专利名称：食物的制作方法
技术领域：
本发明提供了用于减少伙伴动物中核酸损伤的营养成分。
鉴定涉及决定种特有的寿命的机制仍然是生物衰老的未解决问题之一。
进化论提出，寿命长的物种能够通过更耐久的体质为它们的寿命提供准备，该体质包括增强的细胞抗应激力。正常细胞过程如呼吸和其它代谢活动在细胞微环境中产生各种各样的应激。这些应激包括氧化应激、热能和在正常生化反应过程中产生的离子和pH变化，已知所有这些应激都能引起对细胞器(如线粒体、高尔基体、细胞溶胶、质膜、细胞骨架、溶酶体和细胞核)和细胞大分子(如蛋白质、多糖、核酸、脂质和磷脂)的损伤。由这些应激引起的一些损伤是不可逆的。
因此，希望能够减少对所述细胞微环境，如细胞器或细胞大分子的一个或多个组分的损伤。
本发明提供了用于减少对核酸损伤的营养干预。
现认为影响细胞器和细胞大分子的因素是广泛的。它们可能包括环境影响(温度压力)、地理因素、表型因素和营养干预(饮食)。
本发明已经确定和提供了用于减少对细胞大分子损伤的营养干预，该细胞大分子为核酸分子。
因此，本发明提供了维生素E、维生素C和类胡萝卜素在制备用于减少伙伴动物中核酸损伤的食物中的应用。
所述核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。
维生素E是几种生物类似化合物的集合术语，这些化合物包括称为生育酚和生育三烯酚的那些化合物。它们具有相同的生物活性。动物组织中维生素E最具生物活性的生物形式(也是最活跃的抗氧化剂)是α-生育酚。维生素E在体内不能合成。维生素E可保护细胞膜完整不受损失，该损失不利地改变细胞和细胞器的功能。
维生素E的单位可以用国际单位(IU)表示，其中1IUα-生育酚等于1mgα-生育酚。其它维生素E化合物可按照McDowell，L.R(1989)Vitamin EIn vitamins in Animal Nutrition，第四章，第96页，Academic Press，UK.的描述，通过将它们的生物效价与α-生育酚比较来测定它们的IU。
按照本发明第一方面的所述维生素E可以呈任何形式。它可以是生育酚或生育三烯酚。它可以是α-生育酚(d-α或dl-α)、β-生育酚(d-β或dl-β)、γ-生育酚(d-γ或dl-γ)、δ-生育酚、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚或δ-生育三烯酚。优选它为α-生育酚。
所述维生素E的来源没有限制。优选的维生素E来源包括乙酸维生素E，(例如乙酸生育酚)、乙酸维生素E吸附物或喷雾干燥的乙酸维生素E。尽管可以应用天然来源，但是优选的来源是合成的。
所述维生素E的给予形式没有限制。它可以呈饮食、食物或补充物的形式。在本说明书的下文中，术语“食物”覆盖了食物、饮食和补充物的全体。这些形式的任何一种可以是固体、半固体或者液体。
所述补充物对于补充不含足够高含量的按照本发明成分中的一种或多种的饮食或食物是特别有用的。补充物中所述成分的浓度可以用来“装满”动物饮食或食物中的所述含量。这可以通过用动物饮食包含一定量的所述补充物或者通过另外地喂给动物一定量的所述补充物来完成。所述补充物可以形成为具有特别高含量的本发明的一种或多种成分的食物，该食物在喂给动物前需要稀释。所述补充物可以呈任何形式，包括固体(例如，粉末)、半固体(例如食品样稠度/凝胶)、液体或可替换地，它可以呈片剂或胶囊的形式。可以方便地用食品将所述液体混入或者例如通过勺或通过吸移管样装置将液体直接喂给所述动物。所述补充物可以富含本发明的一种或多种成分或者可以呈至少两部分的组合包的形式，每部分含有所需含量的一种或多种成分。
优选将所述维生素E加入商业宠物食品产品或商业饮食补充物中。所述宠物食品产品可以是干、半干、湿或液体(饮料)产品。湿产品包括以罐头或箔制容器销售并且具有70至90％水分含量的食品。干产品包括具有类似组成，但具有5至15％的水分并且作为饼干样粗粉呈现的食品。优选把饮食、食物或补充物包装。这样消费者能从包装上识别食物中的组分和确认它适合被考虑的狗或猫。包装可以是金属(通常以罐头或软箔的形式)、塑料、纸或布纹纸。任何产品中的水分量可影响可以使用或需要的包装类型。
按照本发明的食物包括伙伴动物可以在它的饮食中消耗的任何产品。因此，本发明覆盖标准食品、以及宠物食品点心(例如点心条、饼干和甜品)。所述食物优选是熟食品。它可以加入肉或得自动物的材料(如牛肉、鸡肉、火鸡肉、羔羊肉、血浆、骨髓等，或者其中的两种或更多种)。为了提供蛋白质来源，所述食物也可选择地不含肉类(优选包括肉类替代品如大豆、玉米面筋或大豆产品)。所述产品可含有另外的蛋白质来源如大豆蛋白浓缩物、牛奶蛋白质、面筋等。所述产品还可含有淀粉来源如一种或多种谷物(例如小麦、玉米、大米、燕麦、大麦等)或不含淀粉。典型的干商业狗和猫食品含有约30％的粗蛋白质、约10～20％的脂肪和余下部分为碳水化合物，包括食物纤维和灰分。典型的湿的或湿润的产品含有(在干物质基础上)约40％的脂肪、50％的蛋白质和余下部分为纤维和灰分。本发明特别与在此描述的作为猫或狗的饮食、食物或补充物销售的食物有关。
本发明的所述伙伴动物没有限制。它不涉及人。伙伴动物包括驯养的猫和驯养的狗，以及马、鱼、鸟、兔和豚鼠。在本文中术语“驯养的”狗和“驯养的”猫意思是指狗类和猫类，尤其是家猫(Felisdomesticus)和家犬(Canis domesticus)。
可以容易地测定产品(固体或液体或任何其它形式)中维生素E的浓度。例如，可以用HPLC方法测定它。
优选地，按照本发明第一方面的食物的所述维生素E的水平从25IU/400kcal饮食起。在本文中，关于每千卡浓度是指千卡总代谢能摄入。用Nutritional Requirements of Dogs(1985)National ResearchCouncil(U.S.)National Academy Press Washington DC，ISBN0-309-03496-5或Nutritional Requirements of Cats(1986)National Research Council(U.S.)National Academy PressWashington DC，ISBN0-309-03682-8可确认卡路里密度的测定。对猫优选的水平为从30IU/400kcal起，从35IU/400kcal起，从40IU/400kcal起，从45IU/400kcal起，从50IU/400kcal起，从55IU/400kcal起，直到约100IU/400kcal或以上。对狗优选的水平为从30IU/400kcal起，从40IU/400kcal起，从45IU/400kcal起，从50IU/400kcal起，从55IU/400kcal起，从60IU/400kcal起，从65IU/400kcal起，直到约从100IU/400kcal或以上起。
本发明的第一方面还包括维生素C(抗坏血酸)。
维生素C是一种水溶性物质。它在驯养的猫和驯养的狗体内都能从头合成。因为它能体内合成，所以以前还没有研究过维生素C补充物在狗和猫体内的作用。具体地说，还没有研究过作为潜在的抗氧化剂以及与维生素E补充相组合，维生素C补充在狗和猫体内的作用。
按照本发明第一方面的所述维生素C可以呈任何形式。它可以是液体、半固体或固体。优选它是一种热稳定形式如磷酸钙形式。
所述维生素C的来源没有限制。优选的维生素C来源包括结晶抗坏血酸(任选纯的)、乙基纤维素包衣的抗坏血酸、抗坏血酸的磷酸钙盐、抗坏血酸-2-单磷酸盐或者具有小痕量二磷酸盐和痕量三磷酸盐，磷酸钙的抗坏血酸-2-单磷酸酯、或者例如，新鲜肝脏。
可以容易地测定产品(固体，液体或任何其它形式)中的维生素C水平。例如，可以用HPLC方法测定它。
涉及维生素E与维生素C组合应用的进一步应用点是它们潜在的协同作用。下面事实可以支持这一点维生素E是脂溶性的而维生素C是水溶性的。已知α-生育酚位于脂膜中。抗坏血酸和α-生育酚，例如，在细胞膜或脂蛋白与水之间的界面相互作用。抗坏血酸快速还原膜中的α-生育酚自由基重新生成α-生育酚。按照本发明第一方面维生素C的优选浓度为这样一个水平，与当喂给所述动物对照饮食时相比，它优选提高动物血浆维生素C水平高达约25％(优选25％或更高)，以致于它的总维生素C消耗为(既对猫又对狗)5mg/400kcal饮食。本发明的第一方面还覆盖不能实现这种提高的维生素C水平。按照本发明第一方面的维生素C水平包括从10、12、15、17、20、22、25、27、30、32、38、40、42、48直到约50mg/400kcal饮食。对猫优选的水平为上面从10至48mg/400kcal的选择，对狗为上面从12至50mg/400kcal的选择。55mg/400kcal以上的水平不会提供增加的益处，通常最好避免。
本发明的第一方面还包括类胡萝卜素。
所述类胡萝卜素是一组红色、橙色和黄色的色素，这些色素主要发现于植物食品中，特别是水果和蔬菜中，以及吃所述植物的动物的组织中。它们是亲脂性化合物。有些类胡萝卜素起维生素A前体的作用，有些则不能。这种性质与它们的抗氧化活性无关。类胡萝卜素可以起强抗氧化剂的作用。不同的动物品种吸收类胡萝卜素的程度不同。可以将类胡萝卜素分成两大组基于胡萝卜素的那些和基于胡萝卜醇(它们包括氧化了的化合物)的那些。普通类胡萝卜素包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质和虾青素。现在没有证明类胡萝卜素是猫或犬饮食中的必须营养物。与人和狗不同，猫不能将前体β-胡萝卜素转化成活性维生素A形式，因为猫的肠粘膜中缺乏这种转化所必须的酶(它们不具有裂开所述胡萝卜素分子所需的双加氧酶)。
本发明表明，类胡萝卜素能被驯养的猫和狗吸收(提供升高的血浆浓度)而且能促成DNA损伤减少。另外，本发明已经证实，在将类胡萝卜素混入商业产品后它们能被吸收。如上面所提及的，本发明第一方面的所述成分可协同起作用。维生素E能保护β-胡萝卜素免受氧化而且可能对β-胡萝卜素具有节约(sparing)作用。现在认为维生素E能保护β-胡萝卜素的化学键免受氧化。
所述类胡萝卜素的来源没有限制，可包括自然和合成来源。具体地说，优选的来源为自然来源且包括金盏花粉和紫花苜蓿粉(叶黄素的来源)、番茄粉、红棕榈油、番茄粉、番茄渣/浆(β-胡萝卜素和番茄红素的来源)。来源包括类胡萝卜素含量高的油和纯制造的类胡萝卜素如叶黄素、堇菜黄质、隐黄质、胭脂树橙、玉米黄质、apo-EE(Apo-8-胡罗卜酸乙酯(Apo-8-carotenic acid ethylester))、斑蝥黄、citranaxanthin、achinenone、番茄红素和辣椒红。总类胡萝卜素的优选含量为从0.01mg/400kcal，或从0.2mg/400kcal或从1mg/400kcal或从2mg/400kcal起。
下面类胡萝卜素的浓度为优选β-胡萝卜素0.01至1.5mg/400kcal，优选0.5至1mg/400kcal番茄红素0.01至1.5mg/400kcal，优选0.5至1mg/400kcal叶黄素0.05至1.5mg/400kcal，优选0.5至1mg/400kcal。
具体地说，本发明提供了本发明第一方面中的类胡萝卜素的组合。
所述组合的类胡萝卜素优选来源包括红棕榈油和金盏花粉番茄粉、金盏花粉和紫花苜蓿番茄渣和金盏花粉。
可以容易地测定产品中的类胡萝卜素含量。例如，可以用HPLC方法测定它。
本发明的第一方面可包括牛磺酸。
牛磺酸是一种发现于许多种动物中不常见的氨基酸。对猫来说牛磺酸是一种必须营养物，与狗不同，猫不能从前体氨基酸合成牛磺酸。现认为牛磺酸能够保护细胞膜以免受包括氧化剂的毒性成分的影响。动物饮食中维生素牛磺酸水平的提高，特别是与本发明的其它成分组合，能促成自由基减少以及因此动物中DNA损伤减少。
按照本发明第一方面的牛磺酸可以呈任何形式。它可以是粉末的、结晶的、半固体或液体的形式。
所述牛磺酸的来源没有限制。优选的牛磺酸来源包括氨基乙基磺酸(C2H7NO3S)。来源可以是自然或合成的。
通常在某种程度上产品的加工(例如，所述产品是干的还是罐装的)决定了按照本发明第一方面应用的牛磺酸的合适浓度。要维持猫血浆牛磺酸水平在正常范围(＞60μmol/l)，罐装(湿的)饮食必须提供每天每千克体重至少39mg牛磺酸，而干饮食必须提供每天每千克体重至少19mg牛磺酸。本发明的第一方面为一种不经过高温方法(如罐装)的产品提供的优选含量从约80mg/400kcal起，更优选从约100起，提高到甚至更优选从120、150、180、200、220、250、280、300、320、350、400和以上起(用mg/400kcal饮食表示)。在例如通过高温处理的产品中，按照本发明的含量优选从约380mg/400kcal起，更优选从约400起，提高到甚至更优选从420、450、480、500、520、550、580、600、620、650、700和以上饮食起(用mg/400kcal表示)。
可以容易地测定产品(固体、液体或者呈任何其它形式)中牛磺酸的浓度。例如，可以用HPLC色谱法测定它。
如上所述，本发明包括维生素E和其它成分。所述成分的有用组合(优选以罐装或干的宠物食品形式)包括维生素E、维生素C、牛磺酸、红棕榈油和金盏花粉维生素E、维生素C、牛磺酸、番茄粉、金盏花粉和紫花苜蓿维生素E、维生素C、牛磺酸、番茄粉和金盏花粉维生素E、维生素C、牛磺酸、番茄粉和紫花苜蓿维生素E、牛磺酸、番茄渣和金盏花粉。
本发明的一种组合是大约的活性成分mg/400kcal生产后(干产品)维生素C 20mg抗坏血酸维生素E 50IU牛磺酸 200mg(在湿产品中500mg)叶黄素 0.17mg番茄红素0.03mgβ-胡萝卜素 0.01mg本发明的又一种有用组合是维生素E 50IU/400kcal维生素C 20mg/400kcal牛磺酸 500mg/400kcalβ-胡萝卜素 0.5至1mg/400kcal番茄红素1mg/400kcal叶黄素 0.5至1mg/400kcal按照本发明的食物的其它有用成分包括痕量无机物(不是直接的抗氧化剂，但起抗氧化金属酶系统内的辅因子的作用)、硒(抗氧化含硒酶，谷胱甘肽过氧化物酶的一个必须部分)、铜、锌和锰(形成抗氧化金属酶Cu-Zn-超氧化物歧化酶和Mn-超氧化物歧化酶的完整部分)。
本发明的第二方面提供了一种减少动物中核酸损伤的方法，该方法包括给予所说的动物包含维生素E、维生素C和类胡萝卜素的食物。
本发明第一方面的全部优选特征也适用于所述第二方面。
按照所述第二方面的方法，可以同时、分开或顺序给予或使用所述成分。
随着越来越多的证据提示自由基参与了氧化DNA损伤的发展，在许多变性性障碍(degenerative disorders)的病原学中已经牵涉这种损伤的后果，因此对精确评估DNA损伤水平的需求已经重新受到了关注。在正常人细胞中已经检测到显著的DNA损伤水平，现认为这是由作为正常身体过程副产物产生的自由基攻击(例如羟基自由基)引起的。
确实存在各种各样的防御机制来猝灭潜在引起损伤的自由基。主要的抗氧化防御包括酶类(过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)。次要的抗氧化防御涉及消除自由基诱导的DNA损伤的切除和修复过程。尽管存在这些防御系统，但在细胞内还发生损伤，现认为未修复DNA的累积可促成各种各样的障碍。
单细胞电泳，更常称为彗星试验，是一种简单且非常灵敏的测定核酸损伤(特别是DNA损伤)的方法，该方法具有能够在单细胞水平上评估DNA损伤的附加优点。该试验的基本原理是，存在于所有细胞类型中的DNA通过自由基攻击的作用都能够受损伤、突变或重组。DNA修复酶(例如DNA内切核酸酶)可除去这些损伤的DNA区域。这事实上在DNA中留下了缺口或“DNA链断裂”。设计彗星试验来检测和定量的就是这些链断裂。
目前，所述彗星试验已经被用于各种各样的应用中，包括毒理研究(Singh N.P.，McCoy，M.T.，Tice，R.R.& Schneider，E.L.(1988).A simple technique for quantitation of low levels of DNA damagein individual cells.Exp.Cell Biol.175184-191)，运动诱发的损伤(Hartmann，D.(1994).Free-radical theory of ageingIncreasing the functional life span.Ann.NY.Acad.Sci.7171-15)，和测定细胞生长和DNA修复机制(Duthie，S.J.& Collins，A.R.(1997).The influence of cell growth，detoxifying enzymesand DNA repair of hydrogen peroxide-mediated DNA damage(measured using the comet assay)in human cells.Free Radic.Biol.Med.22717-724)。
具有能精确测定自由基损伤的水平以及饮食干预如何能减少猫和狗中的这种损伤的能力是重要的。为包括在营养研究中，我们已经开发和证实了所述彗星试验(由Singh等，(上文)描述的最初方法进行改进)用于测定猫和狗血样中由自由基攻击诱发的DNA损伤的水平。
所述彗星试验基于下述原理工作自由基，如活性氧，攻击然后引起DNA链断裂，这就导致DNA超螺旋结构解旋和丧失。用琼脂糖包埋细胞如白细胞，然后在显微镜载玻片上分层，用去污剂溶解后在碱性条件下电泳。形成含有无核小体但还是超螺旋的DNA的拟核。存在于DNA中的任何断裂都可引起超螺旋局部松弛然后DNA环自由伸展形成具有明显“尾”区的彗星形状结构，该“尾”区由伸展和破裂的DNA环组成，当进行碱性电泳时该DNA环已经从拟核“头”迁移。
所述碱性条件还允许破裂环中的链解旋然后将碱不稳定的位点转变为DNA断裂，促使彗星“头”和“尾”的形成。
荧光染色后，染色强度与DNA含量有关，通过证实的目视分级系统和/或计算机图像分析包确定DNA损伤的量。评估两种DNA损伤的量度。第一，内源性(背景)DNA损伤，它提供了细胞内自然发生DNA断裂的指征。第二，人工诱发(用过氧化氢处理细胞)的DNA损伤，它反应对内源性损伤的抗氧化耐受性。
内源性和外源性DNA损伤提供了一种指征升高的损伤水平(或升高的导致损伤的应激)促成继发性疾病的发展。
所述彗星试验还证明具有以下益处●仅需要来自猫和狗的少量血样，●在单细胞水平上检测DNA损伤的灵敏性，●潜在地高通量测定，●易应用、适应性强和低成本。
所述彗星试验能用来鉴别饮食对内源性和外源性DNA损伤的不同作用，因此可建议把它作为研究不同营养补充物对调制猫和狗DNA损伤水平的作用的简单生物测定。
现描述本发明。
图1不同浓度的过氧化氢(0-250μM/ml)对诱发DNA损伤的作用。结果为12只受试验猫的平均值±SEM。用不同字母表示的平均值在p＜0.001统计学显著。
图2不同浓度的过氧化氢(0-250μM/ml)对诱导DNA损伤的作用。结果为12只受试验狗的平均值±SEM。用不同字母表示的平均值在p＜0.001统计学显著。
图3猫白细胞所有DNA损伤级的尾中DNA百分数的目视评分与计算机图像分析之间的关系。结果为平均值±SEM(n＝100每级)。
图4猫白细胞所有DNA损伤级的尾力矩的目视评分与计算机图像分析之间的关系。结果为平均值±SEM(n＝100每级)。
图5猫白细胞所有DNA损伤级的尾长的目视评分与计算机图像分析之间的关系。结果为平均值±SEM(n＝100每级)。
图6狗白细胞尾中DNA百分数的目视评分与计算机图像分析之间的关系。结果为平均值±SEM(n＝100每级)。
图7狗白细胞所有DNA损伤级的尾力矩的目视评分与计算机图像分析之间的关系。结果为平均值±SEM(n＝100每级)。
图8狗白细胞所有DNA损伤级的尾长的目视评分与计算机图像分析之间的关系。结果为平均值±SEM(n＝100每级)。
图9猫对照组和补充组的内源性DNA损伤。显示的是每组的平均值，以及该平均值的标准误差均值(SEM)。
图10猫对照组和补充组的外源性DNA损伤。显示的是每组的平均值，以及该平均值的标准误差均值(SEM)。
图11小狗对照组和补充组的内源性DNA损伤。显示的是每组的平均值，以及该平均值的标准误差均值(SEM)。
图12在补充前取样，狗对照组和AOX补充组的内源性和外源性DNA损伤。显示的是每组的平均值。
图13在补充后2个月取样，狗对照组和AOX补充组的内源性和外源性DNA损伤。显示的是每组的平均值。
图14比较狗不加补充物组和AOX补充组之间的基线和补充后2个月的内源性DNA损伤结果。
图15比较狗不加补充物组和AOX补充组之间的基线和补充后2个月的外源性DNA损伤结果。
图16在补充前取样，狗对照组和抗氧化剂(AOX)补充组的内源性和外源性DNA损伤。显示的是每组的平均值。结果表示为平均值(±SEM)，n＝20。未观察到显著差异。
图17在补充后2个月取样，狗对照组和抗氧化剂(AOX)补充组的内源性和外源性DNA损伤。显示的是每组的平均值。结果表示为平均值(±SEM)，n＝20。星号*表示p＜0.005的显著。
现在参照下面的实施例描述本发明。
实施例1用于评估狗和猫白细胞中DNA损伤水平的单细胞凝胶电泳试验(彗星试验)的证实。
我们在此报道了狗和猫系统内彗星试验的开发和验证，该试验将来可用于研究营养补充可能具有的保护细胞免受自由基损伤的作用。
材料与方法细胞制备将所有猫和狗养在Waltham Centre for Pet Nutrition，条件与宠物猫和狗的条件相似，并且在整个研究期间喂给可通过商业途径得到的完全饮食。从12只健康成年猫(7.2±4.8岁)和12只健康成年狗(4.5±2.3岁)的颈静脉抽取小体积血样(5ml)注入肝素锂管中，然后用PBSa按1∶1稀释。通过以1000g离心40分钟在Histopaque1083梯度仪(Sigma，UK)上分离白细胞。在记数和直到需要时为止在-80℃用90％胎牛血清(Sigma)和10％二甲亚砜(Sigma)以1×106细胞/ml贮藏前，用10ml PBSa洗涤白细胞两次然后以700g离心10分钟。生存力(用锥虫蓝排除法评估)通常为95％左右。
过氧化氢处理通过将所述白细胞暴露给H2O2浓度(0-250μM，用PBSa稀释)范围离体(ex vivo)诱发DNA损伤来确定诱发DNA损伤明显高于背景内源性DNA损伤水平所需要的最适H2O2水平。在37℃水浴中快速解冻白细胞，用PBSa洗两次，以700g离心15分钟，然后用PBSa以2×105/ml重新悬浮。用0μM、10μM、50μM、100μM和250μM H2O2的PBSa溶液将细胞重新悬浮，然后在冰上培育5分钟。在4℃以700g离心经处理的白细胞15分钟备用于载玻片制备。
载玻片制备制备两层琼脂糖。对于第一层，用吸移管将在95℃用PBSa制备的85μl 1％(w/v)高熔点(HMP)琼脂糖(Sigma)吸移到充分霜冻的显微镜载玻片上，用18×18mm的盖玻片覆盖然后让其在4℃凝固10分钟。用PBSa将未经处理的和经过氧化氢处理的白细胞洗两次，以700g离心15分钟然后用85μl 1％(w/v)低熔点(LMP)琼脂糖(Sigma)以2×105重新悬浮。然后将所述细胞悬液吸移到凝固的HMP琼脂糖层上，用18×18mm的盖玻片覆盖然后让其在4℃凝固10分钟。移去盖玻片后，用新制备的冷溶解液浸渍所述载玻片。
细胞溶解为了脱除细胞蛋白质，在4℃用预先冷却的溶解溶液(2.5M NaCl，100mM EDTA钠，10mM Tris，用NaOH颗粒调pH至10，1％Triton X-100(v/v)，(使用前立即加入))浸渍载玻片60分钟。
碱处理和电泳溶解后，将所述载玻片放置在凝胶电泳装置中，在暗处4℃以25V(300mA)电泳30分钟前，在暗处室温下用新鲜碱性电泳缓冲液(300mMNaOH，1mM EDTA，pH13)培育40分钟。
中和与染色电泳后，用中和缓冲液(0.4M Tris-HCl，pH7.5)浸渍所述载玻片，然后在4℃小心地洗三次5分钟以脱除碱和去污剂。往每个载玻片中加入50微升SYBR Green(Trevigen，Gathersberg，MD)使DNA染色，然后用盖玻片覆盖，在观察前置于暗处一个密闭潮湿的容器中。仿效Ward，T.H.& Marples，B.(2000)的研究SYBR Green I and theimproved sensitivity of the single-cell electrophoresis assay.Int.J.Rad.Biol.7661-65，选择SYBR Green使损伤的DNA染色，证实了与可替代的DNA染色剂相比SYBR Green的改善的检测灵敏性和测定分辨率。
DNA损伤评分按照Collins，A.R.，Dunsiska，M.，Gedik，C.M.& Stetina，R.(1996).Oxidative damage to DNAdo we have a reliablebiomarker？Enrion.Health Pers.104(Suppl 3)465-469和Collins，A.，Dunsiska，M.，Franklin，M.，Somorovska，M.，Petrouska，H.，Duthie，S.，Fillion，L.，Panayiotidis，M.，Raslova，K.& Vaughan，N.(1997).Comet assay in humanbiomonitoring studiesreliability，validation andapplications.Envir.Mol.Mutagen.30139-146的方案进行DNA损伤的目视和计算机图像分析。在Zeiss倒置荧光显微镜上460nm处放大250倍观察载玻片。基于观察到的彗星尾长迁移和彗星尾中DNA的相对比例凭视觉以0～4(即范围从0＝没有DNA损伤，至4＝深度DNA损伤)的任意尺度给随机选择的非重叠细胞赋予一个得分。通过用所述级的数值乘分配给每个损伤级的细胞数然后总计全部级数(给出最大可能得分400，对应于4级100个细胞)推导出每个载玻片的总损伤得分。为确定是否目视评分与计算机图像分析相关联，还用KOMET4.0分析包(Kinetic Imaging，Liverpool，UK)对相同细胞进行DNA损伤评分。进行各种客观测量，包括测定尾中DNA百分数、尾长(从彗星头的前缘起测量)和尾力矩(tail moment)。按下面公式计算尾力矩尾力矩＝尾长x％尾DNA/100统计分析应用线性回归分析使目视彗星得分与计算机图像分析所得得分相关联。为确定用来离体诱发DNA损伤的H2O2不同浓度之间的统计学显著差异，应用两因素ANOVA和Student-Newman-Keuls检验。
结果本研究的目的是开发和证实彗星试验评估猫和狗白细胞中DNA损伤水平的应用。用观察到的彗星尾长和尾中DNA水平作为评分标准，从0级(无DNA损伤)到4级(深度DNA损伤)对DNA损伤进行目视评分。为证实猫和狗白细胞对DNA损伤的敏感性，用0-250μM H2O2处理细胞悬液5分钟。然后用目视评分系统评价SYBR green染色的彗星的DNA损伤。当与未经处理的样品比较时，用目视评分系统在10～250μM H2O2范围内猫和狗样品中都观察到DNA损伤统计学地显著增加(p＜0.001)。尽管相对于猫和狗二者样品中使用的所有其它H2O2浓度，应用250μM H2O2诱导了DNA损伤的显著增加(图1和图2)，但当比较猫样品应用10～100μM H2O2(图1)和狗样品应用50-100μM H2O2(图2)时，在DNA损伤水平之间未观察到显著差异。
本研究的第二个目的是将彗星的目视评分(以0～4的尺度)与尾中DNA百分数、尾力矩和尾长的计算机图像分析参数进行比较。图3、4和5表明，如用线形回归确定的，猫白细胞彗星的目视评分与计算机图像分析高度相关，相关性分别为尾中DNA百分数(R2＞0.99)、尾力矩(R2＞0.95)和尾长(R2＞0.90)。当使狗白细胞彗星的所述目视评分与计算机图像分析相关联时，观察到了相似的趋势，相关性分别为尾中DNA百分数(R2＞0.97)、尾力矩(R2＞0.95)和尾长(R2＞0.91)，图6、7和8。
实施例2应用彗星试验评估补充抗氧化剂猫与对照猫中DNA损伤的水平。
动物将所有猫养在Waltham Centre for Pet Nutrition，条件与宠物猫的条件相似。所述试验对照组由14只成年驯养的短毛猫(9.2±2.1岁)组成并且用可通过商业途径得到的完全饮食饲养。由14只成年驯养的短毛猫(8.7±1.9岁)组成的抗氧化剂补充组用额外含有下面抗氧化补充物(表1)的相同商业罐装饮食饲养。所有的猫用它们各自的饮食饲养2年以上。
表1存在于湿饮食中的抗氧化剂混合物的组分含量小体积血样采集全血样品注入5ml肝素锂管中。然后纯化所述白细胞组分并且将其从全血中分离用于彗星分析。
彗星试验按照上面实施例1中强调的进行彗星试验。
统计分析应用独立的两样品t检验比较数据组。结果显示在图9和图10中。
讨论尽管各种各样的身体组织已经被建议用于彗星试验，但是血白细胞被认为是实际身体状态的一个好标记。因为在白细胞的质膜中多不饱和脂肪酸的高百分比以及提高的作为它们正常功能部分的自由基产生，它们对自由基的损伤效应更敏感。通过Fenton反应，产生与DNA分子接近的高活性羟基自由基(OH·)，过氧化氢被认为是DNA损伤、染色体变化和基因突变的最强的原因之一
本报告的结果证实了，与未补充抗氧化剂的对照猫组比较，补充抗氧化剂的猫组的内源性和外源性DNA损伤水平显著降低。这证实了补充抗氧化剂的猫显著更高的抗氧化耐受性，导致DNA对内源性和外源性自由基攻击敏感性降低和暴露减少，减少加强DNA不稳定性、突变和功能紊乱的损伤。
内源性DNA损伤表明，升高的损伤水平(或者升高的引起所述损伤的氧化应激)促成继发性疾病的发展。这种方法可用于变性性障碍的进展。另外，DNA损伤和突变可导致(a)因为DNA损伤介导的细胞周期停滞，免疫细胞不能增殖，(b)作为对携带某些突变的细胞的体内选择结果，增殖的速率降低可导致对感染最适度以下的免疫应答，(c)由临界水平DNA损伤触发的升高的细胞程序死亡水平可导致免疫细胞类型的数目减少。
总之，通过猫体内抗氧化剂补充而实现的内源性和外源性DNA损伤水平的降低可能意味着，通过降低DNA对自由基损伤的敏感性以及可能升高DNA修复的水平，对变性性障碍的敏感性降低。
实施例3应用彗星试验评估补充抗氧化剂的小狗和对照小狗中DNA损伤的水平。
两组4只、年龄和性别配对的，拉布拉多狗同窝仔用完全均衡的饮食维持体重，该饮食从6周龄开始相应地用补充物进行调整，直到在15月龄取样用于彗星试验。其中一组用抗氧化剂混合物补充，该混合物的组分给出在表2中。
表2.所述混合物的组分的含量小体积血样采集全血样品注入5ml肝素锂管中。然后纯化所述白细胞组分并且将其从全血中分离用于彗星分析。
彗星试验按照上面实施例1中强调的进行彗星试验。
统计分析应用独立的两样品t检验比较数据组。
结果显示在图11中。
讨论本报告的结果证实了，与未补充抗氧化剂的对照小狗组比较，补充抗氧化剂的小狗组的内源性DNA损伤水平降低(p＝0.150)。
总之，通过给小狗补充抗氧化剂而实现的内源性DNA损伤水平降低，意味着通过降低DNA对自由基损伤的敏感性以及可能提高DNA修复的水平，对感染和包括通常衰老过程的变性性障碍的敏感性降低。
实施例4应用彗星试验评估补充抗氧化剂的成年狗和对照成年狗中DNA损伤的水平。
两组20只、年龄和性别配对的混合饲养的成年狗用完全均衡的饮食维持体重，该饮食用补充物相应地调整16周实验期。在第0周和第8周进行采样用于彗星试验。一组狗用抗氧化剂混合物补充，该混合物的组分给出在表1中。
括号中的数字指以干饮食形式的浓度。
表1.所述混合物的组分含量小体积血样采集全血样品注入5ml肝素锂管中。然后纯化所述白细胞组分并且将其从全血中分离用于彗星分析。
彗星试验按照上面实施例1中强调的进行彗星试验。
统计分析应用独立的两样品t检验比较数据组。
结果显示在图12至15中。
本报告的结果证实了，与未补充抗氧化剂的对照狗组比较，补充后2个月时补充AOX狗组的内源性(p＝0.001)和外源性(p＝0.003)DNA损伤水平都显著降低(图13)。在基线时两组之间内源性或外源性DNA损伤水平未观察到显著差异(图12)。同样，对照组显示，当将补充后2个月所取样品与基线水平比较时，不管是内源性还是外源性DNA损伤水平都没有显著变化(图14和15)。当然，当将补充AOX狗组的2个月补充的外源性和内源性DNA损伤水平与它们的基线值比较时，内源性DNA损伤(p＝0.041；图14)和外源性DNA损伤(p＝0.005；图15)存在显著减少。
实施例5应用彗星试验评估补充抗氧化剂的狗和对照狗中DNA损伤的水平。
补充8周后，如用彗星试验测定的，与对照狗比较，补充AOX的狗还表现出内源性和外源性DNA损伤两者的显著减少(p＜0.005)。在狗中的这些新研究结果表明，抗氧化剂补充发挥了DNA损伤减少的保护作用。
材料&方法动物选择两组混合饲养的20只、年龄(平均4.4岁±1.85岁)和性别配对的成年狗用于本研究。所有狗已经被接种过(犬瘟病毒、细小病毒和腺病毒)并且被视为是临床上健康的。将所有狗养在WALTHAMCentre for Pet Nutrition，Leicestershire，英国，在那里将这些狗养在特意修建、环境强化的设施中并且按照该中心的研究伦理和英国内政部的法规进行处置。
研究设计给所有狗提供基础饮食，该基础饮食为由湿的(Pedigree()，Masterfoods，Melton Mowbray，UK)和干的(Chappie Complete，Masterfoods，Peterborough，UK)工业生产的饮食在能量基础上按照50∶50比例配制而成的营养完全和均衡的饮食。在开始研究之前以每kgW0.75为460kJ预期代谢能的允许量给予动物所述基础饮食12周，目的是维持正常体重。所述对照组仍然给予基础饮食度过16周试验期，而补充抗氧化剂(AOX)的组同时接受基础饮食并且在每天的基础上口服补充抗氧化剂混合物(维生素C、维生素E、牛磺酸、叶黄素、番茄红素和β-胡萝卜素)度过16周试验期。根据体重的任何变化相应地改变饮食摄入。
为分析DNA损伤，在第0周和第8周采集样品。
为分析DNA损伤，在第0周和第8周采集小体积血样注入肝素锂管(LIP Ltd)中，然后用磷酸缓冲盐水(PBSa)按1∶1稀释。通过以1000g离心40分钟在Histopaque 1083梯度仪(Sigma Chemical Co.，UK)上分离白细胞。在记数和用90％胎牛血清(Sigma)和10％二甲亚砜(Sigma)以1×106细胞/ml缓慢冷冻至＜-80℃直到需要时为止之前，用10ml PBSa洗白细胞两次并且以700g离心10分钟。生存力(用锥虫蓝排除法评估)通常为98％左右。按照实施例1用彗星试验进行DNA损伤测定。用未经处理和经H2O2处理的分离的狗白细胞分析DNA链断裂。基于证实的应用图像分析软件(KOMET 4.0分析包(KineticImaging，Liverpool，UK))的目视评分系统(每个样品100个细胞)和上文Collins等1996、1997方法对彗星评分。
统计分析用适用Windows的SPSS(版本10.0.0，SPSS Inc.，Chicago，I11.)评价所得数据。当在ANOVA中通过组相互作用显著时间显示两组之间有差异时，通过在每个时间点单独进行t-检验对这些差异进行更详细地研究。用成对的和不成对的t-检验分析DNA损伤数据。在分析前，对所有变量进行正常态评价。在p＜0.05认为数值显著。数据以平均值±SEM报告。
结果DNA损伤在第0周未观察到两组之间内源性或外源性DNA损伤水平显著差异(图16)。在补充8周后，与对照狗比较，补充AOX的狗组的内源性(p＜0.005)和外源性(p＜0.005)DNA损伤水平都存在显著降低(图17)。当将补充8周后所取样品与基线水平(未显示数据)比较，狗对照组显示不管是内源性还是外源性DNA损伤水平都没有显著变化。当然，在补充8周之后，当将来自补充AOX的狗组的外源性和内源性DNA损伤水平与它们自己的基线值比较时，观察到内源性DNA损伤(p＜0.05)(未显示数据)和外源性DNA损伤(p＜0.005)(未显示数据)显著减少。
讨论本数据证实了，在第0周(补充之前)两组狗之间的DNA损伤不存在差异，但是在补充8周后内源性和外源性DNA损伤都存在显著减少。内源性损伤的减少可以表明补充物中抗氧化剂保护DNA免受自由基攻击的保护作用增加，和/或对受损DNA的修复速率提高。用外源性H2O2体外攻击白细胞以诱发DNA链断裂还提供了一种抗氧化保护作用或对自由基损伤的耐受性的指标。
权利要求
1.维生素E、维生素C和类胡萝卜素在制备用于减少伙伴动物中核酸损伤的食物中的应用。
2.如权利要求1的应用，进一步包括牛磺酸。
3.如权利要求1或权利要求2的应用，其中所述类胡萝卜素是β-胡萝卜素、叶黄素或番茄红素中的一种或多种。
4.如权利要求1至3中任意一项的应用，其中所述维生素E是以从25IU/400kcal饮食或以上起的浓度存在。
5.如权利要求1至4中任意一项的应用，其中所述维生素C是以从10mg/400kcal或以上起的浓度存在。
6.如权利要求1至5中任意一项的应用，其中所述类胡萝卜素是以从0.01mg/400kcal或以上起的浓度存在。
7.如权利要求2至6中任意一项的应用，其中所述牛磺酸是以从80mg/400kcal或以上起的浓度存在。
8.如权利要求1至7中任意一项的应用，其中所述食物为一种干、湿或半干的食物。
9.一种减少动物中核酸损伤的方法，该方法包括给予伙伴动物一种包含维生素E、维生素C和类胡萝卜素的食物。
10.如权利要求9的方法，其中所述食物进一步包括牛磺酸。
11.如权利要求9或权利要求10的方法，其中所述类胡萝卜素是β-胡萝卜素、叶黄素或番茄红素中的一种或多种。
12.如权利要求9至11中任意一项的方法，其中维生素E是以从25IU/400kcal饮食或以上起的浓度存在。
13.如权利要求9至12中任意一项的方法，其中维生素C是以从10mg/400kcal或以上起的浓度存在。
14.如权利要求9至13中任意一项的方法，其中类胡萝卜素是以从0.01mg/400kcal或以上起的浓度存在。
15.如权利要求9至14中任意一项的方法，其中牛磺酸是以从80mg/400kcal或以上起的浓度存在。
16.如权利要求9至15中任意一项的方法，其中所述成分被同时、分开或顺序给予。
17.如此前参照所述实施例中的一个或多个描述的维生素E、维生素C和类胡萝卜素的应用。
18.如此前参照所述实施例中的一个或多个描述的减少伙伴动物中核酸损伤的方法。
全文摘要
本发明提供了用于减少伙伴动物中核酸损伤的营养成分。所述营养成分为维生素E、维生素C和类胡萝卜素。这些成分可用于减少伙伴动物中核酸损伤的食物中。
文档编号A61P39/06GK1549679SQ02817194
公开日2004年11月24日 申请日期2002年8月2日 优先权日2001年8月3日
发明者P·R·希顿, B·H·E·史密斯, J·M·罗林斯, E 史密斯, P R 希顿, 罗林斯 申请人:马斯英国有限公司