专利名称：通过永久性遗传修饰其生物膜而由病原微生物产生非强毒微生物用于制备疫苗的方法
技术领域：
本发明涉及通过永久性遗传修饰其生物膜而由病原微生物产生非强毒微生物(non virulent microorganisms)的方法。特别地，本发明的方法提供了对膜的物理状态和/或动力学状态的修饰，以获得可用于疫苗制备的修饰的病原体。本发明还涉及这样获得的疫苗。
以下说明书中所用的术语MPS膜物理状态克隆载体含有使其在转染宿主后得以复制的完整遗传信息的DNA分子。
去饱和酶基因编码去饱和酶的基因，该酶在饱和脂肪酸(SFA)酰基链的特定位置(Δ6、Δ9、Δ12等)引入双键以形成不饱和脂肪酸(UFA)。
差示扫描量热法一种研究生物膜的热改变行为(thermotropicbehavior)的技术。随着生物膜的温度从其脂质成分(或者是其具有特定脂质头部基团和脂肪酰链的区域)的凝胶温度升高到液晶相变，烃链的活动性增强并发生相应的热吸收的增加。凝胶到液体的脂质相变一般是在低于或围绕该生物体的生长温度左右完成的。高温热转变通常归因于蛋白变性，并且，与脂质转变形成对照，是不可逆转的。
基因表达该术语是指生物体通过中间分子mRNA合成由特定基因所编码的蛋白质的全过程。
热激基因(应激基因)普遍存在的基因，当细胞暴露于突然升高的温度和/或各种不同形式的应激时迅速转录激活。应激的可诱导性由这些编码序列启动子区域特定顺式作用元件(如热激元件，HSE)的存在而获得。
热激蛋白(HSP或应激蛋白)暴露于应激后细胞所迅速积聚的热激基因的蛋白质产物，并且其功能包括指导新生多肽正确折叠、靶向变性蛋白(错误折叠的)、保护线粒体和叶绿体的功能、mRNA成熟、其插入膜中以保护MPS，等等。
整合性(或内在性)膜蛋白部分或完全地与磷脂双层的疏水区相互作用，并且只能用去垢剂从膜中提取的任何膜蛋白。
巨噬细胞存在于血液、淋巴和其他组织中的细胞。其功能是吞噬和破坏病原体。有些巨噬细胞负责B和T淋巴细胞的激活。
膜包围真核及原核细胞、细胞器(如线粒体、叶绿体、内质网、细胞核等)的半透性屏障，由脂双层(磷脂、糖脂和固醇)组成，其中存在着内在性膜蛋白或缔合蛋白。作为本发明描述的遗传操作的结果，所有的膜MPS均经历细胞特异性的变化。
膜流动性描述膜内分子的相对扩散运动的一种广为应用但主观的术语。采用流动性而不是粘性，是因为膜是平面的不对称结构，并且其特性与体相(bulk phase)不具可比性。术语流动性旨在传达发现于脂质呈液体-晶体层状相的功能膜中的侧向扩散、分子摇摆和链伸缩的印象。
膜秩序(Membrane order)膜内分子或分子域的运动动作。膜秩序可通过估计顺磁探针的运动和计算来自ESR或NMR光谱的秩序参数(order parameter)予以量化。
非层状相脂质在水介质中的非双层排列。可以是六角形(HI)或倒六角形(HII)排列；膜中很少发现有HI相。
PCR(聚合酶链式反应)利用互补于靶基因序列的特定寡核苷酸引物由专门的热稳定DNA聚合酶体外大量合成特定核苷酸序列的技术。
pG13含有处于瘰疬分枝杆菌(M.marinum)启动子(命名为PG13，acc.#AF092842)转录调控之下的大肠杆菌(E.coli)绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒。PG13是σ70-样启动子，在瘰疬分枝杆菌(M.marinum)和结核分枝杆菌(M.tuberculosis)中均有发现，其在巨噬细胞中的诱导作用比分枝杆菌hsp60启动子要高40倍左右。
pNir体内厌氧诱导的质粒，含有大肠杆菌(Escherichia coli)pNirB启动子，受细菌蛋白FNR的调控，后者在厌氧条件下激活(Dunstan等，1999)。
启动子RNA聚合酶起始转录的特定DNA区域。该启动子区域含有RNA聚合酶的识别位点。
信号转导途径物理(如温度、摩尔渗透压浓度)化学(如激素)形式信号向其他形式信号的转化。在细胞生物学中，该术语是指由于化学因子与膜或细胞受体的相互作用或者因对膜的物理效应而引起的系列过程，其在一个或多个特定的细胞应答中达到顶点(如处于这种调控之下的序列的基因转录激活)。
转化通过DNA重组技术获得蛋白的方法，需要克隆编码给定蛋白的基因，其中“克隆”是指分离、纯化并测序编码所述蛋白的基因。一经克隆，该核苷酸序列可被插入合适的表达载体中，而所得的DNA重组分子可被引入到微生物中，在那里该基因与宿主DNA同时复制。该基因最终可用分子生物学标准技术重新予以分离。
毒力基因这些基因被定义为编码对宿主有毒的分子(毒素)或者编码对于胞内病原体在宿主环境内生存所必需的蛋白产物的那些遗传性状。因此，编码这些性状的几个基因很可能是响应物理和/或环境的变化例如不同形式的应激而加以调控。
背景技术：
热激反应，或者应激反应，是一种研究的较好的稳态细胞应答，主要是应答变化多样的外界应激和/或病理状态而参与细胞功能的维持。这一应答通过迅速增加那些编码应激蛋白的基因的转录而介导(Lindquist.1986)。已大量证明这种应激基因mRNA合成的增加，以及相关的胞内HSP的积聚，与耐热性的获得有关，伴随着对后来暴露于其他形式的应激或病理条件下的保护等(Singer和Lindquist 1998；van Eden和Young 1996)。业已证明温度变化的初级传感器，并且一般而言，其他形式应激的初级传感器，是定位于膜上的(Carratù等1996；Horvath等1998，Vigh和Maresca，1998；Suzuki等2000，Piper等2000；Torok等2001；Vigh和Maresca，1998)。进一步的，最近的研究表明突然的温度变化或者暴露于其他形式的应激，决定了脂质和蛋白膜组分的物理重建(Slater等1994)，继之而来的是特定的基因应答，旨在补偿MPS的变化。从而，在MPS的变化与基因表达的调控之间存在着对话(cross-talk)，特别是对于热激基因而言。我们将注意力集中在膜作为热激的初级靶的重要角色方面，并尝试了解膜内适当的脂质/蛋白互作是如何决定HS基因的转录调控的。这种分子互作已被证明精密地参与从外界到后续过程中的物理和化学信号转化，最终，以特定的方式，转录激活应激调控基因。反过来，某些HSP和膜特定区域(微区(domain))之间的互作重塑膜的物理状态情况(整体相态、秩序、通透性等)。我们已证明，通过这些膜微区的不均匀分布，精确感知生物学和物理学环境调控信号以及不同形式应激，可获得基因表达特异性。这些研究有力地修正了我们对生物膜功能的观点。我们提出膜的组成、结构和物理状态在急性热激和病理状态期间的细胞应答中起着重要的和决定的作用(Vigh和Maresca，1998)。
在造成适当MPS的试剂中，我们提及去饱和酶，通过其酶活，其调控膜的磷脂组成。去饱和酶是向SFA中引入双键形成UFA的酶。SFA/UFA比是决定所有细胞的适当MPS的关键因素之一(Cossins，1994)。最近证明可诱导性HSP的合成受许多因素突然和局部变化的调控，这些因素包括●膜脂组成●膜脂质/蛋白互作●膜脂动力学(MPS修饰)(Vigh等1998，Vigh和Maresca，未发表，1998)从而，应激条件下MPS的变化重新确定HSP正常合成的阈值。
胞内病原体，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、锥虫等，在发作时及感染巨噬细胞和其他细胞期间，通过转录激活应激基因以及其他系列的种特异性基因，这里概括地定义为毒力基因，而诱导遗传反应。基因产物直接的参与侵染/适应机制，以一种协同的方式进行，并负责病原体侵染、复制和在宿主中诱导疾病(毒力基因)的能力(Groisman和Ochman 1997)。这种大量、协同和普遍的遗传反应使得胞内病原体例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)可以逃避宿主的免疫反应而诱导疾病。
所有的细菌、真菌和寄生虫，一般而言，尚未根除的造成致命疾病的因子，例如沙门氏菌病、伤寒症、肺结核、组织胞浆菌病、念珠菌病、疟疾、锥虫病等，诱导HSP作为其在侵染之初对在宿主中所遭遇到的情况的反应的一个基本部分(Groisman和Saier 1990)。真核病原体Hsp70和细菌Hsp60(GroEL)是主要抗原，构成高达15％的细胞干重(Feige和van Eden，1996)。因而，应激基因和那些参与毒性的基因是严格的相互连接的并且是遗传上协同的(Groisman和Ochman1997)。然而这些毒力基因调控的细节还未阐明，已知这些序列的适当表达也在侵染之初所合成的适量HSP的调控之下。对抗病原体的传统方法被认为几乎是无效的，因为他们是以刺激针对一个或少数几个抗原的免疫反应的疫苗的应用为基础的。举例来说，有些结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)菌株，肺结核的病因因子，日益增多地变得对现有抗生素具有抗性。由于鉴别新的有效无毒抗生素需要多年的实验工作和巨大的投资，急需制备新型的疫苗对抗新的抗性菌株。
关于沙门氏菌(Salmonella)，现有疫苗是●带减毒株的疫苗，可肠胃外注射；●由纯化的细菌荚膜制备的疫苗，可肠胃外注射；●由沙门氏菌(Salmonella)减毒株构成的Ty21疫苗，口服给药。
这样的疫苗，尽管引起永久免疫性，但具有若干缺点。举例来说，未确定由杀死的细菌所制备的疫苗真正不含活细胞，以及减毒疫苗不会回复成致病形式。也有可能由杀死的生物体所获得的疫苗含有可能对于人类有毒的物质、细胞或痕量培养基。进一步的，带杀死的生物体的疫苗常常具有高发的副作用，以及低水平的保护作用。通过迅速热或化学处理获得、由侵染性减毒颗粒制备的疫苗，可能含有生理蛋白折叠被改变(变性)的抗原，从而改变天然的免疫应答。
不涉及应用减毒株的疫苗通常由单个或几个抗原组成，其与天然的免疫应答相比，仅仅产生部分或不完全的保护。
一般而言，这具有导致当今疫苗低功效的缺点，因为在人类中，像一般而言的哺乳动物中，更一般而言的高等真核生物中一样，抵抗侵染因子的天然保护机制包含针对整个微生物体和其结合的所有抗原的复杂免疫应答。
现在作者猜测，并且经试验证明，改变生理学MPS和病原体的应激反应，有可能减毒菌株用于疫苗制备，避免上述的副作用。
发明概述本发明的一个目的是提供一种方法永久性地遗传修饰微生物的MPS，所述微生物特别是胞内病原体(如细菌、真菌、寄生虫)例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)、荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)、锥虫类等，目的是改变侵染发作时这种病原体内HSP的合成和积聚，以及改变那些种特异性的基因产物的合成和积聚，其调控作为MPS的结果而被改变，包括由信号转导途在介导其激活的基因(如c-fos，fos B，junB，junD，MAP激酶，基因)，其中宿主可以是靶细胞例如巨噬细胞、一般而言高等生物或者哺乳动物或人类的细胞。所以，作为这种修饰的结果，病原体变成非强毒的(减毒的)。
另一个目的是利用这些减毒株制备疫苗。
进一步的目的是开发一类新的疫苗用于人类以及一般而言用于动物，其包含该修饰的病原体。
进一步的目的是制备病原微生物减毒的非强毒株(non-virulentstains)的方法，所述微生物例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)、荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)等，这通过转化携带和表达编码集胞蓝细菌(Synechocystis) PCC6803Δ12-去饱和酶或沙门氏菌(Salmonella)或其他原核和真核微生物(如酿酒酵母(S.cerevisiae)或荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)的Δ9-去饱和酶)的其它去饱和酶的基因或编码导致MPS干扰(perturbation of MPS)(脂相变、通透性)的整合膜蛋白的基因的载体来实现。利用根据本发明产生的遗传修饰，有可能获得，例如在沙门氏菌(Salmonella)中，总膜(外膜和内膜或胞质膜的混合物)的蛋白/脂质比从100左右(强毒株)升高到170左右(遗传修饰株)(图4)，或者，例如在瘰疬分枝杆菌(M.marinum)突变株中，其细胞外膜的主要脂相变至少下降4℃。该方法可扩展到本文下面作为非限制性实例所列的其他胞内病原体。
进一步的目的在下面的发明详细描述中是明显的。
附图简述
图1含集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803(登录号X53508，CyanoBase http//www.Kazusa.or.jp/cyano/)Δ12-去饱和酶基因(SEQIDN.1)(图B)的载体(图A)，克隆在处于PNir启动子调控下的pNir质粒的NdeI限制性位点。NdeI限制性位点利用合适引物(desA-NdeI3’-SEQ ID N.3和desA-NdeI 5’-SEQ ID N.4)(图C)通过PCR产生。FNR是FNR蛋白的DNA结合位点，FNR蛋白是厌氧条件下细菌诱导产生的，并激活起始于PNir启动子的下游转录。
图2 在37℃培养并在自37℃到41、45及47℃热激后15分钟，鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)中如Northern印迹所示的集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去饱和酶基因的表达。在仅由空载体(pNir)转化的细胞中，检测不到内源性Δ12-去饱和酶的mRNA。
图3从厌氧条件下表达Δ12-去饱和酶基因或者含有空载体的沙门氏菌(Salmonella)裂解制备物的沉淀物级分中纯化的蛋白提取物(7和15μg蛋白)的变性胶(a＝在O2中生长至对数晚期的鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)(pNir)，b＝在O2中生长至对数晚期的鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)(pΔ12)，c＝在无O2条件下生长20小时的鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)(pNir)，d＝在无O2条件下生长20小时的鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)(pΔ12))。箭头表示Δ12-去饱和酶蛋白。在细菌裂解物的可溶性级分中鉴别不到Δ12-去饱和酶蛋白。细胞在氧气中生长至对数晚期以耗竭氧气(厌氧生活)或在厌氧条件下生长。
图4含pNir∷Δ12构建物-des或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)中总膜的蛋白/脂质比的变化。
图5考马斯凝胶沙门氏菌(Salmonella)外膜蛋白的SDS PAGE(17％)电泳。细胞生长于30℃。Western印迹含pNir∷Δ12构建物或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)外膜分级物中Δ12-去饱和酶的鉴定。
图6集胞蓝细菌(Synechocystis)Δ12-去饱和酶抗体按1∶2000稀释使用。集胞蓝细菌(Synechocystis)总细胞提取物作为阳性对照应用(Syn.)。
图7含pNir∷Δ12构建物-des或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)膜通透性的变化。在25°-40℃之间，膜蛋白Δ12去饱和酶的过量产生诱导Δ12-转化的沙门氏菌(Salmonella)菌株(细胞生长于30℃)的外膜通透性升高。
图8含pNir∷Δ12构建物-des或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)膜通透性的变化。数据组与图7相同，并表示为两套数的比值。
图9由差示扫描量热法所检测的集胞蓝细菌(Synechocystis)Δ12-去饱和酶的过量产生对外膜向热致变行为的DSC影响。第一次和第二次热扫描的原始数据。第一次热扫描的标准化数据。膜分离自在30℃生长的细胞。
图10放大和显示了图9的DSC主信号峰。
图11含pNirΔ12构建物-des或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)中DnaK(hsp70)基因的表达，Northern印迹。细胞在30℃生长并于37°、39°及43℃热激15分钟。
图12Northern印迹显示的含pNirΔ12构建物-des或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)中DnaK(hsp70)基因的表达。细胞在37℃生长并于41°、43°、45°及47℃热激15分钟。
图13含有带des的pNirΔ12构建物或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)中GroEL基因(hsp60)的表达，Northern印迹。细胞在30℃生长并于37°、39°及43℃热激15分钟。
图14含有带des的pNirΔ12构建物或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)中GroEL基因(hsp60)的表达，Northern印迹。细胞在37℃生长并于41°、43°、45°及47℃热激15分钟。
图15含有带des的pNirΔ12构建物或仅含pNir的沙门氏菌(Salmonella)DnaK诱导的定量。数据是图11和12的那些。
图16Northern印迹显示含(Δ12)pNir∷Δ12构建物或Nir(pNir；对照)的沙门氏菌(Salmonella)中的DnaK(hsp70)和IbpB(hsp17)基因的表达，Northern印迹。细胞在30℃生长并于45℃热激15分钟。
图17(a-c)苯甲醇毒性曲线。暴露于增加浓度的(5至80mM)苯甲醇(BA)30分钟对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)生长的影响。
图18含pNir∷Δ12构建物-des或仅含pNir或用50mM BA处理的沙门氏菌(Salmonella)中DnaK的诱导表达(Northern印迹)。
图19(a-f)用pNirΔ12构建物-des或仅用pNir(强毒株)转化鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)对巨噬细胞感染的影响。巨噬细胞以1∶1的巨噬细胞/沙门氏菌(Salmonella)比(MΦ/S.th.1∶1)感染不超过30分钟。在巨噬细胞裂解后，回收沙门氏菌(Salmonella)，并取小份涂布于琼脂上测定存活。经遗传修饰的细胞不再具有强毒性。
图20(a-e)用50mM BA处理鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及其对巨噬细胞感染的影响。巨噬细胞用沙门氏菌(Salmonella)(MΦ/S.th.1∶1)感染不超过60分钟。在巨噬细胞裂解后，回收沙门氏菌(Salmonella)，并取小份涂布于琼脂上测定存活。在最初的休克之后，细胞通过细胞重构建得以恢复。
图21载体pG13Δ12，含集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去饱和酶基因(DesA)，受PG13启动子调控。该基因克隆在该载体的NdeI限制性位点。
图22用含有集胞蓝细菌(Synechocystis)Δ12-去饱和酶基因的pG13Δ12转化的瘰疬分枝杆菌(M.marinum)中Δ12-去饱和酶基因的表达。对照细胞中没有可检测的表达。
图23用pG13和含有处于PG13启动子调控之下的集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去饱和酶基因的pG13Δ12转化的瘰疬分枝杆菌(M.marinum)的生长。
图24瘰疬分枝杆菌(M.marinum)以及用含有处于PG13启动子调控之下的集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC680312-去饱和酶基因的pG13Δ12转化的细菌的总膜蛋白/脂质的变化。
图25用含有处于PG13启动子调控之下的集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去饱和酶基因的pG13Δ12转化的瘰疬分枝杆菌(M.marinum)的存活被终止，而对照细胞的生长按照预期得以恢复。
图26经遗传修饰的荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)强毒株(D3)中hsp70基因转录的变化(Northern印迹)。
图27荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)G217B强毒株和经修饰的D3株在鼠源巨噬细胞胞内生长能力的比较。D3株在巨噬细胞内不繁殖。
图28用G217B强毒株接种以及用非强毒性D3接种后又用正常G217B强毒株攻击的小鼠的存活曲线。
发明的详细描述根据本发明的方法可利用遗传工程技术，例如象Sambrook等(1989)描述的技术，通过构建含有能够在感染期间驱动目的基因在将最终用于获得特定疫苗的病原体中表达(如在厌氧条件下，或在细胞中例如巨噬细胞或其他哺乳动物细胞、在人或动物宿主中)的启动子的载体来进行。然后该修饰菌株可用来制备注射疫苗、或可用于口服或经由鼻腔喷雾的疫苗。
本发明的方法可根据如下的主要步骤来概括-对每一种特定的病原微生物构建合适的载体以调节受控于合适启动子的基因的(组成型或诱导型)表达，以及蛋白产物的相对生产，所说的蛋白能够修饰病原体的膜，例如改变膜脂的脂酰链内的饱和度水平的酶或者能够移位并与细胞膜上预存的脂蛋白复合体相互作用的膜整合蛋白；该载体可包含，举例来说，Δ9-去饱和酶或Δ12-去饱和酶基因或其他去饱和酶基因或者编码整合膜蛋白或其衍生物的基因；-用所述的每种病原微生物的特定载体遗传转化强毒株(病原体)；-表达能够直接(整合蛋白)或间接(去饱和酶)与病原体的膜相互作用的蛋白产物；可对强毒病原体进行体外测试以验证对应激基因、去饱和酶、整合膜蛋白、和/或毒力基因和/或信号途径之转录的影响(如通过Northern印迹)。
这样得到的非强毒株可根据已知的方法予以加工，以便利用它作为有效成分以有效量制备疫苗。
熟练技术人员可利用根据本发明的经修饰的病原菌株进行疫苗的制备。可以建立工艺来制备包含赋形剂、佐剂和其他可用于例如皮内、肌肉内、静脉内、粘膜、阴道、口服、直肠、鼻用给药的常规试剂的疫苗。
这种遗传学方法特别适用于所有的胞内病原体，原核生物和真核生物，但不排除胞外病原体。可应用本发明的方法的病原体的例子是未穷举的本列表中提及的那些*严格胞内细菌衣原体属(Chlamydia)物种(肺炎衣原体和沙眼衣原体)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、恰非埃里希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、立克次氏体属(Rickettsiae)。
*兼性胞内细菌侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、分枝杆菌属(Mycobacteria)(结核分枝杆菌(M.tubereulosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、诺卡氏菌属(Nocardia)物种(足分枝菌病)、巴尔通氏体属(Bartonella)物种、布鲁氏菌属(Brucella)物种、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、单核细胞增生利斯特氏菌属(Listeria monocytogenes)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种。
*其他细菌布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、奈瑟氏球菌属(Neisseriae)物种、葡萄球菌属(Staphylococci)、酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、耶尔森氏菌属(Yersiniae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)。
*真菌烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、假丝酵母菌属(Candida)物种、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)。
*寄生虫溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、利什曼原虫属(Leishmania)物种、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(vivax)及其他种、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、克鲁斯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。
在本发明的范围之内，不同类别的病原体组合和/或混合物是可能的。
根据本发明的方法可得到修饰的MPS，并且当他们结合宿主时，病原体中合成的HSP的量下降，宿主可以是巨噬细胞，或者，一般而言，高等真核生物、尤其是哺乳动物、更具体是人类的任何类型的细胞。HSP量的下降是由MPS的干扰控制的，MPS的干扰是用本发明中描述的方法诱导的，并且作为实例，可包含以下方面的变化●膜脂组成●膜内蛋白与脂质的比●膜通透性以及热相变所以，根据本发明的MPS的遗传修饰，在病原体所遭遇的应激条件下(当病原体与其侵染的宿主细胞相互作用并被内在化时)，确立了一种新的(不同的)应激(热激或hs)基因正常转录的应激阈。从而，MPS的修饰将病原体“冻结”在生理和免疫活性状态，带有全套未加修饰的抗原。在侵染期间，修饰的病原体不能在恰当的时间合成适量的参与病原体对存在于宿主中的条件的适应过程和允许其侵染、增殖以及最终导致疾病的特定蛋白。修饰病原体适应宿主条件的能力下降，所以，不发生疾病。
用这种方法，减毒病原体的抗原并不在结构上被修饰，因而，病原体是具完全免疫活性的。此外，这些修饰的胞内病原体不能正确地诱导避免宿主免疫反应所必需的遗传的和确定的种特异性程序(例如新的特定抗原和蛋白)。所以，本发明的方法可以产生毒力机理减弱但具完全免疫活性的病原体株系。这样获得的减毒活疫苗代表了对抗胞内病原体的最好保护。
根据本发明一个特别的实施方式，我们在实例中描述了制备鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)和荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)非强毒菌株的主要步骤以及他们用于疫苗制备的用途。
鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)和荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)等减毒非强毒菌株的制备可通过用载体转化相应的病原微生物获得，该载体携带和表达集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去饱和酶基因或者沙门氏菌(Salmonella)或其他原核和真核生物体(例如荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)或酿酒酵母(S.cerevisiae) Δ9-去饱和酶等)的去饱和酶基因，或者编码能够导致病原体MPS干扰的整合膜蛋白的其他基因。特别地，插入细胞膜(外膜及内膜或者胞质、核、线粒体等膜)的整合膜蛋白改变预存的蛋白/脂质比从而改变其与膜在给定的温度范围内恰当地行使功能密切相关的通透性以及热相变性质(thermalphase transition profile)。这样的修饰导致广泛的或局部的MPS的修饰，这是编码整合膜蛋白的外源基因表达的结果，其效果与去饱和酶通过变更SFA/UFA比而改变这些参数的酶活性所决定的效果相似。
该方法包含以下步骤●为给定的致病因子构建合适的载体，其包括这样的基因，该基因的产物直接或间接的修饰病原体的MPS；●用蓝藻类细菌(cyanobacterium)集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去饱和酶基因遗传转化病原菌鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)的强毒株，并用含有受控于可驱动下游基因在病原体侵染阶段期间表达的启动子，例如Downs菌株的上调启动子的Δ9-去饱和酶基因的质粒遗传转化强毒荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)G217B菌株(G217BATCC 26036，美国典型培养物保藏中心，Rockwille，MD)；●Δ12-或Δ9-去饱和酶基因或其他去饱和酶基因或编码整合膜蛋白的基因的超表达；●去饱和酶的酶活性；●蛋白产物转移到膜内；●介由酶活性和/或蛋白在膜中插人而改变MPS。
用所述方法得到的修饰诱导应激基因的表达型式改变，以及其他基因例如负责毒力的那些和/或参与适应宿主中存在的条件和牵涉细胞存活及病原体毒性的基因和/或在MPS调控下受信号转导途径调节的基因的表达模式的改变。MPS的干扰以及基因表达的改变与巨噬细胞感染期间和动物感染模型中鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)的毒力丧失相关。如此得到的减毒株诱导针对鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)强毒株的免疫保护。
用本发明的方法所得到的结果证明，通过过量表达去饱和酶基因或者局部或广泛修饰MPS的膜蛋白用遗传方法获得的膜干扰，或者用干扰MPS的分子处理膜，导致沙门氏菌(Salmonella)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)(以及其他原核和真核胞内病原体)积累适量应激蛋白的能力显著改变。
当利用遗传转化的菌株感染巨噬细胞细胞系(J774)或鼠源巨噬细胞或其他细胞或感染对感染易感的动物或人类时，如此获得的膜干扰导致沙门氏菌(Salmonella)、瘰疬分枝杆菌(M.marimum)和荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)(以及其他病原体)的毒力永久性丧失。
实例中描述的遗传操作程序可以产生非强毒菌株，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)，从而允许开发针对这些病原体的疫苗。这一技术可应用于其他或者是原核生物或者是真核生物的胞内病原体(参见上述列表)以获得其他减毒株来开发其他疫苗。
提供下列实施例和附图是用来更好地显示本发明的，而不应当理解为是对其范围的限制。
实施例1通过PCR克隆了完整的蓝藻类细菌(cyanobacterium)集胞蓝细菌属(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去饱和酶基因(SEQ IDN.1)，并插入到pNir载体中(图1)，处于在厌氧条件下可诱导的大肠杆菌(E.coli)PNirTM启动子(Dunstan等1999)的调控，并利用它来转化野生型强毒鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)菌株。在正常生长时或在感染巨噬细胞期间及在对感染易感的动物中，都可以用能够驱动下游基因表达的其他启动子替代PNir。
转化株是用pNir永久性遗传修饰的生物体，并且在厌氧条件下过量表达提高水平的Δ12-去饱和酶mRNA(图2)，后者被高水平地翻译为编码蛋白(图3)。Δ12-去饱和酶基因至少在不超过47℃时编码高水平的蛋白(SEQ ID N.2)(图2)。按照文献描述(Janoff等，1979)从沙门氏菌(Salmonella)中分离内、外及总膜。利用十七烷酸(heptadecaonic acid)作为内标准通过GC分析测定分离的沙门氏菌(Salmonella)总膜中的脂含量。用改良的膜蛋白Lowry分析法(Peterson，1983)测量蛋白浓度。图4显示了对照和转化的沙门氏菌(Salmonella)细胞的总膜蛋白/脂质比的测定。Δ12-去饱和酶基因的外源性表达及其蛋白产物在总膜中的定位导致膜P/L的强烈增加，增加至少60％，这决定了膜的不稳定性，并决定了诱导热激基因、或许其他基因转录的信号的改变。
分离的沙门氏菌(Salmonella)外膜的蛋白分析。外膜蛋白的SDSPAGE分析揭示pNirΔ12菌株与pNir相比蛋白含量显著增加(考马斯凝胶，图5)。利用集胞蓝细菌(Synechocystis)的Δ12-抗体的Western印迹分析证实了pNirΔ12外膜分级分离物中去饱和酶的存在，其在pNir菌株中检测不到(Western印迹，图6)。作为阳性对照，应用了总细胞提取物(Syn.)。作为Δ12去饱和酶过表达的结果，检测到水平大量增加的额外的蛋白带(考马斯凝胶)。该蛋白带进一步用质谱测量法予以表征，发现由沙门氏菌(Salmonella)的两种热激蛋白，IbpA和IbpB构成(小HSP家族的成员)。
质谱测量法对pNirΔ12菌株外膜上sHSP的鉴定。为进一步表征凝胶中鉴定到的蛋白，切下考马斯蓝染色的来自沙门氏菌(Salmonella)(pNirΔ12)外膜制备物的1D凝胶带(MW＜20kDa)。使该凝胶带经过胶内消化程序(在Cys巯基被还原(用DTT)和烷化(用碘乙酰胺)之后，用0.1μg胰蛋白酶在37℃作用7小时)。从凝胶中抽提胰蛋白酶消化肽产物后，用C18 ZipTip进行纯化，并且所得的未分离的混合物在二羟基苯甲酸基质中用MALDI-TOF分析。以MALDI分析为基础，在MS-Fit数据库中查找，从混合物中鉴定到两种蛋白热激蛋白IbpB(肠沙门氏菌(Salmonella enterica)，NCBI#(03.26.2002)16762514，MW16kDa)。该命中识别了30％的测得的m/z值，覆盖该鉴定蛋白的40％。该鉴定结果进一步通过MH+＝961.65的PSD光谱证实，通过MS-Tag数据库查找鉴定为ITLALAGFR，上述蛋白的[47-55](图5)。
热激蛋白IbpA(肠沙门氏菌(Salmonella enterica)NCBI#(03.26.2002)16762513，MW16kDa)。该命中识别了另外35％测得的m/z值，覆盖该鉴定蛋白的40％。该鉴定结果进一步通过MH+＝1124.58的PSD光谱证实，通过MS-Tag数据库查找鉴定为NFDLSPLYR，上述蛋白的[3-11](图5)。
体内检测的作为膜通透性函数的膜功能性的干扰。图7显示了苯基萘基胺(NPN)荧光的变化。NPN是不带电荷的亲脂性染料，在水环境中微弱发荧光，但是其在非极性疏水环境例如在细胞膜中极大提高。作为外膜通透性破坏的结果，NPN标记越来越多的膜，增加其荧光(Tsuchido等1989)。在广泛的温度范围内(在25°和55℃之间)，Δ12-去饱和酶蛋白的过表达诱导膜去稳定，导致转化细胞与仅含有质粒的细胞相比，其外膜永久渗漏。在25°-40℃之间增加的渗漏的效果非常显著，但其在较高的热激温度时不存在。显然，高于42-45℃，热诱导的膜坍缩(collapse)超过在较低温度下检测到的蛋白/磷脂失衡所造成的膜解体(desintegration)而占据主导地位。图8显示的是，利用与图7相同的数据，通过在25°-40℃诱导Δ12-去饱和酶转化的沙门氏菌(Salmonella)菌株的提高的外膜通透性(细胞生长于30℃)，过量产生膜结合Δ12-去饱和酶的效果。
差示扫描量热法。通过差示扫描量热法(DSC)来检测过量表达集胞蓝细菌(Synechocystis)Δ12-去饱和酶对沙门氏菌(Salmonella)外膜热致变行为的影响。在10°和65℃之间的温度范围内，在第一次上行扫描(up-scan)中观察到一个主吸热峰，其在第二次上行扫描中同样重复出现，然而在高温度范围内(65°-110℃)出现数个主吸热峰。高温度范围内的吸热峰在第二次上行扫描中消失，该结果提示这些峰是来自于不可逆的蛋白变性。在15°-45℃温度区域的可逆吸热峰对应于膜脂质的相转变(图9)。分离自pNir和pNir∷Δ12菌株的外膜的转变中点分别为34.1℃和30.8℃(图10)。这些结果指示Δ12-去饱和酶的过量表达显著降低细胞外膜中某些脂质区域的转变温度。
由于Δ12-去饱和酶蛋白的过量表达所致的MPS干扰重建了热激基因(应激基因DnaK(图11、12)和GroEL(图13、14))表达的最佳温度，在30℃和47℃间及在宿主细胞(巨噬细胞和哺乳动物)中存在的不利条件下，其积累HSP的模式发生显著变化。图15显示了生长于30℃或37℃并在不同温度下应激的细胞在热激条件下积聚的DnaK mRNA的定量。去饱和酶基因过量表达的细胞表现出显著不同的mRNA积聚模式(与野生型细胞相反的模式)。数据来源于图11的凝胶分析。
图16为Northern印迹，显示了遗传修饰的沙门氏菌(Salmonella)细胞中DnaK(hsp70)和IbpB(hsp17)两者mRNA积聚模式的相似变化，其在45℃应激温度下不诱导任何基因，但是他们在30℃表达。野生型细胞具有相反的行为。
过量表达的集胞蓝细菌(Synechocystis)Δ12-去饱和酶，在我们的实验条件下由于缺乏合适的底物而在细胞内无酶活性，自身插入到膜脂双层中并导致沙门氏菌(Salmonella)中HSR的重置。在转化细胞的膜中发现实质上较高的膜蛋白含量，也就是，失衡的蛋白/磷脂比。作为另外的证据，去饱和酶转化的细胞不能恰当地接纳这种额外的膜蛋白，表现出改变的热相变性质，即使是在非应激条件下也表现大为提高的外膜通透性。失衡的膜组织(初始事件)引发复杂的补偿机制，包括改变某些脂质区域相变温度以及外膜对小HSP家族成员，IbpA和IbpB的缔合。结果，HSP表达模式强烈下降，并且反过来影响当其遭遇到易感宿主时该修饰菌株的正确适应机制。
实施例2膜干扰还可通过用药物例如苯甲醇(BA)化学处理获得。它产生与热激基因(DnaK和GroEL)表达相似的或较其高的效果，尽管其效果是暂时的，下面的实施例将解释这点。
所用的浓度(不超过50mM)对沙门氏茵(Salmonella)的生长没有毒性作用(图17)。图18表明50mM BA浓度时，生长于30℃的细胞在42℃积聚DnaK的水平显著下降。这些结果证明过量表达去饱和酶基因用遗传学方法或者通过用BA化学处理获得的膜干扰决定了沙门氏菌(Salmonella)积聚适量应激蛋白能力的显著变化。然而 遗传学方法产生的膜干扰(参见实施例1)导致沙门氏菌(Salmonella)在被用来感染巨噬细胞系(J774，图19)时完全和永久的丧失其毒力； 用BA处理沙门氏菌(Salmonella)因为在从生长培养基中除去BA和膜生理重建而仅仅暂时降低其感染巨噬细胞的能力(图20)。
实施例2.1完整的蓝藻类细菌(cyanobacterium)集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去饱和酶基因被克隆到pG13载体中，受控于PG13启动子(图21)(Barker等1998，1999)，并转化到野生型强毒瘰疬分枝杆菌(M.marinum)菌株中。在正常生长时或在感染巨噬细胞期间及在对感染易感的动物中，可以用能够驱动下游基因表达的其他启动子取代PG13。转化株是用pG13Δ12载体永久遗传修饰的生物体，并且具有提高水平的Δ12-去饱和酶mRNA，其被高水平地翻译为Δ12-去饱和酶基因编码蛋白。Δ12-去饱和酶mRNA在转化细胞中的表达显示于图22。集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去饱和酶基因的引入和表达不影响细胞的生长(图23)。Δ12-去饱和酶蛋白的引入和过量表达决定了用含处于PG13启动子调控之下的集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去饱和酶基因的pG13Δ12转化的瘰疬分枝杆菌(M.marinum)总膜分级分离物中的蛋白/脂质比增加大约40％(图24)。图25显示了用含处于PG13启动子调控之下的集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803Δ12-去饱和酶基因的pG13Δ12转化的瘰疬分枝杆菌(M.marinum)的存活终止，而对照细胞的生长按照预期得以恢复。
实施例3.完整的荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)强毒G217B菌株的Δ9-去饱和酶基因被克隆到pWU44载体中(Woods和Goldman，1993)，受真菌荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)Downs菌株的上调Δ9-去饱和酶启动子的调控(Gargano等1995)，并利用它来转化荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)强毒G217B菌株。这种修饰菌株命名为D3。其他启动子可取代这种在正常生长时或在感染巨噬细胞和动物期间能够表达下游基因的启动子。这样转化的菌株是遗传修饰的生物体，过表达提高水平的Δ9-去饱和酶mRNA，后者最终被高水平地翻译为相应的蛋白。由于Δ9-去饱和酶蛋白的过量表达所致的MPS干扰改变热激基因(例如hsp70)表达的最佳温度，在34℃和42℃间及在宿主细胞(例如巨噬细胞和哺乳动物细胞)中存在的不利条件下，其积聚HSP的模式发生显著变化(图26)。这些结果一致说明，用遗传方法通过过量表达去饱和酶基因或者局部或广泛改变MPS的膜蛋白获得的膜干扰，会导致荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)(以及其他原核和真核胞内和胞外病原体)积聚适量应激蛋白的能力显著改变。这样获得的膜干扰导致被遗传转化的荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)在被用来感染来自Balb CD-11小鼠胫骨的巨噬细胞时完全和永久地丧失其毒力。图27显示，D3菌株不能在鼠源巨噬细胞中生长。以5×10/ml的浓度用强毒性G217B酵母菌株注射的Balb CD-11小鼠在5天之内死亡，而用相似量的被遗传修饰的减毒D3菌株酵母细胞注射的那些小鼠存活至少45天。此外，这种小鼠，如果在第45天后用强毒G217B菌株攻击，则表现出至少60％的存活率(图28)。
参考文献1.Buchmeier NA等Science(科学)248730-2，1990.
2.Barker LP，Brooks DM，Small PL.Mol Microbiol.291167-77，1998
3.Barker LP，Porcella SF，Wyatt RG，Small PL.FEMSMicrobiol Lett.17579-85，19994.Carratù，L.等Proc.Nat’l Acad.Sc.USA，933870-5，19965.Cossins，AR(ed.)Temperature Adaptation of BiologicalMembranes，Portland Press，19946.De Kruijff，B Nature(自然)386129-130，19977.Dunstan SA等Inf Imm，675133-41，19998.Feige U等EXS 77359-73，19969.Gargano S.等Lipids，30899-906，199510.Groisman EA等Trends Microbiol 5343-9，199711.Groisman EA等Trends Biochem Sci 1530-3，199012.Janoff AS，Haug和McGroarty EJ Biochim.Biophys.Acta，55556-66，197913.Horvath I等Proc Natl Acad Sci USA.953513-8，199814.Lindgren SW等Proc Natl Acad Sci USA 934197-201，199615.Lindquist S Annu Rev Biochem 551151-91，198616.Peterson GL Methods Enzymol.9195-119，198317.Piper PW等Cell Stress & Chaperones 212-24，199718.Sambrook J等Molecular CloningA Laboratory Manuall989，Cold Spring Harbor Laboratory Press，II Ed，Cold SpringHarbor，NY19.Singer MA等Trends Biotechnol 16460-8，199820.Slater SJ等J Biol Chem 2694866-4871，199421.Suzuki I等EMBO J 191327-34，200022.Trk Z等Proc Natl Acad Sci USA.983098-103，200123.Tsuchido T等J Gen Microbiol，1351941-7，198924.Van Eden和Young Eds，Stress proteins in Medicine，Dekker，NY，1996
25.Vigh，L等Trends Biochem Sci 23369-74，199826.Woods JP等J Bacteriol；175636-41，1993
序列表<110> Brane Tech S.r.l.
<120> 通过永久性遗传修饰其生物膜而由病原微生物产生非强毒微生物用于制备疫苗的方法<130> 2810pt<160> 4<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1489<212> DNA<213> 集胞蓝细菌PCC6803(Synechocystis PCC6803)<400> 1aattcagaag caattcggtt cctggtcaat ggcaacgtgt tataaaaaga aaagtttgtt60tacctgagta ttaattccta ggcacggcaa accttggccg ctttatagcc catgaatcca120taaacaaaat ctgtccgacc ttccatttgg agataaacct ttataaatga ctgccacgat180tcccccgttg acaccaacgg taacgcccag caatcccgat cgcccgattg cggatctcaa240actacaagac atcattaaaa ccctgcccaa ggaatgcttc gagaaaaaag cgagcaaagc300ctgggcttct gttttgatta ccctaggggc gatcgccgtg ggctatttgg gcattattta360tctgccctgg tactgcttgc ccattacctg gatctggaca gggacagcct taacgggggc420cttcgttgtc ggccatgact gtggccatcg ctcctttgct aaaaaacgct gggtcaatga480tttagtggga catatcgctt ttgctcccct catctaccct ttccatagct ggcgcctact540ccacgaccac catcacctcc acaccaacaa aattgaggtt gataacgcct gggatccctg600gagtgtggaa gctttccaag ccagcccggc gatcgtccgg cttttttatc gggccatccg660gggtcccttc tggtggactg gttccatttt ccattggagc ttaatgcact tcaaactttc720caactttgcc caaagggacc gcaataaagt caaattatcc attgccgttg tcttcctgtt780tgcggcgatc gcctttcctg ccctaattat caccacaggg gtgtggggtt tcgtcaaatt840ttggctaatg ccctggttgg tgtatcactt ttggatgagc acttttacca ttgtgcacca900caccattccc gaaattcgtt tccgtcccgc cgccgattgg agtgccgccg aagcccagtt960aaatggtact gttcactgcg attatccccg ttgggtggaa gtgctctgcc atgacatcaa1020cgtccatatt ccccaccacc tctccgttgc catcccttcc tataacctac gactagccca1080cggaagttta aaagaaaact ggggaccttt tctttacgag cgcaccttta actggcaatt1140aatgcaacaa attagtgggc aatgtcattt atatgacccc gaacatggct accgcacctt1200cggctccctg aaaaaagttt aatactggga caactagtaa tttttgaccc atgattggtc1260agtaattaac tttgactgat ccccagggag agaaatacca gatcacaaat taactatctt1320ggaatgcggc catcgagctg tattcctttt ttcttttctt ggtgaggaaa aaaactttct1380aagtgggcag atgggagcgg ttcagactag aaagatccac tcggccaaaa tgaatgctaa1440acgcaacctg catattctcc aaggttttca ctagccaagg taccccttc1489
<210> 2<211> 351<212> PRT<213> 集胞蓝细菌PCC6803<400> 2Met Thr Ala Thr Ile Pro Pro Leu Thr Pro Thr Val Thr Pro Ser Asn1 5 10 15Pro Asp Arg Pro Ile Ala Asp Leu Lys Leu Gln Asp Ile Ile Lys Thr20 25 30Leu Pro Lys Glu Cys Phe Glu Lys Lys Ala Ser Lys Ala Trp Ala Ser35 40 45Val Leu Ile Thr Leu Gly Ala Ile Ala Val Gly Tyr Leu Gly Ile Ile50 55 60Tyr Leu Pro Trp Tyr Cys Leu Pro Ile Thr Trp Ile Trp Thr Gly Thr65 70 75 80Ala Leu Thr Gly Ala Phe Val Val Gly His Asp Cys Gly His Arg Ser85 90 95Phe Ala Lys Lys Arg Trp Val Asn Asp Leu Val Gly His Ile Ala Phe100 105 110Ala Pro Leu Ile Tyr Pro Phe His Ser Trp Arg Leu Leu His Asp His115 120 125His His Leu His Thr Asn Lys Ile Glu Val Asp Asn Ala Trp Asp Pro130 135 140Trp Ser Val Glu Ala Phe Gln Ala Ser Pro Ala Ile Val Arg Leu Phe145 150 155 160Tyr Arg Ala Ile Arg Gly Pro Phe Trp Trp Thr Gly Ser Ile Phe His165 170 175Trp Ser Leu Met His Phe Lys Leu Ser Asn Phe Ala Gln Arg Asp Arg180 185 190Asn Lys Val Lys Leu Ser Ile Ala Val Val Phe Leu Phe Ala Ala Ile195 200 205Ala Phe Pro Ala Leu Ile Ile Thr Thr Gly Val Trp Gly Phe Val Lys210 215 220Phe Trp Leu Met Pro Trp Leu Val Tyr His Phe Trp Met Ser Thr Phe225 230 235 240Thr Ile Val His His Thr Ile Pro Glu Ile Arg Phe Arg Pro Ala Ala245 250 255
Asp Trp Ser Ala Ala Glu Ala Gln Leu Asn Gly Thr Val His Cys Asp260 265 270Tyr Pro Arg Trp Val Glu Val Leu Cys His Asp Ile Asn Val His Ile275 280 285Pro His His Leu Ser Val Ala Ile Pro Ser Tyr Asn Leu Arg Leu Ala290 295 300His Gly Ser Leu Lys Glu Asn Trp Gly Pro Phe Leu Tyr Glu Arg Thr305 310 315 320Phe Asn Trp Gln Leu Met Gln Gln Ile Ser Gly Gln Cys His Leu Tyr325 330 335Asp Pro Glu His Gly Tyr Arg Thr Phe Gly Ser Leu Lys Lys Val340 345 350<210>3<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>3caaattatga ccctgttgat cagt 24<210>4<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>4cccccccatatgactgccac gattc 2权利要求
1.将病原微生物转化为非强毒微生物的方法，包括步骤在所说的病原体中诱导遗传修饰，以使它们诱导它们所接触的宿主细胞的生物膜的物理学和/或动力学状态发生改变。
2.根据权利要求1的方法，其中宿主细胞是巨噬细胞，或者，一般而言，高等真核生物、特别是哺乳动物、更具体的是人类的另外类型的细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中膜状态的改变在病原体中导致至少一个如下效应应激蛋白合成下降、膜脂组成改变、膜蛋白/脂质比改变、膜相状态、物理秩序和通透性改变。
4.根据权利要求1的方法，其中遗传修饰是按照如下主要步骤获得的构建包含处于启动子调控之下的基因的载体，该启动子调节蛋白产物的表达，该蛋白产物能够修饰该载体所插入的病原体的膜的物理学和/或动力学状态；用这种载体遗传转化病原体；用这样的载体表达该蛋白产物。
5.根据权利要求4的方法，其中构建载体以便使其含有选自下组中的至少一个基因应激基因、去饱和酶基因、毒力基因、其产物为膜结合蛋白的基因、其激活由信号转导途径介导的基因。
6.根据权利要求5的方法，其中其激活由信号转导途径介导的基因为c-fos、fos B、junB、junD。
7.根据权利要求4的方法，其中蛋白产物通过在所述载体中插入选自下组的至少一个基因而获得Δ12-去饱和酶基因、Δ9-去饱和酶基因、Δ6-去饱和酶基因、其他去饱和酶基因、编码整合膜蛋白的基因。
8.根据权利要求4的方法，其中蛋白产物能够直接或间接地与膜相互作用。
9.根据权利要求8的方法，其中直接效应归因于整合膜蛋白。
10.根据权利要求8的方法，其中间接效应归因于修饰膜脂肪酸和磷脂的不饱和度水平的酶。
11.根据权利要求8的方法，其中间接效应归因于改变膜蛋白/脂质比的蛋白的直接效应。
12.根据权利要求8的方法，其中直接效应归因于改变膜通透性的蛋白。
13.根据权利要求8的方法，其中直接效应归因于改变膜的热相变性质的蛋白。
14.根据权利要求1的方法，其中病原微生物选自严格胞内细菌、兼性胞内细菌、真菌和寄生虫以及非胞内病原体。
15.根据权利要求1的方法，其中病原微生物选自衣原体属(Chlamydia)物种，例如肺炎衣原体(C.pneumoniae)和沙眼衣原体(C.trachomatis)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、恰非埃里希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、立克次氏体属(Rickettsiae)；侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、分枝杆菌属(Mycobacteria)，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、诺卡氏菌属(Nocardia)物种(足分枝菌病)、巴尔通氏体属(Bartonella)物种、布鲁氏菌属(Brucella)物种、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌属(Salmonella)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种；布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、奈瑟氏球菌属(Neisseriae)物种、葡萄球菌属(Staphylococci)、酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、耶尔森氏菌属(Yersiniae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、假丝酵母菌属(Candida)物种、新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)；溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、利什曼原虫属(Leishmania)物种、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(P.vivax)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、克鲁斯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。
16.制备减毒的非强毒病原微生物的方法，所述微生物选自鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)和荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)，其特征在于以下步骤构建载体；用这种载体转化病原体，该载体受在病原体感染期间调节下游基因表达的启动子的控制，表达下列基因之一蓝藻类细菌集胞蓝细菌(Synechocystis)PCC6803 Δ12-去饱和酶基因或强毒荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)G217B菌株的Δ9-去饱和酶基因、酿酒酵母(S.cerevisiae)或荚膜组织胞浆菌(H.capsulatum)Δ9-去饱和酶基因、或原核或真核生物体的其他去饱和酶基因、或其他编码导致所述生物膜物理学和/或动力学状态干扰的整合膜蛋白的基因；过量表达该插入的基因。
17.根据权利要求16的方法，其中启动子是Downs菌株的上调启动子。
18.用根据权利要求16-17的方法获得的沙门氏菌(Salmonella)，其特征在于分离的外膜的蛋白/脂质比在强毒株中大约为100，而在遗传修饰株中为170。
19.用根据权利要求16-17的方法获得的瘰疬分枝杆菌(M.marinum)，其特征在于遗传修饰株中分离的外膜的蛋白/脂质比增加40％。
20.用根据权利要求1的方法获得的病原微生物，其特征在于其毒力机理减弱但具有完全的免疫活性。
21.用根据权利要求1的方法获得的修饰微生物，用于医学应用。
22.用根据权利要求1的方法获得的修饰微生物，用于制备疫苗。
23.根据权利要求20-22的修饰微生物制备疫苗的用途。
24.包含作为活性成分的有效量的根据权利要求1的修饰微生物与合适的赋形剂和添加剂组合的疫苗。
25.根据权利要求24的疫苗，其中所述微生物选自衣原体属(Chlamydia)物种，例如肺炎衣原体(C.pneumoniae)和沙眼衣原体(C.trachomatis)，伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、恰非埃里希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、立克次氏体属(Rickettsiae)；侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、分枝杆菌属(Mycobacteria)，例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、瘰疬分枝杆菌(M.marinum)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、诺卡氏菌属(Nocardia)物种(足分枝菌病)、巴尔通氏体属(Bartonella)物种、布鲁氏菌属(Brucella)物种、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌属(Salmonella)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种；布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)(莱姆病)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、奈瑟氏球菌属(Neisseriae)物种、葡萄球菌属(Staphylococci)、酿脓链球菌(Streptococcus pyrogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、耶尔森氏菌属(Yersiniae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、假丝酵母菌属(Candida)物种、新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)；溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)、利什曼原虫属(Leishmania)物种、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(P.vivax)、鼠弓形体(Toxoplasma gondii)、克鲁斯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)以及相关组合。
26.根据权利要求24-25的疫苗，配制成皮内、肌肉内、静脉内、粘膜内、经鼻、阴道、口服和直肠给药。
全文摘要
我们在这里描述了一种通过永久性遗传修饰其膜物理状态(MPS)而由病原微生物产生非强毒微生物的方法学。从而，在侵染之初，在这些修饰的生物体中，当它们侵染宿主(如高等真核生物，特别是哺乳动物的靶细胞，更具体的是人类细胞)，或者将其注射到动物侵染模型中，热激(应激)基因表达和其编码蛋白(应激蛋白或HSP)积累以及其他物种特异性基因产物积累时，作为MPS修饰的结果，其调控被改变。除此之外，我们还提到由信号转导路径所介导调控的基因。所以，作为这一措施的结果，病原体成为非强毒的(减毒活生物体)，可用于疫苗制备。
文档编号A61P31/04GK1516735SQ02810864
公开日2004年7月28日 申请日期2002年5月29日 优先权日2001年5月30日
发明者R·辛克布莱尼, S·克罗纳罗马诺, R 辛克布莱尼, 弈陕蘼砼 申请人:布瑞恩技术有限责任公司