内毒素结合的配体及其用途的制作方法

专利名称：内毒素结合的配体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及亲和配体和它们从各种流体如水、水溶液、血液、血浆、药物产品、抗生素、疫苗、蛋白质、核酸和其它生物产品中除去内毒素的用途。
背景技术：
内毒素是在革兰氏阴性菌如大肠杆菌的外膜中发现的脂多糖(LPS)(Raetz，Ann.Rev.Biochem.，1990，p.129，Vol.59)。LPS分子含有三个不同的化学区域，脂质A区，中心多糖区和O-抗原区。脂质A区由含磷酸基的葡糖胺二糖组成且被长链脂肪酸高度取代和认为决定了内毒素的毒性效果(Rietschel等，Cellular and Molecular Aspects ofEndotoxin Reaction，Ed.Nowotny，A.，Spitzner，J.J.and Ziegler，E.J.，1990，p15)。
由内毒素诱导的生物效果来自于免疫系统的激活，特别地单核细胞和巨噬细胞的激活，且极其多样，其中包括发烧、代谢破坏和毒脓性休克(Martich等，Immunobiology，1993，p.403，Vol.187)。由于内毒素潜在有害的效果，因此在生物衍生的产品和用于治疗用途的药物产品中内毒素的存在是主要关心的区域。尽管保持无菌过程可确保生物产品不含内毒素，但这通常不可能，特别地当生物产品在革兰氏阴性菌源如大肠杆菌中表达时。使内毒素失活的典型方法包括暴露于浓氢氧化钠(1M NaOH)和/或长期热处理(250℃)。然而，这种处理方法不可用于大多数生物产品。
已使用许多技术从生物产品中除去内毒素和包括超滤(Sweadner等，Appl.Environ.Microbiol.，1977，p.382，Vol.34；Li等，Biotechnol.Tech.，1998，p.119，Vol.12)、炭吸附(Nagaki等，Int.J.Artif.Organs.，1991，p.43，Vol.14)、尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法(Hou等，J.Parenter.Sci.Technol.，1990，Vol.44；Hou等，Biotechnol.Bioeng.，1990，p.315，Vol.12；Neidhardt等，J.Chromatogr.，1992，p.255，Vol.590)和亲和色谱法。所有这些技术显示出明显的缺点，特别是当应用到从治疗蛋白质和其它生物产品中除去内毒素上时。炭吸附和离子交换色谱降低蛋白质溶液中的内毒素含量，但它们还倾向于结合生物组分。
已使用亲和色谱法在固定的多粘菌素B上实现了内毒素的有效去除(Talmadge等，Chromatogr.，1989，p.175，Vol.476；Anspach等，J.Chromatogr.A，1995，p.81，Vol.711)。然而，对多粘菌素B沥滤液的潜在毒性的担心限制了它的应用。基于连接到固相基体上的二氨基烷烃和单氨基烷烃化合物的合成配体已用于从水溶液中除去内毒素，但仅显示出有限的能力结合内毒素(Hou等，Biochim.Biophys.Acta，1991，p.149，Vol.1073)。
J.Chromatography，248，401-408(1982)和262，193-198(1983)以及US-A-4381239公开了共价连接到固体基体上的组胺和其它芳族氮杂环。
US-A-5358933公开了细菌内毒素解毒和防止与治疗毒脓性休克用的合成肽。
发明概述本发明涉及一类新的合成亲和配体结构，其用于从含生物治疗产品的溶液中选择性捕获和除去内毒素。可通过下述通用结构(结构1和2)描述本发明的合成亲和配体-基体共轭物结构1
结构2 其中A表示任选取代的直链、支链或环状饱和烃链，和在各重复单元内的各A可以相同或不同；X1、X2和X3各自独立地表示氢原子或烷基取代基；n为2或更大；m为1或更大；和配体通过任选的间隔基臂连接到支持基体Z上。
特别地，结构2的共轭物可能是新的。
优选实施方案的说明具有结构1或2的多胺配体具有至少3个基本氮原子，和这些氮原子优选通过至少两个碳原子彼此隔开。氮原子可以是伯、仲、叔或季胺基，和在一对氮原子之间的插入碳原子可以是直链、支链或环状烃链。
作为实例，A可具有式-(CH2)x-CHR-(CH2)y-结构，其中x和y独立地为0、1或2，和R为H或C1-4烷基，例如氢、甲基、乙基、丙基或丁基。特别地，A可以是二价C1-4烷基，即甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，或1，4-环亚己基，例如衍生于反式-1，4-二氨基环己烷的1，4-环亚己基。更一般地，A可具有最多6-10个碳原子。
m和n各自优选为1、2、3或4。X可具有最多6或10个碳原子。
支持基体Z可以是粒状或非粒状、可溶或不可溶、多孔或非多孔的任何化合物或材料，其可用于固定内毒素亲和配体，形成内毒素配体-基体共轭物，从而提供从接触溶液中除去内毒素的方便方式。粒状支持基体的实例包括天然聚合物，如琼脂糖、糊精、纤维素或淀粉，合成聚合物和共聚物如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、全氟碳和聚甲基丙烯酸甲酯，和无机化合物如二氧化硅、玻璃、氧化铝和金属氧化物。可溶载体的实例包括糊精的聚合物、聚乙烯醇、聚乙二醇和水解淀粉。支持基体也可以是含上述聚合物和其它聚合物如硝基纤维素、聚醚砜和尼龙的膜或片材形式。
可通过使用各种活化剂，其中包括，但不限于溴化氰、表氯醇、1，4-丁二醇二缩水甘油醚、1，2，7，8-二环氧基辛烷、甲苯磺酰氯、tresylchloride、二乙烯基砜和氰尿酰氯，实现配体共价连接到支持基体Z上。
间隔基臂可以不存在。若存在的话，它可作为部分活化步骤引入，和优选由以下结构来表示-T-L-其中T表示氧原子、硫原子或基团N-R2，其中R2表示氢原子或含有1-6个碳原子的烷基；和L是含有2-20个碳原子的任选取代的烷基、烷基醚、烷基硫醚、烷基酯或酰胺键。
本发明特别优选的共轭物包括Z-(间隔基)-NH(CH2)2N[(CH2)2NH2]2(A)Z-(间隔基)-NH(CH2)2NH(CH2)2NH2(B)Z-(间隔基)-NH(CH2)2NH(CH2)2NH(CH2)2NH2(C)Z-(间隔基)-NH(CH2)2NH(CH2)3NH2(D)Z-(间隔基)-NH(CH2)3NH(CH2)3NH(CH2)3NH2(E)Z-(间隔基)-NH(CH2)3NH(CH2)2NH(CH2)3NH2(F)Z-(间隔基)-NH(CH2)2N[(CH2)3NH2]2(G)其中Z和(间隔基)具有与此前所述相同的含义。
在本发明的一个实施方案中，可通过将合适的多胺共价偶联到预活化的水不溶基体上，从而方便地制备本发明的亲和共轭物。例如，可根据以下所示的反应过程(过程1)，实现将多胺配体(A)偶联到表氯醇活化的琼脂糖基体上过程1 在Z和多胺配体之间的插入基团形成间隔基臂。
根据本发明的优选方面，从含内毒素的溶液中捕获和除去内毒素的方法包括优选在1.0-13.0的pH范围内，使如上所述的亲和共轭物与该溶液接触。这种溶液的实例包括流体如水、水溶液、血液、血浆、药物产品、抗生素、蛋白质、核酸和其它生物产品。本发明的内毒素结合的配体-基体共轭物的另一用途是用于从全血或血浆中体外除去内毒素。可通过使用重力或其它机械方式，在柱内填充共轭物，并使内毒素污染的溶液流过该柱，方便地使用内毒素结合的配体-基体共轭物。或者，可将该共轭物与含内毒素的溶液混合并以分批的方式使用。
在本发明另一实施方案中，可将该共轭物连接到多孔膜上并用作一次使用的可弃置过滤设备，供从溶液中选择除去内毒素。
在本发明另一实施方案中，本发明的内毒素结合配体可被连接到可溶聚合物或非聚合物载体如葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙二醇或水解淀粉上，例如用于内毒素的体内捕获和解毒。
已发现，本发明的共轭物高度有效，和在从抗菌素与蛋白质的缓冲和非缓冲溶液中除去内毒素方面具有选择性，同时证明对生物组分具有低的选择性。
下述实施例阐述本发明。实施例1-3示出了共轭物的制备，和实施例4-6示出了它们在内毒素去除上的用途。
实施例1第1阶段-表氯醇活化的PuraBead6XL的制备不含防腐剂的PuraBead6XL(200g沉降重量)、RO水(128ml)和10M氢氧化钠(3.2ml)的浆料与表氯醇(14.4ml)在40℃下反应1小时。用RO水(10×200ml等份)彻底洗涤环氧活化的PuraBead6XL，除去过量反应物，并立即在第2阶段中使用。
第2阶段-三(2-氨基乙基)胺-PuraBead6XL的制备将来自第1阶段的环氧活化的PuraBead6XL(200g沉降重量)等份地添加到三(2-氨基乙基)胺(15.97g，在80ml RO水中)的水溶液中，并在40℃下搅拌反应混合物16小时。用RO水(10×200ml等份)洗涤所得胺化吸收剂，并在20％(v/v)的含水乙醇中储存直到进一步使用。
实施例2第1阶段-表氯醇活化的PuraBead6XL的制备不含防腐剂的PuraBead6XL(200g沉降重量)、RO水(128ml)和10M氢氧化钠(3.2ml)的浆料与表氯醇(14.4ml)在40℃下反应1小时。用RO水(10×200ml等份)彻底洗涤环氧活化的PuraBead6XL，并立即在第2阶段中使用。
第2阶段-三亚乙基四胺-PuraBead6XL的制备将来自第1阶段的环氧活化的PuraBead6XL(200g沉降重量)等份地添加到三亚乙基四胺(8.04g，在60ml RO水中)的水溶液中，并在40℃下搅拌所得浆料16小时。用大量RO水(10×200ml部分)洗涤所得胺化吸收剂，以除去过量多胺。
实施例3
用10床体积的RO水洗涤PuraBead 6XL，并用192ml RO水使300g排出的凝胶变成浆料。添加10M氢氧化钠(4.8ml)，和温热混合物到36℃，随后添加21.6ml表氯醇。反应温度增加到40℃，并在该温度下维持1小时，之后用10床体积的RO水洗涤活化的PuraBead并允许在重力下排出。添加在60ml水中的N，N’-双(3-氨基丙基)亚乙基二胺(9.586g)，和加热向其中在30分钟的时间段内分批添加100g环氧活化的琼脂糖的混合物到40℃。在40℃下搅拌反应浆料，并用10床体积的水洗涤，以除去过量胺。
实施例4将根据实施例1-3制备的脱热原(depyrogennated)的共轭物(1ml)(共轭物A、C和G)添加到含有大肠杆菌#0113:H10:K阴性内毒素(1.0×103EU)的庆大霉素(2ml，9mg/ml)水溶液中，和在25℃下搅拌所得浆料1小时。使用Limulus Amoebocyte Lysate Turbidimetric测定法，分析上清液中内毒素的存在(参见表1)。
表1
结果表明，从硫酸庆大霉素水溶液中极其有效和选择地除去内毒素且庆大霉素的回收率为100％。
实施例5将脱热原的共轭物(共轭物A，1ml)添加到含有大肠杆菌#0113:H10:K阴性内毒素(3.0×102EU)的人类血清白蛋白(2ml，27mg/ml)的缓冲(150mM磷酸盐缓冲的盐水，pH7.4)溶液中并在25℃下搅拌1小时。使用被校正的Limulus Amoebocyte LysateTurbidimetric测定法，分析上清液中未结合的内毒素，以检测在合适浓度的人类血清白蛋白中的内毒素。结果见表2。
表2
结果证明，除去大于99％存在于人类血清白蛋白内的内毒素，同时维持所采用的蛋白质100％的回收率。
实施例6将根据实施例1和2制备的脱热原共轭物(共轭物A和C，1ml)分别填充在玻璃柱(10mm内径×30mm高度)内并用20ml不含内毒素的水平衡。将含有大肠杆菌#0113:H10:K阴性内毒素(7.5×103EU)的庆大霉素(1ml，3mg/ml)水溶液以61cm/hr的线性流速装载到柱上。然后用不含内毒素的水(9ml)洗涤该柱，除去任何未结合的内毒素。使用Limulus Amoebocyte Lysate Turbidimetric测定法，分析流过的合并溶液的内毒素含量。结果见表3。
表权利要求
1.下述结构的亲和配体-基体共轭物用于含水体系中内毒素的离析、分离、纯化、表征、鉴定或定量化的用途Z-间隔基-[NX-A]m-NY-A-NX2其中m是至少为1的整数；各A独立地表示含1-6个碳原子的任选取代的直链、支链或环状饱和烃链；各X独立地表示氢或烷基；Y为X或A-NX2；和Z是通过任选的间隔基臂(间隔基)连接到配体上的支持基体。
2.权利要求1的用途，其中含水体系选自缓冲液、蛋白质、疫苗、抗生素、血液、血浆、血清、核酸、药物产品和其它生物化合物。
3.权利要求1或2的用途，其中各A独立地表示二价C1-4烷基。
4.前述任何一项权利要求的用途，其中存在间隔基且其具有如下结构-T-L-其中T表示O、S或N-R2，其中R2表示氢原子或含有1-6个碳原子的烷基；和L是含有2-20个原子的任选取代的烷基、烷基醚、烷基硫醚、烷基酯或酰胺键。
5.权利要求1-3任何一项的用途，其中间隔基不存在。
6.前述任何一项权利要求的用途，其中Z选自多孔琼脂糖珠粒、全氟碳颗粒和功能膜。
7.前述任何一项权利要求的用途，其中配体选自二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、N，N-双(3-氨基丙基)亚乙基二胺和N-(2-氨基乙基)-1，3-丙二胺。
8.权利要求1-6任何一项的用途，其中配体是三(2-氨基乙基)胺。
9.前述任何一项权利要求的用途，其中含水体系具有在3-10范围内的pH。
10.前述任何一项权利要求的用途，其中含水体系与共轭物的悬浮液或填充床接触。
11.前述任何一项权利要求的用途，用于在体外设备中从全血或血浆中除去内毒素。
12.前述任何一项权利要求的用途，其中配体连接到可溶聚合物或非聚合物载体上，供体内捕获内毒素。
全文摘要
下述结构Z－间隔基－[NX－A]
文档编号A61M1/16GK1658908SQ03813610
公开日2005年8月24日 申请日期2003年5月22日 优先权日2002年5月22日
发明者S·J·伯顿, T·博德格尔斯基, S·S·艾潘 申请人:普罗米蒂克生物科学有限公司