专利名称：用于诊断和治疗心血管疾病的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及诊断心血管疾病的方法和用于治疗或预防此类疾病的组合物。具体而言，本发明涉及用于诊断和治疗冠状动脉疾病的方法和组合物。
所述斑块中的T淋巴细胞和巨噬细胞之间重要但又复杂的关系可能部分上是由受体配体对通过巨噬细胞(和其他细胞)上的CD40将CD40L连接到活化的斑块内T细胞上介导的，由此对一系列的结果产生影响，包括斑块的重构、斑块破裂和抗原呈递(Lamon等，1997)。
最近，人们发现，具体的微生物同动脉粥样硬化的促进有关。尽管最近的综述表明持久性的感染一般与内膜炎症和动脉粥样硬化斑的生长有关，但最确定的微生物为肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)(Saiku等，Lancet 116(1998)983-5；Shar等，S Sfr Med J82(1992)158-61；Mejer等，JAMA 281(1999)427)。目前，还没有数据来阐明动脉粥样硬化发生的机理，即与流行病相关的微生物有助于动脉粥样硬化产生的过程。
因此，人们需要有助于诊断以免疫应答为基础的心血管疾病例如冠状动脉疾病的改进的方法，还需要预防或治疗此类疾病的组合物。
本发明是基于发现了一种新的冠状动脉疾病发生的主要机理，与过敏反应(一种现代生活中“Th2型细胞因子”发生偏离的疾病)的情况类似，冠状动脉疾病，如动脉粥样硬化也是一种与“Th2偏离”有关的现代生活疾病。许多因素可以改变Th2型炎性反应对动脉粥样硬化的促进作用(如脂质水平、吸烟和高血压等)。尽管不希望受任何具体的作用机理的限制，但是申请人认为其原因可能是由于环境对肠道细菌的影响所致，从而使Th1促进微生物如乳酸菌(Lactobacilli)被其他与Th2应答有关的微生物所代替。
这一新的观察结果为诊断和治疗提供了一个独特的机会，由此可以检测并改善易发生动脉粥样硬化或动脉粥样高危个体。具体而言，用某些“常规”的细菌(益生菌)对肠道进行重建不失为一条有效的治疗途径。
本发明还包括对其他具体的微生物进行调整的诊断和治疗，这些微生物(如肺炎衣原体和幽门螺旋杆菌(H.pylori))一旦出现则会加剧Th2的偏离。“现代生活性动脉粥样硬化”可能是由于肠道菌群偏离引起细胞因子分布型发生改变所致，这样一个概念与在发达国家和发展中国家之间动脉粥样硬化的本质区别是在发达国家中发炎斑块的数目过多这一观点是相符的。
因此，从广泛的意义上讲，本发明涉及诊断或检测Th2介导的动脉粥样硬化如冠状动脉疾病的方法，该方法是基于对血液(可以与动脉壁的组织间隙发生交换的血液)中Th2应答的各种标志和指标进行测定，本发明还涉及能够用作治疗或预防剂的组合物，该组合物可以促进Th1型应答和/或抑制Th2型应答。
具体而言，一方面，本发明提供了预防或治疗心血管疾病的方法，该方法包括给予需要此类治疗的个体有效量的至少一种药物，相对于与疾病有关的Th2型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型，该药物能够对Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型进行增量调节。
所述Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型的增量调节可以通过增量调节个体的Th1型T-细胞应答和/或抑制个体的Th2型T-细胞应答来实现。或者，增量调节可以通过增强Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子的活性和/或抑制Th2型应答的特征性细胞因子的活性来实现。
可以给予个体宿主一种或多种药物以达到所需的效果。这可以通过给予能够抑制Th2T细胞应答的药物并由此获得Th1型T细胞应答的相对增量调节来达到，或者通过给予可产生可检测到的Th1型T细胞应答升高的药物来达到。或者，可以给予所述个体一种或多种能够可检测到地提高Th1型T细胞应答的药物以及一种或多种抑制Th2型T细胞应答的药物。优选给予至少一种能够增量调节Th1型T细胞应答和抑制Th2型T细胞应答的药物。
一般而言，该方法包括使Th2型T-细胞应答的特征性细胞因子转换为Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子。
因此，在另一方面，本发明提供了预防或治疗心血管疾病的方法，该方法包括给予需要此类治疗的个体有效量的至少一种能够增量调节Th1型T-细胞应答的药物和/或至少一种能够抑制与疾病有关的Th2型T-细胞应答的药物。
在另一方面，本发明提供了预防或治疗心血管疾病的方法，该方法包括给予需要此类治疗的个体有效量的至少一种能够抑制与疾病有关的Th2型T-细胞应答的特征性细胞因子活性的药物和/或至少一种能够增强Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子的作用的药物。
在另一方面，本发明提供了改变心血管疾病患者体内细胞因子平衡的方法，该方法包括给予需要此类治疗的个体有效量的至少一种能够增量调节Th1型T-细胞应答的药物和/或至少一种能够抑制与疾病有关的Th2型T-细胞应答的药物。
在再一方面，本发明提供了改变心血管疾病患者体内细胞因子平衡的方法，该方法包括给予需要此类治疗的个体有效量的至少一种能够抑制与疾病有关的Th2型T-细胞应答的特征性细胞因子的作用的药物和/或至少一种能够增强Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子的作用的药物。
用于本发明方法中的优选的药物为微生物或其能够达到所需结果的组分、提取物或分泌物。例如，微生物可以是酵母、细菌和它们的混合物。优选微生物为细菌，更优选为益生菌。适合的益生菌选自乳酸菌属亚种和/或分枝杆菌属亚种。优选能够抑制Th2型应答并降低胆固醇的乳酸菌。特别优选嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)。
可以理解，可以给予活的、灭活的或杀死的微生物。优选以活的微生物形式给予益生菌。
但是，本发明不限于使用微生物，可以理解，可以使用任何相对于Th2型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型而言能够对Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型进行增量调节的药物。其他药物包括例如抗体及其结合片段。特别优选抗-CD40抗体或其结合片段。另外，也可以使用CD40的其他配体。
所述细胞因子标志可以是与Th1或Th2型应答有关的任何特征性细胞因子。例如，对于Th1应答而言，所述细胞因子可以是干扰素-γ或白介素-12，而对于Th2应答而言，所述细胞因子可以是白介素-4、白介素-10、TGF-β和/或白介素-13。但是，可以理解，可以使用任何其他的细胞因子标志，只要该标志为Th1或Th2型应答的特异性或特征性标志即可。
上述的治疗方法可以与一种或多种用于治疗可以使心血管疾病恶化的情况的药用活性物质联合应用，如降脂药、抗高血压药和抗糖尿病药。
可以在给予所述药用活性物质之前、同时或之后给予所述用于改变T-细胞应答或调节相关细胞因子活性的药物。
本发明的方法也可以有效用于由于细菌感染、细菌性抗原、多克隆激活剂(如内毒素等)、超抗原(如来自克隆细菌)或自身抗原(血管壁的斑块内)而导致细胞因子失衡或适当的T细胞应答缺乏恶化的个体。与本发明特别相关的为肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌或非典型性流感嗜血杆菌(non-typable Haemophilusinfluenzae)引起的感染或这些细菌的细菌性抗原。
因此，在另外一个方面，本发明提供了心血管疾病易感性的诊断或评价的方法，该方法包括评价个体的T-细胞应答，其中Th2型应答的增量调节和/或Th1型应答的抑制为所述疾病易感性或存在所述疾病的指标。
在另一方面，本发明提供了诊断或评价心血管疾病易感性的方法，该方法包括评价个体的T-细胞应答，其中Th1型应答的特征性细胞因子的产生或活性的抑制和/或Th2型应答的特征性细胞因子的产生或活性的增强为个体易感所述疾病或存在所述疾病的指标。
在另一方面，本发明提供了诊断心血管疾病或评价个体是否易感心血管疾病的方法，该方法包括(a)测定一种或多种受疾病影响的免疫球蛋白的水平从而获得试验数据；并(b)将试验数据与参比数据进行比较，籍此评价该个体是否易感心血管疾病或者患有心血管疾病。
优选所述免疫球蛋白为IgG，更优选为IgG2亚类。
优选所述免疫球蛋白为IgG2亚类的抗体，该抗体对病原菌如肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌或非典型性流感嗜血杆菌具有特异性。对本领域技术人员而言，显而易见也可以使用其他特异性抗体。
优选将总的IgG2与IgG2亚类特异性抗体之比或总的IgG2亚类免疫球蛋白与IgG2亚类特异性抗体之比的改变用作心血管疾病易感性或心血管疾病存在的指标。
术语“心血管疾病”包括动脉粥样硬化和退行性血管疾病以及与冠状动脉发炎有关的任何心血管疾病，包括1至3支冠状动脉疾病。
一般地说，所述心血管疾病为退行性血管疾病，更通常为动脉粥样硬化。
具体地说，本发明的方法可以用于治疗患有动脉粥样硬化(经血管造影术确定)的个体，该类患者具有较少或广泛的冠状动脉粥样硬化但在临床上是稳定的，该方法还可以用于治疗具有与近期心肌梗塞或不稳定型心绞痛有关的不稳定型临床疾病的动脉粥样硬化患者。
优选通过测定循环T细胞来评价T细胞应答。但是，可以理解，也可以通过测定具体的T细胞应答的任何特征性细胞因子标志来评价T细胞应答，如对于Th1型应答，测定干扰素-γ或白介素-12，对于Th2型应答，则测定白介素-4和/或白介素-13。
本发明的范围也包括用于在此所述的方法的组合物。而且，本发明还具体包括在此所述的药物在生产用于给予个体以预防或治疗心血管疾病的药物或治疗用组合物中的用途。
另外，本发明也提供了用于本发明的诊断或评价方法中的试剂盒。试剂盒可以包括例如一种或多种用于进行测定的试剂，如抗体、缓冲剂、对照和使用说明。
下面将参照本发明的多个优选的非限定性实施方案对本发明的特点和优点进行描述。
本发明优选实施方案的详述人们观察到，大量动脉粥样硬化的存在导致血液中IL-4水平升高，同时伴随IFN-γ水平下降。这种细胞因子平衡的改变是向Th2型应答发生偏移的指标，可以用于动脉粥样硬化的诊断中。该观察结果也为目的在于使T细胞应答向Th1型应答发生转变的治疗方法提供了坚实的基础，因此，对于预防和/或治疗具有相似发病机理的冠状动脉疾病和其他心血管疾病(包括动脉粥样硬化)是有益的。
包括在此的可能的治疗用制剂的一个示例为包括益生菌(如乳酸菌)的制剂，它们可以趋使细胞因子平衡恢复为Th1型应答，并因此减缓心血管疾病的进展、预防心血管疾病的发作或逆转心血管疾病。但是，其他药物和组合物，如在下面描述的能使Th2型应答转换为Th1型应答的细菌佐剂也可以用于在此所述的疾病的治疗中。
检测循环的T细胞中是否存在Th2偏离的任何直接或间接的方法，如监测这种偏离的下游作用，如肺炎衣原体或幽门螺旋杆菌(但不限于这些病原体)的抗体产生中发生的IgG亚类改变或IgG亚类特异性抗体改变，均可用作冠状动脉疾病的指标。例如，当细胞因子分布型向Th2偏移时，IgG2含量相对较低。所以，总IgG2亚类免疫球蛋白或IgG2亚类特异性抗体，如肺炎衣原体或幽门螺旋杆菌的特异性抗体之比发生改变(或为低水平)表示发生了“促进动脉粥样硬化的”细胞因子的偏离。
情况确是如此，可以通过检测免疫球蛋白如IgG2亚类抗体的水平，并与参比水平或之比比较，从而评价个体是否易感心血管疾病(如动脉粥样硬化)或者已患有该种疾病。适合的参比水平或之比通常是基于由健康个体获得的相应的值，一般而言，包括根据常规的方法学由代表性群体获得的平均值。
此外，属于本发明范围的预防、治疗或逆转动脉粥样硬化的方法还包括能够使细胞因子平衡向Th1型应答方向偏移或改变的任何治疗方法，如给予益生菌(特别是乳酸菌属)。例如，嗜酸乳杆菌可以减量调节脾T细胞(即循环细胞)分泌IL-4并增量调节脾T细胞分泌INF-γ，并因此可以用于治疗动脉粥样硬化和其他此类心血管疾病。其他治疗方法包括给予抑制Th2细胞因子分泌或抑制这些因子的作用的任何因子，和/或能够促进Th1型细胞因子如INF-γ的分泌或活性的任何治疗方法。
对于本领域技术人员而言，显而易见，本发明还包括下列治疗方法，即可以特异性调节循环T细胞分泌的细胞因子的水平或分布型的任何治疗方法，上述T细胞特别对抗原(如肺炎衣原体或幽门螺旋杆菌)或非特异性活化因子(如多克隆活化剂、内毒素或超抗原)有活性。
而且，也可以采用联合治疗方法，将益生菌或其他能够使细胞因子平衡向Th1型应答方向改变的药物与旨在改变“危险因素”的现有治疗方法(如降脂药、抗高血压药等)联合。多种其他因素(如血脂、糖尿病、高血压、吸烟)均可以引起动脉粥样硬化，因此本发明还包括将改变细胞因子平衡的治疗方法与治疗所述疾病诱因的方法联合。
一般而言，由个体获得样品，评价T-细胞的细胞因子分布型和/或T-细胞应答。该样品可以是全血样本、全血的细胞组分、分离的细胞或者为如适合测定的活组织切片样本。
微生物可以选自细菌和酵母株，包括酵母属亚种，如酿酒酵母和酵母菌。优选所述细菌为益生菌。另外，可以使用所述微生物的组分、超声处理产物、提取物或分泌物或混合物。提取物包括例如细胞壁组分。所述微生物的组分可以包括抗原，如由本领域技术人员已知的酶处理方法获得的抗原性肽等。
细菌可以选自(但不限于)乳酸菌属、乳酸菌、分枝杆菌属和双歧杆菌属。还更优选使用嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌或母牛分枝杆菌，或其能够诱导Th1细胞应答的组分、提取物、超声处理产物、分泌物或其混合物。特别优选嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌或母牛分枝杆菌，它们可以以活的形式使用，也可以以灭活的制剂形式使用，只要它们能够诱导所需的Th1型T-细胞应答即可。
优选以活的制剂形式使用嗜酸乳杆菌和发酵乳杆菌。也可以使用其他的细菌(无论它们是否具有益生作用)，例如公知的辅助细菌，如干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、短双歧杆菌等。
可以根据心血管疾病的性质和严重程度、是否给予用于预防或治疗的药物以及所涉及的微生物的类型来调整给予个体的微生物或提取物等的剂量。本领域的技术人员可以容易地确定治疗参数以及所需的剂量。
优选微生物或含微生物的组合物为片剂或胶囊剂。但是，对于本领域技术人员而言，很明显也可以以液体或其他固体制剂形式提供微生物。具体而言，所述微生物也可以以食物的形式提供，如以酸奶形式或其他乳制品形式，或者以类似的非乳制品形式，如豆制品形式提供。
通常以一定的间隔、通常为每天经口给予微生物等，一般而言，所述治疗可以持续数月或更长时间。优选以每天log3至log12的剂量给予微生物。当以活的全菌的形式给予时，益生菌的剂量可以为约1×108-1×1012个微生物。
但是，在本发明的方法中也可以使用其他能够增量调节Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型的药物。本领域的技术人员根据在此给出的教导，通过常规试验可以容易地确定此类其他药物。此类药物可以包括例如抗体及其结合片段。
就此而言，发明人发现，动脉粥样硬化患者血液T-细胞分泌的IL-4的量与冠状动脉疾病的程度有关。这种相关性与发明人关于T-细胞介导的炎性反应是由CD40L通过一系列结构性和循环的细胞(包括血小板)上的CD40连接到CD4+T-细胞上引起的这一观察结果相符。具体而言，由于CD40L是通过血小板上表达的CD40连接到激活的CD4+T-细胞上的，因此血小板似乎是产生IL-4的重要因子。
因此，给予能够抑制CD40L与CD40(如抗体、特别是抗-CD40抗体或其结合片段)连接的药物可以改变患者的Th2型应答的特征性细胞因子分布型。结合片段是指保留了抗体的结合能力的抗体片段，分别包括通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶进行蛋白酶剪切获得的Fab和(Fab′)2片段。另外，也可以给予本领域人员已知的CD40的其他配体或其肽片段，以相对于Th2型T细胞应答而言对Th1型T细胞应答进行所需的增量调节。根据所附的实施例中公开的方法可以容易地鉴定适当的配体和药物。可以通过静脉、肌内或皮下或其他适当的途径给予此类药物。
可以将此类药物和其他药物(如微生物提取物和超声处理产物等)配成药用组合物用于对所需个体给药，该组合物中可以加入药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。一般而言，此类活性药物的剂量与其常规的治疗方案相符，通常要考虑年龄、体重、所治疗的疾病的性质和个体的整体健康状况，这是本领域技术人员可以理解的。
药物形式包括适合于注射的水溶液和适合于现场制备注射溶液的粉剂。此类可注射组合物必须具有一定的流动性以可以用于注射，并且通常而言具有稳定性以使得在生产后可以储存。载体可以是含有乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油中的一种或多种及其适合的混合物的溶剂或分散介质。通过使用包衣物(如卵磷脂)、在为分散液的情况下维持所需的颗粒大小和加入表面活性剂来保持流动性。
一般而言，可以通过将所需量的活性物质加至含有上述各种组分的适当溶剂中来制备注射溶液。一般地讲，可以通过将所述活性物质加至含有分散介质和其他组分的载体中来制备分散液。如果是制备注射用溶液的粉剂，那么优选的方法是真空干燥和冷冻干燥方法，籍此可以得到活性组分的粉末。
用于口服给药时，可以将药物在口服可接受的适当的载体中配制。具体而言，可以用惰性稀释剂、可同化的食用载体配制活性组分，或者将活性组分包囊于硬壳或软壳的明胶胶囊中。另外，还可以将活性组分直接加至上述的食品中。而且，可以以咀嚼片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等的形式使用活性组分。
本发明的组合物中也可以加入一种或多种适当的防腐剂，如山梨酸。在许多情况下，组合物中还可以包括等渗剂如糖或氯化钠。
片剂、锭剂、小丸、胶囊剂等也可以含有一种或多种下列物质粘合剂，如黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精，或矫味剂。如果剂型为胶囊，那么除一种或多种上述组分外，还可以含有液体载体。可以存在用作包衣物或用于改变剂量单位的外形的其他组分。例如，可以用虫胶、糖或两者对片剂、小丸或胶囊进行包衣。另外，也可以将活性组分制成任何适当的缓释制剂。
药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂包括任何合适的常规已知溶剂、分散介质和等渗的制剂或溶液。此类组分和药物活性物质的介质的应用是公知的。只要常规的介质或物质与活性组分相容，便可以将它们用于本发明的治疗和预防组合物中。需要时，也可以将其他的活性组分加至组合物中。
可以理解，考虑到准备采用的给药方式，组合物中的药物的量应足以向个体递送适当的有效剂量。
在本文中，单位剂量形式是指适于以单位剂量的形式向待治疗个体给药的物理上可分的单位，每单位中含有计算出的可产生所需治疗或预防作用的预定量的活性组分以及相应的载体、稀释剂和/或赋形剂。
可以在进行抗生素治疗或用其他活性药物进行治疗之前、同时或之后，将所述药物和一种或多种抗生素或一种或多种用于治疗心血管疾病或使所述疾病恶化的病症的其他药学活性物质联合给药。实施例实施例1乳杆菌属抑制IL-4分泌为了测定乳杆菌属是否能够调节IL-4的产生，将增加剂量的发酵乳杆菌(得自澳大利亚悉尼的新南威尔士大学微生物学和免疫学学院的培养物保藏中心的VRI 002株)加至培养基中，该培养基中含有等体积的得自正常健康个体的肝素化全血和不含AIM-V血清的培养基。对照培养物则仅含有培养基。用Con A(5μg/ml)刺激所有的培养物。温育24小时后，通过捕获IL-4 ELISA测定IL-4的分泌量。如
图1所示，发酵乳杆菌以剂量依赖方式抑制IL-4的分泌，剂量为2×105个细菌/培养物时抑制响应最大。该数据表明，发酵乳杆菌可以有效对与Th2型应答有关的IL-4介导的炎性反应进行减量调节。实施例2益生菌对Th1/Th2型细胞因子应答的作用为了测定益生菌是否可以对Th2型细胞因子应答产生减量调节并对Th1型细胞因子应答产生增量调节，用进食针将各种剂量的嗜酸乳杆菌(得自澳大利亚悉尼的新南威尔士大学微生物学和免疫学学院的培养物保藏中心的VRI001株)对C57/B16小鼠进行胃内给药，每日给药，连续两周，此后用在0.2mL磷酸盐缓冲液中的8μg卵清蛋白(OVA)和氢氧化铝腹膜内给药致敏。随后继续给予嗜酸乳杆菌十次，每两天给药一次，连续两周，然后将小鼠处死。通过过筛分离脾脏淋巴细胞，用PBS洗涤，将其以10×106个细胞/ml培养基的浓度重新悬浮。
然后将每份1mL的细胞悬浮液分配至24孔平底微量滴定板的各孔中，用OVA(5μg/mL)刺激。温育4天后，收集上清液，采用标准ELISA方法，用IL-4或IFN-γ单克隆抗体对测定IL-4和IFN-γ的产生量。
简言之，用捕获抗-IL-4抗体对24孔微量滴定板的各孔进行包被。于室温下温育1小时后，洗涤各孔并向各孔中加入生物素化的抗-IL-4抗体。再温育1小时，洗涤各孔，向各孔中加入链霉抗生物素-过氧化物酶结合物。温育30分钟后，洗涤各孔，然后加入TMB底物。在ELISA读板仪上于450/620nm处读取光密度。根据标准曲线，采用插入法对未知样品中的IL-4进行定量。采用类似的方法测定IFN-γ。
结果示于图2A和图2B中。由图2A可以看出，给予嗜酸乳杆菌以剂量依赖的方式抑制IL-4产生，而图2B则表明IFN-γ的产生增加。因此，全血中IL-4分泌量的增加与冠状动脉疾病患者中疾病的严重程度有关。实施例3个体的选择和测试3.1个体.根据血管造影术研究，对John Hunter Hospital(纽卡斯，澳大利亚)提供的个体进行选择。记录危险因素(脂质、高血压、糖尿病、吸烟、家族史)。分为下列各组(a)很轻的冠状动脉粥样硬化(n＝100)；(b)伴有稳定型临床疾病的广泛的冠状动脉粥样硬化(涉及三个主要血管的＞50％)(n＝100)，和(c)伴有不稳定型临床疾病的广泛的冠状动脉粥样硬化(n＝100)(近期有心肌梗塞或不稳定型心绞痛)。
在血管造影术后从选择的个体取血(20ml)进行抗体和T细胞研究。在JohnHunter Hospital(纽卡斯，澳大利亚)进行的血管造影术研究的数目约为30-40个/周，其分布约为10-15％具有正常的动脉或具有较轻的疾病，20-30％具有三支动脉疾病，这其中约三分之一具有不稳定型临床疾病，三分之二具有稳定型临床疾病。
3.2抗-衣原体肺炎抗体.通过微量免疫荧光试验测定肺炎衣原体特异性抗原的免疫球蛋白IgG(Chlamydia-cel Pn试剂盒，CeLLabs Pty Ltd，澳大利亚)，从而测定抗体。采用特异性IgG亚类抗血清测定IgG亚类抗体。
3.3 T-细胞增殖.在96孔圆底微量滴定板上一式三份对全血淋巴细胞培养物进行测定。用不含AIM-V血清的培养基以1∶1(v/v)稀释肝素化血液，所述培养基中含有含量逐渐增加的根据下面所述方法制备的肺炎衣原体原体(EB)(0.1、1.0、10μg/ml)。另外再用沙眼衣原体(C.trachomatis)或EB抗原(0.1、1.0、10μg/ml)作为“不相关”抗原对照对所有的个体进行刺激。于37℃、在5％CO2环境中培养5天后，加入氚标胸腺嘧啶脱氧核苷(0.5μCi/培养物)，再培养6小时，然后收获并计数。
3.4细胞因子的产生.采用基于细胞因子的全血测定方法检测EB活性T细胞。在96孔圆底微量滴定板中用AIM-V培养基以1∶1(v/v)稀释肝素化血液，所述培养基中含有各种浓度的EB抗原，或者不含有该抗原。为了测定产生的IL-4，用捕获单克隆抗IL-4抗体(Endogen，CSL)预包被部分孔。将培养物在37℃、5％CO2环境中培养24-48小时，然后收集血浆上清液，用于IL-2、IL-10和IFN-γ测定(Endogen试剂盒，CSL)。根据测定试剂盒中的说明，洗涤并加入显色抗-IL-4抗体后，直接测定各孔中捕获的IL-4的含量和各标准品的含量。已经对用于测定抗原活性T细胞和细胞因子产生分布型的全血测定法进行了验证使其可以用于被幽门螺旋杆菌感染的患者的研究中。
3.5由肺炎衣原体制备原体.使由P Saikku教授(University of Helsinki，芬兰)提供的适应HeLa细胞229的肺炎衣原体Kajaani株在含有RPMI 1640培养基的培养瓶中、于37℃、5％CO2湿化环境中在HeLa细胞中生长，所述培养基中补充有5％胎牛血清(FCS)和链霉素。3天后，由培养的细胞中分离衣原体原体。用无菌刮刀使细胞由培养瓶剥离，洗涤并悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中，超声使包含体破裂。离心去除细胞碎片，于30,000g超速离心收集EB材料。将该EB材料悬浮于PBS中并铺层于30-60％Nycodenz溶液(Nycomed，Norway)上。离心后，收集60％梯度以上的EB材料，洗涤并用1％甲醛灭活24小时。充分洗涤，将EB材料悬浮于PBS中，测定蛋白浓度(Pierce蛋白试剂盒)。将由Saikku教授和其同事处获得的EB抗原用作对照。用类似的方法从沙眼衣原体(仍由PSaikku教授提供样品)制备原体抗原。
3.6特异性克隆的蛋白.使用Saikku博士和Makela博士(芬兰，见上)提供的肺炎衣原体克隆抗原进行细胞因子平衡测定(见上)。所述克隆抗原包括枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中产生的重组蛋白MOMP、OMP2和HSP60。测定浓度为1μg/ml。
具体而言，自冠状动脉粥样硬化患者收集肝素化全血，这些患者为肺炎衣原体血清阳性(n＝17)或血清阴性(n＝27)。如上所述于37℃培养过夜后，通过捕获ELISA测定分泌的IL-4，同时测定血浆上清液中的IFN-γ。
如图3A和3B所示，与有轻度或1支血管疾病的个体相比，在有2至3支冠状血管疾病的个体中检测到了较高的IL-4水平。在正常个体中，未检测到IL-4或IL-4的水平很低。与血清阴性个体、特别是具有1支血管疾病的个体相比，在肺炎衣原体血清阳性的个体中，具有1-3支血管疾病的个体分泌更多的IL-4，这表明IL-4分泌的增加与感染状态有关。但是，在所有研究的个体中，IL-4分泌并不依赖于培养物中肺炎衣原体抗原的刺激，这表明IL-4的自发产生是由体内激活的T-细胞所致，这些激活的T细胞对培养物中其他抗原刺激不再发生应答。将由44名患者获得的数据结合观察发现其结果相似，即全血培养物中分泌的IL-4水平与疾病的程度有关而与抗原刺激无关。实施例4T淋巴细胞的自发激活截然不同的是，IL-4和IFN-γ的分泌产生呈相反关系(参见图4A和4B)。但是，IFN-γ水平与疾病的严重性之间无相关性，这表明动脉粥样硬化中的炎性反应受CD4+Th2辅助细胞介导的炎性反应驱动，同时增量调节IL-4。
具体而言，细胞因子自发产生的结果表明，在具有“正常”冠状血管造影的个体和具有2或3支血管疾病(表示“高负荷”动脉粥样硬化)的个体之间存在显著差异，那些定义为轻度或较少冠状动脉粥样硬化的个体IL-4的产生量处于中等。就INF-γ而言，在正常个体和“检测有动脉粥样硬化”的个体之间存在差异，正常个体INF-γ水平较高。较轻患者和严重动脉粥样硬化患者的INF-γ水平间的差异不像IL-4的差异那么显著。总而言之，这些结果清楚地表明，Th1-Th2平衡的偏移与动脉粥样硬化的量有关。
由此可以得出结论，具有倾向于对T细胞的刺激物产生Th2型细胞因子应答的“系列因素(set)”的个体血管壁中过量的动脉粥样硬化集聚是由于Th2型T细胞相关的炎性途径激活所致。由于在此测定的细胞因子是由全血培养物中的T细胞自发分泌的，因此激活在体内就已经发生了。刺激物包括多克隆激活剂(如由肠道菌群产生的内毒素)、超抗原(如，来自克隆细菌)、自身抗原(包括斑块或血管壁内的抗原)或特异性抗原，特别是来自与宿主具有克隆或寄生关系的微生物(如肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌、非典型性流感嗜血杆菌等)的抗原。后者与是“与具体的微生物无关的慢性感染”而不是具有独特的抗原作用的肺炎衣原体是动脉粥样硬化进展的“危险因素”这一观点相符(Groyston JT，Kuo Coulson AS等，Circulation(1995)923397-3400；Bachmaier K，Neu N等，Science(1999)2831335-1339；Mejer D，Derby LE等，JAMA(1999)18272-277)。另外，图3A和3B中的数据表明，用肺炎衣原体抗原刺激的培养物中“Th2偏移”具有增大的倾向与免疫系统的“Th2系列”、特别是微生物可以增强向Th2型应答的转换并因此进一步发展为动脉粥样硬化斑这一观察结果相符。循环细胞可与动脉粥样硬化斑中的细胞发生相互交换。因此，慢性感染可以使具有显著动脉粥样硬化的个体的Th2偏离更加严重。但是，目前由衣原体感染或未感染的个体获得的数据表明Th2细胞因子的基本“系列因素”与衣原体感染无关(如上所述，尽管感染可能使偏离更加严重)。
该项研究支持下面这样一个结论T淋巴细胞自发激活的类型通常与动脉粥样硬化、特别是冠状动脉粥样硬化的量有关。实施例5给予乳杆菌对进食高胆固醇饮食的小鼠动脉粥样硬化的影响通过测定小鼠主动脉窦(根)脂肪纹的形成来评价高胆固醇饮食对动脉粥样硬化进展的影响。
食物含有下列组分g/100g蔗糖 51.3酪蛋白(酸)20.0
菜籽油1.00可可脂15.00纤维素5.10DL-甲硫氨酸 0.30AIN93G矿物质 3.50AIN93G维生素 1.00氯化胆碱50％w/w 1.00胆酸钠0.50胆固醇1.00DLα-生育酚乙酸酯 0.26简言之，给予C57/B16雄性小鼠(8周龄)高胆固醇食物(HCD)或不含胆固醇的正常食物，并使其可以自由饮水。使各组小鼠(n＝10)进食HCD一周，然后根据给药方案给予含有发酵乳杆菌(VRI 002)的食物。每周经口-胃给予3次200μl洗涤过的来自重新悬浮的过夜培养物的细菌悬浮液样本，终浓度为log9.5-log10.5个微生物。对照小鼠则仅给予200μl盐水。5周后，用0.1mL在不完全弗氏佐剂中乳化的5mg/mL杀死的结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberclosis，MT，Difco)经皮下注射对两组小鼠进行免疫。该免疫步骤的原理是基于这样一个近期报道，该报道表明用杀死的细菌进行免疫使免疫系统激活可以导致主动脉窦加速形成脂肪纹(George J等，Ateriosclerosis，Thrombosis and Vascular Biology，1999，19505-510)。
在用HCD和益生菌进行处理后7周，将所有的小鼠处死。通过心脏穿刺取血。将心脏全部取出，剥离含有主动脉窦(根)的上面部分，在10％福尔马林的PBS溶液中固定。在福尔马林/PBS中固定过夜后，将组织浸于OCT培养基中并冷冻，然后在恒冷切片机中切片。取6-7片(8-10μm厚)，用油红O染色。由不知情的观察者对每一切片的损伤区打分。根据形成的脂肪纹，采用0-5的损伤评分系统。如图5A所示，仅进食HCD的小鼠比用乳杆菌处理的小鼠形成更多的脂肪纹。采用MT对小鼠进行免疫获得了类似的结果(参见图5B)，尽管在这些小鼠中损伤的数目较未免疫的组少，这表明免疫可以限制动脉粥样硬化形成。实施例6冠状动脉疾病患者全血培养物中IL-4产生的量受抗-CD40单克隆抗体的抑制由冠状动脉疾病患者收集肝素化血液并在用抗IL-4抗体包被的96孔平底培养板中用等体积的含有梯度浓度抗CD40L抗体的不含血清的AIM-V培养基(总体积为300μL)培养。对照培养物仅含有培养基或者小鼠IgG1同型对照物。培养24小时后，经捕获ELISA测定法检测分泌的IL-4的量。如图6所示，与对照相比，抗-CD40抗体以剂量依赖的方式抑制IL-4的产生(p＜0.05，9名患者)，而加入小鼠IgG1同型对照物或抗-CD40L抗体(数据未示出)没有作用。该结果表明，CD40对于全血培养物中IL-4的产生至关重要。
尽管前面已参照优选的实施方案对本发明进行了描述，但是本领域的技术人员可以理解，在不偏离本发明的范围的情况下，可以对本发明进行多种改变和修改。
权利要求
1.预防或治疗心血管疾病的方法，该方法包括给予需要此类治疗的个体有效量的一种或多种药物，以相对于与所述疾病有关的Th2型T-细胞应答的细胞因子分布型而言，对Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型进行增量调节。
2.权利要求1的方法，该方法包括使Th2型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型转换为Th1型应答的特征性细胞因子分布型。
3.权利要求1或2的方法，该方法包括给予能够在个体中增量调节Th1型T-细胞应答并抑制Th2型T-细胞应答的药物。
4.权利要求1或2的方法，该方法包括给予能够在个体中增强Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子的作用并抑制Th2型应答的特征性细胞因子的作用的药物。
5.权利要求1的方法，该方法包括给予能够在个体中增量调节Th1型T-细胞应答的药物。
6.权利要求1的方法，该方法包括给予能够在个体中增强Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子的作用的药物。
7.权利要求1的方法，该方法包括给予能够在个体中抑制Th2型T-细胞应答的药物。
8.权利要求1的方法，该方法包括给予能够在个体中抑制Th2型T-细胞应答的特征性细胞因子的作用的药物。
9.权利要求1-8中任何一项的方法，其中所述的一种或多种药物包括微生物或其组分、提取物、超声处理产物或分泌物，或者为前述部分物质或全部物质的混合物。
10.权利要求9的方法，其中所述提取物包括微生物的细胞壁成分。
11.权利要求9或10的方法，其中所述微生物选自酵母和细菌。
12.权利要求11的方法，其中所述微生物为益生菌。
13.权利要求12的方法，其中所述益生菌选自乳杆菌属和分枝杆菌属。
14.权利要求13的方法，其中所述乳杆菌属能够在个体中抑制Th2应答并降低胆固醇水平。
15.权利要求12的方法，其中所述益生菌选自嗜酸乳杆菌、发酵乳杆菌和母牛分枝杆菌。
16.权利要求11的方法，其中所述微生物选自干酪乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和短双歧杆菌。
17.权利要求11-16中任何一项的方法，其中所述微生物是活的微生物。
18.权利要求1-17中任何一项的方法，该方法包括除给予所述个体用于增量调节Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型的药物外，还给予个体至少一种有效量的用于治疗的药物活性物质。
19.权利要求18的方法，其中所述的药物活性物质选自降脂药、抗高血压药和抗糖尿病药。
20.权利要求18或19的方法，其中在给予个体所述药物活性物质之前、同时或之后给予所述用于增量调节Th1型T-细胞应答的特征性细胞因子分布型的药物。
21.权利要求1-20中任何一项的方法，其中与疾病有关的Th2型T-细胞应答由于细菌感染、细菌性抗原、多克隆激活剂、超抗原或自身抗原而加剧。
22.权利要求20的方法，其中所述感染为肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌或非典型性流感嗜血杆菌引起的感染，或者所述细菌性抗原来自肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌或非典型性流感嗜血杆菌。
23.权利要求1-22中任何一项的方法，其中所述心血管疾病选自具有稳定型或不稳定型临床疾病的动脉粥样硬化疾病。
24.诊断或评价心血管疾病的易感性的方法，该方法包括评价个体的T-细胞应答，其中Th2型T-细胞应答的增量调节和/或Th1型T-细胞应答的抑制为易感或存在所述疾病的指标。
25.权利要求24的方法，该方法包括测定所述个体中是否存在Th2型T-细胞应答的增量调节和Th1型T-细胞应答的抑制。
26.权利要求24的方法，其中所述评价包括测定Th1型T-细胞应答的一种或多种特征性细胞因子的活性或产生是否受到抑制和/或Th2型T-细胞应答的一种或多种特征性细胞因子的活性或产生是否得到增强。
27.权利要求26的方法，其中所述评价包括测定Th1型T-细胞应答的一种或多种特征性细胞因子的活性或产生是否受到抑制以及Th2型T-细胞应答的一种或多种特征性细胞因子的活性或产生是否得到增强。
28.权利要求26或27的方法，其中所述细胞因子选自IFN-y、IL-4、IL-10和IL-12。
29.权利要求24-28中任何一项的方法，其中通过分析循环的T-细胞来评价所述T-细胞应答。
30.诊断心血管疾病或评价个体是否易感心血管疾病的方法，该方法包括(a)测定一种或多种受疾病影响的免疫球蛋白的水平从而获得试验数据；并(b)将试验数据与参比数据进行比较，籍此评价该个体是否易感心血管疾病或者患有心血管疾病。
31.权利要求30的方法，该方法包括检测一种或多种IgG水平。
32.权利要求31的方法，该方法包括检测总IgG2亚类的免疫球蛋白。
33.权利要求31或32的方法，该方法包括检测IgG2亚类的特异性抗体的水平。
34.权利要求33的方法，其中所述IgG2亚类的特异性抗体是肺炎衣原体、幽门螺旋杆菌或非典型性流感嗜血杆菌的特异性抗体。
35.权利要求31的方法，其中总的IgG2亚类与IgG2亚类特异性抗体之比或总的IgG2亚类与IgG2亚类特异性抗体之比的改变是易感或存在所述疾病的指标。
36.权利要求30-35中任何一项的方法，其中所述的心血管疾病选自具有稳定型或不稳定型临床疾病的动脉粥样硬化疾病。
全文摘要
本发明公开了预防或治疗心血管疾病的方法，包括给予需要此类治疗的个体有效量的一种或多种药物，以相对于与所述疾病有关的Th2型T－细胞应答的细胞因子分布型而言，对Th1型T－细胞应答的特征性细胞因子分布型进行增量调节。本发明还公开了用于该方法的组合物。
文档编号A61P43/00GK1471402SQ01818014
公开日2004年1月28日 申请日期2001年10月25日 优先权日2000年10月25日
发明者G·庞, G 庞, P·康威, 嘉, R·克兰西 申请人:阿瑟罗马斯塔特有限公司