含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物的保健食品的制作方法

专利名称：含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物的保健食品的制作方法
技术领域：
本发明属于保健品领域。
文献Walter Karrerr，Birkhauser Verlag，Bassel undstuttgart(1958)，P.652，NO1640公开了二氢杨梅素的结构式 但是没有对二氢杨梅素的活性进行研究。杨梅素是一种已知的化合物，其结构式是 。迄今为止没有人公开过含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物及其用途。
本发明的目的是提供一种新的组合物，其含有二氢杨梅素和杨梅素，其中二氢杨梅素含量是20％至98％重量比，杨梅素含量是2％至80％重量比。本发明组合物中还可以含有一种或几种选自下面的成分杨梅甙，没食子酸和/或茶多酚。杨梅甙的含量优选占二氢杨梅素和杨梅素总重量的0-50wt％，没食子酸的含量优选是占二氧杨梅素和杨梅素总重量的0-50wt％，茶多酚的含量优选是占二氢杨梅素和杨梅素总重量的0-50wt％。
本申请人令人惊奇地发现含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在保健品领域具有广泛的用途。
本发明的含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物具有降血糖和降血脂作用，具有预防和/或恢复酒精性肝损伤的功能，具有保肝护肝，增强免疫系统免疫力的功能，可以用作食品添加剂，做为一种配料制作各种馒头、元宵、饼、油条、面条、面点、糕点、饼干、面包、米饭、火腿肠等各类主食、做为一种配料制作具有各种不同口味的饮料、雪糕、冰淇淋等各种液成食品，制备各种保健食品和饮料。
本发明的另一个目的是提供制备本发明含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物的方法。本发明的组合物可以通过将所述组分单体按比例混合制备，也可以从蛇葡萄属植物中提取。所述蛇葡萄属植物包括粤蛇葡萄，栋叶玉葡萄，显齿蛇葡萄，大叶蛇葡萄，白蔹，东北蛇葡萄和山葡萄。所述提取方法可以是通过各种溶剂(水和/或有机溶剂)煎煮葡萄科植物，煎煮一次或多次，煎煮液经浓缩冷却，静置过夜，检测沉淀与上清的药效成分，取具有活性的沉淀和/或经进一步硅胶吸附后得到本发明组合物。煎煮所用的溶剂优选水，醇类，酯类，酮类，醚类和强极性有机溶剂，更优选低级链烷醇，低级脂肪酸酯，具有3-12个碳原子的酮和醚和/或水，最优选甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，正丁醇，异丁醇，仲丁醇，叔丁醇，乙酸乙酯，乙酸甲酯，甲酸乙酯，丙酮，甲基乙基酮，乙醚，甲基乙基醚，甲基叔丁基醚，二氯甲烷，氯仿，四氯化碳，二甲亚砜，N，N-二甲基甲酰胺和/或水等等。分离使用的吸附剂可以是硅胶。
本发明的含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物可以作为添加剂加到各种类型的食品中，制成保健食品，含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物的添加量优选是食品总重量的0.5％-45wt％。饮料中含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物含量可以是0.5-53％w/v(重量体积百分比(克/升)，下文相同)，优选是2％w/v至含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在各种饮料中的溶解饱和度的量。可以直接将所述量的所述组合物加到饮料中搅拌均匀，制得含有蛇葡萄素作为添加剂的饮料。
通过下面的实施例详细说明本发明。但是应该理解这些实施例只是说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的范围。
实施例1从二氢杨梅素和杨梅素晶体制备本发明组合物取二氢杨梅素80g，杨梅素20g，上述组分在混合机中混合后得混合物。或者取二氢杨梅素98g，杨梅素2g，上述组分在混合机中混合后得混合物。或者取二氢杨梅素20g，杨梅素80g，上述组分在混合机中混合后得混合物。
实施例2从二氢杨梅素和杨梅素晶体制备本发明组合物取二氢杨梅素20g，杨梅素80g，杨梅甙2.5g，没食子酸2.5g，茶多酚2.5g，上述组分在混合机中混合得混合物。或者取二氢杨梅素98g，杨梅素2g，杨梅甙2.5g，没食子酸2.5g，茶多酚2.5g，上述组分在混合机中混合得混合物。或者取二氢杨梅素85g，杨梅素15g，杨梅甙25g，没食子酸2g，上述组分在混合机中混合得混合物。或者取二氢杨梅素50g，杨梅素50g，杨梅甙25g，茶多酚2.5g，上述组分在混合机中混合得混合物。或者取二氢杨梅素70g，杨梅素30g，杨梅甙5g，上述组分在混合机中混合得混合物。
实施例3从二氢杨梅素和杨梅素晶体制备本发明组合物分别取实施例1的第一种组合物(或实施例2的第三种组合物)30g，乳糖53g，羧甲基纤维素钠1.5g，硬脂酸镁0.5g，50％乙醇5ml，上述组分在混合机中混合后压制成片。
实施例4从二氢杨梅素和杨梅素晶体制备本发明组合物取二氢杨梅素115g，杨梅素15g，糖粉345g，糊精145g，乙醇5ml，上述组分混合后干燥，得到冲剂。
实施例5从显齿蛇葡萄植物制备本发明组合物取显齿蛇葡萄干燥嫩茎叶2kg，用95％乙醇(医用乙醇)回流提取两次，每次2小时，过滤，合并滤液，蒸发至干，加入1200毫升85℃热水，使浸膏充分溶解，滤去黑色不溶物，滤液中加入硅胶(100目)200g，将滤液加热至60℃，乘热过滤，将滤液冷却至室温，沉淀，静置过夜，得到黄色沉淀，产率11.2％。其中二氢杨梅素含量74.8％重量比，杨梅素含量21.1％重量比，杨梅甙的含量是2.8％重量比，没食子酸的含量是1.3％重量比。薄层色谱分析用聚酰胺薄层层析，规格8×8cm，展开剂甲醇，显色剂4％三氯化铁-乙醇溶液，Rf没食子酸＝0.72，Rf杨梅甙＝0.54，Rf二氢杨梅素＝0.50，Rf杨梅素＝0.21。
或者取显齿蛇葡萄干燥嫩茎叶2kg，用95％乙醇(医用乙醇)回流提取两次，每次2小时，过滤，合并滤液，蒸发至干，加入1200毫升85℃热水，使浸膏充分溶解，滤去黑色不溶物，滤液用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并乙酸乙酯溶液，蒸发至干，得到黄色沉淀，产率10.25％。其中二氢杨梅素含量76％重量比，杨梅素含量18％重量比，杨梅甙的含量是3.0％重量比，没食子酸的含量是2％重量比，其余为显齿蛇葡萄植物中Rf5＝0.41的成分。薄层色谱分析用聚酰胺薄层层析，规格8×8cm，展开剂甲醇，显色剂4％三氯化铁-乙醇溶液，Rf没食子酸＝0.72，Rf杨梅甙＝0.54，Rf二氢杨梅素＝0.50，Rf杨梅素＝0.21，Rf5＝0.41。
实施例6从东北蛇葡萄植物制备本发明组合物室温下，将收集来的东北蛇葡萄1000克洗去尘土，加入4000毫升水，超声提取0.5小时，过滤，残渣再加入1000毫升丙醇，再超声提取0.5小时，再过滤，滤液合并，浓缩至2毫升，加入500毫升100℃热水，冷却到60℃，静置，过滤，。滤液用硅胶(100目)100g吸附，将滤液加热至70℃，乘热过滤，将滤液冷却至室温，沉淀，静置过夜，得到黄色沉淀，产率10.3％。其中二氢杨梅素含量58％重量比，杨梅素含量14％重量比，杨梅甙的含量是1.4％重量比，没食子酸的含量是1.7％重量比，其余为东北蛇葡萄植物中Rf5＝0.43的成分。薄层色谱分析用聚酰胺薄层层析，规格8×8cm，展开剂甲醇，显色剂4％三氯化铁-乙醇溶液，Rf没食子酸＝0.76，Rf杨梅甙＝0.55，Rf二氢杨梅素＝0.54，Rf杨梅素＝0.22，Rf5＝0.43。
实例7本发明的含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物降血糖的试验1.材料与方法
1.1.受试物实施例5获得的第一种组合物1.2.试验动物和检测条件选用健康清洁级雌性昆明种小鼠，体重24±2g，动物饲料执行标准GB14924-94。检测环境条件，温度范围20-25℃，相对湿度范围40-70％。
1.3.剂量选择试验分正常动物和高血糖模型动物两批进行，各设1个对照组(蒸馏水)和泽生牌血纯片0.25、0.50、1.50g/kg剂量组，分别相当于人推荐摄入量的5、10和30倍，灌胃量均为0.1ml/10g。
1.4.主要仪器与试剂四氧嘧啶(Alloxan)Sigma公司；50％葡萄糖注射液盐城新曹制药厂。
SUPER GLUCOCARD II GT-1640型超级血糖测定仪日本京者第一科学株式会社生产GLUCOCARD血糖试纸日本京者第一科学株式会社生产。
1.5.实验方法1.5.1.正常动物禁食5小时后，取小鼠测血糖。筛检空腹血糖在正常范围内的小鼠40只，按血糖水平随机分为四组，每组10只，分别为正常对照组和样品各剂量组(组间差不大于1.1mmol/L)。
1.5.2.高血糖模型动物严格禁食24小时后，小鼠尾静脉注射四氧嘧啶50mg/kgBW，6天后禁食5小时，测血糖。筛检空腹血糖值＞10mmol/L的小鼠40办，按血糖水平随机分为四组，每组10只，分别为模型对照组和样品各剂量组(组间差不大于1.1mmol/L)。
1.5.3.空腹血糖和糖耐量的测定按设计剂量对小鼠连续灌胃给受试物30天，然后禁食5小时，给予葡萄糖1.5g/kgBW灌胃，于0、0.5、2.0小时三时相分别测定血糖值。
1.6.统计方法全部实验数据采用SPSS/PC软件包(单因素方差分析)在微机上处理。
2.结果2.1.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对正常小鼠体重的影响表1 各组正常小鼠的初始体重、中期体重、结束体重组别 初始体重 中期体重 结束体重动物数 体重(g)动物数 体重(g)动物数 体重(g)正常对照 10 23.4±1.0 10 30.5±1.5 10 32.4±1.6受 0.25g/kg 10 23.7±1.0 10 31.3±1.3 10 33.0±1.7试 0.50g/kg 10 23.6±1.1 10 30.8±1.7 10 32.2±1.8物 1.50g/kg 10 23.6±1.3 10 31.0±1.4 10 33.7±1.7F值 0.115 0.475 0.353P值 0.951 0.701 0.787注受试物各剂量组小鼠体重在各试验期和正常对照组比较，差异均无显著意义(方差分析，P＞0.05)
2.2.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对正常小鼠空腹血糖的影响表2 含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对正常小鼠空腹血糖的影响动物数 空腹血糖值(mmol/L)组别 差值(只)试验前 试验后正常对照 10 4.7±0.5 4.6±0.7 0.1±06受0.25g/kg10 4.4±0.7 4.3±0.8 0.1±1.2试0.50g/kg10 4.6±0.9 4.4±0.9 0.2±1.0物1.50g/kg10 4.5±0.8 4.5±0.8 0.0±0.5F值 0.3880.302 0.099P值 0.7620.82 0.960注受试物各剂量组空腹血糖值和正常对照组比较，差异均无显著性意义(方差分析，P＞0.05)。
2.3.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对正常小鼠餐后血糖的影响表3 二氢杨梅素和杨梅素的组合物对正常小鼠餐后血糖的影响组别 动物数 葡萄糖0h血糖值(mmol/L)(只) (g/kgBW)0.5h 2h正常对照 10 1.5 4.6±0.7 10.4±1.25.5±0.7受 0.25g/kg 10 1.5 4.3±0.8 10.8±1.05.2±1.0试 0.50g/kg 10 1.5 4.4±0.9 10.5±1.65.0±1.2物 1.50g/kg 10 1.5 4.5±0.8 10.5±1.45.2±1.9F值 0.302 0.2300.529P值 0.824 0.8750.665注受试物各剂量组餐后血糖值和正常对照组比较，差异均无显著性意义(方差分析，P＞0.05)。
2.4.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对正常小鼠糖耐量的影响表4 二氢杨梅素和杨梅素的组合物对正常小鼠糖耐量的影响组别 动物数 血糖升高及降低幅度(mmol/L)(只)0.5h-0h 0.5h-2h正常对照 10 5.8±0.94.8±0.9受 0.25g/kg 10 6.5±0.65.6±1.2试 0.50g/kg 10 6.1±1.05.5±1.0物 1.50g/kg 10 6.0±1.45.3±1.3F值 0.998 1.018P值 0.405 0.396注受试物各剂量组糖耐量值和正常对照组比较，差异均无显著性意义(方差分析，P＞0.05)。
2.5.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对引起的高血糖小鼠体重的影响表5 各组高血糖模型小鼠的初始体重、中期体重、结束体重组别 初始体重中期体重 结束体重动物数 体重(g)动物数体重(g)动物数 体重(g)正常对照 10 24.3±1.3 1030.7±2.0 10 31.2±1.9受 0.25g/kg 10 24.5±2.7 1031.8±2.2 10 32.4±2.8试 0.50g/kg 10 24.0±1.4 1031.7±2.9 10 32.6±2.9物 1.50g/kg 10 23.8±1.5 1030.9±1.9 10 30.8±1.7F值0.2710.576 1.418P值0.8460.634 0.253注受试物各剂量组各阶段体重和模型对照组比较，差异均无显著性意义(方差分析，P＞0.05)。
2.6.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对引起的高血糖小鼠空腹血糖的影响表6 二氢杨梅素和杨梅素的组合物对高血糖模型小鼠空腹血糖的影响动物数 空腹血糖值(mmol/L)组别 差值(只) 试验前试验后正常对照 1022.9±3.3 20.4±5.1 2.5±4.2受0.25g/kg1022.9±3.0 13.2±4.1* 9.7±3.7*试0.50g/kg1022.4±2.5 15.3±6.4 7.2±4.7物1.50g/kg1022.5±3.5 17.1±6.3 5.4±6.1F值 0.068 3.058 4.137P值 0.977 0.041 0.0123注与模型对照组比较，*P＞0.05(q检验)受试物低剂量组试验后空腹血糖值及前后空腹血糖差值与模型对照组比较，差异均有显著(方差分析，P＞0.05)。
2.7.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对引起的高血糖小鼠餐后血糖的影响表7 二氢杨梅素和杨梅素的组合物对高血糖型小鼠餐后血糖的影响组别 动物数 葡萄糖0h血糖值(mmol/L)(只) (g/kgBW)0.5h2h正常对照 10 1.5 20.4±5.1 31.2±2.7 24.7±3.7受 0.25g/kg 10 1.5 13.2±4.1*26.4±4.2 16.5±6.6*试 0.50g/kg 10 1.5 15.3±6.4 27.1±5.7 16.9±7.2*物 1.50g/kg 10 1.5 17.1±6.3 28.4±4.3 20.2±7.2F值3.058 2.393 3.536P值0.041 0.085 0.024注受试物低剂组餐后0h血糖值和低中剂量组餐后2h血糖值与模型对照组比较，差异均有显著(方差分析，P＞0.05)。
2.8.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对引起的高血糖小鼠糖耐量的影响表8 二氢杨梅素和杨梅素的组合物对高血糖模型小鼠糖耐量的影响组别 动物数 血糖升高及降低幅度(mmol/L)(只)0.5h-0h 0.5h-2h正常对照 10 10.8±3.2 6.5±2.9受 0.25g/kg 10 13.3±1.7 9.9±3.0试 0.50g/kg 10 11.8±3.6 10.1±3.7物 1.50g/kg 10 11.3±2.9 8.3±4.2F值 1.301 2.255P值 0.289 0.099注受试物各剂量组糖耐量值和模型对照组比较，差异均有显著(方差分析，P＞0.05)。
实验结果表明，二氢杨梅素和杨梅素的组合物具有调节血糖作用。
用实施例1的第一种组合物、实施例2的第三种组合物、实施例5的第二种组合物或实施例6的组合物进行相同的试验，得到了大致相同的结果。
实施例8本发明的含有一氢杨梅素和杨梅素的组合物降血脂的试验将动物随机分为4组，正常对照组、阳性对照组、模型对照组、提取液组。每组10只小鼠，一日一次，连续给药10天，正常对照组不给任何药。其余各组小鼠均给高脂乳剂0.5ml/只，形成实验性高血脂，于10天用药后禁食过夜，次日从小鼠眼眶取静脉血，按酶法检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。结果表明，模型对照组血清TC、TG值明显升高，HDL-C值下降，与模型对照比较，实施例5的第一种组合物组能明显降低血清TC、TG值，还使HDL-C略有升高，说明此提取物能抑制高脂乳剂引起的小鼠血脂升高，具有降脂作用。用实施例1的第一种组合物、实施例2的第三种组合物、实施例5的第二种组合物或实施例6的组合物进行相同的试验，得到相同的结果。
1.材料和方法1.1.受试物实施例5获得的第一种组合物，将受试物用蒸馏水配制成所需浓度的浑浊液供试验用。
1.2.实验动物SPF级Wistar大鼠，体重170-190g，雌性，共55只(5只备用)。实验温度23-25℃，相对湿度65-70％。
1.3.饲料1.3.1.普通基础饲料配方略。(湖北省预防医学科学院实验动物中心配制的Wistar纯鼠料)。
1.4.剂量分组实验分为五个组，即正常对照组、高脂模型对照组和受试物低、中、高三个剂量组，剂量分别为0.5、1.0、1.5g/kg.bw，相当于生产厂家推荐人体日摄入量3g/60kg.bw的10、20、30倍。
1.5.实验方法大鼠适应性饲养3天后开始实验。取大鼠尾血，测定血清总胆固醇(TCO)、甘油三脂(TGO)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c0)基础值。根据TCO水平，将大鼠随机分成五组，每组10只动物，即低、中、高剂量组，正常对照组和高脂模型对照组。除正常对照组给予基础饲料外，其余各组均给予高脂饲料。三个受试物剂量组按1.0ml/100g.bw的容量经口灌胃给予，正常对照组和高脂模型对照组自由饮水进食。连续给予30天，于灌胃第30天检测TC，TG，HDL-C值。
1.6.主要仪器与试剂SABA-18型全自动生化分析仪(意大利产)，标准质控血清及相应试剂盒均由上海复星长征医学科学有限公司生产。
1.7.数据处理采用STATA统计软件进行统计分析2.结果2.1.第一种组合物对高脂模型动物体重的影响从表9可见，与模型对照组比较，低、中、高剂量组在第四周时大鼠体重均低于模型对照组，低、中、高剂量组与模型对照组比较差异有显著性(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)。与正常对照组比较，低、中、高剂量组第四周体重均高于正常对照组，但经统计学分析，差异无显著性。
表9 含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对高血脂模型大鼠体重的影响(g，x±s)剂量 动物数 体重g/kg.bw (只) 始重第一周第二周第三周终重181.4± 202.2±正常对照 10 219.6±4.7226.2±3.7230.7±4.0**2.8 6.2181.7± 208.7±模型对照 10 224.5±4.4231.4±3.5237.6±3.73.5 2.6182.4± 208.1±0.5 10 221.7±3.4227.9±3.4233.6±3.0**4.1 2.6183.1± 207.0±1.0 10 221.5±2.4227.7±2.0233.2±2.1**2.8 2.5182.3± 208.3±1.5 10 220.3±3.2226.2±3.8232.7±3.1**2.5 2.8**与模型对照组比较P＜0.012.2.第一种组合物对大鼠总胆固醇含量的影响从表10可见，与模型对照组比较，实验结束时中、高剂量组总胆固醇含量在实验期间下降明显，经统计学分析，差异有显著性(p＜0.05、P＜0.01)。
表10 含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对大鼠总胆固醇含量的影响(mmol/L，x±s)剂量 动物数总胆固醇g/kg.bw(只) 试验前 P值 试验后P值
1.80±正常对照 100.786 1.81±0.16 0.0000.071.81±模型对照 10- 3.72±0.34 -0.111.83±0.5 100.803 3.35±0.55 0.2690.101.82±1.0 100.928 3.10±0.54* 0.0100.101.84±1.5 100.634 2.86±0.57** 0.0010.11*与模型对照组比较P＜0.05，**与模型对照组比较P＜0.012.3.第一种组合物对大鼠甘油三酯含量的影响从表11可见，与模型对照组比较，试验结束时低、中、高剂量组甘油三酯含量下降明显，经统计学分析，差异有显著性(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01)。
表11含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对大鼠甘油三酯含量的影响(mmol/L，x±s)剂量 动物数 总胆固醇g/kg.bw(只)试验前 P值 试验后 P值1.24±正常对照 10 0.8281.29±0.11 0.0000.251.26±模型对照 10 -2.30±0.47 -0.271.23±0.510 0.7881.90±0.29* 0.0110.191.24±1.010 0.8201.89±0.24** 0.0090.181.21±1.510 0.5841.86±0.12** 0.0080.15*与模型对照组比较P＜0.05，**与模型对照组比较P＜0.012.4.一种组合物对大鼠高密度脂蛋白胆固醇含量的影响从表12可见，与模型对照组比较，低、中、高剂量组对高密度脂蛋白胆固醇有升高作用，经统计学分析，差异有显著性(P＜0.05)。
表12 含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对大鼠高密度脂蛋白胆固醇含量的影响(mmol/L，x±s)剂量 动物数 高密度脂蛋白胆固醇g/kg.bw (只) 试验前 P值 试验后 P值1.13±正常对照 100.872 1.06±0.11 0.0000.121.12±模型对照 10- 0.84±0.11 -0.181.10±0.5 100.644 0.94±0.10* 0.0270.081.13±1.0 100.841 0.93±0.07* 0.0420.091.14±1.5 100.733 0.95±0.08* 0.0150.05*与模型对照组比较P＜0.052.5.第一种组合物对大鼠血脂水平的影响本实验方法为高脂饲料与受试物同时给予，属预防性，故TG、TC下降及HDL-c上升值均与高脂模型对照组比较。由表13可见，中、高剂量组总胆固醇含量下降幅度分别为16.7％、23.1％，低、中、高剂量组甘油三酯含量下降幅度分别为17.4％、17.8％、19.1％，低、中、高剂量组高密度脂蛋白胆固醇含量升高值为4.64、5.03、4.26mg/dl。
表13 含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对大鼠血脂水平的影响剂量 动物数 TC TGHDL-Cg/kg.bw(只) (％)(％) (mg/dl)0.510 10.317.4 4.641.010 16.717.8 5.031.510 23.119.1 4.26判断标准下降＞10％ 下降＞15％升高4mg/dl注HDL-c升高值(mg/dl)是mmol/L×38.7＝mg/dl换算结果用实施例1的第一种组合物、实施例2的第三种组合物、实施例5的第二种组合物或实施例6的组合物进行相同的试验，得到了大致相同的结果。
实施例9本发明含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物预防和/或恢复酒精性肝损伤的功能1、材料与方法1.1试品本发明含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物，见实施例5的第一种组合物。
1.2实验动物成年雄性小鼠(18-22克)，每组10只。
1.3实验方法和步骤1.3.1剂量分组及受试样品给予时间实验设空白对照组、模型对照组和受试品三个剂量组(分别为10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg，分别用无水乙醇配制，浓度分别为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml)，用无水乙醇(分析纯)造成肝损伤模型，无水乙醇浓度为50％(以蒸馏水稀释)，小鼠灌胃12-14ml/kgBW(折合乙醇的剂量为6000-7000mg/kgBW)。受试样品给予时间为30天。
1.3.2给予受试样品的途径经口灌胃给予受试样品，并记录每只动物的饲料摄入量或饮水量。
1.3.3实验步骤受试品三个剂量组每日经口灌胃给予受试样品的乙醇溶液0.2ml，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水。动物每周称重两次。给予受试样品结束时将模型对照组及各样品组一次灌胃给予50％乙醇12ml/kgBW，空白对照组给蒸馏水，禁食15小时处死动物，进行各项指标的检测及病理组织学检查。
1.3.4检测指标肝组织中丙二醛(MDA) 还原型谷胱甘肽(GSH)甘油三酯(TG)的含量1.4肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)测定方法1.4.1原理MDA(malondiadehycle)是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，检测其含量可间接估计脂质过氧化的程度，MDA与硫代巴比妥酸在酸性条件下共热，形成粉红色复合物，吸收峰在535nm，具此可测得MDA的含量。
1.4.2仪器与试剂仪品721分光光度计、微量加样品、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器试剂0.2M乙酸盐缓冲液PH3.50.2M乙酸溶液 185ml0.2M乙酸钠溶液15ml1mmol/L四乙氧基丙烷(贮备液，4℃保存3个月)，临用前用水稀释成40nmol/ml8.1％十二烷基硫酸钠SDS0.8％硫代巴比妥酸TBA
0.2M磷酸盐缓冲液PH7.40.2M磷酸氢二钠1920ml0.2M磷酸二氢钾480ml1.4.3实验步骤1.4.3.1样品制备组织匀浆样品取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以2000r/min匀将10s，间歇30s，反复进行3次，制成5％组织匀将(W/V)，3000r/min离心5~10min，取上清液待测。
1.4.3.2样品测定表14试剂 空白管 样品管 标准管5％组织匀浆 0.1ml40nmol/ml四乙氧基丙烷 0.1ml8.1％SDS 0.2ml0.2ml 0.2ml0.2M 乙酸盐缓冲液 1.5ml1.5ml 1.5ml0.8％TBA 1.5ml1.5ml 1.5mlH2O0.8ml0.7ml 0.7ml混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色1.4.3.3计算 A空白管吸光度B样品荧吸光度F四乙氧基丙烷吸光度C四乙氧基丙烷浓度K稀释倍数1.4.3.4数据处理及结果判定数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值/F0.05，结论各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
结果判定在模型成立的前提下，受试样品组的MDA含量与模型对照组比较，差异有显著性，判定该指标结果阳性。
1.5.肝匀浆还原型谷胱甘肽(GSH)测定方法1.5.1原理GSH和5，5′-二硫对硝基甲酸(DTNB)反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基甲酸阳离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算GSH的含量。
1.5.2试剂0.9％生理盐水4％磺基水杨酸溶液0.1mol/L PBS溶液(pH＝8.0)Na2HPO413.452gKH2PO40.722g加蒸馏水至1000ml0.004％DTNB溶液称取DTNB 40mg溶于1000ml的0.1mol/L PBS溶液(pH＝8.0)中。
叠氮纳缓冲液NaN316.25mgEDTA-Na27.44mgNa2HPO41.732gNaH2PO41.076g加蒸馏水至1000ml，用少量HCl、NaOH调pH7.0，4℃保存。
标准溶液称取还原型GSH15.4mg，加叠氮纳缓冲液至50ml，终浓度为1mmol/L1.5.3方法1.5.3.1样品测定取肝脏0.5g加生理盐水5ml充分研磨成细浆(10％肝匀浆)，混匀后取浆液0.5ml加4％磺基水杨酸0.5ml混匀，室温下3000rpm离心10分钟，取上清液即为样品。
表15测定管 空白管样品 0.5ml -4％磺基水杨酸- 0.5mlDTNB 4.5ml 4.5ml混匀，室温放置10分钟后，412nm处测定吸光度。
1.5.3.2标准曲线表161 2 3 4 5 6Immol/L(ml) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25生理盐水(ml)0.50 0.45 0.40 0.35 0.20 0.25DTNB(ml) 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50
GSH量(μmol/L)01002003004005001.5.3.3计算样品GSH含量(μmol/g肝组织)＝对应曲线浓度值((μmol/L)÷50g/L1.5.4数据处理和结果判定数据采用方差分析，但需方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论各组均数间差异无显著性；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
结果判定在模型成立的前提下，受试样品组的还原型GSH含量与模型对照组比较，差异有显著性，判定该指标结果阳性。
1.6肝匀浆中甘油三脂(TG)测定方法1.6.1测定方法采用甘油三脂测定试剂盒(甘油磷酸氧化酶过氧化物酶法)测定10％肝匀浆中的甘油三脂含量。与血清甘油三脂测定方法相同，以等量10％肝匀浆替代血清按操作说明进行操作，测定结果以mmol/g肝重表示。
1.6.2数据处理和结果判定数据采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≥0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计，对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
结果判定在模型成立的前提下，受试样品组的TG与模型对照组比较，差异有显著性，判定该指标结果阳性。
1.7肝脏病理组织学变化，诊断标准和结果判定1.7.1实验材料从肝左叶中部做横切面取材，冰冻切片，苏丹III染色。
1.7.2镜检从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用40倍物镜连续观察整个组织切片。主要观察脂滴在肝脏的分布、范围和面积。
1.7.3评分标准肝细胞内脂滴散在，稀少 0分含脂滴的肝细胞不超过1/4 1分含脂滴的肝细胞不超过1/2 2分含脂滴的肝细胞不超过3/4 3分肝组织几乎被脂滴代替4分1.7.4数据处理和结果判定采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差剂性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论各组均数间差异无显著性F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变是转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
结果判定在模型成立的前提下，模型对照组与受试样品任何一个剂量组之间，脂肪变性减轻，有统计学上的差异，可判断为阳性结果。
1.8结果判定满足任一条件，可判定受试样品具有对酒精性肝扣内务有辅助保护作用1.8.1肝脏MDA、还原型GSH和TG三项检测指标结果阳性。
1.8.2.肝脏MDA、还原型GSH和TG三项指标中任两项指标阳性和病理组织学检查结果阳性。
2.结果2.1肝匀浆中过氧化脂质降解产物丙二醛(MDA)由表17可知，损伤对照组与阴性对照组相比，肝组织中MDA含量明显升高，差异有极显著性(P＜0.01)；受试物各剂量组MDA含量比损伤对照组降低，且有极显著性差异(P＜0.01)。说明受试物可降低肝组织中MDA含量。
2.2肝匀浆还原型谷胱甘肽(GSH)由表17可知，损伤对照组与阴性组相比GSH含量明显降低，差异有极显著性(P＜0.01)。受试物各剂量组GSH含量高于损伤对照组，差异有显著性(P＜0.01)。说明受试物可有效阻止GSH的耗竭。
2.3肝匀浆中甘油三脂(TG)由表17可知，损伤对照组与阴性对照比较，肝脏TG含量明显升高，差异有极显著性(P＜0.01)。受试物各剂量组TG含量明显低于损伤对照组，差异有显著性(P＜0.05)。说明受试物可降低肝脏中TG的含量。
表17 蛇葡萄素对丙二醛、还原型谷胱甘肽和甘油三脂的影响
2.4肝脏病理组织学检查取肝脏(左大叶)10％福尔马林固定，冰冻切片苏丹III脂肪染色，苏木精复染，封片，镜检，结果见表18。
1)阴性对照组动物有3例见肝细胞出现轻度脂肪变性。
2)损伤对照组动物肝细胞均出现弥漫性脂肪变性，脂滴分级为+++~++++级。
3)中、高剂量组肝细胞脂肪变性程度明显低于阳性对照组，且差异有显著性(P＜0.05)。低剂量组肝细胞脂肪变性程度与阳性对照组比较无显著性差异。
表18对肝脏脂滴分布的影响组别 动物数P值总积分(mg/kg)(只)阴性对照(0)103损伤对照(0)1039## ＜0.01低剂量(10) 1028中剂量(20) 1028* ＜0.05高剂量(40) 1026* ＜0.05与阴性对照组比较## P＜0.01；与损伤对照组比较*P＜0.05
3..结论试验结果表明，实施例5得到的第一种组合物可有效地阻止乙醇导致肝脏肝脏GSH耗竭和MDA升高，减轻肝细胞脂肪变性，具有预防乙醇性肝损伤功能。利用实施例6、实施例5的第二种组合物、实施例1的第一种组合物和实施例2的第三种组合物进行上述相同的试验，得到了大致相同的结果。
实施例10本发明的含有含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物增强免疫力的功能的试验1.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响1.1实验目的观察含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠吞噬功能的影响。
1.2受试药物名称含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物溶剂热双蒸水用量0.5ml/20g小鼠1.3对照样品联苯双酯；上海天平制药厂，沪卫药准字(1995)第3765号-0111.4动物小鼠，昆明种，雄性，19～21g。
鸡红细胞5％浓度1.5方法昆明种小鼠，随机分为5组，即对照组、含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物75、150、300mg/kg、联苯双酯150mg/kg，对照组给予生理盐水，给药组均口服给药，每日1次，共6次，末次给药同时腹腔注射0.5％水解乳蛋白1.5ml/只，24小时后腹腔注射5％鸡红细胞0.1ml，30分钟后断头放血，用生理盐水冲洗腹腔，收集腹腔巨噬细胞37℃孵育半小时，离心，沉淀物涂片，染色，油镜下计数细胞，以下列公式计算，并与对照组比较。

1.6结果结果见表19，含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物低、中、高剂量均能促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞及增加吞噬指数，联苯双酯150mg/kg剂量组也能促进小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能。
表19.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响 (±SD)
**P＜0.01与模型对照组比较2.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响2.1实验目的观察含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响。
2.2受试药物名称含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物溶剂热双蒸水用量0.5ml/20g小鼠2.3对照样品联苯双酯；上海天平制药厂，沪卫药准字(1995)第3765号-0112.4动物小鼠，C57BL/6，♂，19～21g。
2.5其他材料刀豆球蛋白(ConA)Sigma产品，50μg/ml浓度
3H-TdR上海原子核研究所，放射性浓度1mci/ml培养基RPMI-1640，内含15％小牛血清、巯基乙醇、Hepes等2.6方法C57BL/6小鼠，随机分为5组，即正常对照组、含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物75、150、300mg/kg、联苯双酯150mg/kg，每天口服给药1次，连续7天，给药结束后，处死动物无菌条件下取脾，计数脾细胞，并调整细胞浓度为1×107/ml，在96孔细胞培养板上每孔加细胞悬液100μl，ConA 50μl，和培养液，各组均设三复管，37℃，5％CO2条件下培养48小时，加入3H-TdR 0.5μci/孔，继续培养18小时，用多头细胞收集器收集细胞，在液闪仪上测CPM值，并与对照组比较，结果见表20。
2.7结果表20.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
*P＜0.05**P＜0.01与对照组比较结果表明，含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物有明显的促进小鼠脾淋巴细胞增殖的作用，并以低剂量作用较其它两组强。
用实施例1、实施例2和实施例6的组合物进行试验，得到了大致相同的试验结果，说明这些组合物都有增强免疫力的功能。
实施例11含有本发明的组合物的面条的制备取莜面200g、荞面100g、莞豆面50g和实施例5得到的第一种组合物(或实施例1或2的各种组合物)20g，水适量，混合，压制成面条。
实施例12含有本发明的组合物的面包的制备小麦粉300g，干酵母3.5g，砂糖10g，盐2g，温水200ml，紫苏油12g，实施例5得到的第一种组合物(或实施例1或2的各种组合物)25g，上述成分混合并烘制成面包。
实施例13含有本发明的组合物的方便面的制备小麦粉200kg，苯甲酸钠0.1kg，盐200g，温水100ml，紫苏油1kg，油10kg，Vc0.05Kg，Ve0.01Kg，实施例5得到的第一种组合物(或实施例1或2的各种组合物)6kg，上述成分混合并制成方便面。
实施例14含有本发明的组合物的蛋糕的制备富强粉190kg，白糖100kg，鸡蛋250kg，苯甲酸钠0.60kg，香油25kg，紫苏油5kg，油10kg，Vc0.1Kg，Ve0.09Kg，大豆磷脂0.2kg，实施例5得到的第一种组合物(或实施例1或2的各种组合物)300kg，上述成分混合并烘烤制成蛋糕。
实施例15含有本发明的组合物的饮料的制备将酸梅原汁20ml，用水200ml调兑成酸梅饮料，加入50g实施例5得到的第一种组合物(或实施例1或2的各种组合物)，搅拌均匀，得到保健饮料。该饮料中还可以通入二氧化碳气体适量。
权利要求
1.添加有含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物的保健食品，特征在于向各种面制，米制食品和各种饮料中添加含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物。
2.权利要求1的保健食品，特征在于其中所述含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物中含有20％至98％重量比的二氢杨梅素和2％至80％重量比的杨梅素。
3.权利要求1或2的保健食品，特征在于其中所述组合物还含有一种或几种选自下面的成分杨梅甙，没食子酸和/或茶多酚。
4.权利要求3的保健食品，特征在于其中杨梅甙的含量是二氢杨梅素和杨梅素总重量的0-50wt％，没食子酸的含量是二氢杨梅素和杨梅素总重量的0-50wt％，茶多酚的含量是二氢杨梅素和杨梅素总重量的0-50wt％。
5.权利要求1-4任一项的保健食品，特征在于其中所述组合物是从蛇葡萄属植物中提取的。
6.权利要求5的保健食品，特征在于其中所述蛇葡萄属植物包括粤蛇葡萄，栋叶玉葡萄，显齿蛇葡萄，大叶蛇葡萄，白蔹，东北蛇葡萄或山葡萄。
7.权利要求1-4任一项的保健食品，特征在于其中所述组合物是所述单体按照所述比例混合得到的。
8.权利要求1-7任一项的保健食品，特征在于其是面条，面包，方便面，糕点，或饼干。
9.权利要求1-7任一项的保健食品，特征在于其是饮料。
10.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物作为食品添加剂的用途。
11.权利要求8的用途，其中所述食品是面制食品。
12.权利要求8的用途，其中所述食品是饮料。
13.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤病的保健食品中的用途。
14.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在制备预防和/或治疗高血糖病的保健食品中的用途。
15.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在制备预防和/或治疗高血脂病的保健食品中的用途。
16.含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物在制备提高免疫力的保健食品中的用途。
全文摘要
本发明公开了添加有含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物作为食品添加剂的用途，其中所述含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物中二氢杨梅素含量是20％至98％重量比，杨梅素含量是2％至80％重量比。并且提供了添加有含有二氢杨梅素和杨梅素的组合物的各种保健食品和饮料。
文档编号A61P1/00GK1483327SQ03123889
公开日2004年3月24日 申请日期2003年5月30日 优先权日2003年5月30日
发明者任启生, 宋新荣 申请人:任启生, 宋新荣