专利名称：含有乳酸寡聚物混合物的抗肿瘤剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤剂，更详细而言，涉及含有由链状和环状乳酸寡聚物混合物形成的聚乳酸混合物的抗肿瘤剂。本发明的抗肿瘤剂可发挥肿瘤缩小效果和转移抑制效果，可用于癌症的治疗。
背景技术：
含有环状聚乳酸的聚乳酸混合物抑制癌细胞的厌氧糖酵解体系、发挥抗肿瘤效果，以应用自然发生癌症的小鼠检测其成瘤抑制效果和应用移植癌组织(Lewis肺癌细胞)检测其肿瘤增殖抑制效果和转移抑制效果为中心进行了研究(长户等，第56次日本癌学会总会，1997年9月；高田等，第57次日本癌学会总会，1998年9月)。
还对聚乳酸混合物进行了Chemoprevention效果、抗癌剂与放射线照射的并用效果施用方法和施用量进行了检测，在高用量施用实验中未见到显著的抗肿瘤效果。鉴于此，进行合成新型的聚乳酸混合物的新的尝试。
发明公开本发明把通过评价在特定的胺化合物存在下聚合丙交酯而形成的聚乳酸混合物的抗肿瘤作用而提供新型的抗肿瘤剂作为自己的课题。本发明还把提供利用上述抗肿瘤剂的饮食品作为自己的课题。
为了解决上述课题，本发明者们对上述课题进行了大量研究，对在特定的胺化合物存在下聚合丙交酯而形成的聚乳酸混合物(下面的实施例中叫做X03)的抗肿瘤效果、用不同的方法制备的聚乳酸混合物(下面的实施例中叫做X01和X02)的抗肿瘤效果进行了比较实验，结果成功地确认了前者的有用性。尤其是本发明的聚乳酸混合物显示肿瘤重量的抑制，肺转移的显著抑制。基于此完成了本发明。
即，本发明提供抗肿瘤剂，它包含在下面通式(3)Me-N(R1)(R2)(3)
(式中Me代表碱金属，R1和R2分别独立地代表脂肪族基团或芳香族基团)代表的化合物的存在下聚合丙交酯而形成的、下面通式(1)或(2) (式中m表示1-30的整数，n表示1-30的整数)所代表的链状和环状乳酸寡聚物混合物(以下也叫做本发明中所用的链状和环状乳酸寡聚物混合物)。
优选通式(3)中Me为锂。
优选通式(3)中R1和R2分别独立地为碳数1-6的烷基。
优选通式(3)中Me为锂，R1和R2为异丙基。
优选通式(1)中m为1-19的整数。
优选通式(2)中n为1-25的整数。
根据本发明的其它方面，本发明提供饮食品，它包含上述本发明的抗肿瘤剂。
本发明的其它方案提供本发明中所用的链状和环状乳酸寡聚物混合物在抗肿瘤剂或抗肿瘤饮食品制备中的应用。
本发明的其它方案提供抑制肿瘤的方法，它包括给人等哺乳动物施用有效量的本发明中所用的链状和环状乳酸寡聚物混合物。
附图简述
图1表示合成例1中得到的聚乳酸混合物的质量图谱。
图2表示合成例2中得到的反应生成物的MS图谱。
图3表示合成例2中得到的反应生成物的NMR全图。
图4是图3中一部分的放大图。
图5是图3中一部分的放大图。
图6表示合成例3中得到的生成物的positive mode FABMS的总图谱。Rangem/z 10.0000-1305.5900图7表示合成例3中得到的生成物的negative mode FABMS的总图谱。Rangem/z 10.0000-2000.0000图8表示合成例3中得到的生成物的negative mode FABMS图谱的放大图。Rangem/z 10.0000-501.9260图9表示合成例3中得到的生成物的negative mode FABMS图谱的放大图。Rangem/z 490.2980-1003.7700图10表示合成例3中得到的生成物的negative mode FABMS图谱的放大图。Rangem/z 999.9500-1504.3400图11表示合成例3中得到的生成物的negative mode FABMS图谱的放大图。Rangem/z 1484.5300-2000.0000图12表示合成例3中得到的生成物的NMR总图谱。
图13表示肿瘤重量测定结果的比较。
图14表示肺转移集落数和肿瘤重量测定结果的比较。
实施发明的最佳方式以下对本发明的实施方法和实施方式进行详细说明。
制备本发明的抗肿瘤剂及饮食品中作为有效成分使用的链状和环状乳酸寡聚物混合物时的原料是2分子乳酸脱水缩合而成的丙交酯(3，6-二甲基-1，4-二噁烷-2，5-二酮)。本发明中在上述通式(3)代表的碱金属化合物的存在下与丙交酯反应。以下，对通式(3)进行说明。
Me-N(R1)(R2)(3)通式(3)中Me代表碱金属。R1和R2分别独立地代表脂肪族基团或芳香族基团。
本说明书中所讲的脂肪族基团可举出碳数1-12、优选1-6的直链状、支链状、环状或它们的组合的饱和或不饱和脂肪族烃基团，具体而言可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、十二烷基等烷基，环丙基、环丁基、环辛基、环十二烷基等环烷基等。脂肪族基团也可是有双键或三键的不饱和烃基。
本说明书中所说的芳香族基团，可举出碳数6-30、优选6-20、更优选6-12、更进一步优选6-10的芳基以及芳烷基。作为芳基可举出，苯基、甲苯基、萘基等，作为芳烷基可举出，苄基、苯乙基、萘甲基等。
脂肪族基团及芳香族基团也可有1个或更多的取代基团。对取代基团的种类无特殊限定，例如包括直链或支链、链状或环状的烷基，直链或支链、链状或环状的烯基，直链或支链、链状或环状的炔基、芳基、酰氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、氨基甲酰基氧基、碳酰胺基、磺胺基、氨基甲酰基、氨基磺酰基、烷氧基、芳氧基、芳氧基羰基、烷氧基羰基、N-酰基氨基磺酰基、N-氨基磺酰基氨基甲酰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、烷氧基羰基氨基、芳氧基羰基氨基、氨基、铵基、氰基、硝基、羧基、羟基、磺基、巯基、烷基亚硫酰基、芳基亚硫酰基、烷基硫基、芳基硫基、脲基、稠环基(例如至少含有1个或更多的氮、氧及硫等的、3-12员环的单环、稠环)、稠环氧基、稠环硫基、酰基、氨基磺酰基氨基、甲硅烷基、卤原子等。上述烷基、烯基、炔基及烷氧基的碳原子数一般为1-12，优选1-6，芳基的碳原子数一般为6-20，优选6-10。
通式(3)中，Me表示碱金属。作为碱金属可举出，例如Li、Na或K，优选Li。
通式(3)中代表的化合物中具有不对称碳的可分别是(R)体、(S)体、(R)，(S)体中的任何一种都可以。
对通式(3)中代表的碱金属化合物的得到方法无特殊限制，只要是本领域技术人员适宜的得到方法即可。可让二异丙基胺等二烷基胺与正丁基锂等烷基化碱金属反应而得。更具体而言，该反应可，例如，在氮气氛围下等对反应惰性的条件下，将THF等惰性溶剂中包含二烷基胺的溶液与己烷等惰性溶剂中包含烷基化碱金属的溶液混合、搅拌进行。对反应温度无特殊限定只要反应进行即可，但优选从-78℃到室温。反应时间可适当设定。
在通式(3)中的化合物存在下聚合丙交酯时，通式(3)中的化合物(Me-N(R1)(R2))的使用量为相对于1mol丙交酯优选1-0.1mol，更优选0.2-0.3mol。
进行丙交酯聚合反应时的反应温度只要反应进行即可无特殊限定，但优选从-100℃到室温，更优选从-78℃到室温。
优选丙交酯聚合反应在反应溶剂存在下进行。对反应溶剂无特殊限制，只要对反应是惰性的溶剂即可，但优选应用四氢呋喃等环状醚、二乙基醚、二甲氧基乙烷等。作为反应氛围气体可使用氮气和氩气等惰性气体。对反应压力无特殊限制，优选常压。
用上述方法所得的链状和环状乳酸寡聚物混合物的组成，根据作为反应辅助剂使用的通式(3)的化合物的种类和反应条件等而变化，但优选与环状乳酸寡聚物相比链状乳酸寡聚物的含量高。
根据上述方法可制备下面通式(1)或(2)代表的链状及环状乳酸寡聚物物混合物。
(式中，m表示1-30的整数；n表示1-30的整数)通常，反应生成物是由m为1-30的整数、例如1-28、1-25、1-21或1-19等整数的环状乳酸寡聚物与n为1-30的整数、例如1-28或l-25等整数的链状乳酸寡聚物的混合物。
本说明书中单独称“乳酸”时，该乳酸中包含L-乳酸、D-乳酸或二者任意比率的混合物。本发明中优选乳酸基本上由L-乳酸组成。这里所讲的“基本上”是指聚乳酸混合物中L-乳酸单元的比率[即，(L-乳酸单元数/L-乳酸单元数+D-乳酸单元数)×100]，例如在70％或以上，优选80％或以上，更优选85％或以上，更优选90％或以上，尤其优选95％或以上。聚乳酸混合物中L-乳酸单元的比率依赖于作为起始物质使用的乳酸中所存在的L-乳酸和D-乳酸的比率。
本发明的抗肿瘤剂可广泛用于肿瘤的抑制。所谓肿瘤抑制，具体而言，包含防止肿瘤发生、抑制肿瘤增大、使肿瘤消退、及抑制肿瘤转移等，包含临床上的癌症和/或肿瘤的预防和/或治疗。
可应用本发明抗肿瘤剂的癌症的种类无特殊限制，包含良性肿瘤和恶性肿瘤。作为癌症的具体例可列举恶性黑色素瘤、恶性淋巴瘤、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大肠癌、直肠癌、结肠癌、尿道肿瘤、胆囊癌、胆管癌、胆道癌、乳腺癌、肝脏癌、胰腺癌、睾丸肿瘤、上颚癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽癌、喉癌、卵巢癌、子宫癌、前列腺癌、甲状腺癌、脑肿瘤、Kaposi肉瘤、血管瘤、白血病、真性多血症、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、骨髓瘤、膀胱瘤、肉瘤、骨肉瘤、肌肉瘤、皮肤癌、基底细胞癌、皮肤附属器癌、皮肤转移癌、皮肤黑色素瘤等，但并不限定于此。
本发明的抗肿瘤剂可与其它的抗肿瘤剂和/或免疫疗法剂并用。作为其它的抗肿瘤剂包括丝裂霉素、阿霉素、顺铂、长春地辛、长春新碱、环磷酰胺、イフオマフアミド、博莱霉素、匹来霉素或依托泊甙等。作为其它的免疫疗法剂包括微生物或细菌细胞壁骨化中心成分，免疫活性多糖天然型或遗传工程学手段得到的细胞因子，或集落刺激因子等。作为免疫活性多糖包括香菇多糖或西佐喃等，作为细菌细胞壁骨化中心成分包括胞壁酰二肽衍生物等，作为微生物包括乳酸菌等，作为天然型或遗传工程学手段得到的细胞因子包括干扰素等。
本发明的抗肿瘤剂除上述成分之外，可根据需要，在不损坏本发明效果的范围内，任意地选择、联合应用医药品类、医药部外品类等制剂中使用的成分和添加剂。本发明的抗肿瘤剂除可作为单独的医药品类使用以外，可配合医药品类、医药部外品类等应用。
对本发明的抗肿瘤剂的形态无特殊限制，可从经口施用或非经口施用的制剂类型中选择最适于目的的制剂形式。
作为经口施用的制剂包括，例如片剂、胶囊制剂、散剂、饮剂、颗粒剂、细粒剂、糖浆制剂、溶液制剂、乳剂、悬浊剂、咀嚼剂等。作为适于非经口施用的制剂形式包括，例如注射制剂(皮下注射、肌内注射、或静脉内注射等)、外用剂、点滴剂、吸入剂、喷雾剂等，但并不限定于此。
适于经口施用的制剂，例如溶液制剂、乳剂或糖浆制剂等，可应用水、蔗糖、山梨糖醇、果糖等糖类，聚乙二醇、丙二醇等二醇，蓖麻油、橄榄油、大豆油等油类，对羟基安息香酸酯类等防腐剂，草莓调味剂、胡椒素等调味类等。另外，制备胶囊剂、片剂、散剂、或颗粒剂等固体制剂时可应用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇等赋形剂，淀粉、褐藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁、滑石等润滑剂，聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等结合剂，脂肪酸酯等表面活性剂，甘油等增塑剂。
适于非经口施用的注射用或点滴用制剂，优选将作为有效成分的上述物质溶解或悬浮到与受者血液等张的灭菌水性介质中。例如，对于注射剂的情况，可应用盐溶液、葡萄糖溶液、或盐水与葡萄糖溶液的混合物构成的水性介质等来制备溶液。用于肠内施用的制剂，例如可应用可可脂、氢化脂肪、或氢化羧酸等载体进行制备，作为栓剂提供。另外制备喷雾剂时，可将作为有效成分的上述物质分散成微细的粒子，可使用不刺激受者口腔及气道粘膜，且使有效成分容易吸收的载体。作为载体，具体而言有乳糖或甘油等。根据作为有效成分的物质及所使用的载体性质可制备出气溶胶或干粉等形态的制剂。这些非经口施用的制剂中可添加1种或更多的选自二醇类、油类、调味剂类、防腐剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、结合剂、表面活性剂、增塑剂等的饮食品。
本发明的抗肿瘤剂的施用量和施用次数可根据包含施用目的、施用方式、摄取者的年龄、体重或性别等条件的各种因素适当设定，但通常有效成分的施用量为每天1-10000mg/kg，优选10-2000mg/kg，更优选10-200mg/kg。优选一天分1-4次施用上述量的制剂。对本发明的抗肿瘤剂的施用时间无特殊限制。
本发明还涉及包含上述乳酸寡聚物混合物的饮食品。即，本发明中应用的乳酸寡聚物混合物不仅可如上所述以单独的制剂形式使用，而且可在饮食品中配合使用。
对本发明的饮食品的配合形式无特殊限制，只要该配合不分解乳酸寡聚物混合物即可。
作为本发明的饮食品的具体例包括清凉饮料、饮剂、健康食品、特定保健用食品、功能性食品、功能活性型食品、营养辅助食品、补充品、饲料、饲料添加物等通常所称的包含饮料的健康食品或辅助食品。另外，本发明的抗肿瘤剂可作为兽医药、饵饲料等使用。
作为饮食品的具体例包括，例如，口香糖、巧克力、糖果、果片、果胨、曲奇、饼干、酸乳等点心类，冰激凌、冰果等冷果类，茶，清凉饮料(包括果汁、咖啡、可可豆等)，营养饮剂、美容饮剂等饮料，面包，火腿，汤，果酱，细面条，冷冻食品等任意食品。或者，本发明所使用的乳酸寡聚物混合物可添加到调味料或食品添加剂等中应用。通过摄取本发明的饮食品可提供发挥抗肿瘤效果，基本上无有害的副作用的安全饮食品。
本发明饮食品的获得可将乳酸寡聚物混合物与食品中使用的一般原料直接混合、分散后，按众所周知的方法加工成所希望的形式。
本发明的饮食品包含所有形式的饮食品，对其种类无特定限制，可在上述各种饮食物或各种营养组成物中，例如在各种经口或经肠营养剂和饮料等中配合本发明的抗肿瘤剂作为饮食品。这类饮食品的组成除包含乳酸寡聚物混合物之外，还包含蛋白质、脂质、糖类、维生素和/或矿物质类等。对饮食品的形式无特殊限定，只要易于摄取即可，可以为固体、粉末、液体、胶状、浆状等任一形式。
对饮食品中乳酸寡聚物混合物的含有量无特殊限定，通常为0.1-20重量％，更优选0.1-10重量％左右。
饮食品中所含乳酸寡聚物混合物的量，优选其含量能发挥本发明的目的即抗肿瘤作用，优选在摄取的饮食物1食中为0.1g-10g左右，更优选0.5g-3g左右。
以下通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不限定于此。
实施例合成例1聚乳酸混合物(以下称作X01)的制备将500ml L-乳酸(也混入了D-乳酸)加入到放在覆套式加热器中的可分式烧瓶中。以300ml/分的速度流入氮气，搅拌，蒸馏出的水分经保温的下降型接续管导入带有环流冷却器的烧瓶。145℃加热3小时。再减压到150mmHg相同温度下加热3小时后，3mmHg减压下155℃加热3小时，最后在3mmHg的减压下185℃加热1.5小时，得到反应生成物聚乳酸。
所得聚乳酸保持在100℃，加入100ml乙醇后接着加入400ml甲醇，然后冷却。向其中加入500ml甲醇，充分搅拌，静置，然后过滤纯化。将滤液减压干燥，溶解到乙腈中，总量200ml(原液)。
将该原液通过预平衡过的逆相ODS柱(TSK gel ODS-80TM)，用含0.01M盐酸的30％、50％和100％乙腈(pH2.0)阶式洗脱，乙腈100％洗脱级分为聚乳酸(缩合度3-20)。所得物质的质量图谱如图1所示。如图1中规则的片段离子峰所表明的，所得聚乳酸混合物处于环状缩合物和链状缩合物混合存在的状态。
合成例2环状聚乳酸混合物(以下称作X02)的制备将10.0g(s)-(+)-乳酸加入到100ml的茄型烧瓶中，将之放到旋转蒸发仪上。将烧瓶内的压力调整到350-400mmHg，加热到140℃，相同压力及相同温度下持续反应6小时(第一加热工序)。该反应所生成的副产水蒸馏出去。另外，在上述反应条件下，丙交酯一点也没蒸馏到体系之外去。
接着将反应温度上升到150-160℃，反应压力在大约6小时内从400mmHg缓缓下降直到15-20mmHg(降压速度1mmHg/分)。在该种降压速度条件下，除去了副产水，但丙交酯一点也没除去。其后，保持15-20mmHg的压力，继续反应6小时(第二加热工序)。
接下来在30分钟内降压力降到1-3mmHg，在160℃的反应温度下持续5小时的反应(第三加热工序)。
上述反应终止后，分析反应生成物，结果得到平均聚合度为3-21的环状寡聚物6.80g(收率85％)。
合成例2中所得反应生成物的MS图谱如图2所示。另外，合成例2中所得反应生成物的NMR全图如图3所示，图3的部分放大图如图4及图5所示。
合成例3乳酸寡聚物混合物(以下称作X03)的制备合成例3的反应图如下所示
二异丙基氨基锂(LDA)
氮气氛围下，0℃，将正丁基锂(1.6M己烷溶液)0.63mL(1mmol)加入到二异丙基胺0.101g(1mmol)的5mL THF溶液中，搅拌10分钟，形成二异丙基氨基锂(LDA)后，加入L-(-)丙交酯0.577g(4mmol)的4mL THF溶液，搅拌15分钟进行反应。向该反应混合物中加入饱和的氯化铵水溶液20mL，处理反应，再加入10mL水。用THF(50mL)进行5次抽提，用无水硫酸钠干燥有机层。过滤去除无水硫酸钠后，减压浓缩有机溶剂，得到0.53g粗生成物。向所得粗生成物中加入6mL醚，在超声波洗涤器中浸渍10分钟，过滤，得到熔点125-129℃的白色固体生成物0.39g。
所得生成物的物理特性数据示于图6-12中。从图6-图12所示的FABMS及NMR数据可以确认固体生成物中存在3-21聚体的环状乳酸寡聚物和3-27聚体的链状乳酸寡聚物。
试验例1(A)材料与方法(1)实验动物与肿瘤细胞的移植在9周龄雌性小鼠(C57BL/6N)的右大腿肌肉内移植1×104个Lewis肺癌细胞。
(2)被检物质的施用将小鼠分成对照组(溶剂施用组)、X01施用组、X02施用组及X03施用组。X03经口施用或腹腔施用，经口施用时给予0.1％粉末混饵饲料，腹腔施用时1.0mg/只，隔日施用。从移植后第二天开始施用，一直到第17-19天实施安乐死。
(3)组织学检测从摘出的肿瘤组织中取出中心部的海绵状组织后，细切组织片，经固定、脱水后，包埋到亲水性甲基丙烯酸树脂中。从包埋的组织块儿制作切片，H-E染色，进行观察。
(B)结果与结论(1)肿瘤重量肿瘤重量的测定结果如图13所示。经口施用X03时与腹腔施用X02时同样可明显看到肿瘤组织的增殖抑制效果(图13)。另一方面，经口施用及腹腔施用X01时，肿瘤自身的重量无显著性差异，海绵状组织显著性增加。
(2)肺转移集落和肿瘤重量肺转移集落是从直径2mm以上大的集落到针尖大小的微小集落。随着集落数的增加有巨大集落增加的趋势。集落总数与肿瘤重量间的关系如图15所示。集落数显著性减少的是X01的4mg腹腔施用组、X02的1mg腹腔施用组、及X03的1mg腹腔施用组与经口施用组(0.1％)。可明显看到肿瘤重量抑制的是X02及X03施用组，X01施用组未见到。
(3)总结将嗜中性粒细胞的观察结果添加到以上结果后如表1所示。与对照相比，有效果的标为○，其中效果特别显著的标为◎，不太有效果的标为△，完全无效的标为×。X03的嗜中性粒细胞浸润到肿瘤组织中、肺转移抑制效果最显著。
表1
产业上利用的可能性通过本发明，提供新型的抗肿瘤剂及利用它的饮食品成为可能。另外，由于本发明中作为有效成分应用的聚乳酸混合物是生物体成分来源的乳酸的低缩合体，所以生物体适应性高，副作用少。
权利要求
1.抗肿瘤剂，它包含在下面通式(3)Me-N(R1)(R2) (3)(式中Me代表碱金属，R1和R2分别独立地代表脂肪族基团或芳香族基团)代表的化合物的存在下聚合丙交酯而形成的、下面通式(1)或(2)代表的链状和环状乳酸寡聚物混合物 (式中m表示1-30的整数，n表示1-30的整数)。
2.权利要求1所述的抗肿瘤剂，其中通式(3)中Me为锂。
3.权利要求1或2所述的抗肿瘤剂，其中通式(3)中R1和R2分别独立地为碳数1-6的烷基。
4.权利要求1-3中任一项所述的抗肿瘤剂，其中通式(3)中Me为锂，R1和R2为异丙基。
5.权利要求1-4中任一项所述的抗肿瘤剂，其中通式(1)中m为1-19的整数。
6.权利要求1-5中任一项所述的抗肿瘤剂，其中通式(2)中n为1-25的整数。
7.饮食品，它包含权利要求1-6任一项所述的抗肿瘤剂。
全文摘要
本发明的目的是，通过评价在特定的胺化合物存在下聚合丙交酯而形成的聚乳酸混合物的抗肿瘤作用而提供新型的抗肿瘤剂。根据本发明，抗肿瘤剂包含在下面通式Me－N(R
文档编号A61K31/365GK1703230SQ0282681
公开日2005年11月30日 申请日期2002年11月5日 优先权日2001年11月6日
发明者长户康和, 高田繁生, 村山千惠子, 渡边干夫, 村上正裕 申请人:天藤制药株式会社