专利名称：多克隆免疫球蛋白的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多克隆免疫球蛋白制剂的用途。
背景技术：
高等生物的特征在于具有使其免受潜在危险物质或微生物侵染的免疫系统。如果物质(抗原)侵入体内，借助免疫系统可以将所述物质识别为“异物”并且清除掉。而且“退化的”自体细胞也通常能被免疫系统识别出来而从循环中清除掉。
人的适应性免疫系统由两个基本部分，体液免疫和细胞免疫组成。适应性免疫应答建立在B和T-淋巴细胞克隆选择的基础上并且原则上能够识别任何抗原以及建立免疫记忆。适应性免疫系统的这些特征一般被有效用于疫苗接种。
每种B细胞产生具有一定结合特异性的抗体。这种抗体还以特异性受体的形式存在于产生它的B细胞的膜中。针对被识别为异物的抗原产生的体液免疫应答建立在产生这种抗体的B细胞的选择性激活的基础上，所述抗体能与各种抗原的表位结合。在B细胞分化过程中发生的DNA重排对抗体的多样性起着决定性作用。
在人血清中存在着大量的特异性差异大、同型和亚类的抗体。血清中的全部免疫球蛋白的总浓度是15-20mg/ml；这意味着约100g具有不同特异性的免疫球蛋白在血液中不断地进行循环。不可能确定特异性不同的所有抗体的精确数目，一个人体中储备的各种B细胞克隆约为109。一般来说，尽管亲和力和结合力有所不同，但一种特定抗体可与多种相似抗原结合。
鉴于不同特异性的分布和平衡，免疫系统必须借助于内源调节机制来维持体内稳态。达到此目的的一个必需机制是“独特型网络”(Ann.Immunol.125C373-89(1974))。针对一种抗体的决定其结合特异性的每种独特型，就象抗原识别过程一样，存在着与第一抗体的独特型结合的抗-独特型的抗体。根据这种解释模式，淋巴细胞上的独特型-特异性受体之间的相互作用起着调节免疫系统的作用。显然，确实存在着这些相互作用，这是因为已经证明在免疫应答过程中，还形成了针对通过免疫应答初次诱导的抗体的抗-独特型抗体。由于存在着针对任何抗体的抗-独特型抗体，淋巴细胞对抗体的独特型基本上不耐受(William E.Paul，Eds.，Fundamental Immunology，3rdEd.，RavenPress Ltd.New York，1993，887-902页)。
因此，免疫系统由分别通过系统内的其它克隆产生的免疫球蛋白刺激或调节的淋巴细胞克隆构成。术语“连通度”应被理解成免疫系统的交联度。无连通度的免疫系统含有更多的不受独特型/抗-独特型相互作用影响的免疫细胞克隆。对于这种类型的相互作用的理解不仅是直接的相互作用，即两个抗体结合位点间的相互作用，而且主要是通过抗体的一系列相互作用间接形成的作用。其中不仅涉及B-细胞和抗体，还涉及带有受体的T细胞(Immunol.Rev.(1988)，101191-215)。
整个免疫网络具有一定的“内部结构”，该“内部结构”中的B淋巴细胞分为多种类型，即产生基本特性不相同的免疫球蛋白(Immunol.Rev.(1989)，11037-61)·对几乎所有其它免疫球蛋白具有亲和力的抗体(即还具有自身亲和力，也就是说它们自身也发生反应，“粘着抗体”)，·镜像抗体是对一种特定抗体的独特型具有亲和力的抗体，·对“粘着抗体”具有弱亲和力的抗体。
网络的连通度越高，交联免疫球蛋白的种类越多。所有这些抗体都处于一定的平衡当中。平衡的偏移能引起病理现象(自身免疫疾病、过敏反应、癌症、对感染性疾病的易感性)。在本文中，病理现象的发生在某种程度上应被理解为由于连通度缺陷或降低而引起的自身反应性克隆的无规扩增。
数据表明对自身免疫疾病治疗性施用高剂量的多克隆免疫球蛋白(IVIG)的积极作用在于导致免疫系统连通度的恢复或改善(Immunological Reviews(1989)110135-149；Scand.J.Immunol.(2000)51408-414；Immunology Today(1994)15341-342；Dermatol.Clin.(2000)18447-457)。
在美国专利US5562902和US5965130中记载了IVIG在癌症治疗中的应用。
混合型免疫球蛋白的最早期应用之一是预防感染性疾病。以这种方式使用的免疫球蛋白在进行静脉内用药时可导致过敏性休克，因此免疫球蛋白只能进行有限量的肌肉注射用药(几毫升相当于几百毫克的免疫球蛋白)。
还观察到用于预防肝炎而进行的血清免疫球蛋白的预防性用药还能降低治疗群体中各种皮肤病的发病率(Int.J.Dermatol.(2000)39628-631)。
在利用混合型血清球蛋白的作用模式进行各种实验观察的基础上建立了多种理论·通过Fc-Fc受体的相互作用影响吞噬作用(Ann.Intern.Med.(1991)115294-307)；·调节独特型/抗独特型网络；抑制某些独特型(Int.J.Artif.Organs(1993)16，增刊.5189-195)；·抑制抗体产生(Clin.Exp.Immunol.(1986)65409-415)；·免疫球蛋白-细胞因子间的相互作用(Immunol.Rev.(1994)1395-19)；·超抗原和毒素的中和作用(New Engl.J.Med.(1991)3241633-1639)；·补体系统的影响(J.Neuroimmunol.(1996)71227-229)；·免疫球蛋白代谢的加速(Immunol.Today(1997)18592-598)；·细菌、真菌和病毒的中和作用(Goodman和Goldman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics，McGraw-Hill，New York(1996)1291-1308)。
即使这种免疫球蛋白的用药机制不是总能清楚地被归结为仅仅一个作用，但是可以看到所有施用者将大量的免疫球蛋白用于治疗而且所施用的免疫球蛋白显示出一个直接的效果。每天每公斤体重的通用量是几百毫克至几克的免疫球蛋白，治疗过程大多进行一天以上(Dermatol.Clin.(2000)18447-457)。
混合型多克隆免疫球蛋白(如静脉内免疫球蛋白、IVIG或免疫血清球蛋白)是通过对源自成千供体的混合血清进行分级来制备的。迄今用于治疗多种免疫疾病所需的高剂量通常在该制剂的供给上面产生瓶颈效应。
在WO 92/15885A1中，记载了用于治疗HIV感染的含有单克隆抗-独特型抗体的制剂的生产方法。根据该文献，由于相对于多克隆抗体具有特定专一性而选择合适的单克隆抗体并配制成疫苗。多克隆抗体本身没有被用于所述的制剂中。在该篇文献中也没有提示本领域的技术人员能用多克隆抗体取代单克隆抗体。
根据WO 91/114651A1的记载，抗独特型抗体被用作特定抗原的免疫原性模拟物。该文中记载了单克隆抗体和多克隆抗体，然而WO 91/114651A1仅仅公开了使用特异性抗-独特性抗体制备疫苗的用途，而非具有不同特异性的多克隆抗体。
因此，本发明的目的是针对所述疾病提供一种新型和有效的治疗可能性，借助该治疗方法还可以避免供给方面的瓶颈效应。
根据本发明，以一种全新的方式使用多克隆免疫球蛋白，即将多克隆免疫球蛋白用于免疫接种，由此实现本发明的目的。因此根据本发明，仅仅需要使用微量(与被动免疫或免疫球蛋白在其它领域中的用途，特别是现有技术中的IVIG相比)的这种物质，即用于其它有效免疫接种的使用量。
通过免疫接种，引发免疫应答从而恢复免疫系统的连通度。多克隆免疫球蛋白中存在的“粘着抗体”以及对“粘着抗体”具有弱亲和力的抗体产生免疫应答从而表明这些抗体类型的增强。同样，在自身应用中，通过免疫接种，可以诱导产生针对存在于多克隆免疫球蛋白中的病理自身抗体的抗-独特型抗体。这可减少病理抗体的产生。
本发明还涉及多克隆免疫球蛋白制剂用于生产含有不同特异性的抗体的疫苗制品的用途，该疫苗制品用于对免疫球蛋白来源的同种个体进行免疫接种。例如，本发明提供了用于人类治疗的人免疫球蛋白制剂，而例如牛或猪免疫球蛋白被分别用于牛或猪的治疗。
将不同特异性的抗体用作多克隆抗体，优选从人血清中或人血浆的混合免疫球蛋白级分中分别发现的多种特异性。
根据现有技术，多特异性抗体以免疫球蛋白制剂的形式进行施用，其中免疫原性既不是所需的也没有被发现。令人惊奇的是被配制成本发明疫苗的多特异性抗体具有作为激活免疫应答的免疫原的优势作用。尽管是非特异性免疫原，但是对某些不需要抗原产生的反应性被证明增强了而且没有产生不希望有的副作用。该反应性主要能有效抵抗同种异型抗原如肿瘤抗原或本身不能被身体识别为异物的自身抗体。
在本发明中，0.01至1ml体积的含有人多特异性抗体的疫苗制品中，通常能够提供大约5μg-10mg的免疫球蛋白用以对患者进行治疗。免疫球蛋白的量优选地约为10至1000μg，最优选地为50至750μg。
所述疫苗既适合于疾病的预防又适合于疾病的治疗，其中主要的综合征与肿瘤、感染和自身免疫疾病有关。
本发明分别避免或减少了上述现有技术中存在的缺点，因此只需要以低剂量使用免疫球蛋白制剂就能在受体生物体内诱导免疫应答。在本文中，令人惊奇地是采用多特异性免疫球蛋白进行的免疫接种不产生不希望有的副作用，尤其是尽管激活了非特异性免疫应答，但是特异结合肿瘤细胞的活性明显提高了。
根据本发明，多克隆免疫球蛋白混合物(例如IVIG或其它γ球蛋白制剂)可被用于进行有效免疫接种。
在此以有效免疫接种所需的常规量将免疫球蛋白制剂施用于受体生物。施用途径与进行有效免疫接种的常用途径(例如皮下、皮内或肌内)一样，优选的是皮下和皮内的施用方式。
优选地，自身免疫球蛋白制剂被用作相同个体进行有效免疫接种的多克隆免疫球蛋白制剂，该多克隆免疫球蛋白制剂得自所述个体。多克隆免疫球蛋白制剂的自身施用，即将免疫球蛋白制剂施用于由其含免疫球蛋白的体液获得多克隆免疫球蛋白的个体，是本发明的一种特别优选的技术方案。本发明的这种自体技术方案的其它优势在于能够排除如可以是混合制剂形式存在的得自其它个体(例如病毒，如丙型肝炎病毒和HIV病毒)的免疫球蛋白制剂的感染的影响。本发明所指的个体应被理解为具有含有抗体的体液或组织的人类个体或动物个体。当然，本发明制剂的制备优选应用脊椎动物，特别优选应用哺乳动物，尤其优选的是人。
优选地，将一种或多种佐剂混合到多克隆免疫球蛋白制剂中。佐剂应被理解成能够定性和/或定量增强针对免疫原的免疫应答的物质。本发明的多克隆免疫球蛋白以一种能够激发免疫应答的形式进行施用。因此为了增强免疫应答，免疫球蛋白制剂能与免疫学上通用的佐剂联用。
下列物质可以作为佐剂的实例，但并不局限于这些物质含铝佐剂，具体地是氢氧化铝，脂多糖衍生物、芽孢杆菌CalmetteGuerin(BCG)、皂甙及其衍生物(例如QS-21)、脂质体制剂。因此，在本发明的一个优选技术方案中，将抗体制剂制成疫苗制品包括添加佐剂物质、免疫刺激细胞、活性剂和/或添加配制辅剂，所述佐剂具体地选自含铝佐剂，脂多糖衍生物、芽孢杆菌(BCG)、脂质体或QS-21(其它优选佐剂已被记载在Singh等，Nat.Biotechnol.17(1999)，1075-1081页中)，所述免疫刺激细胞具体地是树突细胞或其它抗原-递呈细胞，所述活性剂优选地是细胞因子，具体地是粒细胞-巨噬细胞刺激因子，所述制剂辅剂具体地是缓冲物质、稳定剂或增溶剂或这些物质的混合物。
在US 5965130以及US 5562902和EP 0750514A的专利说明书中，记载了较低的用量(皮下用量为每天每千克体重4mg至20mg)，然而这些用量仍然不在有效免疫接种常规用量的范围内。有效免疫接种的常规用量为进行每次免疫接种时每千克体重约100纳克至100微克。
在上述美国专利说明书中，列举了一个其中皮下施用200微克免疫球蛋白就具有效果的实例。该实例令人产生误解，其中免疫球蛋白制剂不是得自于进行了体内接种的相同物种(人免疫球蛋白被接种到小鼠体内)，对小鼠采用所述用量因而其实达到每千克体重约1毫克的用量。
优选地，每次免疫接种，疫苗制品中的多克隆免疫球蛋白制剂的用量为每千克体重低于200微克，更优选地每千克体重低于20微克，特别优选地每千克体重低于5微克。然而，每次免疫接种每千克体重200纳克-1微克的免疫球蛋白用量也能满足需要。通常，对一种物种的使用剂量进行了标准化而且是建立在各个物种的平均体重的基础上。
从含有免疫球蛋白的人体或动物体的体液(例如人血清或血浆)中分离免疫球蛋白可以通过大量已知的方法来实现。为了达到此目的，可以采用沉淀方法、色谱法(例如离子交换层析、疏水作用层析或采用免疫球蛋白特异性-配体如抗IgG或抗IgM或蛋白G等的亲和层析)或其它方法或多种方法的结合。最终从个体分离根据本发明的免疫球蛋白只需要基本上从体内其它不需要的物质中分离所需要的免疫球蛋白。分别基于总蛋白含量，优选纯度为90％，特别优选纯度98％。在此对于本发明重要的是通过多克隆免疫球蛋白的制备方法进一步保留免疫球蛋白的多样性。特别优选在制备方法中不应当有任何富集或消耗某些免疫球蛋白特异性的步骤(例如在J.Immunol.(1985)1351091-1096中提及的)。
本发明所定义的免疫球蛋白制剂主要由IgG、IgM和IgA组成，然而也可以仅采用特定类型的免疫球蛋白(例如，仅采用IgM或IgA或仅采用IgG)，或者各种类型免疫球蛋白的某种混合物。
因此本发明所指的术语“免疫球蛋白”或“抗体”还包括所获取的抗体的片段或衍生物。应当提到的是，但不限于此例如可以通过本身已知的生物化学方法(例如通过酶裂解)制备的F(ab)2’片段、F(ab)’片段。本文中的术语“衍生物”包括例如可以通过本身已知的化学或生物化学方法制备的抗体衍生物。特别是，所述术语还包括通过将抗体或抗体片段与能增强免疫应答的分子(例如破伤风毒素、假单胞菌外毒素、脂A的衍生物、GM-CSF、IL-2、IL-12、C3d)进行化学偶联而制得的产物。
可以将含有得自不同个体的免疫球蛋白的混合体液作为多克隆免疫球蛋白的来源，然而也可以使用单个个体的含免疫球蛋白的体液。
因此，本发明的优选技术方案涉及天然状态的多克隆免疫球蛋白制剂的用途，也就是说所述免疫球蛋白是在没有富集或消耗某种免疫球蛋白特异性的条件下制备的，因而在其组成上与分别存在于或循环于各个生物体或各种体液(血液、淋巴液、初乳等)中的天然免疫球蛋白谱相应。
因此，本发明的另一个方面涉及免疫球蛋白用于制备含有多种特异性抗体的疫苗制品的用途，所述疫苗制品用于治疗癌症、自身免疫疾病、用于预防(预防性的)或治疗过敏反应和用于治疗对病毒、细菌或真菌的易感性；每种治疗都是通过免疫接种来进行的。
本发明还涉及一种用于对个体进行预防或治疗的方法，在该方法中按照本发明制备的制剂以有效量，优选地以每千克体重几微克至一百微克的量施用给从其体内抽取体液的个体。该治疗方法主要适用于自身免疫疾病的病例，诸如全身性红斑狼疮、自身免疫甲状腺炎、系统性节结性脉管炎、格-巴二氏综合征和抗因子VIIIC自身免疫疾病、过敏反应或癌症。
可以根据本发明对健康个体进行预防感染(诸如各种皮肤病)的治疗。
总的来说，所述治疗方法可以用于治疗以及预防性的目的。
另一方面，本发明还涉及自身免疫球蛋白制剂用于制备免疫调节剂的用途。
本发明还涉及一种含有人多克隆抗体的人用疫苗，是通过将多克隆多特异性人免疫球蛋白制剂配制到疫苗制品中而得到的。优选地，该疫苗是通过配制免疫球蛋白混合物而得到的。优选地，该疫苗还进一步含有一种或多种佐剂。根据一个特别优选的技术方案，该疫苗含有含量为5μg至10mg的免疫球蛋白。
本发明还将通过下列实施例的方式得到更详细的解释，然而并不局限于这些实施例。
实施例1用于有效免疫接种的免疫球蛋白制剂的制备在无菌条件下将0.83ml的Alu-Gel(购自Serva的Alu-Gel S；2％的悬浮液；质量等级用于制备疫苗的佐剂)悬浮液与5ml的恒河猴免疫球蛋白溶液(Sigma，USA，I4385，用1mM的pH6.0磷酸缓冲液稀释成2.5mg/ml；0.86％NaCl)混合并在室温下轻轻摇晃1小时。将所述悬浮液以0.5ml的等分量无菌装入针刺瓶中。
实施例2增强免疫血清的抗肿瘤细胞结合活性采用实施例1制备的每份0.5ml的疫苗对恒河猴进行四次免疫(第0、15、29和60天)。采用细胞ELISA测试所述恒河猴血清结合人肿瘤细胞的能力。
检测所述恒河猴免疫血清中是否含有结合了人癌细胞的免疫球蛋白。为了达到该目的，采用了KATO III胃癌细胞系。这些检测是通过细胞ELISA-测试按照下列步骤进行的于4℃下在培养基A中以2×106个细胞/ml的浓度在微滴板的各孔中分别将100μl的待测细胞系的悬浮液培养过夜。吸去上清液后，将所述微滴板与每孔50μl的固定液于室温下一起温育5分钟。吸去上清液后，在每孔中各自加入200μl的封闭缓冲液B，并在37℃下将所述微滴板温育1小时。每孔分别用200μl的洗涤缓冲液B冲洗两遍后，用稀释缓冲液B将各100μl的待测恒河猴血清等分样品稀释成1∶10至1∶100000的稀释度后于37℃下温育1小时。微滴板的每个孔分别用100μl冰冷的洗涤缓冲液B冲洗两遍后各自分别加入100μl用稀释缓冲液A稀释成1∶1000稀释度的与超氧化酶偶联的抗人-Ig-抗体(Zymed)并在37℃下温育45分钟。微滴板各孔分别用100μl的冰冷洗涤缓冲液B冲洗三遍。通过每孔分别加入100μl的特异性底物来显示抗体的结合力，约5分钟后，通过每孔分别加入50μl的终止溶液来终止显色反应。通过在490nm下测定光密度(OD)(对照测量的波长是620nm)来进行评价。
结果(如表1所示的稀释度为1∶100)免疫过程中的结合能力明显增强了。
表1样品MOD前血清 250第15天 323第29天 845第60天 1224洗涤缓冲液A 2％NaCl0.2％Triton X-100少量PBS洗涤缓冲液B 0.05％Tween20，少量PBS封闭缓冲液A 5％小牛血清(加热失活)少量PBS封闭缓冲液B 1％牛血清白蛋白0.1％NaN3少量PBS稀释缓冲液A 2％小牛血清(加热失活)少量PBS稀释缓冲液B 少量PBS染色缓冲液24.3mM柠檬酸51.4mM Na2HPO4
pH5.0底物 40mg的邻-苯二胺-二盐酸化物100ml的染色缓冲液20μl的H2O2(30％)终止溶液4N H2SO权利要求
1.多克隆免疫球蛋白制剂用于制备疫苗制品的用途，所述疫苗制品含不同特异性的抗体，用于对免疫球蛋白来源的同种个体进行免疫接种。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多克隆免疫球蛋白制剂是一种用于对制剂来源的同一个体进行免疫接种的自身免疫球蛋白制剂。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述多克隆免疫球蛋白制剂中混合了一种或多种免疫佐剂。
4.如权利要求1至3中任一项所述的用途，其特征在于，进行每次免疫接种时，所述制品中的多克隆免疫球蛋白制剂的用量为每千克体重小于200微克，优选地为每千克体重小于20微克，特别优选地为每千克体重小于5微克。
5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其特征在于，所述多克隆免疫球蛋白制剂以天然形式存在于所述制品中。
6.如权利要求1至5中任一项所述用于制备疫苗制品的用途，所述疫苗制品含不同特异性的抗体，通过免疫接种该疫苗制品来预防或治疗癌症。
7.如权利要求1至5中任一项所述用于制备疫苗制品的用途，所述疫苗制品含不同特异性的抗体，通过免疫接种该疫苗制品来预防或治疗自身免疫疾病。
8.如权利要求1至5中任一项所述用于制备疫苗制品的用途，所述疫苗制品含不同特异性的抗体，通过免疫接种该疫苗制品来预防或治疗过敏反应。
9.如权利要求1至5中任一项所述用于制备疫苗制品的用途，所述疫苗制品含不同特异性的抗体，通过免疫接种该疫苗制品来预防或治疗对病毒、细菌或真菌感染的易感性。
10.一种用于人的含有人多特异性抗体的疫苗，该疫苗可通过将多克隆、多特异性人免疫球蛋白制剂配制成疫苗制品而获得。
11.如权利要求10所述的疫苗，其可通过免疫球蛋白混合物的制剂而获得。
12.如权利要求10或11所述的疫苗，其特征在于，该疫苗中含有一种或多种佐剂。
13.如权利要求10至12中任一项所述的疫苗，其特征在于，该疫苗含有含量范围为5μg至10mg的免疫球蛋白。
全文摘要
本发明涉及多克隆免疫球蛋白制剂用于生产疫苗制品的用途，该疫苗制品含有用于对免疫球蛋白来源的同种个体进行免疫接种的多特异性抗体。可以将所述有效免疫制剂用于，例如，预防或治疗癌症、自身免疫疾病、过敏反应和对病毒、细菌或真菌感染的易感性。
文档编号A61P31/04GK1512895SQ02811121
公开日2004年7月14日 申请日期2002年3月19日 优先权日2001年6月1日
发明者H·罗伊伯纳, G·希姆勒, H 罗伊伯纳, 防 申请人:伊格尼昂癌症治疗研发股份公司