专利名称：口腔用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于预防和/或治疗口臭、牙槽脓溢、牙周病等口腔内疾病的组合物。更详细地说，涉及以三氟蛋氨酸为有效成分的用于预防和/或治疗口臭、牙槽脓溢、牙周病等口腔内疾病的组合物。
背景技术：
近年来，对于预防和治疗口臭、牙槽脓溢、牙周病等口腔内疾病的关心程度日益增高。
引起口臭的最重要的物质是被称为挥发性硫化物的硫化氢、甲硫醇、二甲基硫醚。其中，已知甲硫醇会产生大量牙周病的病原菌，在甲硫醇作为牙周炎的指标的同时，也被认为是牙周炎的病原因子之一，因此受到了瞩目。该甲硫醇通过细菌具有的酶，即L-蛋氨酸-α-脱氨基-γ-巯基甲烷-裂合酶(MET酶)，由蛋氨酸生成。
在牙周病菌中，作为大量产生甲硫醇的菌，已知牙龈卟啉单胞菌(Prophyromonas gingivalis)等卟啉单胞菌属(Prophyromonas)细菌、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)等梭杆菌属(Fusobacterium)细菌等。
因此，认为通过抑制这些菌的增殖，能够得到预防和治疗上述口腔内疾病的效果，并认为通过通常使用的抗菌活性物质也能够杀灭这些菌得到预防、治疗口臭等的效果。但是，通常使用的抗菌活性物质有可能也会杀灭口腔内不具有病原性的土著菌(indigenousbacteria)，从防止有害外来菌侵入的观点来看，并不优选。
因此，认为如果能够发现一种对于认为能引起上述口腔内疾病的甲硫醇产生菌具有选择性杀菌效果或繁殖抑制效果的物质，将会非常有用。
发明公开本发明的目的在于提供一种口腔用组合物，该组合物以对上述口腔内疾病病原菌显示选择性杀菌效果或繁殖抑制效果的物质作为有效成分。
本发明人制作了上述口腔内细菌的MET酶缺损株，确认丧失了由蛋氨酸合成甲硫醇的能力，表明只有MET酶负责甲硫醇的合成。几乎所有的微生物都具有MET酶，但是尚不知道以人为首的哺乳类中也存在。因此，认为如果以MET酶作为靶使用对于上述口腔内疾病的病原菌显示繁殖抑制效果的物质，则能够提供安全性高的口腔内疾病的预防和治疗剂。
本发明人基于上述观点，使用蛋氨酸的衍生物三氟蛋氨酸考察了对甲硫醇产生菌的繁殖抑制效果，结果发现具有显著的繁殖抑制效果。
因此，本发明提供一种以三氟蛋氨酸为有效成分的口腔用组合物。
按照本发明的优选方式，本发明的口腔用组合物可以用于预防和/或治疗口臭、牙槽脓溢和/或牙槽脓溢。
图1是表示本发明口腔用组合物的有效成分三氟蛋氨酸对牙龈卟啉单胞菌W83株的抗菌效果试验结果的图。
图2是表示本发明口腔用组合物的有效成分三氟蛋氨酸对牙龈卟啉单胞菌ATCC33277株的抗菌效果试验结果的图。
图3是表示本发明口腔用组合物的有效成分三氟蛋氨酸对牙龈卟啉单胞菌M1217株的抗菌效果试验结果的图。
图4是表示本发明口腔用组合物的有效成分三氟蛋氨酸对具核梭杆菌ATCC10953株的抗菌效果试验结果的图。
图5是表示本发明口腔用组合物的有效成分三氟蛋氨酸对伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)Y4株的抗菌效果试验结果的图。
图6是表示本发明口腔用组合物的有效成分三氟蛋氨酸对大肠杆菌(Escherichia coli)BL21株的抗菌效果试验结果的图。
发明的最佳实施方式以下详细说明本发明。
本发明的口腔用组合物以三氟蛋氨酸作为有效成分。三氟蛋氨酸本身是公知的化合物，例如可以按照H.Duewel，E.Daub，V.Robinson，and J.F.Honek，Biochemistry，363404-3416(1997)记载的方法制备。
本发明的口腔用组合物的形态没有特别限定，可以采用通常适用于口腔的形态。作为本发明的口腔组合物的形态，例如口含片、牙粉、牙膏、液状牙膏(牙齿清洗剂)、漱口剂(漱口水)、含漱药、霜剂、凝胶、霜剂、糊剂、喷雾剂、泡沫剂等，也可以采用糖果、口香糖等饮食品的形态。
本发明的口腔用组合物为了以上述形态构成组合物，除上述有效成分以外，还可以含有口腔用组合物中通常使用的载体和添加剂。
作为本发明的口腔用组合物中使用的载体或添加剂，例如研磨剂、粘合剂、润湿剂、增稠剂、表面活性剂、香料、甜味剂、防腐剂、保存剂、着色剂、pH调节剂、其它有效成分、溶剂等。
作为研磨剂，例如沉淀性二氧化硅、硅胶、硅酸铝、硅酸锆等硅类研磨剂，磷酸氢钙2水合物和无水物、磷酸氢钙、不溶性偏磷酸钠、偏磷酸钾、焦磷酸钙、正磷酸镁、碳酸钙、氢氧化铝、氧化铝、碳酸镁、沸石、硅酸酐、含水硅酸、硅酸铝、硅酸锆、膨润土、沸石、氧化铝、氢氧化铝、合成树脂类研磨剂以及它们的混合物等。
作为粘合剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、海藻酸盐、角叉菜胶、阿拉伯胶、聚乙烯醇、黄原胶、黄蓍胶、淀粉、聚丙烯酸钠、卡波普、瓜尔胶、阿拉伯胶、明胶等。
作为润湿剂，例如聚乙二醇、丙二醇、山梨醇、甘油、麦芽糖醇、木糖醇等。
作为增稠剂，例如甘油、山梨醇、丙二醇、聚乙二醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳醇等。
表面活性剂可以用作发泡剂或亲油性物质的稳定剂。作为表面活性剂的实例，可以例举阴离子、非离子、阳离子和两性表面活性剂，具体而言例如烷基硫酸钠、烷基磷酸酯、烷基苯磺酸钠、N-酰基肌氨酸钠、N-酰基谷氨酸盐、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯聚丙烯嵌段共聚物(普朗尼克型表面活性剂)、蔗糖脂肪酸酯、烷基糖苷类、脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、烷基二甲基胺氧化物、烷基三甲铵乙内酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油、烷基醇酰胺聚甘油脂肪酸酯等。
作为香料，例如绿薄荷油、欧薄荷油、冬青油、黄樟油、丁香油、洋苏叶油、桉油、马郁兰油、肉桂油、百里香油、薄荷油、橙油、冬绿油、柠檬油、橙油等天然香料，1-薄荷醇、茴香脑、香芹酮、丁香酚、柠檬烯、百里酚、水杨酸甲酯等合成香料。
作为甜味剂，例如糖精、糖精钠、右旋糖、木糖醇、斯替维苷、新橙皮苷双氢查耳酮、紫苏糖、对甲氧基肉桂醛、甘草酸盐、天冬甜素(天冬氨酰基苯丙氨酸甲酯)、蛇菊提取物等。
作为防腐剂，例如苯甲酸、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯、水杨酸、水杨酸钠、山梨酸、异丙基甲酚等。
作为保存剂，例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸酯、苯甲酸钠、对羟基苯甲酸酯、二氧化钛等。作为杀菌剂，例如氯己定类、季铵盐、三氯生、盐酸烷基二氨基乙基甘氨酸等。作为水溶性氟化物，例如氟化钠、一氟磷酸钠等。
作为着色剂，例如蓝色1号、黄色4号、二氧化钛等。
作为pH调节剂，例如枸橼酸及其盐、磷酸及其盐、苹果酸及其盐、葡糖酸及其盐、马来酸及其盐、天冬氨酸及其盐、琥珀酸及其盐、葡萄糖醛酸及其盐、富马酸及其盐、谷氨酸及其盐、己二酸及其盐、盐酸、氢氧化碱金属等。
作为其它有效成分，可以使用迄今为止已知的抗菌剂、口臭预防剂等，具体例如叶绿素化合物、氯化钠、维生素C、维生素E、烟酸酯、尿囊素水合氯化铝(allantoin chlorohydroxyaluminium)、甘葡环烃、盐酸溶菌酶、日柏醇、甘草酸、甘草酸二钾、蛋白酶，氟化钠、氟化钾、氟化铵、氟化亚锡、一氟磷酸钠等氟化物，正磷酸的钾盐、钠盐等水溶性磷酸化合物，尿囊素水合氯化铝、日柏醇、抗坏血酸、盐酸溶菌酶、甘草酸及其盐类、氯化钠、氨甲环酸、ε-氨基己酸、醋酸d1-生育酚、甘葡环烃、甘草次酸、铜叶绿素钠、葡糖酸铜、乳酸铝、氯化锶、硝酸钾、小檗碱、异羟肟酸及其衍生物、三聚磷酸钠、沸石、葡聚糖酶、变位酶(mutanase)、淀粉酶、甲氧基乙烯、马来酸酐共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、表二氢胆固醇、二氢胆固醇、苄索氯铵、三氯二苯脲、枸橼酸锌，当归、黄柏、丁香、迷迭香、黄芩、红花等的提取物等生药提取物等。
根据本发明的主旨，其它活性成分优选以确认不会杀死口腔内的土著菌，日常使用时不存在安全性问题的量使用。
作为溶剂，例如水、乙醇等。
本发明的口腔用组合物可以通过将活性成分，即三氟蛋氨酸或产生三氟蛋氨酸的化合物，与上述载体、添加剂按照公知的方法混合进行制备。
上述例举的本发明口腔用组合物中含有的载体、添加剂的种类和配合量没有特别的限定，本领域技术人员可以根据上述口腔用组合物的各种形态容易地进行选择。
例如，液状牙膏或漱口剂等液体组合物的场合，可以含有表面活性剂0.01～10％、润湿剂1～30％、溶剂50～95％。牙膏、霜剂等糊状组合物的场合，可以含有研磨剂10～75％、粘合剂0.5～10％、润湿剂和水10～85％。香料、甜味剂等通常在0.01～5％的范围内配合。另外，本发明的口腔用组合物的pH优选为4～11，特别优选5～10。
本发明的口腔用组合物中的活性成分三氟蛋氨酸的含量没有特别的限定，通常为组合物的0.01～1重量％，优选0.05～0.5重量％，更优选0.1～0.2重量％。
认为本发明的活性成分三氟蛋氨酸通过口腔内细菌的MET酶转变成三氟甲硫醇，并通过该三氟甲硫醇抑制口腔内细菌的增殖。三氟甲硫醇在常温下为气体，因此不会滞留在体内，可以说安全性很高。但是，不言而喻本发明并不受特定理论的任何约束。
实施例以下结合实施例详细说明本发明，但是本发明并不受这些实施例的限定。
实施例1三氟蛋氨酸对牙周病病原菌的抗菌力(制备例)三氟蛋氨酸(TFM)使用按照H.Duewel，E.Daub，V.Robinson，and J.F.Honek，Biochemistry，363404-3416(1997)记载的方法，由和光纯药株式会社制造的物质。在以下的实施例中同样。
(抗菌试验)分别将一接种环牙龈卟啉单胞菌W83、ATCC33277和M1217株以及具核羧杆菌ATCC10953的继代培养物，接种在含有5mg/ml氯高铁血红素和1mg/ml甲萘醌的GAM肉汤(Nissui Medical)3ml中，在厌氧条件下(10％CO2、10％H2、80％N2)37℃下培养一夜。然后，将得到的培养物以接种后的培养基在550nm处的吸光度达到0.15的量接种在与上述相同的新鲜培养基中，在与上述相同的条件下培养。接着，使用含有0.1mM或1.0mM三氟蛋氨酸的上述培养基同样培养上述菌株。随时间经过测定各培养物在550nm处的吸光度，根据培养基的浊度评价菌的增殖。结果分别如图1～4(A～D)所示。各图中，□表示使用不含三氟蛋氨酸的培养基得到的结果，■和●分别表示使用含有三氟蛋氨酸0.1mM和1.0mM的培养基得到的结果。
另外，使用THY肉汤(每1升含有30g胰蛋白酶大豆肉汤(trypticase soy broth)〔BBL Microbiology Systems，Cockeysville，Md.〕和10g酵母提取物(Difco))，除在5％CO2下培养以外，与上述同样培养口腔内细菌伴放线放线杆菌Y4株，同样在进一步含有0.1mM或1.0mM三氟蛋氨酸的相同培养基中培养，评价菌的增殖。而且，使用2xTY肉汤(每1升含有16g细菌培养用胰蛋白胨(Difco)、10g酵母提取物(Difco)、5g氯化钠)，与上述同样培养大肠杆菌BL21株，同样在进一步含有0.1mM或1.0mM三氟蛋氨酸的相同培养基中培养，评价菌的增殖。结果分别如图5和6(E和F)所示。各图中，□表示使用不合三氟蛋氨酸的培养基得到的结果，■和●分别表示使用含有三氟蛋氨酸0.1mM和1.0mM的培养基得到的结果。
由图1～6所示的结果可知，三氟蛋氨酸对肠内细菌大肠杆菌没有显示显著的抗菌效果，但是对口腔内细菌牙龈卟啉单胞菌、具核羧杆菌、伴放线放线杆菌显示显著的抗菌效果。因此，认为本发明的口腔用组合物的有效成分三氟蛋氨酸能够特异性地抑制包括产生甲硫醇的细菌在内的口腔内细菌的增殖，对于预防、治疗口臭、牙周病等口腔疾病有效，而且不会杀死口腔内的非病原性土著菌。
实施例2
三氟蛋氨酸对牙周病病原菌的抗菌力(测定最小生长抑制浓度)分别将一接种环牙周病病原菌牙龈卟啉单胞菌W83、W50、ATCC49417和ATCC33277株、伴放线放线杆菌Y4株、具核羧杆菌ATCC10953和ATCC25586株的继代培养物，接种在含有5mg/ml氯高铁血红素和1mg/ml甲萘醌的GAM肉汤(Nissui Medical)3ml中，在厌氧条件下(10％CO2、10％H2、80％N2)37℃下培养一夜。然后，将得到的培养物稀释至10-8、10-6、10-4和10-3，作为接种用菌液。
准备配制成含有400、200、100、50、25、10或5μg/ml的TFM的琼脂培养基，将如上所述准备的接种用菌液用接种环划线2cm左右涂抹在培养基上，在与上述同样的厌氧条件下37℃下培养48～72小时后，评价菌的生长。用肉眼观察明显抑制生长的最低浓度为最小生长抑制浓度。
除使用Brain Heart Infusion(Difco)在5％CO2存在下进行培养以外，与上述同样培养表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)MT8246、血链球菌(Streptococcus sanuis)ST160、变异链球菌(streptococcus mutans)Xc以及唾液链球菌(Streptococcussalivarius)HHT，评价生长。
如上所述求得的各菌的TFM最小生长抑制浓度归纳于下表。表1菌株 最小生长抑制浓度牙龈卟啉单胞菌W83 5μg/mlW50 5μg/mlATCC494175μg/mlATCC332775μg/ml伴放线放线杆菌Y4 10μg/ml具核羧杆菌ATCC1095325μg/mlATCC2558625μg/ml表兄链球菌 MT8246 ＞400μg/ml血链球菌ST160＞400μg/ml变异链球菌 Xc ＞400μg/ml唾液链球菌 HHT ＞400μg/ml根据上述结果，判断出TFM对牙周病病原菌显示选择性的抗菌活性。
实施例3测定三氟蛋氨酸对标准菌株的最小生长抑制浓度采用按照日本化学疗法学会标准法的琼脂平板稀释法，测定三氟蛋氨酸及其它抗菌药对标准菌株的最小生长抑制浓度。
(药物板的制作)首先，制作使用最高浓度10倍浓度的药物溶液(使用的溶剂参照表2)作为表2所示的各试验药物的原液。根据需要的梯度制备原液的2倍稀释系列，向表3所示的培养基9mL中加入各药液1mL，制成药物板。使用的各药物的浓度范围如下三氟蛋氨酸400～0.025μg/mL(15个梯度)、四环素100～0.025μg/mL(13个梯度)、甲红霉素100～0.025μg/mL(13个梯度)。
(接种菌液的配制、菌的培养以及生长的判断)1)在-80℃下将储备的菌液接种在琼脂培养基(使用的培养基参见表3)中后，在37℃下培养一夜。根据需要，用相同的琼脂培养基再继代培养一次(37℃下培养一夜)。
2)用接种环采集琼脂培养基上生长的菌落，悬浊于液体培养基(参见表3)中，在37℃下静置培养18小时(预培养)。
3)进行预培养达到McFarland 0.5(McFarland 0.5＝约108CFU/mL)后，用Muellar Hinton Broth将培养液稀释至106CFU/mL，使用微量接种机将稀释液接种在上述药物板上各5μL。
另外，McFarland是一般微生物领域所使用的浊度指标，与McFarland 0.5相同浊度的大肠杆菌ATCC25922悬浊液显示1～2×108CFU/mL。因此，通过使用McFarland 0.5能够简便地配制约108CFU/mL的菌液。这种浊度的菌液也有市售品，但是也可以容易地制备。如果在99.5mL的1％v/v(0.18mol/L)硫酸中添加0.5mL的0.048mol/L氯化钡水溶液，则达到McFarland 0.5。
4)在37℃下将各菌培养18至20小时后，与实施例2同样判断生长，求出最小生长抑制浓度。
如上所述判断的最小生长抑制浓度(MIC)如表4所示。
表2
表3
HIAHeart Infusion Agar，MHBMuellar Hinton BrothLHBLysed Horse Blood(马溶血液)，MHAMuellar Hinton Agar
表4
CAM甲红霉素，TC四环素由上述结果判断出TFM对牙周病病原菌显示选择性的抗菌活性。实施例4(制剂例)1、牙膏按照常规方法将下述成分(重量比)混合，制造牙膏。
磷酸氢钙45.0硅酸酐 2.0羧甲基纤维素钠 1.2甘油7.0山梨醇 15.0糖精钠 0.2对羟基苯甲酸甲酯0.2月桂基硫酸钠1.5尿囊素水合氯化铝0.1香料0.9三氟蛋氨酸 0.1净化水 余量共计100.02、液状牙膏按照常规方法将下述成分(重量比)混合，制造液状牙膏。
硅酸酐 7.5羧甲基纤维素钠 0.8甘油3.0山梨醇 30.0糖精钠 0.3对羟基苯甲酸甲酯0.1蔗糖脂肪酸酯1.0氟化钠 0.2三氟蛋氨酸 0.1净化水 余量共计100.03、漱口液按照常规方法将下述成分(重量比)混合，制造漱口液。
木糖醇 10.0乙醇4.0聚氧乙烯硬化蓖麻油 0.2肉豆蔻酸0.1L-精氨酸0.09香料0.15着色剂 微量三氟蛋氨酸 0.1净化水 余量共计100.0工业实用性采用本发明的口腔用组合物，能够有效地预防和/或治疗口臭、牙槽脓溢、牙周病等口腔疾病，另外本发明的口腔用组合物不会杀死口腔内的非病原性土著菌，能够日常用于口臭、牙周病的预防等。
权利要求
1.一种口腔用组合物，以三氟蛋氨酸作为有效成分。
2.如权利要求1所述的口腔用组合物，是口臭的预防剂和/或治疗剂。
3.如权利要求1所述的口腔用组合物，是牙槽脓溢的预防剂和/或治疗剂。
4.如权利要求1所述的口腔用组合物，是牙周病的预防剂和/或治疗剂。
全文摘要
本发明提供一种以三氟蛋氨酸为有效成分的口腔用组合物。从而，提供一种对于预防和/或治疗口臭、牙周病、牙槽脓溢等口腔内疾病有效的口腔用组合物，该组合物即使日常使用也很安全。
文档编号A61K8/69GK1482905SQ01821366
公开日2004年3月17日 申请日期2001年12月26日 优先权日2000年12月26日
发明者古贺敏比古, 中野善夫, 吉村满美子, 夫, 美子 申请人:大正制药株式会社, 株式会社产学连携机构九州