专利名称：通过阳离子多糖防止细菌对生物材料的附着的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括眼用镜片、支架、植入物和导管在内的医疗装置的表面处理。具体而言，本发明涉及一种简单、低成本的修饰医疗装置表面从而降低其对细菌粘附的亲和性的方法。
背景技术：
已经对医疗装置，如眼用镜片进行了多年的研究。这些材料通常可以分成两大类，即水凝胶和非水凝胶。非水凝胶不吸附可感知量的水，而水凝胶可以吸附并以平衡状态将水保留。
本领域技术人员早就已经认识到表面特性在生物相容性方面起着主要的作用。已知增加接触镜表面的亲水性改善接触镜的润湿性。因而这与改善的接触镜佩戴舒适度相关。另外，镜片表面可能影响镜片对沉积的敏感性，特别是对镜片佩戴期间来自泪液的蛋白和脂质沉积的敏感性。积聚的沉积可能引起眼睛不适，或者甚至引起炎症。就长期佩戴的接触镜(即无需每日睡前取出镜片而使用的镜片)而言，表面尤其重要，因为长期佩戴的镜片必须设计成在长时间内舒适且生物相容的高标准。
长期佩戴的镜片还面对两个附加的挑战。首先，镜片通常与上皮连续接触7至30天。这与传统接触镜显著不同，传统接触镜在睡前从眼睛中取出。第二，因为长期佩戴的镜片被连续佩戴，所以它们一般不被取出消毒，直到推荐的长期佩戴时间结束。因此抑制细菌附着的改进方法对传统和长期佩戴的接触镜都是一个重要进展。
在接触镜润湿/调理溶液的领域中，已经发现聚电解质可以结合到相反电荷的镜片表面并形成聚电解质络合物。商业上已经表明，这种聚电解质络合物因其对表面结合水的更大吸附而可以得到更舒适的镜片材料。用于形成这类聚电解质络合物的材料的实例在下列专利中教导授予Ellis等的美国专利4,321,261、授予Ellis等的美国专利4,436,730、授予Ellis等的美国专利5,401,327、授予Ellis等的美国专利5,405,878、授予Potini等的美国专利5,500,144、授予Zhang等的美国专利5,604,189、授予Ellis等的美国专利5,711,823、授予Zhang等的美国专利5,773,396、授予Ellis等的美国专利5,872,086。
据信细菌对生物材料表面的附着在装置相关感染中是起作用的因素。但是难以预测给定微生物对给定生物材料的附着程度。抑制这种附着的方法的实例在下述专利中教导授予Dearnaley的美国专利5,945,153、授予Homola等的美国专利5,961,958、授予Homola等的美国专利5,980,868、授予Dearnaley等的美国专利5,984,905、授予Hultgren等的美国专利6,001,823、授予Tweden等的美国专利6,013,106和授予Robertson等的美国专利6,054,054。
对于接触镜材料，细菌附着于镜片表面可能导致细菌性角膜炎或其它可能的接触镜相关并发症，如无菌渗入物和CLARE(接触镜诱导的急性红眼病)。因此期望提供抑制微生物对接触镜的附着的方法。
发明内容
本发明提供一种抑制微生物附着于生物材料表面的方法。在一个实施方案中，本发明的方法包括用阳离子多糖处理生物材料表面。
优选地，生物材料表面在施用阳离子多糖前至少是轻微阴离子性的。只要结合强度足以维持表面用于生物材料的目的用途，阳离子多糖结合到生物医学装置表面的机理并不重要。本文使用的术语“键”和“结合”指在添加或不添加连接剂的情况下，生物医学装置表面和多糖之间形成相对稳定的复合物或其它相对稳定的吸引，并且不限制于特定的机理。因此“结合”可能涉及共价键、氢键、疏水相互作用或者其它能使本发明的阳离子多糖在生物医学装置上形成相对强的表面的分子相互作用。
阳离子多糖上的阳离子电荷可以源自铵基、季铵基、胍鎓基、锍基、磷鎓基、结合的过渡金属和其它正电荷官能团。
在生物医学装置上提供阴离子表面电荷的方法的实例包括(a)生物材料中阴离子部位的体积分布，例如通过聚合；(b)氧化表面处理，如等离子体放电或电晕放电；(c)施用阴离子连接剂；(d)络合作用；或者(e)(a)-(d)中的一种或多种的组合。
引入含有以下基团的单体可以提供分布于聚合基材体相(bulk)中的阴离子部位羧酸基、硫酸基、磺酸基、亚硫酸基、磷酸基、膦酸基、次膦酸基。用于将带负电的部位引入生物基料体相中的单体的实例是甲基丙烯酸和2-丙烯酰氨-2-甲基丙烷磺酸。
如果生物材料表面携带净中性电荷或净阳离子电荷，那么生物材料可以用氧化表面处理或其它表面处理来处理，从而在用阳离子多糖处理之前带有净阴离子电荷。适当的氧化表面处理的实例包括以下专利中教导的等离子体放电或电晕放电授予Letter的美国专利4,217,038、授予Kubacki的美国专利4,096,315、授予Peyman的美国专利4,312,575、授予Yanighara的美国专利4,631,435，以及授予Ratner的美国专利5,153,072、5,091,204和4,565,083。等离子体表面处理另外的实例包括使接触镜表面接受等离子体照射，所述等离子体包含惰性气体或氧气(例如参见美国专利4,055,378、4,122,942和4,214,014)；各种烃单体(例如参见美国专利4,143,949)；以及氧化剂和烃的组合，如水和乙醇的组合(例如参见WO95/04609和美国专利4,632,844)。这些专利引入本文作参考。
通过生物材料表面上的疏水部位与阳离子多糖上的疏水基团之间的相互作用，阳离子多糖可以附着于生物材料的表面。生物材料表面和水溶性阳离子多糖之间还可以存在共价键，从而使阳离子多糖结合到生物材料的表面上。
阳离子多糖还可以通过氢键相互作用结合到生物医学装置的表面上。这些氢键相互作用可以发生在氢键接受表面与氢键施予溶液间，或者发生在氢键施予表面与氢键接受溶液间。氢键接受基团的实例包括吡咯烷酮基、丙烯酰胺基、聚醚基和氟碳基。适当的聚醚基的实例包括聚乙二醇或聚环氧乙烷。适当的氢键施予基的实例包括羧酸、硫酸、磺酸、亚磺酸、磷酸、膦酸、次膦酸、酚基、羟基、氨基和亚氨基。
键的实例包括由偶联剂提供的那些，如酯键和酰胺键。表面键还可以包括表面复合。这种表面复合的实例包括给质子润湿剂处理包含亲水单体和含硅酮单体的生物材料而形成的反应产物，其中在没有表面氧化处理步骤的情况下，润湿剂在生物材料表面上与亲水单体形成复合物。
生物医学装置可以是眼用镜片，例如眼内镜、接触镜或角膜嵌入物。生物医学装置也可以是接触镜盒，更具体而言是接触镜盒的内部。本发明的方法对诸如水凝胶的软性镜片材料和硬性接触镜材料都有用。本发明的方法对适于连续佩戴约7至约30天的长期佩戴的接触镜尤其有用。
已经发现本发明的阳离子纤维素聚合物对细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonus aeruginosa)表现出强的抗附着性质(活性)，如在对接触镜表面附着的研究中所证明。有用的阳离子多糖的实例源自基于纤维素、瓜尔胶、淀粉、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、蝉豆胶、黄蓍胶、凝胶多糖、普鲁兰多糖(pullulan)和硬葡聚糖的家族。特别感兴趣的是源自纤维素材料的阳离子聚合物。据信抑制活性的程度与聚合物表面涂层和镜片表面间的离子键强度有关。因此，与机理无关，相信更强的键与更大程度地抵抗细菌附着相关。
图1显示实施例3的结果，比较了有或没有在两分钟浸泡步骤中施用的阳离子纤维素聚合物表面涂层的长期佩戴的水凝胶接触镜表面上细菌铜绿假单胞菌的浓度。
图2显示实施例4的结果，比较了有或没有在四小时浸泡步骤中施用的阳离子纤维素聚合物表面涂层的长期佩戴的水凝胶接触镜表面上细菌铜绿假单胞菌的浓度。
具体实施方案本发明可应用于多种生物材料，包括如上所述的眼用镜片材料。眼用镜片的实例包括接触镜、前房镜和后房镜、眼内镜和角膜嵌入物。眼用镜片可以从软质或硬质材料制造，这取决于具体应用需要的特性。
基材水凝胶包括含有平衡态水的水合、交联聚合物系统。常规水凝胶镜片材料包括含有诸如以下的单体的聚合物甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、甲基丙烯酸甘油酯、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和二甲基丙烯酰胺。
可以用于本发明的软质眼用镜片材料包括硅酮水凝胶以及常规水凝胶和低水弹性材料。可以用于本发明的软质眼用镜片材料的实例在以下专利中教导授予Künzler等的美国专利5,908,906、授予Künzler等的美国专利5,714,557、授予Künzler等的美国专利5,710,302、授予Lai等的美国专利5,708,094、授予Bambury等的美国专利5,616,757、授予Bambury等的美国专利5,610,252、授予Lai等的美国专利5,512,205、授予Lai等的美国专利5,449,729、授予Künzler等的美国专利5,387,662，以及授予Lai等的美国专利5,310,779，这些专利引入本文作参考。
美国专利6,037,328、6,008,317、5,981,675、5,981,669、5,969,076、5,945,465、5,914,355、5,858,937、5,824,719和5,726,733教导了含有HEMA单体的眼用镜片材料。
美国专利6,071,439、5,824,719、5,726,733、5,708,094、5,610,204、5,298,533、5,270,418、5,236,969和5,006,622教导了含有甲基丙烯酸甘油酯单体的眼用镜片材料。
美国专利6,008,317、5,969,076、5,908,906、5,824,719、5,726,733、5,714,557、5,710,302、5,708,094、5,648,515和5,639,908教导了含有NVP单体的眼用镜片材料。
美国专利5,539,016、5,512,205、5,449,729、5,387,662、5,321,108和5,310,779教导了含有二甲基丙烯酰胺单体的眼用镜片材料。
优选的常规水凝胶材料通常含有HEMA、NVP和TBE(甲基丙烯酸4-叔丁基-2-羟基环己酯)。PolymaconTM材料，例如Soflens 66TM牌接触镜(商业上可从Bausch & Lomb Incorporated of Rochester，NewYork获得)是特别优选的常规水凝胶材料的实例。
硅酮水凝胶一般具有大于约5％(重量)，更常见约10％至约80％(重量)的含水量。材料通常通过聚合含有至少一种含硅酮单体和至少一种亲水单体的混合物来制备。含硅酮单体和亲水单体之一可以起交联剂的作用(交联剂定义为具有多个可聚合官能团的单体)，或者可以使用独立的交联剂。可用于形成硅酮水凝胶的含硅酮单体单元在本领域中是公知的，并且大量实例在以下专利中给出美国专利4,136,250、4,153,641、4,740,533、5,034,461、5,070,215、5,260,000、5,310,779和5,358,995。
优选的硅酮水凝胶材料包含(在共聚合的体相单体混合物中)5～50％(重量)，优选10～25％(重量)的一种或多种硅酮大分子单体，5～75％(重量)，优选30～60％(重量)的一种或多种聚硅氧烷基烷基(甲基)丙烯酸单体，以及10～50％(重量)，优选20～40％(重量)的亲水单体。一般而言，硅酮大分子单体是分子两端或更多端用不饱和基团封端的聚有机硅氧烷。除了上述结构式中的端基外，授予Deichert等的美国专利4,153,641公开了另外的不饱和基团，包括丙烯酰氧基或甲基丙烯酰氧基。含延胡索酸酯的材料，例如在授予Lai的美国专利5,512,205、5,449,729和5,310,779中教导的材料也是本发明有用的基材。优选地，硅烷大分子单体是含硅的碳酸乙烯酯或氨基甲酸乙烯酯，或者是具有一种或多种硬-软-硬嵌段并且用亲水单体封端的聚氨基甲酸酯-聚硅氧烷。
适当的亲水单体包括那些一旦聚合就能与聚丙烯酸形成复合物的单体。适当的单体形成可用于本发明的水凝胶，并且包括，例如，与聚丙烯酸及其衍生物形成复合物的单体。有用的单体的实例包括酰胺，如N，N-二甲基丙烯酰胺、N，N-二甲基甲基丙稀酰胺，环内酰胺，如N-乙烯基-2-吡咯烷酮和用可聚合基团官能化的聚烯烃二醇。有用的官能化的聚烯烃二醇的实例包括含有一甲基丙烯酸酯或二甲基丙烯酸酯封端的不同链长的聚乙二醇。在优选的实施方案中，聚烯烃二醇聚合物含有至少两个烯烃二醇单体单元。亲水碳酸乙烯酯或氨基甲酸乙烯酯单体的其他实例在美国专利5,070,215中公开，而亲水噁唑酮单体在美国专利4,910,277中公开。其它适当的亲水单体对本领域技术人员将是清楚的。在特别优选的实施方案中，接触镜材料中使用的亲水单体能够和阳离子多糖形成稳定的复合物。
硬质眼用镜片材料包括硬质透气性(“RGP”)材料。RGP材料通常包括含有低于5％(重量)水的疏水交联聚合物系统。根据本发明有用的RGP材料包括那些在以下专利中教导的材料授予Ellis的美国专利4,826,936、授予Ellis的美国专利4,463,149、授予Ellis的美国专利4,604,479、授予Ellis等的美国专利4,686,267、授予Ellis的美国专利4,826,936、授予Ellis等的美国专利4,996,275、授予Baron等的美国专利5,032,658、授予Bambury等的美国专利5,070,215、授予Valint等的美国专利5,177,165、授予Baron等的美国专利5,177,168、授予Valint等的美国专利5,219,965、授予McGee和Valint的美国专利5,336,797、授予Lai等的美国专利5,358,995、授予Valint等的美国专利5,364,918、授予Bambury等的美国专利5,610,252、授予Lai等的美国专利5,708,094，以及授予Valint等的美国专利5,981,669。授予Ellis等的美国专利5,346,976教导了制备RGP材料的优选方法。上述专利都引入本文作参考。
只要可以实现阳离子多糖的表面附着，也可以使用其它用于长期佩戴的应用的非硅酮水凝胶。本发明的方法对于在制备多种医学装置之前或之后处理生物材料也有用，仅仅举几个例子来说，所述医学装置包括眼内镜、人工角膜、支架和导管。
表面涂层材料本发明中有用的表面涂层材料包括阳离子多糖，例如阳离子纤维素聚合物。具有的实例包括含有N，N-二甲氨基乙基的纤维素聚合物(质子化或四取代的)和含有N，N-二甲氨基-2-羟丙基的纤维素聚合物(质子化或四取代的)。阳离子纤维素聚合物可商购，或者可以通过本领域公知的方法制备。作为实例，四级含氮乙氧基化的葡糖苷可以通过羟乙基纤维素与三甲基铵取代的环氧化物反应来制备。多种优选的阳离子纤维素聚合物可商购，例如可以从CTFA(Cosmetic，Toiletry，and Fragrance Association)命名的Polyquaternium-10获得的水溶性聚合物。这些聚合物可以从Amerchol Corp.，Edison，NJ，USA以商品名UCAREPolymer商购。这些聚合物含有沿纤维素聚合物链季铵化的N，N-二甲氨基。阳离子纤维素组分在组合物中的量可以为组合物重量的约0.01％至约10％，优选约0.05％至约5％，特别优选约0.1％至约1％。适当的阳离子纤维素材料具有以下通式
其中R1、R2和R3选自H、C1-C20羧酸衍生物、C1-C20烷基、C1-C3的一元和二元链烷醇、羟乙基、羟丙基、环氧乙烷基、1，2-环氧丙烷基、苯基、“Z”基及它们的组合。R1、R2和R3中至少一个是Z基。
“Z”基的性质是 其中R′、R″和R可以是H、CH3、C2H5、CH2CH2OH和 x＝0-5，y＝0-4，并且z＝0-5X-＝Cl-、Br-、I-、HSO4-、CH3SO4-、H2PO4-、NO3-授予Marlin等的美国专利5,645,827(该专利引入本文作参考，讨论阳离子多糖)公开了包含阳离子多糖与阴离子治疗剂，例如透明质酸或其盐的组合物的用途，透明质酸及其盐是公知的治疗干眼病的润药。Marlin等的欧洲申请088770 A1公开了阳离子纤维素聚合物递送阳离子治疗剂，尤其是用于治疗青光眼。
授予Ellis等的美国专利4,436,730和5,401,327(该专利引入本文作参考)公开了阳离子纤维素衍生物在接触镜处理液中的用途，该处理液包含阳离子纤维素聚合物和乙氧基化的葡萄糖如葡聚糖(glucam)。
任选地，一种或多种另外的聚合或非聚合润药可以和上述组分组合。已知润药可以提供润湿、增加湿气和/或润滑作用，导致舒适感增加。聚合物润药还起水溶性增粘剂的作用。水溶性增粘剂包括非离子纤维素聚合物，如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羧甲基纤维素、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙烯醇等等。这些增粘剂或润药的总量可以为约0.01％至约5.0％(重量)。最终配方的粘度为2厘泊(cps)到几百万cps，这取决于配方是用于接触镜、眼内镜还是角膜嵌入物。还可以添加舒适剂，如甘油或丙二醇。
本发明的组合物还可以含有消毒量的防腐剂或抗微生物剂。抗微生物剂的存在不是必需的，但是，为了使本发明有效降低生物材料表面上的细菌浓度，特别优选的防腐剂是山梨酸(0.15％)。抗微生物剂定义为通过与微生物化学或物理化学相互作用而发挥它们的抗微生物活性的有机化学药品。例如，双胍包括阿来西定、氯己定、六亚甲基双胍的游离碱或盐及它们的聚合物，以及前述物质的组合。阿来西定和氯己定的盐可以是有机或者无机的，并且通常是葡糖酸盐、硝酸盐、醋酸盐、磷酸盐、硫酸盐、卤化物等等。优选的双胍是可从Zeneca，Wilmington，DE商购的六亚甲基双胍，商标是CosmocilTMCQ。一般而言，六亚甲基双胍聚合物也称作聚氨基丙基双胍(PAPB)，分子量为至约100000。
如果在本发明的溶液中使用，所用的抗微生物剂量应该至少部分减少所用配方中微生物种落。优选地，消毒量是在四小时内将微生物生物负载降低两个log级，更优选在一小时内降低一个log级的量。最优选地，消毒量是这样的量，即当用于推荐浸泡时间方案(FDAChemical Disinfection Efficacy Test-July，1985Contact Lens SolutionDraft Guidelines)时，消除接触镜上微生物负载的量。通常，这些试剂的浓度为约0.00001％至约0.5％(w/v)，更优选为约0.00003％至约0.05％(w/v)。
除了上述活性组分外，本发明所采用的水溶液还可以包含一种或多种通常存在于眼用溶液中的其它组分，例如，缓冲剂、稳定剂、张力试剂等等，这些试剂有助于使眼用组合物对使用者而言更舒适。本发明的水溶液通常用张力试剂调节至接近正常泪液的张力，其相当于0.9％的氯化钠溶液或2.8％的甘油溶液。将溶液制成基本上与单独使用或一起使用的生理盐水等渗；否则，如果简单地与无菌水混合并使之低渗或高渗的话，镜片将丧失它们期望的光学参数。相应地，过量的盐或其它张力试剂可能导致形成引起刺痛和眼睛刺激的高渗溶液。约225至400mOsm/kg的重量克分子渗透压浓度是优选的，更优选是280至320mOsm/kg。
本发明的溶液的pH应该维持在5.0至8.0的范围内，更优选在约6.0至8.0的范围内，最优选在约6.5至7.8的范围内；可以添加适当的缓冲剂，如硼酸盐、柠檬酸盐、碳酸氢盐、TRIS和各种混合磷酸盐缓冲剂(包括Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4的组合)，以及它们的混合物。硼酸盐缓冲剂是优选，特别是对于增强PAPB的功效而言。一般而言，缓冲剂的用量为约0.05～2.5％(重量)，优选为0.1～1.5％(重量)。
除了缓冲剂外，在某些情况下，为了结合金属离子，本发明的溶液中包含螯合剂是期望的，否则金属离子会与镜片和/或蛋白沉积物反应，并聚集在镜片上。乙二胺四乙酸(EDTA)及其盐(二钠盐)是优选的实例。它们通常以约0.01％(重量)至约0.02％(重量)的量添加。
本发明中所采用的溶液可以通过多种技术制备。一种方法采用两阶段混合程序。在第一阶段中，通过在约50℃下混合约30分钟，将约30％的蒸馏水用于溶解阳离子纤维素聚合物。然后，将第一阶段溶液在约120℃下进行高压灭菌30分钟。在第二阶段中，接着将碱金属氯化物、螯合剂、防腐剂和缓冲剂在搅拌下溶解在约60％的蒸馏水中，接着使蒸馏水平衡。然后，通过压力使第二阶段溶液通过0.22微米滤器而将其无菌地加入第一阶段溶液中，然后包装在无菌的塑料容器中。
如上所述，本发明对于改善长期佩戴的接触镜的舒适性和佩戴性有用。为此目的，可以将用于本发明的组合物配方成滴眼剂，并在1至30ml大小的多种小体积容器中销售。这些容器可以由HDPE(高密度聚乙烯)、LDPE(低密度聚乙烯)、聚丙烯、聚对苯二甲酸乙二酯等等制得。具有常规滴眼剂分送盖(dispensing tops)的软质瓶尤其适用于本发明。本发明的滴眼剂配方根据需要例如在眼中滴入约一(1)或三(3)滴而使用。
本发明还可以用作清洁、消毒或调理液的组分。本发明还可以包含抗微生物剂、表面活性剂、毒性调节剂、缓冲剂等等，已知它们是接触镜调理和/或清洁液的有用组分。清洁和/或消毒液的适宜配方的实例在授予Richard和Heiler的美国专利5,858,937中教导，该专利引入本文作参考。
实施例实施例1具有聚合物JR的Surevue镜片的表面调理本实施例阐明了阳离子纤维素聚合物对亲水接触镜的结合作用，据信其减少细菌对材料表面的附着。将在三种不同溶液中的三个Surevue镜片(Johnson & Johnson，New Brunswick，NJ生产)通过原子力显微镜(AFM)分析进行比较。为了进行比较，溶液1是空白硼酸盐缓冲盐水。溶液2是含有0.1％聚合物JR的溶液1。为了进行进一步比较，溶液3是ReNuMPS(由Bausch & Lomb，Rochester，NY生产)。将镜片处理过夜，然后从小瓶中取出，并在HPLC级水中以静态模式脱盐最少15分钟。在洁净的玻璃基材上将所有镜片用洁净的解剖刀切割。干燥样品，切片并放在洁净的基材上。用AFM获取镜片各面(前和后)的三幅50×50μm的形貌图。本研究中使用的AFM是Dimension3000，并且以接触模式(ContactMode)操作。AFM通过测量尖锐的探针和镜片表面上的原子间的纳米级力(10-9N)来工作。所得的AFM图像表明，贮存在空白硼酸盐缓冲盐水(溶液1)以及ReNuMPS(溶液3)中的镜片的前表面和后表面没有明显的形貌改变。贮存在聚合物JR溶液(溶液2)中的镜片的前表面和后表面显示显著不同的形貌。表面被薄膜覆盖，多种大小和形状的孔隙覆盖前表面和后表面。这些孔隙的平均深度为40±10nm。这些孔隙样不规则物在贮存于溶液2或溶液3中的镜片中不存在。孔隙对于贮存在聚合物JR溶液中的镜片的均方根(RMS)粗糙度有影响。
使用Nanoscope软件计算RMS表面粗糙度(结果列于下表中)。与贮存在聚合物JR溶液中的镜片的前表面和后表面相比，贮存在溶液1或溶液3中的镜片具有更平滑的前表面和后表面。
表1 各AFM图像的RMS粗糙度
AFM结果表明，聚合物JR对镜片表面的形貌有影响，表明在镜片的前侧和后侧覆盖有大的多种形状和大小的空隙的薄膜。
实施例2将20ml 0.1％的阳离子聚合物JR溶液的等分试样倒入无菌聚苯乙烯一次性培养皿中。将带负电的连续佩戴的镜片用无菌镊子从包装中取出，并在180ml初始无菌的0.9％盐水中浸渍五次。然后将这些镜片放入含有0.1％聚合物JR溶液的培养皿中，并在室温下浸泡4小时。4小时的培养时间后，用无菌镊子从0.1％聚合物JR溶液中取出离子涂布的镜片，并在三个连续变化的初始无菌的0.9％盐水(180ml)各浸渍5次。然后将镜片转移至含有3ml～108细胞/毫升放射性标记细胞接种物的20毫升玻璃闪烁瓶中，并在37℃下培养2小时。
实施例3和4实施例3和4使用放射性标记方法评价细菌对生物材料的粘附。
粘附研究用修改的Sawant等(1)和Gabriel等(2)的程序进行。在37℃下，细菌细胞在旋转振荡器上的Triptic大豆肉汤(Triptic SoyBroth，TSB)中生长12至18小时。通过在3000xg下离心10分钟来收集细胞，用0.9％的盐水洗涤两次，并悬浮在基本培养基(1升蒸馏水中含有1.0克D-葡萄糖，7.0克K2HPO4，2.0克KH2PO4，0.5克柠檬酸钠，1.0克(NH4)2SO4和0.1克MgSO4，pH7.2)中，至每毫升约～2×108个细胞的浓度(600nm处光密度为0.10)。将基本肉汤培养物在37℃下振荡培养1小时。向细胞中加入1至3Ci/ml的L-[3，4，5-3H]亮氨酸(NEN Research Products，Du Pont Company，Wilmington，DE)，并将细胞悬浮液再培养20分钟。这些细胞用0.9％的盐水洗涤4次并悬浮在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中至每毫升约～108个细胞的浓度(600nm处光密度为0.10)。
将带有正常阴离子表面电荷的长期佩戴的接触镜与3ml放射性标记细胞悬浮液一起在37℃下培养2小时。用无菌镊子从细胞悬浮液中取出这些镜片，并在三个连续变化的初始无菌的0.9％生理盐水(180ml)中各浸渍5次。振荡镜片除去盐水并转移入20毫升的玻璃闪烁瓶中。向每个瓶中加入10ml Opti-Fluor闪烁合剂(Opti-Fluorscintillation cocktail)(Packard Instrument Co.，Downers Grove，IL)。将小瓶涡旋，然后放入液体闪烁计数器(LS-7500，Beckman仪器公司，Fullerton，CA)中。基于标准校正曲线，将两次实验数据从每分钟的蜕变(dpm)转换成菌落形成单位(cfu)，并以cfu/mm2表示。校正曲线从在连续稀释接种体的倾注平皿中回收的菌落数和已知密度的细胞悬浮液连续稀释的光密度(O.D.s)作出。用作亮氨酸的非特异性摄入的对照的具有正常阴离子表面电荷的未接种的长期佩戴的接触镜按照与接种切片相同的方式处理。结果列于表2和表3中。
1.Sawant，A.D.，M.Gabriel，M.S.Mayo，和D.G.Ahearn.1991.Radioopacityadditives in silicone stent materials reduce in vitro bacterial adherence.Curr.Micorbiol.22285-292.
2.Gabriel，M.M.，A.D.Sawant，R.B.Simmons，和D.G.Ahearn.1 995.Effectsof sliver on adherence of bacteria to urinary catheterin vitro studies.Curr.Microbio.3017-22.
表2
表3
按照本文的教导，本发明的许多其它修改和变化都是可能的。因此应理解，在本发明权利要求的范围内，本发明可以通过本文具体描述之外的其他方式实施。
权利要求
1.抑制细菌粘附于生物医学装置表面的方法，所述方法包括将阳离子多糖结合到所述生物医学装置表面上。
2.权利要求1的方法，所述方法进一步包括处理所述生物医学装置表面，从而在使所述表面与所述阳离子多糖接触之前在所述表面上提供净阴离子电荷。
3.权利要求1的方法，其中所述生物医学装置表面带有净阴离子表面电荷，并且其中该方法在使所述多糖结合到所述生物医学装置表面之前不包括中间处理步骤来改善表面电荷。
4.权利要求2的方法，其中所述表面处理步骤进一步包括使所述表面与连接剂接触。
5.权利要求1的方法，其中所述结合步骤进一步包括通过选自离子相互作用、氢键相互作用、疏水相互作用和共价相互作用的至少一种而将所述阳离子多糖保留在所述生物医学装置表面上。
6.权利要求5的方法，其中所述离子相互作用是生物医学装置和含阳离子多糖的水溶液之间的带相反电荷的离子基团间的作用。
7.权利要求6的方法，其中生物医学装置上的负电荷源自选自羧酸基、磺酸基、磷酸基和膦酸基的至少一种。
8.权利要求6的方法，其中阳离子多糖上的正电荷源自季铵基、锍基、磷鎓基和其它带正电的官能团。
9.权利要求5的方法，其中所述氢键相互作用发生在氢键接受表面和氢键施予溶液之间，或者通过氢键施予表面与氢键接受表面发生。
10.权利要求9的方法，其中所述氢键接受基团选自吡咯烷酮基、N，N-二取代的丙烯酰胺基和聚醚基。
11.权利要求10的方法，其中所述聚醚基是聚乙二醇或聚环氧乙烷。
12.权利要求9的方法，其中所述氢键施予基团选自羧酸、磷酸、膦酸和酚基。
13.权利要求5的方法，其中所述疏水相互作用通过生物材料表面上的疏水部位与阳离子多糖上的疏水基团发生。
14.权利要求5的方法，其中所述共价相互作用存在于生物材料表面和水溶性阳离子多糖之间，从而使阳离子多糖结合到生物材料表面上。
15.权利要求1的方法，其中所述生物医学装置是眼用镜片。
16.权利要求15的方法，其中所述眼用镜片选自接触镜、前房镜、后房镜、眼内镜和角膜嵌入物。
17.权利要求1的方法，其中所述生物医学装置是硅酮水凝胶材料。
18.权利要求17的方法，其中所述接触镜是适于连续佩戴约7至约30天时间的长期佩戴的接触镜。
19.抑制细菌粘附于适于连续佩戴约7至约30天时间的长期佩戴的水凝胶接触镜表面的方法，所述方法包括给所述接触镜施用阳离子多糖，从而在所述接触镜上形成所述阳离子多糖的表面涂层。
20.权利要求19的方法，所述方法进一步包括处理所述接触镜表面，从而在给所述接触镜施用所述阳离子多糖之前，在所述接触镜表面上提供净阴离子电荷。
21.权利要求19的方法，其中阳离子多糖是阳离子纤维素。
22.权利要求1的方法，其中阳离子多糖选自阳离子淀粉、阳离子葡聚糖、阳离子脱乙酰壳多糖、阳离子蝉豆胶、阳离子黄蓍胶、阳离子凝胶多糖、阳离子普鲁兰多糖和阳离子硬葡聚糖。
全文摘要
本发明涉及抑制细菌粘附于生物医学装置表面的方法，所述方法包括将阳离子多糖结合到所述生物医学装置表面上。
文档编号A61L31/10GK1589162SQ01817934
公开日2005年3月2日 申请日期2001年9月27日 优先权日2000年10月24日
发明者罗亚·博拉兹雅尼, 约瑟尼·C·萨拉莫内, 小丹尼尔·M·安蒙, 杰伊·F·孔兹勒, 胡珍泽 申请人:博士伦公司