原肽一起对APC进行非常有效的刺激。
实施例2采用作为“载体肽”的不同合成抗微生物肽转运小鼠巨噬细胞对R1-XZXZNXZX-R2序列的不同合成抗微生物肽作为抗原的“载体肽”在体外转运APC的功能，即增强抗原向APC中的摄入功能进行了测试。为了该目的，将荧光标记的肽用作抗原肽。将抗原肽与不同浓度的含有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽和其它上述“载体肽”按照所示方法进行混合。
为了比较这些不同“载体-肽”的肽递送效率，通过在37℃下将P388D1细胞(小鼠单核细胞-巨噬细胞抗原呈递细胞系；购自ATCC(TIB-63))与恒量的荧光素标记的肽单独或与所示浓度的不同“载体-肽”一起培养1小时来监测摄入到APC中的肽量。在利用流式细胞光度法进行分析之前，对细胞充分进行冲洗从而去掉游离肽。利用流式细胞光度法测定被细胞摄取的荧光素标记的肽的量。
所使用的抗原肽是一种流感-血细胞凝集素衍生的-I型MHC(Kd)结合肽(Buschle，M.(1997))。将3μg的这种抗原肽(FL-LFEAIEGFI)与3种不同量的每种载体肽进行混合，在代表101.7，50.9和5.09nmol正电荷的浓度下对所述载体肽进行了测试。(图1显示了与只有肽的情况相比肽摄入增强的成倍增加)与下列成分混合的肽FL-LFEAIEGFI(1)+聚-L-精氨酸(60聚体)(2)Hp(2-20)，一种得自幽门螺杆菌中的核糖体蛋白L1的杀菌肽样抗菌肽；SEQ ID.No6(3)LALF-肽SEQ ID No7(4)小鼠cathelicidin衍生的抗微生物肽；SEQ ID No2(5)KAKAAAAAKAK-NH2；SEQ ID.No8(6)KGKGGGGGKGK-NH2；SEQ ID.No9(7)KTKTTTTTKTK-NH2；SEQ ID.No10(8)KLKLVIFWKLK-NH2；SEQ ID.No11(9)KVKVVVVVKVK-NH2；SEQ ID.No12(10)KWKWWWWWKWK-NH2；SEQ ID.No13(11)KFKFFFFFKFK-NH2；SEQ ID.No14
(12)RLKLLLLLKLR-NH2；SEQ ID.No15(13)RLRLLLLLRLR-NH2；SEQ ID.No16(14)KLKLLLLLKLK-NH2；SEQ ID.No17(15)KLKLLLLLKLK-COOH(游离C-端)；SEQ ID.No.1。
尽管已知在只用肽处理的细胞中荧光稀疏(如前面所说明的)，在被作为“载体肽”的含有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽(包括上述优选的实施方案)转运的细胞中却特别发现了“被转运的”细胞的强烈荧光，表明本发明的肽能够与抗原肽一起对APC进行非常有效的刺激。
实施例3测试增强体内诱导肽特异性T细胞应答的能力为了测试(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK增强体内诱导肽特异性T细胞应答的能力，给几组的小鼠，每组包括4只小鼠(C57BL/6，雌性，8周龄，H-2b)，单独侧腹皮下注射得自TRP-2(小鼠酪氨酸酶相关蛋白-2)的抗原黑色素瘤肽(100μg)，或者与作为“载体肽”的聚-L-精氨酸或(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK一起侧腹皮下注射得自TRP-2(小鼠酪氨酸酶蛋白-2)的抗原黑色素瘤肽(100μg)，共注射3次(第0，28和56天)。(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK的用量为在以下浓度下的四种不同的量，所述浓度代表以μg表示的等量(100μg)的聚-L-精氨酸、以正电荷表示的等量(168μg)、二倍量(336μg)和三倍量(504μg)的聚-L-精氨酸。按照以下方式给几组小鼠进行注射(所示量/每只小鼠)。
(1)100μg肽(2)100μg肽+100μg聚-L-精氨酸(pR60)(3)100μg肽+100μg KLKLLLLLKLK(4)100μg肽+168μg KLKLLLLLKLK(5)100μg肽+336μg KLKLLLLLKLK(6)100μg肽+504μg KLKLLLLLKLK12
第3次接种疫苗后的第12天，取出引流(腹股沟的)淋巴结并利用TRP-2衍生的(小鼠酪氨酸酶相关蛋白-2)肽离体激活淋巴结细胞(图3)以便用ELISpot测定法确定产生IFN-γ的特异性细胞(每一百万个淋巴结细胞的IFN-γ-ELISpots的数目)。
图3显示了采用肽与递增量的KLKLLLLLKLK对小鼠进行注射所产生的特异性IFN-γ产生细胞比单独采用肽或采用肽与聚-L-精氨酸进行注射所产生的特异性IFN-γ产生细胞多。也已经证实了肽KLKLLLLLKLK没有引发产生IFN-γ的肽特异性T细胞(通过ELISpot测定被证实)，即在本实验中只获得了非KLKLLLLLKLK特异性T细胞。
该实施例清楚地表明(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK可增强肽特异性T细胞应答的体内诱导。
总之，(合成抗微生物)肽KLKLLLLLKLK具有很高的“转运”和免疫刺激效率，表明A肽与抗原性肽能够在体外和体内非常有效地刺激APC并且在诱导适应性免疫应答的过程中是抗原性肽的优良佐剂/“载体肽”。
参考文献Banchereau，等(1998)，“树突细胞和免疫控制(Dendritic cellsand the control of immunity)”，自然(Nature)392(6673)245-52。
Boman(2000)，“天然免疫和正常微生物区系(Innate immunityand the normal microflora)”，免疫学评论(Immunol.Rev)1735-16。
Brossart，等(1997)，“外源蛋白抗原通过树突细胞在主要组织相容性复合体I型分子上的呈递(Presentation of exogenous proteinantigens on major histocompatibility complex class I molecules bydendritic cells)通过细胞因子的呈递和调节途径(pathway ofpresentation and regulation by cytokines)”，血液(Blood)90(4)1594-9。
Buschle，等(1998)，“化学成分确定的，不含细胞的癌疫苗(Chemically defined，cell-free cancer vaccines)肿瘤抗原衍生肽或多表位蛋白用于疫苗接种的用途(use of tumor antigen-derived peptidesor polyepitope proteins for vaccination)”，基因治疗和分子生物学(Gene Therapy and molecular Biology)1309-21。
Buschle，等(1997)，“肿瘤抗原衍生肽向抗原呈递细胞中的转运(Transloading of tumor antigen-derived peptides intoantigen-presenting cells)”，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)94(7)3256-61。
Cho，等(1999)，“通过细胞表面钙网蛋白，由合成抗微生物肽KLKLLLLLKLK-NH2对人嗜中性白细胞的激活(Activation of humanneutrophils by a synthetic anti-microbial peptide，KLKLLLLLKLK-NH2，via cell surface calreticulin)”，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem)266878-85。
Ganz，等(1997)，“白细胞的抗微生物肽(Antimicrobial peptidesof leukocytes)”，血液学最新评述(Curr.Opin.Hematol)4(1)53-8。
Ganz，T.，(1998)，“脊椎动物的抗微生物肽(Antimicrobial peptidesof vertebrates)”，免疫学最新评述(Curr.Opin.Immunol).10(1)41-4。
Ganz，等(1999)，“源于高等真核生物的抗菌肽(Antibioticpeptides from higher eukaryotes)生物学及其应用(biology andapplications)”，今日分子医学(Mol.Med.Today)5(7)292-7。
Gudmundsson，等(1999)，“哺乳动物免疫系统中的嗜中性白细胞抗菌肽，多功能效应分子(Neutrophil antibacterial peptides，multifunctional effector molecules in the mammalian immune sys-tem)”，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)232(1-2)45-54。
Harding(1995)，“用于通过MHC分子呈递的抗原的吞噬加工(Phagocytic processing of antigens for presentation by MHCmolecules)”，细胞生物学的发展趋势(Trends in Cell Biology)5(3)105-09。
Harding(1996)，“外源抗原的I型MHC呈递(Class I MHCpresentation of exogenous antigens)”，临床免疫学杂志(J.Clin.Immunol)16(2)90-6。
Mizukawa，等(1999)，“防卫素在与口腔癌和癌前期病变邻接的郎格汉斯上皮细胞中的出现(Presence of defensin in epithelialLangerhans cells adjacent to oral carcinomas and precancerouslesions)”，抗癌研究(Anticancer Res.)19(4B)2669-71。
Monaco(1992)，“I型MHC限制性抗原加工的分子模型(Amolecular model of MHC class-I-restricted antigen processing)”，今日免疫学(Immunol.Today)13(5)173-9。
Nakajima，等(1997)，“合成抗微生物肽的化学治疗活性(Chemotherapeutic activity of synthetic antimicrobial peptides)化学治疗活性与嗜中性白细胞激活活性之间的关系(correlation betweenchemotherapeutic activity and neutrophil-activating activity)”，FEBS通讯(FEBS Lett)4156466。
Schijns(2000)，“疫苗佐剂活性的免疫学概念(Immunologicalconcepts of vaccine adjuvant activity)”，免疫学最新评述(Curr.Opin.Immunol)12(4)456-63。
Schmidt，等(1997)，“以不含细胞的肿瘤抗原肽为基础的癌症疫苗(Cell-free tumor antigen peptide-based cancer vaccines)”，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)94(7)3262-7。
Zanetti，等(1997)，“cathelicidin族的抗菌肽前体(Thecathelicidin family of antimicrobial peptide precursors)嗜中性白细胞的不依赖于氧的防御机制的元件(a component of theoxygen-independent defense mechanisms of neutrophils)”，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sc)832147-62。
序列表<110>Cistem Biotechnologies GmbH<120>疫苗组合物<130>R38239<140><141><160>17<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<400>1Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys1 5 10<210>2<211>31<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<400>2Arg Leu Ala Gly Leu Leu Arg Lys Gly Gly Glu Lys Ile Gly Glu Lys1 5 10 15Leu Lys Lys Ile Gly Gln Lys Ile Lys Asn Phe Phe Gln Lys Leu20 25 30<210>3<211>37<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<400>3Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu1 5 10 15Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val20 25 30Pro Arg Thr Glu Ser35<210>4<211>13<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(13)<223>酰胺化<400>4Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg1 5 10<210>5<211>12<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<400>5Arg Leu Cys Arg Ile Val Val Ile Arg Val Cys Arg1 5 10<210>6<211>19<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<400>6Ala Lys Lys Val Phe Lys Arg Leu Glu Lys Leu Phe Ser Lys Ile Gln1 5 10 15Asn Asp Lys<210>7<211>10<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<400>7Arg Ile Lys Pro Thr Phe Arg Arg Leu Lys1 5 10<210>8<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>8Lys Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Lys Ala Lys1 5 10<210>9<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>9Lys Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Gly Lys1 5 10<210>10<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>10Lys Thr Lys Thr Thr Thr Thr Thr Lys Thr Lys1 5 10<210>11<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>11Lys Leu Lys Leu Val Ile Phe Trp Lys Leu Lys1 5 10<210>12<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>12Lys Val Lys Val Val Val Val Val Lys Val Lys1 5 10<210>13<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>13Lys Trp Lys Trp Trp Trp Trp Trp Lys Trp Lys1 5 10<210>14<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>14Lys Phe Lys Phe Phe Phe Phe Phe Lys Phe Lys1 5 10<210>15<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>15Arg Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Arg1 5 10<210>16<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>16Arg Leu Arg Leu Leu Leu Leu Leu Arg Leu Arg1 5 10<210>17<211>11<212>PRT<213>合成序列<220><223>合成序列的种类肽<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>酰胺化<400>17Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys1 5 10
权利要求
1.疫苗，其特征在于该疫苗含有至少一种抗原和一种具有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽，其中-N是一个3至7的整数，优选地是5，-X是一种带正电荷的天然和/或非天然氨基酸残基，-Z是一种选自L，V，I，F和/或W的氨基酸残基，和-R1和R2分别独立地选自-H，-NH2，-COCH3，-COH，具有至多20个氨基酸残基的肽或肽反应基团或者含有或不含肽的肽接头；X-R2还可以是C-端氨基酸残基的酰胺、酯或硫酯。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的X是一种选自K、R、鸟氨酸和/或高精氨酸的氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的X是K。
4.如权利要求1至3中任一项所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的Z选自L、I和/或F。
5.如权利要求4所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的Z是L。
6.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于所述肽序列是H-KLKLLLLLKLK-H。
7.如权利要求1至6中任一项所述的疫苗，其特征在于所述肽序列中的R1和/或R2是10至20个氨基酸残基。
8.如权利要求7所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸残基是不带负电荷的氨基酸残基。
9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸残基选自L、V、I、F和/或W。
10.如权利要求9所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸残基选自L、I和/或F。
11.如权利要求10所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸残基是L。
12.如权利要求7至11中任一项所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸残基是带正电荷的天然和/或非天然氨基酸残基。
13.如权利要求12所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸残基选自K、R、鸟氨酸和/或高精氨酸。
14.如权利要求13所述的疫苗，其特征在于所述R1和/或R2的氨基酸残基是K。
15.如权利要求1至14中任一项所述的疫苗，其特征在于该疫苗含有至少一种其它的免疫应答刺激物质。
16.如权利要求1至15中任一项所述的疫苗，其特征在于该疫苗进一步含有一种免疫刺激核酸，优选地含有一种含有脱氧肌苷的寡脱氧核苷酸、一种含有脱氧尿苷的寡脱氧核苷酸、一种含有CG基元的寡脱氧核苷酸或一种含有肌苷和胞苷的核酸分子。
17.如权利要求1至16中任一项所述的疫苗，其特征在于其进一步含有一种作为免疫应答刺激物质的细胞因子。
18.如权利要求1至17中任一项所述的疫苗，其特征在于其进一步含有一种聚阳离子肽、神经活性化合物或具有生长因子活性的激素。
19.如权利要求1至18中任一项中所定义的具有R1-XZXZNXZX-R2序列的肽用于制备用来增强针对至少一种抗原的免疫应答的佐剂或载体蛋白的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其特征在于所述佐剂或载体蛋白增强了至少一种抗原在抗原呈递细胞(APC)中的摄入。
21.如权利要求19或20所述的用途，其特征在于所述佐剂或载体蛋白被加入到疫苗中。
全文摘要
本发明涉及一种疫苗，该疫苗含有至少一种抗原和一种具有R
文档编号A61P37/04GK1468109SQ01817116
公开日2004年1月14日 申请日期2001年10月18日 优先权日2000年10月18日
发明者J·福里茨, J 福里茨, F·马特纳, 啬, W·佐纳, 怖, E·纳吉, M·布什勒 申请人:英特塞尔生物医药研究发展股份公司