专利名称：鱼类精巢发育因子的基因序列及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及鱼类胚胎发育神经胚期起始表达的基因序列，更具体涉及一种从银鲫胚胎发育尾芽期SMART cDNA文库中筛选出的一个精巢高度富含的新基因精巢发育因子1(Tdf1)(testis development factor 1)的核苷酸序列、氨基酸序列及其时空表达图谱，本发明还涉及该基因的用途。
背景技术：
两性差异是脊椎动物个体间最大的差异，它不但表现在雌雄个体间不同的生殖器官上，而且还表现在诸如体色、大小等与生长速度和经济性状相关的多方面。在长期的生产实践中，人们早已发现，不同性别的动物往往在生长速度和商品价值上有着明显的差异，如雌性鲫鱼、鲤鱼、鳜鱼、牙鲆等的生长速度比雄性个体约快30％；鲟鱼和鲻鱼的鱼籽价值要比鱼本身高出百倍，东北林蛙(哈士蟆)的卵巢腺每公斤价值4000元，比作为食用的蛙高出数百倍。因此，自20世纪80年代以来，动物的性别决定机制以及性别决定基因的鉴定一直是生命科学和生物技术的研究热点，并在动物遗传育种生物技术中发展起以人工培育单性动物群体为目标的性别控制育种技术。性激素诱导和染色体组操作可以产生全雌性后代，但操作相对费时。近年来，随着基因组计划的启动和功能基因组时代的到来，一些遗传育种学家开始将注意力转向了性别决定基因，并试图用这些基因来达到动物性控目的。
银鲫(Carassius auratus gibelio)属鲤科(Cyprinidae)鲫属(Carassius)鲫(C.auratus)的一个亚种，广泛分布于北欧到西伯利亚及亚洲一带，是重要的经济鱼类。银鲫具有雌核发育单性生殖的能力，有趣的是，它与其它单性物种明显不同，在其天然种群和人工自交繁育群体中存在约5％-20％的雄性个体。银鲫卵子用其它鱼类的精子授精时，其后代全为雌性，而当用银鲫的精子授精时，产生的后代中出现一定比例的雄性个体，既表明银鲫的卵子具有特殊的应答精子的机制，也说明在其精子发生、受精以及胚胎发育过程中存在微妙的独特调控方式。虽然已经在小鼠等动物中鉴定出了Dmrt和SOX等基因家族，并认为它们与动物性别决定相关，但是生物的性别控制和分化涉及许多基因参与，是一个极为复杂的调控网络，还有许多未知基因参与了动物性别决定与分化，因此，鉴定和分离调控性别决定与分化的基因无疑能为动物性控育种提供坚实的技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鱼类精巢发育因子的基因序列、氨基酸序列和时空表达图谱，筛选方法简便。
本发明还涉及一种鱼类精巢高度丰富的基因序列在鱼类的生殖调控中的应用。
本发明还涉及一种鱼类精巢高度丰富的基因序列在鱼类的雄性性腺分化中的应用。
本发明还涉及一种鱼类精巢高度丰富的基因序列在鱼类性别决定繁殖和人工性别调控中的应用。
本发明还涉及一种鱼类精巢高度丰富的基因序列在饲料制备人工饵料中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术措施本发明所述的基因Tdf1是从银鲫尾芽期胚胎的SMART cDNA质粒文库中筛选到的一个新基因。其cDNA序列和编码蛋白的氨基酸序列如下。该基因cDNA全长761bp，自54bp至476bp区段为其开放阅读框，编码141个氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元，没有特殊的结构域或跨膜区，3’非编码区长285bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中进行同源搜索，发现与其它基因无任何同源性，为一新基因。Tdf1基因的cDNA序列如下ACGCGGGGACTCCAGTCCTTTAATTCTCTCTACAGGAATCTCACTAGCACAAGATGAAGCTGACATTTGCTCTCATTCTTGCACTCCAAGTGTCAGTGTGTGTCTGGGCACAGGAATGGCCCCAGCCTGACAAGGAGTTAGTAGAGAAATATGAGGGGCTGAAGGCAGTTTTCTTTAAGAGGATCGTCAATGCTTGGGAAAAGACCAAAGCTGCCCTTCAGCCAACACTCGAGGGCTCACCAACAGGAGATCAAGCCAAACAAATTCTTGAAGAACTGAGCAAAAGGCCAAGAGTGGAGAGTGCCATCAAAATCATCGGCGGTTTGGCCAGTGATATGGAGCCTATGGTGGACAAAGCTCGCATGGCTCTTCTTGGTGCTTATGGCCACTATCTGCGGCCCCACATCGGAGAATACCTGGACAGGGCAATCACCAACATCAAGCCCGTGCTGGATACTGTCCTGCCTCATGAGGGTTAGAGTCTGCAGCTCATCAACCACTGATTCCTTCAACCCAGCAAACTTCAATAATAGATCTGGATGCTGTGTGTCCAGCACGTCGGTGCAGATTTTGCATGTATATACTGTATCTGTGTATTTGATACCATTCTGTTCAGTGCAGGAAAAATAAAAAACACCCAGCCCAGCATTAATAGAGAATGAATTATGTGATTTTGTGTGCCTCATAAAGAAACAACATGACCCATTCTAAATAAAAACATCTGGAAAATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Tdf1基因编码蛋白的氨基酸序列如下MKLTFALILALQVSVCVWAQEWPQPDKELVEKYEGLKAVFFKRIVNAWEKTKAALQPTLEGSPTGDQAKQILEELSKRPRVESAIKIIGGLASDMEPMVDKARMALLGAYGHYLRPHIGEYLDRAITNIKPVLDTVLPHEG运用RT-PCR技术考察了Tdf1在银鲫脑、卵巢、肾脏、精巢、心脏、肝脏和脾脏的mRNA水平，考察了其在银鲫未受精的成熟卵细胞、受精后40分钟、多细胞期、桑椹期、囊胚期、原肠期、神经胚期、尾芽期、肌肉效应期、心跳开始期、出苗前期和出苗期的表达图谱，结果表明该基因在成熟卵细胞以及胚胎发育早期无mRNA转录本，神经胚期可以明显检测到mRNA存在，肌肉效应期后扩增带的亮度基本无变化，直至出苗(附图1)。成鱼组织中的结果显示，该基因在精巢中的mRNA丰度很高，在脾中可以检测到微量mRNA的存在，而在其它组织中未检测到mRNA产物(附图2)。这表明该基因在银鲫的雄性性腺诱导分化和生殖调控中具有重要功能。
鉴于Tdf1基因是全新基因，目前人类对此基因的认识和了解仅限于本发明人所作的科学工作研究。由于该基因基本只在精巢中表达，而且，银鲫卵子用非银鲫的异源精子授精时产生的后代均为雌性个体，而以银鲫精子授精时产生的后代有5-20％的雄性个体，因此它有可能在银鲫的生殖授精和雄性性腺诱导分化中有着重要功能。通过制备该基因的原核表达蛋白和真核酵母表达蛋白，用于研究该基因在银鲫的生殖调控、雄性性腺分化中的作用。通过制备该基因的真核酵母表达蛋白，可作为饲料添加剂制备人工饵料，可能改变银鲫和其它鱼类的繁殖力和人工控制性别。
本发明的优点通过制备该基因的蛋白，用于研究该基因在银鲫的生殖调控、雄性性腺分化中的作用，通过制备酵母表达的蛋白，可制备人工饵料，改变银鲫和其它鱼类的繁殖力和人工控制性别。
图1为RT-PCR检测基因Tdf1在银鲫组织中的表达。
1-未受精卵；2 受精40分钟；3-多细胞期；4-桑椹胚；5-囊胚；6-原肠胚；7-神经胚；8-尾芽期；9-肌肉效应期；10-心跳开始期；11-出苗前期；12-出苗期。MDL 2 000 DNA分子量标准。表明该基因在神经胚期以前不转录，而在神经胚期开始的所有胚胎发育阶段均可检测到mRNA转录产物图2为RT-PCR检测基因Tdf1在银鲫组织中的表达。
1-脑；2-卵巢；3-肾脏；4-精巢；5-肝脏；6-心脏；7-脾；8-基因组对照。MDL 2 000 DNA分子量标准。图中表明该基因在精巢中mRNA丰度极高，其它组织中除了脾脏有极少量的mRNA外均无转录产物，提示该基因为精巢特异性表达基因，可能与银鲫精巢诱导发育以及性别调控和生殖调控有关。
具体实施例方式
1.超速离心法提取尾芽期胚胎的总RNA用三氟乙酸铯盐(CsTFA)密度梯度超速离心提取总RNA，步骤详见RNAExtraction Kit(Pharmaica)操作手册。银鲫胚胎于20℃条件下在盛有暴气水的培养名中孵化，称取1.4g尾芽期胚胎，加入8mL提取缓冲液，匀浆。5,000×g离心取上清，上清用7号针头反复抽吸10次以上。在16×89mm离心管中先加7.5mL的CsTFA溶液，再轻轻地加入3.5mL上清。用SW41水平转头15℃下以125,000×g(32,000rpm)超速离心16h。弃去所有溶液后用250μL TE溶解附着于管底的总RNA。同样时期的两管中的Total RNA合并于一个1.5ml离心管中，取两份0.5μl分别用分光光度计电泳检测总RNA浓度和质量。
2.尾芽期mRNA的纯化mRNA用生物素标记的寡聚(dT)探针和链亲和素包裹的磁珠纯化，步骤详见PolyATract mRNA Isolation System(Promega)操作手册。将上步提取的总RNA分别定容至500μL，65℃水浴10min。加入3μL生物素标记的寡聚(dT)探针和13μL的20×SSC，混匀后于室温下放置10min。加入0.3mL 0.5×SSC到装链亲和素包裹的磁珠的管中，轻轻重悬磁珠后用磁架将磁珠吸到管壁上，吸去SSC洗涤液。这样反复洗涤3次。将寡聚(dT)探针和RNA溶液与洗好的磁珠混合，室温下放置10min，保持磁珠的悬浮状态。弃去溶液，用0.3mL 0.1×SSC洗涤磁珠3次，弃去SSC洗涤液。加入0.1mL H2O，轻轻重悬磁珠后吸取上清。再用0.15mL H2O洗涤磁珠，吸取上清。合并两次上清，上清中含有polyA+mRNA。用0.1倍体积的NaAc和1倍体积的异丙醇沉淀mRNA，沉淀溶于8μL H2O中，于-70℃保存。取两份0.5μl分别用分光光度计电泳检测mRNA浓度和质量。
3.SMART cDNA质粒文库的构建SMART cDNA的合成步骤详见SMART cDNA synthesis Kit(Clontech)操作手册，合成所用的三个引物是(1)CDS引物(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACT(30)N-1N-3′；(2)Smart II寡核苷酸(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3′；(3)PCR引物(10μmol/L)5′-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3′。
取银鲫尾芽期mRNA1μg，按文库构建方法合成第一链cDNA加入CDS引物和Smart II寡核苷酸各1μl，72℃保温2min后，冰上速冷2min；然后在终体积为10μL的反应体系中，加入5×第一链反应缓冲液(250mmol/L Tris-HCl，pH8.3；375mmol/L KCl；30mmol/L MgCl2)2μl、DTT(20mmol/L)1μl、dNTP(10mmol/L)1μl和PowerScript逆转录酶1μl，42℃保温1h合成第一链cDNA。取2μl第一链cDNA加入dNTP 2μl、PCR引物4μl、和2μl 50×Advantage 2 cDNA Polymerase Mix，于100μl反应体系中进行如下PCR循环95℃预变性1min后，以95℃5s、65℃5s、68℃ 6min反应13个循环，72℃延伸10min。反应结束后，取5μL电泳检测。
合成的SMART cDNA连接入pEGM-T载体中(Promega)，并转化入top-10感受态细胞中。铺平板(内含μg/mL Amp以及-溴--氯--吲哚-β-D-半乳糖苷和异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)，37℃培养过夜。
4.质粒文库的随机筛选及测序该基因cDNA全长761bp，自54bp至476bp区段为其开放阅读框，编码141个氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元，没有特殊的结构域或跨膜区，3’非编码区长285bp，有多聚腺苷酸加尾信号AAUAAA和多聚腺苷酸尾巴。在GenBank中进行同源搜索，发现与其它基因无任何同源性，为一新基因。
5.组织和胚胎总RNA的提取和RT-PCR反应银鲫脑、卵巢、肾脏、精巢、心脏、肝脏和脾脏等组织以及未受精的成熟卵细胞、受精后40分钟、多细胞期、桑椹期、囊胚期、原肠期、神经胚期、尾芽期、肌肉效应期、心跳开始期、出苗前期和出苗期等胚胎发育不同时期的总RNA用SVTotal RNA Isolation System(Promega)提取，用于RT-PCR检测，步骤详见SVTotal RNA Isolation System(Promega)操作手册。依试剂盒的说明分别称取适量的新鲜组织或胚胎，加入1mL的抽提缓冲溶液。充分匀浆后，各取175μl匀浆液转移到1.5离心管中，加入350μlSV RNA稀释Buffer，混匀后70℃封阻3分钟，14000×g离心10min。转移上清，加入200μl 95％乙醇，吹打混匀后转移至离心柱，14000×g离心1min，加入600μl SV RNA洗涤液，14000×g离心1min。加入50μl Dnase I 20-25℃消化15min后加200μl SV Dnase终止溶液，14000×g离心1min。加入600μl SV RNA洗涤液，14000×g离心1min后，再次加入250μl SVRNA洗涤液，高速离心2min。用250μl无RNA酶水洗脱总RNA两次。取0.5-5μl电泳检测总RNA浓度和质量。其余总RNA于-70℃冻结实，真空冻干机超低温冻干浓缩，溶解于20-30μl水中，取0.5μl电泳检测mRNA浓度和质量。用鲫鱼的α-tubulin基因(上游引物5’-GTGCACTGGTCTTCAGGGGTT-3’；下游引物5’-GGGAAGTGGATGCGTGGGTAT-3’)作为对照，确证各个组织和各个胚胎发育时期逆转录的效率都符合要求而且cDNA的量都相差不多。该基因RT-PCR的引物为上游引物5′-ACTAGCACAAGATGAAGCTG-3′，下游引物5′-CATGAGGCAGGACAGTATCC-3′；PCR反应条件为94℃(30秒)-60℃(30秒)-72℃(40秒)，30个循环。
6.Tdf1基因融合蛋白的制备以基因开放阅读框的核苷酸序列与pGEX载体设计构成表达质粒，挑单克隆培养至对数期，加入终浓度为1mmoL的IPTG在37℃诱导表达4-8h。表达的蛋白N端融合了长20个氨基酸的组氨酸tag，可用金属离子亲和层析纯化。
7.Tdf1基因编码蛋白特异性多克隆抗体将3mL纯化蛋白(约200-500μg)与3mL弗氏完全佐剂充分混匀乳化，在家兔的背部皮下多点注射，每点注射约0.2mL。第一次注射3周后加强免疫4次，各次剂量为第一次注射的四分之一，每次间隔10天，后4次以弗氏不完全佐剂乳化样品。在第5次注射后10天自心脏抽取血液。将兔血于37℃放置1h后再在4℃放置过夜，×4000g离心10min，吸取上层的多抗血清，分装后于-80℃冻存8.Tdf1基因在酵母中的表达以基因开放阅读框的核苷酸序列与pGAPZA和pGAPZαB表达载体制备成表达质粒，构建的表达载体转入克隆菌株DHα中，将表达质粒用限制性内切酶BspH I消化，浓缩线性化的DNA片段后，电转化毕赤酵母，在Zeocin抗性平板上筛选重组子，3mlYPD(100μg/ml)Zeocin)培养，48h分别取菌体和上清于12.5％的聚丙烯按凝胶电泳。筛选出有特异蛋白表达的克隆。
权利要求
1.一种鱼类精巢发育因子的基因序列，其特征在于基因Tdf1基因cDNA序列及其编码蛋白的氨基酸序列，该基因cDNA全长761bp，自54bp至476bp区段为其开放阅读框，编码141个氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元，3’非编码区长285bp，有多聚腺苷酸加尾信号AAUAAA和多聚腺苷酸尾巴。
2.根据权利要求所述的一种鱼类精巢发育因子的基因序列，其特征在于Tdf1基因cDNA序列ACGCGGGGACTCCAGTCCTTTAATTCTCTCTACAGGAATCTCACTAGCACAAGATGAAGCTGACATTTGCTCTCATTCTTGCACTCCAAGTGTCAGTGTGTGTCTGGGCACAGGAATGGCCCCAGCCTGACAAGGAGTTAGTAGAGAAATATGAGGGGCTGAAGGCAGTTTTCTTTAAGAGGATCGTCAATGCTTGGGAAAAGACCAAAGCTGCCCTTCAGCCAACACTCGAGGGCTCACCAACAGGAGATCAAGCCAAACAAATTCTTGAAGAACTGAGCAAAAGGCCAAGAGTGGAGAGTGCCATCAAAATCATCGGCGGTTTGGCCAGTGATATGGAGCCTATGGTGGACAAAGCTCGCATGGCTCTTCTTGGTGCTTATGGCCACTATCTGCGGCCCCACATCGGAGAATACCTGGACAGGGCAATCACCAACATCAAGCCCGTGCTGGATACTGTCCTGCCTCATGAGGGTTAGAGTCTGCAGCTCATCAACCACTGATTCCTTCAACCCAGCAAACTTCAATAATAGATCTGGATGCTGTGTGTCCAGCACGTCGGTGCAGATTTTGCATGTATATACTGTATCTGTGTATTTGATACCATTCTGTTCAGTGCAGGAAAAATAAAAAACACCCAGCCCAGCATTAATAGAGAATGAATTATGTGATTTTGTGTGCCTCATAAAGAAACAACATGACCCATTCTAAATAAAAACATCTGGAAAATGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
3.根据权利要求所述的一种鱼类精巢发育因子的基因序列，其特征在于Tdf1基因编码蛋白的氨基酸序列MKLTFALILALQVSVCVWAQEWPQPDKELVEKYEGLKAVFFKRIVNAWEKTKAALQPTLEGSPTGDQAKQILEELSKRPRVESAIKIIGGLASDMEPMVDKARMALLGAYGHYLRPHIGEYLDRAITNIKPVLDTVLPHEG
4.根据权利要求1所述的一种鱼类精巢高度丰富的基因序列在鱼类的生殖调控中的应用。
5.根据权利要求1所述的一种鱼类精巢高度丰富的基因序列在鱼类的雄性性腺分化中的应用。
6.根据权利要求1所述的一种鱼类精巢高度丰富的基因序列在鱼类性别决定繁殖和人工性别调控中的应用。
7.根据权利要求1所述的一种鱼类精巢高度丰富的基因序列在饲料制备人工饵料中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鱼类精巢发育因子的基因序列及其用途，该基因cDNA全长761bp，自54bp至476bp区段为其开放阅读框，编码141个氨基酸，5’非编码区长53bp，起始于一个包含在脊椎动物起始密码子ANNATG基元，3’非编码区长285bp，有多聚腺苷酸加尾信号(AAUAAA)和多聚腺苷酸尾巴。该基因在鱼类雄性性别诱导分化决定、雄性性腺发育和生殖调控中的应用。
文档编号A61P43/00GK1401656SQ0213903
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月12日 优先权日2002年9月12日
发明者石耀华, 刘军, 桂建芳 申请人:中国科学院水生生物研究所