专利名称：治疗和预防炎症性疾病的诱饵组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物及其应用，所述组合物包含与转录调节因子结合的位点特异性结合的一种化合物(如核酸及其类似物)。更特异地，本发明涉及包含一种诱饵化合物(decoy compound)(如核因子κB(NF-κB)诱饵)的治疗炎症性疾病(disease)或障碍(disorder)的一种组合物。
背景技术：
许多疾病，包括气喘、癌症、心脏病、动脉瘤、自身免疫疾病及病毒感染出现可变症状和迹象，已经提示一或几种蛋白质的异常表达(过表达或低表达)在许多情况中是主要的病因。通常，那些蛋白质的表达是由许多转录调节因子，如转录激活因子和转录抑制基因控制的。
NF-κB是这种编码对炎症和免疫应答而言重要的基因产物的基因的转录调节因子之一(Baeuerle PA.et al.，Annu Rev Immunol.1994；12141-79)。NF-κB应答多种胞外信号并从胞质迁移至细胞核，在一些细胞因子和粘着分子基因的协同反式激活中起关键作用。Cooper等论证了NF-κB的DNA结合活性的时间依赖性提高，其在异源心脏移植动物模型中在排斥之前3天出现峰值(Cooper M.等，Transplantation，1998 Oct.15；66(7)838-44)。然而，给予PDTC显著延长受体动物的存活时间，PDTC是NF-κB的一种强力抑制剂，降低所述模型中NF-κB活性峰值。
人NF-κB的正常活性形式是两个DNA结合亚单位的异源二聚体，所述亚单位是50kDa亚单位(p50)和65kDa亚单位(relA或p65)(Lenardo，Cell.1989 Jul 28，58(2)227-9；Libermann，Mol Cell Biol.1990 May；10(5)2327-34；Satriano J，J Clin Invest.1994 Oct；94(4)1629-36；Neish AS et al.，J Exp Med.1992 Dec 1，176(6)1583-93)。在未被刺激的细胞中，NF-κB结合称作IκB的一种抑制分子并在胞质内隐藏。在细胞被刺激后，IκB被磷酸化，然后迅速降解。之后，NF-κB从IκB中释放，从而使得转录因子易位至细胞核，在此所述转录因子结合多个DNA识别位点以调节基因表达(Baeurerle，1994，如前述)。已经提示转录因子NF-κB从所述复合物中的解离诱导基因，包括白细胞介素(IL)-1、-6和-8、胞内粘着分子、血管细胞粘着分子和内皮细胞粘着分子的经调节的反式激活，并在炎症改变的调节中起关键作用(Lenardo，1989如前述；Libermann，1990如前述；Satriano J，1994如前述；Neish，1992如前述)。因此，NF-κB的阻断可以减弱基因介导的心肌缺血再灌注。
NF-κB可参与恶性肿瘤的发生进展(Rayet B et al.，Oncogene1999 Nov 22，18(49)6938-47)；NF-κB参与对缺氧应激的肿瘤细胞应答(Royds JA et al.，Mol Pathol 1998 Apr.，51(2)55-61)；NF-κB抑制细胞因子和粘着分子在衍生自慢性类风湿性关节炎患者的滑膜细胞中的表达(Tomita T et al.，Rheumatology(Oxford)2000 Jul，39(7)749-57)；众多转录因子，包括NF-κB之间的协同抑制改变了多种肿瘤的恶性表型(Denhardt DT，Crit Rev Oncog 1996，7(3-4)261-91)；由于绿茶多酚所致的NF-κB激活的下调阻断了一氧化氮合酶的诱导，并抑制A431人表皮样癌细胞(Lin JK et al.，Biochem Pharmacol 1999Sep 15，58(6)911-5)；在阿尔茨海默病患者脑中观测到的β淀粉样肽结合成神经细胞瘤细胞中的75kD神经营养受体(p75NTR)，以时间依赖性方式和剂量依赖性方式激活NF-κB(Kuper P et al.，JNeurosci Res 1998 Dec 15，54(6)798-804)；TNF-α在肾小球性肾炎的发生中起重要作用(Ardaillou et al.，Bull Acad Natl Med 1995 Jan，179(1)103-15)。
一种NF-κB转录因子诱饵抑制细胞因子和粘着分子在体内在TNF-α诱导的小鼠肾炎中的表达(Tomita N et al.，Gene Ther 2000Aug，7(15)1326-32)等等。
这提示NF-κB在转录水平抑制MMP1和MMP9，所述MMP1和MMP9是基质金属蛋白酶(MMP)的成员(Eberhardt W，HuwilerA，Beck KF，Walpen S，Pfeilschifter J.J Immunol 2000 Nov 15，165(10)，5788-97；M，Baker AH，Newby AC.Biochem Biophys ResCommun.Bond 1999 Oct 22，264(2)，561-7；Bond M，Fabunmi RP，Baker AH，Newby AC.FEBS Lett 1998 Sep.11，435(1)，29-34；及Kim H，Koh G.Biochem Biophys Res Commun.2000 Mar 16，269(2)，401-5)。MMP是参与胞外基质成分降解的锌依赖性酶的多基因家族。
MMP通过介导胞外基质蛋白质的降解而在癌细胞的侵润中起重要作用。许多研究提示MMP和MMP抑制剂(TIMP)参与癌症的进展血清中TIMP1水平可用作结肠和直肠癌的预后和诊断的标记，及用作转移癌的一个选择性标记(Pellegrinl P et al.，Cancer ImmunolImmunother 2000 Sep，49(7)388-94)；MMP2和MMP9在人膀胱癌细胞中的表达和活性受到肿瘤坏死因子α和γ干扰素的影响(ShinKY et al.，Cancer Lett 2000 Oct 31，159(2)127-134)；MMP2、MMP9和MT1-MMP及其抑制剂TIMP1和TIMP2在卵巢上皮肿瘤中表达(Sakata K et al.，Int J Oncol 2000 Oct，17(4)673-681)；MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的每一个的水平及MMP的整体活性在结肠和直肠肿瘤中是上调的，MMP1在结肠和直肠癌的进展中最重要(Baker EA et al.，Br J Surg 2000 Sep，87(9)1215-1221)；激活的MMP2尿道上皮癌的侵润中起重要作用，而且激活的MMP2的表达水平可用作一种有效的预后指数(Kaneda K et al.，BJU Int 2000 Sep，86(4)553-557)；一种前列腺素合成抑制剂抑制人前列腺肿瘤细胞的侵润，并降低MMP的释放(Attiga FA et al，Cancer Res 2000 Aug 15，60(16)4629-37)；在乳腺癌和肺癌患者中血清优球蛋白部分的MMP活性提高，可用作这些癌症的肿瘤标记(Farias E et al.，Int J Cancer2000 Jul 20，89(4)389-94)；MMP抑制剂抑制肿瘤细胞中明胶降解活性(Ikeda M et al.，Clin Cancer Res 2000 Aug，6(8)3290-6)；由于膜蛋白LMP1所致的MMP9的诱导促进鼻咽癌(NPC)的转移(Horikawa T et al.，Cancer 2000 Aug 15，89(4)715-23)；MMP在血管成形术的早期阶段起重要作用，MMP抑制剂抑制人微血管内皮细胞的侵润和形态发生(Jia MC et al.，Adv Exp Med Biol 2000，476181-94)；MMP9在侵润性和复发的垂体腺瘤和垂体癌中表达(TurnerHE et al.，J Clin Endocrinol Metab 2000 Aug，85(8)2931-5)等等。
还已知MMP参与主动脉瘤的发生MMP参与脑动脉瘤的形成和破裂(Gaetani P et al.，Neurol Res 1999 Jun，21(4)385-90)；MMP-9启动子是脑动脉瘤的一个危险因素(Peters DG et al.，Stroke 1999 Dec，30(12)2612-6)；MMP的抑制在动脉瘤模型中抑制了微动脉瘤的生长(Treharne GD et al.，Br J Surg 1999Aug，86(8)1053-8)等等。MMP从迁移的血管平滑肌细胞、巨噬细胞等中分泌，并破坏血管壁中存在的胶原、弹性蛋白等，从而血管的紧张性丧失而且血管不再抵抗血压及其直径扩展。事实上，在动脉瘤的血管中观测到弹性蛋白的明显破坏。
根据通过测定35-80岁成年男性的主动脉直径获得的数据，平均值为1.5-2.0cm。通常，直径超过平均值1.5倍的主动脉被判断为主动脉瘤。然而，根据上述数据，在每400人中就有一个人具有直径为3cm或更大的动脉瘤，这被判断为主动脉瘤。因此，尽管在此不考虑主动脉破裂的危险程度，但主动脉瘤的流行在35-80岁的成年男性中相对较高。在65或更高年龄的男性中认为该流行更显著。
已经有报道MMP抑制剂在大鼠腹部中的主动脉瘤模型中抑制血管直径的扩展。MMP抑制剂可用于治疗肾小球性肾炎(Marti HP，Schweiz Med Wochenschr 2000 May 27，130(21)，784-8)。然而，系统性给予MMP抑制剂产生严重的副作用，并难以临床应用处理(治疗和预防)多种疾病。
合成的ODN作为一种“诱饵化合物”顺式元件阻断核因子结合其指定基因的启动子区域，从而抑制体外和体内分析系统的基因反式激活(Sullenger，J Virol 1991 Dec，65(12)6811-6；Morishita R.etal.，Contrib Nephrol.1996，118254-64)。这种诱饵策略已经用于治疗某些人体疾病。本发明人先前报道了E2F诱饵ODN的转染作为在气囊损伤后再狭窄的基因治疗模型以抑制新生内膜(neointimal)增殖(Morishita，Proc Natl Acad Sci USA，1995 Jun 20，92(13)5855-9)。最近，本发明人在大鼠中使用NF-κB诱饵成功地在体内保护心肌免于缺血损伤。
(本发明要解决的问题)因此，这提示NF-κB通过在其转录控制下许多基因的表达而参与多种疾病。然而，目前还没有有效治疗与炎症性疾病相关的障碍或疾病的方法，尤其是非侵入性治疗方法。特别是如上所述，炎症性疾病，如类风湿性关节炎和骨关节炎等不是很罕见的疾病。随着社会的老龄化，动脉硬化疾病的增多不可避免地导致主动脉瘤疾病的增多。考虑到患者年龄的增加，理想的是使用药物直接抑制炎症性疾病的生长，然而，迄今为止还未获得这种手段。因此非常需要揭示炎症性疾病的一种低侵入性的治疗和预防方法。
炎症性疾病是指与炎症相关的任何疾病或障碍。特别地，需要可以有效治疗关节部位的炎症性疾病(例如，类风湿性关节炎、骨关节炎、肩关节周炎等)，而又无副作用或显著降低副作用的方法。
发明概述本发明提供了治疗或预防炎症性疾病或障碍以及由所述疾病或障碍所致的障碍的一种组合物，该组合物包含至少一种NF-κB诱饵或者相似的转录因子的诱饵，及一种药物可接受的载体。本发明还提供了一种治疗或预防炎症性疾病或障碍以及由所述疾病或障碍所致的障碍的方法，所述方法包括为治疗对象给予一种组合物，所述组合物包含至少一种NF-κB诱饵或者相似的转录因子的诱饵，及一种药物可接受的载体。
在一个实施方案中，炎症性疾病包括许多炎症，如肾炎、肝炎、关节炎(例如类风湿性关节炎、骨关节炎等)、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉硬化、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睾炎、睾丸炎等。所述障碍是与上述炎症性疾病相关的那些障碍。所述药物可接受的载体可以是脂质体。所述NF-κB诱饵可包含一个序列GGATTTCCC。在一个实施方案中，所述诱饵或组合物可以直接施用于关节处。
因此，本发明提供如下内容1.一种治疗和预防炎症性疾病或障碍的药物组合物，其包含至少一种NF-κB诱饵，及一种药物可接受的载体。
2.根据第1项的组合物，其中所述疾病或障碍是选自如下一组中的至少一种肾炎、肝炎、关节炎、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉硬化、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睾炎、睾丸炎。
3.根据第1项的组合物，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
4.根据第1项的组合物，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
5.根据第1项的组合物，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
6.根据第1项的组合物，其适于膝关节给药。
7.根据第6项的组合物，其包含至少10mg所述NF-κB诱饵。
8.根据第6项的组合物，其包含至少30mg所述NF-κB诱饵。
9.一种治疗和预防关节疾病或障碍的药物组合物，其包含至少一种NF-κB诱饵，及一种药物可接受的载体。
10.根据第9项的组合物，其中所述疾病或障碍是选自如下一组中的至少一种类风湿性关节炎、骨关节炎、肩关节周炎、颈臂综合征和继发性关节炎。
11.根据第9项的组合物，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
12.根据第9项的组合物，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
13.根据第9项的组合物，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
14.根据第9项的组合物，其中所述疾病或障碍是类风湿性关节炎，其包含至少治疗有效量的所述诱饵。
15.根据第14项的组合物，其中所述治疗有效量是至少0.01mg/kg体重。
16.根据第9项的组合物，其适于膝关节给药。
17.根据第16项的组合物，其中所述NF-κB包含至少10mg。
18.根据第16项的组合物，其中所述NF-κB诱饵包含至少30mg。
19.一种治疗或预防炎症性疾病或障碍的方法，包括给予患者一种组合物，所述组合物包含至少一种NF-κB诱饵，及一种药物可接受的载体。
20.根据第19项的方法，其中所述疾病或障碍是选自如下一组中的至少一种肾炎、肝炎、关节炎、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉硬化、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睾炎和睾丸炎。
21.根据第19项的方法，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
22.根据第19项的方法，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
23.根据第19项的方法，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
24.根据第19项的方法，其中所述组合物适于膝关节给药。
25.根据第24项的方法，其中所述组合物包含至少10mg的NF-κB诱饵。
26.根据第24项的方法，其中所述组合物包含至少30mg的NF-κB诱饵。
27.一种治疗和预防关节疾病或障碍的方法，包括给予患者一种组合物，所述组合物包含至少一种NF-κB诱饵，及一种药物可接受的载体。
28.根据第27项的方法，其中所述疾病或障碍是选自如下一组中的至少一种类风湿性关节炎、骨关节炎、肩关节周炎、颈臂综合征和继发性关节炎。
29.根据第27项的方法，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
30.根据第27项的方法，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
31.根据第27项的方法，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
32.根据第27项的方法，其中所述疾病或障碍是类风湿性关节炎，所述诱饵包含至少治疗有效量。
33.根据第27项的方法，其中所述治疗有效量是至少0.01mg/kg体重。
34.根据第27项的方法，其中所述组合物适于膝关节给药。
35.根据第34项的方法，其中所述组合物包含至少10mg的所述NF-κB诱饵。
36.根据第34项的方法，其中所述组合物包含至少30mg的所述NF-κB诱饵。
37.至少一种NF-κB诱饵在生产治疗和预防炎症性疾病或障碍的药物中的应用。
38.根据第37项的应用，其中所述疾病或障碍是选自如下一组中的至少一种肾炎、肝炎、关节炎、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉硬化、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睾炎和睾丸炎。
39.根据第37项的应用，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
40.根据第37项的应用，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
41.根据第37项的应用，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
42.根据第37项的应用，其中所述组合物适于膝关节给药。
43.根据第42项的应用，其中所述组合物包含至少10mg的NF-κB诱饵。
44.根据第42项的应用，其中所述组合物包含至少30mg的NF-κB诱饵。
45.至少一种NF-κB诱饵在生产治疗和预防关节疾病或障碍的药物中的应用。
46.根据第45项的应用，其中所述疾病或障碍是选自如下一组中的至少一种类风湿性关节炎、骨关节炎、肩关节周炎、颈臂综合征和继发性关节炎。
47.根据第45项的应用，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
48.根据第45项的应用，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
49.根据第45项的应用，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
50.根据第45项的应用，其中所述疾病或障碍是类风湿性关节炎，所述诱饵包含至少治疗有效量。
51.根据第45项的应用，其中所述治疗有效量是至少0.01mg/kg体重。
52.根据第45项的应用，其中所述组合物适于膝关节给药。
53.根据第52项的应用，其中所述组合物包含至少10mg的所述NF-κB诱饵。
54.根据第52项的方法，其中所述组合物包含至少30mg的所述NF-κB诱饵。
本领域技术人员通过阅读及理解如下详细描述，及如果需要则参考附图，对本发明的这些及其它优点将更清楚。
附图简述
图1是示出在猿胶原蛋白关节炎模型的关节中出现由本发明的诱饵所致的改变的X光照片。不加处理和接受混杂的诱饵的模型无作用，而接受本发明诱饵处理的模型示出许多显著的改善，如滑膜炎症的改变、关节肿胀的抑制及关节软骨和关节中破骨的抑制等。
图2示出关节切面的照片，示出NF-κB对骨关节炎大鼠模型的作用。该图示出一个正常的供体，一个胶原蛋白产生的关节炎模型，及NF-κB诱饵(给予10mg和30mg)对这个模型的作用和类固醇对这个模型的作用。给予10mg的诱饵已经获得显著作用，给予30mg诱饵则消灭关节炎。这些作用超过类固醇所获得的那些作用。另外，与类固醇处理相反，这种处理无副作用。
图3示出本发明的治疗胶原蛋白产生的关节炎的方案。
图4示出本发明的治疗骨关节炎的方案。
最佳实施方式下文将对本发明加以描述。应理解在本说明书中单数形式(例如“一个、一种”等)除了特别说明之外均包括其复数的概念。还应理解本文所用术语除了特别说明之外均具有本领域典型使用的含义。因此，除了特别说明之外，本文所用的所有技术和科学术语均具有本领域技术人员所一般了解的相同含义。如果有任何不一致之处，本说明书提前加以说明。
本文所用术语“诱饵”或“诱饵化合物”是指一种化合物，其模拟转录因子，如NF-κB所结合的一个染色体位点，或者其模拟转录调节因子结合的由转录因子，如NF-κB等控制的一个基因的染色体位点(后文称作“靶结合位点”)，从而与结合转录因子的染色体结合位点竞争。典型地，所述诱饵或诱饵化合物包括一种核酸及其类似物。
当一种诱饵存在于细胞核中时，所述诱饵与转录调节因子竞争结合该转录调节因子的靶结合位点。结果，由转录调节因子与靶结合位点结合而产生的生物学功能被抑制。所述诱饵含有能结合靶结合序列的至少一个核酸序列。本发明的诱饵可用于制备一种药物组合物，只要该诱饵具有与靶结合序列结合的活性。
所述诱饵的实例包括含有关于NF-κB的GGGATTTC的寡核苷酸。优选的诱饵的实例包括5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’(SEQID NO1)(NF-κB诱饵)，5’-GATCTAGGGATTTCCGGGAAATGAAGCT-3’(SEQ ID NO2)(STAT-1诱饵)，5’-AGCTTGAGATAGAGCT-3’)(SEQ ID NO3)(GATA-3诱饵)，5’-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAAATCTAT-3’(SEQ ID NO4)(STAT-6诱饵)，5’-AGCTTGTGAGTCAGAAGCT-3’(SEQ ID NO5)(AP-1诱饵)，及5’-AATTCACCGGAAGTATTCGA-3’(SEQ ID NO6)(Ets诱饵)，5’-TGACGTCA-3’(CRE诱饵序列)，或者其含有寡核苷酸的互补序列、其突变体，或者含有这些分子的化合物。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA。所述寡核苷酸还可以包括一种修饰的核酸和/或假核酸。另外，这些寡核苷酸可以是其突变体，或者含有其的化合物。所述寡核苷酸可以具有单链或双链，或者可以是线性或环形的。突变体是具有上述序列的核酸，其一部分具有一个突变、取代、插入或缺失，就所述因子结合的核酸结合位点而言，其特异性拮抗一种转录因子，如NF-κB等，或者由转录因子如NF-κB等控制的基因的另一种转录调节因子。转录因子，如NF-κB等或由转录因子如NF-κB等控制的基因的其它转录调节因子的诱饵的更优选的实例包括含有一或多个上述核酸序列的双链寡核苷酸或其突变体。含有一或多个上述核酸序列的核酸，当包含的核酸序列数是2时称为双重诱饵，当包含的核酸序列数是3时称为三重诱饵，表明核酸序列数。
本发明中使用的寡核苷酸包括经修饰的以对体内降解具有抗性的寡核苷酸，如具有三磷酸二酯键的寡核苷酸(S-oligo)，所述键是一种磷酸二酯键，其氧原子被硫原子置换，及包括其磷酸二酯键被一个无电荷的甲基磷酸基团取代的寡核苷酸等。
本发明的诱饵可以利用本领域已知的化学或生物化学合成方法生产。例如，当一种核酸被用作诱饵化合物时，可应用遗传工程中一般使用的核酸合成方法。例如，可以使用DNA合成仪直接合成指定的诱饵核酸。另外，可以合成这些核酸、含有所述核酸或其一部分的核酸，随后使用PCR方法和一个克隆载体进行扩增等。另外，将通过这些方法获得的核酸使用一种限制酶切割，并使用DNA连接酶连接以产生指定的核酸。为获得在细胞中更稳定的诱饵核酸，可以将所述核酸的碱基、糖和磷酸部分进行化学修饰，如烷化、酰化等。
本发明提供了一种药物组合物，其只包含上述诱饵化合物或者组合一种稳定化合物、一种稀释剂、一种载体或另一种成分、或者一种药剂。
本发明的药物组合物可以这样一种形式应用，即所述诱饵被摄入受影响部分的细胞中或者指定组织的细胞中。
本发明的药物组合物是在任何无菌的生物适合的药物载体中给予的(所述载体包括但非限于生理盐水、缓冲的生理盐水、葡萄糖和水)。任何这些分子与一种合适的赋形剂、佐剂和/或药物可接受的载体混和的一种药物组合物可单独给予患者，或者与另一种药物组合物中的药剂组合给予。在本发明的一个实施方案中，所述药物可接受的载体是无药物学活性的。
本发明的药物组合物通过口服或非肠道给予。非传道给药方法包括局部给药、动脉内给药(例如通过颈动脉给药)、肌内给药、皮下给药、髓内给药、注入蛛网膜下隙、心室内给药、静脉内给药、腹膜内给药或鼻内给药。在本发明中，任何给药途径均可使用，只要所述组合物通过该途径可以到达进行治疗的部位，特别是炎症部位即可。因此，本发明提供了一种新的治疗方法以在炎症部位或动脉进行基因转染及进行该方法的一种组合物。
除了所述诱饵化合物之外，这些药物组合物还含有一种合适的药物可接受的载体，包括促进所述诱饵化合物进程的另一种化合物以产生可以药物学应用的赋形剂或制品。关于所述诱饵化合物的制备和给药的技术的详细描述见例如最近增补的日本药典最新版本及“REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES”(MaackPublishing Co.，Easton，PA)所述。
口服给药的药物组合物可以使用本领域熟知的一种药物可接受的载体以适于给药的给药形式制备。这种载体可以被制成片剂、药丸、糖衣药物、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，适于患者摄取该药物组合物。
口服给药的药物组合物可以如下方式获得将一种活性化合物与一种固体赋形剂组合，如果需要则将所得混合物粉碎，如果需要则再加入一种合适的混合物以获得一种片剂或糖衣药物的核心，加工成粒状混合物。所述合适的赋形剂可以是碳水化合物或蛋白质充填剂，包括但非限于如下物质糖包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；衍生自玉米、小麦、水稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或者羧甲基纤维素钠；树胶包括阿拉伯树胶和黄蓍树胶；及蛋白质如明胶和胶原蛋白。如果需要可使用一种分解剂或增溶剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻酸或其盐(例如藻酸钠)。
提供的糖衣药物核心是具有一种合适的包衣，如浓缩的糖溶液。所述糖衣药物核心还可以含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopolygel、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液及一种合适的有机溶剂或溶剂混和溶液。为鉴别产物或确定活性化合物的量(即剂量)，可以在片剂或糖衣药物中加入染料或色素。
口服给药的药物制品可含有，例如，密闭的软胶囊，其由明胶胶囊、明胶和包衣(例如甘油或山梨糖醇)组成。所述凝胶胶囊可含有一种活性成分混和一种充填剂或结合剂，如乳糖或淀粉，一种润滑剂，如滑石或硬脂酸镁，及任选一种稳定剂。在软胶囊中，所述诱饵化合物可以溶解或悬浮于一种合适的液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中，有或无稳定剂。
非肠道给药的药物制品含有活性化合物的一种水溶液。为进行注射，本发明的药物组合物是在水溶液中制备的，优选在Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理学合适的缓冲液，如缓冲的生理盐水中制备。进行注射的水相悬浮液可含有提高悬浮液粘性的一种物质(例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖)。另外，所述活性化合物的悬浮液可以制备成一种合适的油相悬浮液。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪酸，如芝麻油，合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。如果需要，所述悬浮液可含有一种稳定剂以制备高浓度溶液，或者含有一种合适的药剂或试剂以提高所述化合物的溶解性。
就局部或鼻内给药而言，可以在制备中使用一种渗透特殊屏障的合适渗透剂。这种渗透剂是本领域所熟知的。
本发明的药物组合物可以使用与本领域已知方法相似的方法生产(例如，常规混和、分解、形成颗粒、制备糖衣制剂、淘析、乳化、包囊化、包含、冷冻干燥或冻干)。
优选地，在非肠道给药的情况中，如局部给药或从颈部灌注入受影响部分的细胞或指定组织的细胞中，本发明的药物组合物可含有一种合成的或天然的亲水性聚合物作为载体。这种亲水性聚合物例如包括羟丙基纤维素和聚乙二醇。本发明的诱饵化合物可以与上述亲水性聚合物在合适的溶剂中混和。所述溶剂可以通过如空气干燥方法除去。所得化合物可以根据所希望的形式成形，如薄片，然后给予靶位点。含有亲水性聚合物的这种制品的含水量低，具有良好的保存期限及良好的诱饵保持力，因为当使用时所述制品吸收水分转变为凝胶。
或者，当一种核酸或其修饰体用作诱饵时，本发明的药物组合物优选以基因导入方法中通常使用的形式有利地应用，如使用仙台病毒(HVJ)等的膜融合脂质体制品，使用胞吞等的脂质体制品，含有阳离子脂质如Lipofectamine(Gibco BRL)等的制品，或者使用逆转录病毒载体、腺病毒载体的病毒制品。特别优选膜融合脂质体制品。
所述脂质体制品是任何脂质体构建体，其是大单层小泡(LUV)、多层小泡(MLV)和小单层小泡(SUV)。LUV的颗粒大小为大约200-1000nm。MLV的颗粒大小为大约400-3500nm。SUV的颗粒大小为大约20-50nm。使用HVJ等的膜融合脂质体制品优选应用颗粒大小为大约200nm-1000nm的MLV。
对生产脂质体的方法无特殊限制，只要所述脂质体具有一个诱饵。所述脂质体可以通过常规使用的方法生产，例如，反相蒸发方法(Szoka，F et al.，Biochim Biophys Acta，Vol.601 559(1980))、醚浸渍(ether infusion)方法(Deamer，D.W.Ann.N.Y.Acad.Sci.，Vol.308 250(1978))、表面活性剂方法(Brunner，J et al.BiochimBiophys Acta，Vol.455 322(1976))等。
形成脂质体结构的脂质例如包括磷脂、胆固醇、氮脂质等。通常优选磷脂，包括天然的磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、卵黄卵磷脂、大豆卵磷脂、溶血卵磷脂等，或者通过常规使用的方法氢化相应的磷脂，及另外的合成的磷脂，如联十六烷磷酸酯、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、桐酰磷脂酰胆碱、桐酰磷脂酰乙醇胺、桐油酰磷脂酰丝氨酸等。
包括这些磷脂的所述脂质可以单独使用，或者至少两种组合使用。在这种情况中，可以使用在分子内具有一个正电基团的原子基团的脂质，如乙醇胺、胆碱等，以提高负电性诱饵核酸的结合速度。除了用于形成脂质体的主要磷脂之外，可以使用一种添加剂，如胆固醇、硬脂酰胺、α-生育酚等，这些添加剂是通常已知形成脂质体的添加剂。
由此获得的脂质体可另外含有一种促进膜融合的物质，如从HVJ、失活的HVJ、仙台病毒等中纯化的一种膜融合促进蛋白质，以促进被摄入受影响部位的细胞或指定组织的细胞中。
生产脂质体制品的方法的实例在下文特别加以描述。例如，将上述形成脂质体的物质与胆固醇一起溶解于一种有机溶剂，如四氢呋喃、氯仿、乙醇等中。将所得溶液置于一个合适的试管中，随后在减压下除去所述溶剂，从而在试管内壁上形成脂质体形成物质的一层膜。向该试管中加入含有诱饵的一种缓冲溶液，随后搅动。如果需要则将上述膜融合促进物质加入所得脂质体中，随后分离所述脂质体。可以将由此获得的含有所述诱饵的脂质体悬浮于一种合适的溶剂中，或者可以冻干，随后分散于一种合适的溶剂中。所得悬浮液可以用于治疗。在分离脂质体之后及使用之前的过渡时期可以加入所述膜融合促进物质。
本发明的组合物或试剂盒可进一步包含一种生物适合的材料。这种生物适合的材料可含有选自如下一组中的至少一种硅氧烷、胶原、明胶、乙醇酸-乳酸共聚物、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯。优选硅氧烷，因为其易于成型。生物可降解的聚合物例如包括胶原、明胶、通过脱水缩聚而不用催化剂从选自以下一组中的至少一种合成的聚合物或共聚物α-羟基羧酸(例如乙醇酸、乳酸、羟丁酸等)、羟基二羧酸(例如苹果酸等)和羟基三羧酸(例如柠檬酸等)或其混合物；聚α氰基丙烯酸酯、聚氨基酸(例如聚-γ-偶苯酰-L-谷氨酸等)，基于顺丁烯二酸酐的共聚物的可聚合的酸酐(例如苯乙烯-顺丁烯二酸共聚物等)。聚合的类型是随机的、嵌段的及接枝的。当α-羟基羧酸、羟基二羧酸和羟基三羧酸在分子中具有光学活性中心时，可以使用任何D-异构体、L-异构体和DL-异构体。优选地，可以使用乙醇酸-乳酸共聚物。
在一个实施方案中，本发明的组合物或试剂盒可以是缓释形式。所述缓释剂量形式可以是本领域已知的任何形式，只要其在本发明中使用即可。这种形式包括例如条棒形式(小球形式、圆柱形式、针状等)、片剂形式、圆盘形式、球形和薄片形式。制备缓释形式的方法为本领域所已知，并见于例如日本药典、美国药典及其它国家的药典所揭示。生产一种缓释制品(延长给药的制品)的方法例如包括利用药物从复合物中解体的方法、使用一种水相悬浮液注射的方法、使用一种油相溶液注射或油相悬浮液注射的方法、使用一种乳状液(o/w类型和w/o类型乳状液注射等)注射的方法。
在缓释形式的情况中，可将一种缓释制品(小球制品等)包埋于准备给予所述制品的部位的附近。或者，可以使用一个渗透泵等持续及逐渐地给予所述缓释制品。
可以通过本领域熟知的方法制备注射制剂。例如，将一种成分溶解于一种合适的溶剂中(生理盐水、缓冲液如PBS、无菌用水等)，随后使用滤膜过滤灭菌。之后，将所得溶液充填于一个无菌容器(例如安瓿等)中，从而制备所述注射制剂。如果需要则所述注射制剂可含有一种常用的药物载体。在脂质体形式的情况中，可加入脂质体制备所需要的试剂，如悬浮剂、冷冻剂及通过离心浓缩的冷冻剂。所述脂质体优选通过非肠道给予。因此，当给予所述脂质体时，可以使用一种非侵入性导管、一种非侵入性注射器等给予。例如，作为使用非侵入性导管的给药方法，本发明的组合物被直接灌注于脑部或者通过颈动脉而注入脑部。
本发明的药物组合物包括含有有效量的诱饵化合物的一种组合物，所述有效量是指可以达到指定目的的诱饵化合物。“治疗有效量”或“药物有效量”是为本领域技术人员所熟知的术语，是指有效产生指定药理学作用的药物量。因此，治疗有效量是指足以降低所治疗的疾病表现的量。针对一种预定应用证实有效量(例如治疗有效量)的一种有效的试验是测定疾病的恢复程度。根据所治疗的个体情况准确地给予一定量。所述量优选最佳化以达到所希望的作用而又无显著的副作用。治疗有效量的确定在本领域技术人员的能力范围内。
任何化合物的治疗有效剂量最初可以使用细胞培养分析或任何合适的动物模型进行估计。所述动物模型用于获得所希望的浓度范围和给药途径。之后，这种信息可用于确定用于给予人体的剂量和途径。
治疗有效量是指诱饵化合物的一个量，这个量导致疾病的症状或状况减轻。这种化合物的治疗作用和毒性可以通过标准药理学程序在细胞培养物或实验动物中确定(例如ED50，半数治疗有效量；LD50，半数致死量)。治疗作用和毒性作用之间的剂量比是一个治疗指数，可以表示为ED50/LD50比值。优选呈现高治疗指数的药物组合物。从细胞培养分析和动物研究中获得的数据可用于配制用于人体的剂量范围。这种化合物的剂量优选在循环浓度包括ED50时毒性很低或无毒性的范围内。这种剂量可在此范围内根据所应用的剂型、患者的易感性及给药途径而变化。例如，诱饵的剂量是根据患者年龄及其它状况、疾病类型、所应用的诱饵的类型等而适当选择的。例如，所述诱饵每日一次或多次给予脑部，每次10-10000nmole。所述诱饵一般通过颈动脉给予，每日一或多次，每次10-10000nmole。
在一个实施方案中，所述治疗有效量典型地可以是至少0.01mg/kg体重，通常为至少0.05mg/kg体重，优选为至少0.1mg/kg体重。在膝治疗的情况中，治疗有效量可以是100μg-100mg/关节，通常为至少5mg/关节，优选为至少10mg/关节，更优选为至少20mg/膝，及更优选为至少30mg/关节。治疗有效量/体重可以根据所治疗的属、物种而变化。在人类患者的情况中，治疗有效量可以是至少1mg/关节，通常为至少5mg/关节，优选为至少10mg/关节，更优选为至少20mg/关节，更优选为至少30mg/关节。在给予骨关节炎和类风湿性关节炎的膝的情况中，治疗有效量可以是0.01-500mg/关节，通常为0.05-100mg/关节，优选为至少0.1-5mg/关节。在其它膝的情况中，给予量可以与关节腔的体积成比例设定。可以从猴、大鼠等动物中高概率推出所述治疗有效量。给药频率可以是任何频率，通常是每四周一次至每日一次。在骨关节炎和类风湿性关节炎的情况中，上述剂量适于作为治疗有效量。
在一个优选的实施方案中，本发明的诱饵或诱饵化合物可以至少0.1mg/ml的量存在，更优选1.0mg/ml。在另一个优选的实施方案中，本发明的诱饵或诱饵化合物可以至少2.0mg/ml，至少5.0mg/ml，至少5.0mg/ml，至少20.0mg/ml，至少30.0mg/ml，至少50.0mg/ml，至少70.0mg/ml，至少100.0mg/ml，至少200mg/ml或更多的量存在。
精确剂量及组合物中的诱饵浓度由各个医生根据所治疗的患者的状况加以确定。对剂量和给药加以调节以提供足够水平的活性部分或者具有所希望的作用。要考虑的额外因素包括疾病症状的严重程度(例如肿瘤的大小和部位、患者的年龄、体重及性别、限制饮食的时间及给药频率、药物组合、反应易感性及对治疗的抗性/应答)。根据特异制品的半衰期和消除率，每3-4天、每周或两周一次给予持续作用的药物组合物。在本领域已知的出版物中提供了特异剂量和给药方法的指导。
含有由此获得的诱饵作为主要成分的药物可以根据疾病的类型、所应用的诱饵的类型等而以多种方式给予。例如，就炎症性疾病或障碍而言，所述药物可以血管内给予、应用于疾病部位、给予疾病部位、或者血管内给予疾病部位。例如在慢性关节风湿症、骨关节炎等情况中，所述药物可以直接灌注于关节。
一方面，由本发明的化合物治疗的疾病或障碍是炎症性疾病或障碍。另一方面，本发明治疗的疾病或障碍是关节疾病或障碍(如关节炎)。
本文所用术语“炎症(炎症反应)”是指一种基本病理学过程，包括由一种物理、化学或生物学活性因素、疾病血管及其相邻的组织所导致的细胞和/或组织反应的一种动态复合体。炎症包括局部反应过程，由此导致的形态学改变，损害性物质的破坏和清除，修复和痊愈。炎症的主要症状包括红(变为红色)、触冷感热(高温)、生长(肿胀)、痛(疼痛)等。另外，可以发生功能丧失(功能抑制或丧失)。所有这些症状均可以观测到，但不是所有症状均存在。炎症是相应于对微循环系统分布的组织的毒性刺激的一种局部应答。毒性刺激可例如是外源物、物理能量等，而且损害的组织本质上也可以是这种炎性刺激。因此，炎症是对微循环系统中分布的组织中不利刺激应答的一种局部应答。这种不利刺激包括例如外源物、物理能量等，另外包括损害的组织本身，其可以是致炎症原。因此，在高等动物中炎症的特征在于对刺激的一系列微循环系统应答。即在正常的炎症中，微循环系统瞬时自身收缩，之后自身扩展，从而开放通常是密闭的毛细管床，导致血流体积增加。另外，小静脉区域的内皮细胞的开放空间产生血管渗透增强现象，其中血浆成分通过该空间流出至间质组织中。这种血管渗透增强在两个阶段发生，第一个阶段是由组胺或5-羟色胺产生的微弱应答，第二个阶段是晚期类型渗透，在炎症的血管渗透中起主要作用。然后，多核白细胞、单核细胞(巨噬细胞)、淋巴细胞等从小静脉区域出来至间质组织中。由这些血浆和细胞成分产生的活性剂的作用促进组织细胞的增殖，从而开始修复。这一系列过程被描述为红、肿、热、痛。基本上，炎症是局部的保护性反应，而且另外可以具有组织损害作用。因此，炎症还包括功能性紊乱作为主要症状。因此，详细而言，炎症反应是与局部组织的一种复杂反应，涉及细胞病、循环紊乱、增殖等，并因此本质上可以称作整体动态过程。
本文所用术语“炎症性疾病”是指导致整体疾病部位的慢性炎症的一种疾病，其涉及炎性细胞如淋巴细胞、浆细胞、嗜酸细胞、嗜中性粒细胞。这种炎症性疾病包括，例如，炎症，包括关节炎如类风湿性关节炎和骨关节炎、肾炎、肝炎；急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉硬化、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睾炎和睾丸炎等。
本文所用术语“关节疾病或障碍”包括关节的一种疾病或障碍，包括例如，类风湿性关节炎、骨关节炎、肩关节周炎、颈臂综合征及继发性关节炎等。
本文所用术语“关节炎”是指导致关节炎症的一种疾病。在关节内部，关节腔由软骨和滑液形成，包括在软骨下的骨，及在滑液外部的关节囊、骨、肌、腱、韧带等。关节易患炎症，因为当活动时关节经常受到机械刺激。炎症的原因可以是感染、外伤、过敏、代谢障碍等。相关的症状可以是关节肿胀、疼痛(关节痛)、局部热、运动紊乱等。病理学上，可观测到细胞侵润滑膜、水肿、结缔组织增生等。
本文所用术语“类风湿性关节炎”是指一种疾病，特征在于未知原因所致的慢性关节炎。男性与女性的比值为1∶4，30-50岁的人通常易患这种疾病。在日本这种疾病的发病率估计为总人口的0.3-0.5％。然而至今还未知病因，推测可能涉及许多多因素遗传因子，特别是HLA-D4及病毒感染。关节炎可以在所有滑膜关节中发生，并存在多发及对称倾向。最初，只观测到滑膜炎症，然后进展为软骨和骨的衰竭，以及软骨变形、脱臼及骨僵硬，导致运动丧失。特别地，观测到特征性的腕跗骨易于变形、在掌指关节处尺骨错位、腕骨弯曲(swan-neck)变形、腕骨纽孔花(bouttoniere)变形、及跗骨外翻。除了关节之外，可关联到外层心包炎、脉管炎、皮下结节及纤维肺，而且在脉管炎类型的情况中预后更坏，如弥漫性坏死性动脉周炎，因此这种类型称为恶性类风湿性关节炎。常规地，药物治疗包括使用缓解症状药物(palliation introductory agent)，如类固醇、非类固醇抗炎剂、金制剂、D-青霉胺等；矫形治疗，如滑膜切除术、关节成形术、置换关节成形术等；恢复治疗，如热处理、训练治疗、矫正治疗、假肢修复术治疗等。然而，这样均难以达到完全治愈。特别地，类固醇等具有成问题的不利作用。
本文所用术语“关节变形(arthritis deformans)”和“骨关节炎”是指一种疾病，其中慢性退化性改变和产生性变化在关节中同时发生，从而改变关节的形状。其可以分为原发性骨关节炎和继发性骨关节炎。前者(原发性)是在中老年人中发现的，因此除了年龄增长之外还随着机械刺激而进展。后者(继发性)也可以见于较年轻的人中，发生明显的原因，如关节外伤、畸形、疾病、代谢障碍等之后。病理学上，关节软骨逐渐磨损或缺损，导致骨的暴露。同时，软骨随着血管形成而肥大性生长并形成骨刺。观测到滑膜生长、关节囊肥大或萎缩、离析物出现。常规地，药物治疗是给予非类固醇类消炎剂及关节内注射类固醇等。另一方面，当损害进展时，进行外科手术治疗，关节固定术、关节成形术、切骨术和假肢置换关节成形术等。
通过本发明治疗的部位可以衍生自任何类型的生物体。通过本发明治疗的生物体包括脊椎动物和非脊椎动物，优选哺乳动物(例如灵长类动物、啮齿类动物等)，更优选灵长类动物，最优选人。
本发明的组合物和试剂盒典型地在医师监督下应用，或者在由所涉及的国家的权威机构及法律许可下使用。
另一方面，本发明提供了治疗脑缺血障碍的一种试剂盒。该试剂盒包含本发明的诱饵或诱饵化合物，及提供了给予所述诱饵或诱饵化合物的产品说明书。所述产品说明书描述了给予所述诱饵或诱饵化合物的一种合适的方法。所述产品说明书是根据实践本发明的国家的权威机构(例如Health，Labor and Welfare Ministry(日本)，Food andDrug Administration(FDA)(美国)等)指定的形式准备的，明确地描述了由权威机构许可的用法说明。所述产品说明书是一种所谓的包装插入物，其典型地但非限于是纸制品、电子制品(因特网网址和电子邮件)。
本发明的诱饵或诱饵化合物的量可由本领域技术人员根据使用目的、靶疾病(类型、严重程度等)、患者年龄、体重、性别和病史、细胞中生物活性物质的形式或类型、细胞的形式或类型等容易地确定。
应用于患者的本发明方法的频率也由本领域技术人员根据使用目的、靶疾病(类型、严重程度等)、患者年龄、体重、性别和病史、治疗进展等确定。所述频率例如包括每日一次至几个月进行一次(例如1次/周至1次/月)。优选地，根据进展给予1次/周至1次/月。
在另一个实施方案中，本发明的治疗方法可进一步包括给予另一种药物。这种药物可以是本领域中的任何药物，包括药理学领域已知的任何药物(例如抗生素等)。当然，这种药物可以是至少两种其它药物。所述药物例如包括在最新版本的日本药典、美国药典及其它国家的药典中所述那些药物。所述药物优选是对脑缺血疾病(例如抗血小板剂、脑神经功能改善剂、脑代谢改善剂、血流改善剂等)有作用的那些药物。
本文所用的分子生物学技术、生物化学技术和微生物学技术是本领域熟知并常用的，见例如Ausubel F.A.等编辑(1998)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley，纽约，NY；Sambrook J等(1987)，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY；Jikken-Igaku“Idenshi-Donyu &Hatsugen-Kaiseki-Jikkenho [Experimental medicine“Experimentalmethods for Gene introduction & Expression Analysis”，Yodo-sha，special issue，1997等。
如本文所用，除非特别说明，“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在此可交替地指包含一系列核苷酸的一种大分子(聚合物)。核苷酸是指其碱基是磷酯的一种核苷。所述核苷酸的碱基是嘧啶或嘌呤碱基(嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸)。多核苷酸包括DNA或RNA。
另外，使用软件如BLAST，基于本发明的诱饵的序列通过同源搜索一个遗传信息数据库如GenBank(人类基因组计划的基因组数据)而获得的序列也包含在本发明的范围内。
使用BLAST(序列分析工具)，使用默认参数计算碱基序列的相同性对比。
本文所用“在严格条件下杂交的多核苷酸”是指本领域熟知的并通常使用的条件。这种多肽可以通过使用选自本发明的多核苷酸的一种多核苷酸进行集落杂交、噬菌斑杂交、Southern印迹杂交等而获得。特别地，使用其上固定了衍生自集落或噬菌斑的DNA的一种滤膜在65℃在存在0.7-1.0M NaCl下进行杂交。之后，使用0.1-2倍浓度的SSC(盐水-柠檬酸钠)溶液(1倍浓度的SSC溶液是由150mM NaCl和15mM柠檬酸钠组成)在65℃洗涤该滤膜。通过这种方法鉴别的多核苷酸称作“在严格条件下杂交的多核苷酸”。可以根据例如Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，DNA Cloning 1Core Techniques，A PracticalApproach，第2版，牛津大学出版社(1995)等所述的方法进行杂交。在此，在严格条件下杂交的序列优选不包括仅含有A或T的序列。
术语“高严格条件”是指设计为允许序列是高度互补的DNA链杂交的那些条件，并排除明显错配的DNA杂交。杂交严格性主要是通过温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度而确定。针对杂交和洗涤的“高严格条件”例如是在65-68℃，使用0.0015M的NaCl，0.0015M的柠檬酸钠，或者在42℃使用0.015M的NaCl，0.0015M的柠檬酸钠以及50％的甲酰胺。见Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版，冷泉港实验室，N.Y.，1989)；Anderson等，Nucleic Acid HybridizationA PracticalApproach Ch.4(IRL出版有限公司)(牛津出版社)。可以任选更严格的条件(如较高的温度、较低的离子强度、较高的甲酰胺或者其它变性剂)。根据降低非特异性和/或背景杂交的目的，在杂交和洗涤缓冲液中可以包含其它试剂。尽管也可以使用其它合适的试剂，但例如可以使用0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％的焦磷酸钠，0.1％的十二烷基硫酸钠(NaDodSO4或SDS)，Ficoll，Denhardt’s溶液，超声处理的鲑精DNA(或另一种非互补的DNA)，及硫酸葡聚糖。可以改变这些添加剂的浓度和类型而基本不影响杂交条件的严格性。杂交实验通常在pH6.8-7.4进行；然而，在典型的离子强度条件下，杂交的速度几乎不依赖于pH。见Anderson等，Nucleic AcidHybridizationA Practical Approach Ch.4(IRL出版有限公司，英国牛津)。
影响DNA双链体的稳定性的试剂包括碱基对错配的碱基组成、长度和程度。杂交条件可以由本领域技术人员加以调节以顺应这些变量，并使得不同序列的相关的DNA形成杂合体。完全匹配的DNA双链体的解链温度可以通过如下等式计算Tm(℃)＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(％G+C)-600/N-0.72(％甲酰胺)其中N是形成的双链体的长度，[Na+]是在杂交或洗涤溶液中的钠离子摩尔浓度，％G+C是杂合体中(鸟嘌呤+胞嘧啶)碱基的百分比。就不完全匹配的杂合体而言，解链温度随着每错配1％而降低大约1℃。
术语“中等严格条件”是指在此条件下能形成比在“高严格条件下”可以发生的碱基对错配程度更高的DNA双链体。典型的“中等严格条件”例如是在50-65℃使用0.015M的NaCl和0.0015M柠檬酸钠，或者在37-50℃使用0.015M的NaCl，0.0015M柠檬酸钠和20％甲酰胺。例如，在50℃在0.015M的钠离子中的“中等严格条件”允许大约21％的错配。
本领域技术人员意识到在“高严格条件”和“中等严格条件”之间没有绝对界限。例如，在0.015M的钠离子(无甲酰胺)情况中，完全匹配的长DNA的解链温度为大约71℃。就在65℃洗涤(在相同离子浓度)而言，这允许大约6％错配。为捕捉更不相关的序列，本领域技术人员可以简单地降低温度或提高离子强度。
在1M的NaCl中就直至大约20个核苷酸的寡核苷酸探针而言，解链温度的如下估算Tm＝(2℃/A-T碱基对)+(4℃/G-C碱基对)注意在6×柠檬酸钠盐(SSC)中钠离子浓度为1M。见Suggs等，Developmental Biology Using Purified Genes 683(Brown and Fox，eds.，1981)。
用作诱饵如NF-κB的核酸可以易于从一个cDNA文库中分离，所述文库具有含有例如SEQ ID NO1-8任一所述核酸序列的一部分的PCR引物和杂交探针。在诱饵如NF-κB中所用的核酸或其变体或片段等优选可与SEQ ID NO1-8所示序列的整体或部分在低严格条件下杂交，所述条件是杂交缓冲液在42℃，基本上含有1％牛血清白蛋白(BSA)，500mM磷酸钠(NaPO4)，1mM EDTA和7％的SDS，洗涤缓冲液是在50℃，基本含有2×SSC(600mM NaCl，60mM柠檬酸钠)及0.1％SDS；更优选在如下低严格条件下杂交即杂交缓冲液在50℃，基本上含有1％牛血清白蛋白(BSA)，500mM磷酸钠(NaPO4)，15％甲酰胺，1mM EDTA和7％的SDS，洗涤缓冲液是在50℃，基本含有1×SSC(300mM NaCl，30mM柠檬酸钠)及1％SDS；最优选在如下的低严格条件下杂交即杂交缓冲液在50℃，基本上含有1％牛血清白蛋白(BSA)，200mM磷酸钠(NaPO4)，15％甲酰胺，1mM EDTA和7％的SDS，洗涤缓冲液基本含有0.5×SSC(150mMNaCl，15mM钠。
基因的“同源性”是指两或多个基因序列之间的相同性程度。因此，某两个基因之间的同源性越高，则其序列之间的相同性或相似性越高。两个基因之间是否具有同源性可以通过直接对比两个序列或者通过在严格条件下杂交进行研究。当直接对比两个基因序列时，如果基因的DNA序列有至少50％，优选至少70％，更优选至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是相同的，则所述基因具有同源性。
本文所用核酸分子的“片段”是指一种多核苷酸，其长度比参比核酸分子的全长短，但足以至少用作本发明中的一个因子。因此，在此所述片段是指一种多核苷酸，其序列长度是参比多核苷酸全长的1至n-1(参比多核苷酸的长度是n)。根据目的可以适当地改变片段的长度。例如，在多核苷酸的情况中，所述片段的长度低限为5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100和更多个核苷酸。由在此未特别说明的整数表示的长度(例如11等)可以是低限。
“可杂交的多核苷酸”是指一种多核苷酸，其可以与其它多核苷酸在上述杂交条件下杂交。特别地，所述可杂交的多核苷酸包括至少一种多核苷酸，其与SEQ ID NO1所示碱基序列具有至少60％同源性，优选具有至少80％同源性的多核苷酸，更优选具有至少95％同源性的多核苷酸。在此所述的同源性是使用例如应用Altschul等(分J.Mol.Biol.215，403-410(1990))所揭示的算法的搜索程序BLAST的分值表示的。因此，除非特别说明，氨基酸和碱基序列的相似性、相同性和同源性对比是利用FASTA，使用默认参数计算的，FASTA是进行序列分析的一个工具。
本文所用基因(例如核酸序列、氨基酸序列等)的“相似性”是指当在上述同源性中保守取代被认为是阳性的(相同)时，两或多个序列之间的相同性的比例。因此，同源性和相似性在存在保守取代的情况中彼此不同。如果保守取代不存在，则同源性和相似性具有一样的值。
本文所用“序列(氨基酸、核苷酸等)的相同性、同源性或相似性百分比”是通过在一个对比窗对比两个最佳排列的序列而确定的，其中对比窗中的多核苷酸或多肽序列的部分与用于两序列间进行最佳对比的参比序列相比可包含添加或缺失(例如缺口)(所述参比序列不包含添加或缺失(如果另一个序列包含添加，则可发生缺口))。所述百分比是通过确定在这两个序列中出现相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数，将匹配的位置数除以参比序列中位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100而计算的，以产生序列相同性百分比。当在一个搜索中使用时，同源性是通过一种合适的技术估值的，所述技术选自本领域熟知的多种序列对比算法和程序。这种算法和程序包括例如但非限于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)2444-2448，Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-410，Thompson et al.，1994，Nucleic Acids Res.22(2)4673-4680，Higginset al.，1996，Methods Enzymol.266383-402，Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-410，Altschul et al.，1993，Nature Genetics 3266-272)。
本文所用术语“相应”基因或序列(例如一种诱饵、启动子序列等)是指一种基因或序列，其具有或预期具有与在一个物种中进行对比参考的一种预定基因或序列相似的功能。当多数这种基因或序列呈现具有这种功能时，这种相应的基因或序列是指具有相同进化起源的基因或序列。因此，相应于给定基因或序列的一个基因可以是给定基因或序列的直向同源基因(ortholog)。因此，相应于小鼠NF-κB基因等的基因可以在其它动物(人、大鼠、猪、牛等)中发现。这种相应的基因可以通过本领域熟知的技术鉴别。因此，例如在一种给定动物中的相应基因可以通过使用一种参比基因(例如小鼠NF-κB基因等)的序列作为查询序列，搜索该动物(例如人、大鼠)的序列数据库而发现。如此本发明包括相应于本发明的特异序列(例如SEQ IDNO1-8任一的序列)的序列。
术语“衍生的寡核苷酸”是指一种寡核苷酸，包括核苷酸的衍生物或者核苷酸之间具有非常规键的衍生物。特别地，这种寡核苷酸例如包括其中磷酸二酯键被转变为硫代磷酸酯(phosphothioate)键的一种衍生的寡核苷酸，其中磷酸二酯键被转变为N3’-P5’氨基磷酸酯键的一种衍生的寡核苷酸，其中核糖和磷酸二酯键被转变为肽-核酸键的一种衍生的寡核苷酸，其中尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的一种衍生的寡核苷酸，其中尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶取代的一种衍生的寡核苷酸，其中胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的一种衍生的寡核苷酸，其中胞嘧啶被吩噁嗪修饰的胞嘧啶取代的一种衍生的寡核苷酸，其中核糖被2’-O-丙炔基核糖取代的一种衍生的寡核苷酸，其中核糖被2’-甲氧基乙氧基核糖取代的一种衍生的寡核苷酸等。
本文所用“生物活性”是指某一因子(例如多核苷酸或多肽)在生物体内所具有的活性，包括呈现多种功能的活性。例如，当某一因子是转录因子时，其生物活性包括调节转录活性的活性。当某一因子是一种酶时，其生物活性包括酶活性。再例如，当某因子是配体时，其生物活性包括与配体相应的受体的结合。在本发明的一个实施方案中，其生物活性包括结合至少一种转录因子的活性。
本文所用“核苷酸”是指任何天然的核苷酸和非天然的核苷酸。“衍生的核苷酸”是指一种核苷酸，其与天然的核苷酸不同但与其起源的天然的核苷酸具有相似的功能。这种衍生的核苷酸是本领域熟知的。
本文所用“变体”是指与原始的物质部分不同的一种物质，如多核苷酸等。这种变体例如包括一种取代变体、添加变体、缺失变体、截短变体、等位基因变体等。等位基因是指位于与相应的基因相同的基因座的一种遗传变体，其中两个基因彼此不同。因此，“等位基因变体”是指与某基因具有等位基因关系的一种变体。核酸分子的“同源物”是指一种核酸分子，其具有的核苷酸序列与参比核酸分子的核苷酸序列具有同源性。代表性地，“同源物”是指一种多核苷酸，其在严格条件下与参比核酸分子杂交。在本发明的核酸分子的情况中，“同源物”是指一种核酸分子，其具有的核酸序列与本发明的诱饵的核酸序列具有同源性，其生物学功能与本发明的启动子的功能相同或相似。因此，“同源物”和“变体”的概念部分重叠。因此，同源物与某一物种中某一基因具有氨基酸或核苷酸同源性(优选至少60％同源性、更优选至少80％、至少85％、至少90％及至少95％同源性)。从本发明的描述中将明了获得这种同源物的方法。例如，本发明的诱饵的同源物可以是在相同物种中的一个同源基因或者在其它物种中的相应基因。因此，本发明的诱饵可包括所述诱饵的所有同源物。
本文所用术语“分离的”生物制剂(例如核酸、蛋白质等)是指从天然的生物体的细胞中的其它生物制剂中基本上分离或纯化的一种生物学制剂(例如在核酸的情况中，除了核酸之外的制剂及具有除了指定的核酸之外的核酸序列的核酸；在蛋白质的情况中，除了蛋白质之外的制剂及具有除了指定蛋白质之外氨基酸序列的蛋白质)。“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。分离的核酸和蛋白质还包括化学合成的核酸和蛋白质。因此，一个实施方案中，本发明的核酸可以是这种分离的核酸。
一方面，本发明提供了治疗和预防炎症疾病或障碍、衍生于这种疾病或障碍的障碍以及关节炎的一种药物组合物；本发明还提供了使用这种组合物治疗和预防炎症疾病或障碍、衍生于这种疾病或障碍的障碍以及关节炎的一种方法。在一个优选的实施方案中，所述组合物包括至少一种NF-κB诱饵和一种药物可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明感兴趣的疾病可以是选自如下一组中的至少一种疾病类风湿性关节炎、骨关节炎、肩关节周炎、颈臂综合征和继发性关节炎。
在另一个实施方案中，上述药物可接受的载体可以是药物可接受的任何载体，优选是脂质体。更优选地，本发明的药物组合物是以HVJ脂质体形式提供的。
本发明中使用的NF-κB诱饵可包含序列GGATTTCCC。更优选地，所述NF-κB诱饵可包含一个序列CCTTGAAGGGATTTCCCTCC(SEQ ID NO1)。在另一个实施方案中，所述NF-κB诱饵可以是进一步修饰的形式。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物和方法可以使用一种直接给药途径应用于疾病部位。
优选地，这种基因由于其在炎症部位和/或关节中表达而可以呈现一种作用。所述基因例如包括NF-κB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets和CRE的诱饵。优选的诱饵例如包括5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’(SEQ ID NO1)(NF-κB诱饵)，5’-GATCTAGGGATTTCCGGGAAATGAAGCT-3’(SEQ ID NO2)(STAT-1诱饵)，5’-AGCTTGAGATAGAGCT-3’(SEQ ID NO3)(GATA-3诱饵)，5’-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAAATCTAT-3’(SEQ ID NO4)(STAT-6诱饵)，5’-AGCTTGTGAGTCAGAAGCT-3’(SEQ ID NO5)(AP-1诱饵)，及5’-AATTCACCGGAAGTATTCGA-3’(SEQ ID NO6)(Ets诱饵)，5’-TGACGTCA-3’(CRE诱饵)，或者其互补寡核苷酸，其变体，或含有它们的化合物。在一个优选的实施方案中，所述药物可接受的载体可以是脂质体。
在本发明中，论证了用与转录因子NF-κB结合的顺式元件诱饵的体内转染用于改善炎症如类风湿性关节炎。
在常规的炎症治疗中，通常使用类固醇或非类固醇抗炎剂。然而，类固醇的应用导致整体的不良作用，肾上腺皮质萎缩，并导致退缩综合征、肾衰竭、糖尿病、满月脸，及类固醇性挫伤、类固醇性溢血、皮肤萎缩、多毛、感染性疾病等局部不良作用。
另外，NF-κB的靶基因包括凋亡相关基因(包括TP53(见Wu H，Lozano G.，J Biol Chem.1994，26920067-74)和c-myc(LaRosa FA，Pierce JW，Sonenshein GE.，Mol Cell Biol.1994，141039-44))。因此，根据本发明的使用针对NF-κB结合位点的诱饵的基因治疗抑制了涉及炎症应答及关节损害的基因表达(包括凋亡)。
诱饵治疗有许多益处，包括瞬时作用、低花费及很少或无并发症。使用裸E2F诱饵的基因治疗已经在临床尝试预防静脉移植(vein-graft)疾病(见Mann MJ.Whittemore AD，Donaldson MC，Belkin M，Conte MS，Polak JF et al.，Lancet.19993541493-8)。
如上所述，应注意诱饵在炎症疾病和关节炎障碍领域中的应用在如下描述中示出。
在后文中，本发明通过实施例进行描述，如下实施例只是为了例证本发明。因此，本发明的范围限于权利要求所述而非实施例所述。
实施例在如下实施例中，举例说明了使用的典型材料和方法。
实施例1NF-κB诱饵对猿胶原性关节炎模型的作用这个实施例测试了NF-κB诱饵在猿胶原性关节炎模型中的作用。通过将NF-κB给予关节内部位测试了对猿II型胶原性关节炎模型的作用。另外，将其效力和毒性与关节内给予类固醇加以对比。在本测试中不应用GLP。
使用的测试物质如下1)测试物质NF-κB诱饵寡核苷酸(后文也称作NF-κB诱饵)(AnGes MG)，(100mg/小瓶，保持在-20℃冷冻)。所用的ODN的序列为NF-κB诱饵ODN，5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’(SEQID NO1)。
2)阳性对照乙酸倍他米松，倍他米松磷酸钠(Rinderon悬浮液，后文称作Rinderon)(SHIONOGI)(组成乙酸倍他米松2mg，倍他米松磷酸钠0.66mg/0.5mL/安瓿)。
3)敏化物质牛II型胶原(Collagen Gijutsu Kenshukai＝CollagenTechnology Instutute)(-20℃，避光保存)。
4)佐剂Freund完全佐剂(Becton Dickinson and Company)(避光保存)。
5)培养基-1盐水(Otsuka Seiyaku Kojo)(在室温保存)。
6)培养基-25mmol/L乙酸盐溶液(由Wako Pure Chemical生产＝乙酸盐，Otsuka Seiyaku Kojo＝盐水)(冷冻保存)。
测试物质及阳性对照物质的制备和给予测试物质和阳性对照物质的制备和给予如下进行制备方法NF-κB诱饵将其加入测试物质小瓶中，加入盐水溶解稀释为6、20和60mg/mL以进行应用，并弃去剩余的溶液。
Rinderon安瓿中的阳性对照物质用盐水稀释。制备0.2mg/mL的乙酸倍他米松。一个安瓿(0.5mL)稀释为10mL(20被稀释)并弃去剩余的溶液。
作为测试动物，将40只猿((恒河猴，专业繁殖饲养(purposebred))，体重2-3.5kg(在驯化起始时)，年龄2-3年，来源于中国(培育地为中国广西南宁Yongwu路14号，中国广西灵长类动物中心(Guangxi Primate Center of China)，邮编530001)，进口方中国国家科学设备及材料进出口公司)驯化，并将其中30只进行给药处理。通常，将猿认为是与人相似的测试动物。其关节形式与人相似，而且其大小相似以及易于评估。因此，使用猿作为模型。就动物应用的伦理标准而言，本发明实施例是根据Shin-Nihon kagaku的动物实验伦理标准的许可进行的。
如下进行培育培育温度设定为26±2℃，培育湿度设定为50±10％。换气周期设定为15次/小时，光照使用人工光照设定为12小时/天(6:00a.m.至6:00p.m.)。使用的培育笼是由不锈钢制成的，而且符合USDA许可，圈养数为1只猿/笼。使用的饲料是固体饲料(Teklad Global经检验合格的25％蛋白质灵长类饲料，Harlan SpragueDawley Inc.)，每天在3:00pm给予一次大约108g(大约12g×9)，在第二天9:00am给予一次，收集剩余的饲料。在进行血液测试、血液生物化学测试、给药及尸检前一天，在大约5:00pm收集剩余的饲料。
饮用水使用自动饮水供应设备(Okasaki Sangyo KabushikiKaisha)随意给予，水质符合Water Works Law的标准。
每日用水对室内进行清洁，并用水清洁笼内的下水道。
动物的鉴别如下个体鉴别在动物胸部纹身编号(SpauldingSpecial Electric Tattoo Marker，Spaulding&Rogers Mfg.，Inc.)。为对猿进行鉴别，使用彩色卡片(具有测试编号、组编号、给药量、性别和动物编号)。
驯化选择40只经检疫的雌性猿称重。驯化阶段设定为在开始给药前3周，其间一天观测一次一般状况，并在开始给药之前7天每天进行一次食物摄取测定，在分组时及驯化结束时对每只动物进行称重。进行一次血液学和血液生物化学测试。详细的方法见“17.观测及测试章节”。
动物分组对从开始驯化及直至开始敏化的前期观测无异常的动物进行分组，以便每组在开始敏化之前一天具有大约相同的平均体重(每组有5只雄性动物，共30只)。未用于该测试的动物作为剩余动物剔除出该测试，并保留作为后备培育动物。
将猿用氯胺酮(盐酸氯胺酮，大约10mg/kg，Sigma Chemical Co.，肌内注射，任选额外的给药途径)，然后在踝关节、膝关节和腕(intracarpus)关节给药(左侧、右侧，共6处)。给药量为0.5mL/关节(踝关节和腕关节)及1.0mg/关节(膝关节)。给药周期如下1-3组和6组6次(两周一次)；4组5次(两周一次，在第四周期后4周(第70天)进行第5次给药)；5组3次(四周一次，在第二次给药后大约6周(第72天)进行第3次给药)。选择猿的给药周期以预测临床应用于人体。给药时间是10:00到中午。
测试方法1)胶原性关节炎模型的制备使用30只雌性恒河猴。将24mg/小瓶牛II型胶原加入6mL的5mmol/L乙酸盐水中，在冰箱中(4℃)搅动24小时使之溶解。在将等量的该溶液和Freund’s完全佐剂混和后，通过充分悬浮产生乳状液。使用一次性注射器和针头为每只猿经皮内注射于背部，给予2mL该乳状液(II型胶原，4mg)以进行敏化(初级敏化)。在初级敏化一周后，在背部经皮内注射背部给予相同成分的乳状液以强化免疫。在氯胺酮e(盐酸氯胺酮e，大约10mg/kg，Sigma Chemical Co.，肌内注射，任选额外的给药途径，记录给药量)麻醉下给予该乳状液。
测试组构成使用对照组1；测试物质4组；及阳性对照物质1组(共6组)进行如下实验。方案示于图3。
表1
*给予膝关节双倍量**与测试物质相似的方式给予盐水***4组第5次给药是在第4周期后4周(第70天)进行，5组的第3次给药是在第2次给药后大约6周(第72天)进行。
在猿II型胶原关节炎模型的测试中，在两周间隔给予10mg/关节NFκB诱饵的有效比为3/4。观测到混杂的诱饵的有效比为1/4。因此，考虑到在临床中的安全性，最大量设定为30mg/关节，随后量设定为10和3mg/关节，总比值(common ratio)为3。另外，由于NFκB诱饵当被掺入细胞核时示出长期的效力，因此还设立四周给予一次30mg量的实验组。由于类固醇(Rinderon)的剂量为2mg/关节，因此猿的剂量根据体重设定为1/20。
观测和测试参数如下。起始给药时间设定为在第0天给药，开始给药的那周设定为给药第1周。
1)一般条件在给药期间进行观测一天一次以上(早晨和中午)，在尸检期间针对所有样例一天一次。关节的肿胀用4个阶段评估(无异常、轻度肿胀、中度肿胀及高度肿胀)，记录结果。
2)饲料量在开始给药之前7天记录饲料数及剩余量，针对所有样例计算饲料量(g)，并计算每周平均量作为该周每日平均量。
3)体重用电子称(HP-40K，A and D，Inc.)在敏化前一天(分组当天)、给药前一天(最后驯化当天)、在开始给药后一周及尸检时针对所有样例测定体重。
4)血液学测试测试频率1-3组和6组在驯化期间、在(给药前)第0、14、28、42、56和70天及尸检时测试一次。
4和5组在驯化期间、第0、14、28、42、56、70天(给药前)及第84天测试一次。
实例数每组中所有样例血液取样方法使用注射器从股静脉中取血样。使用经EDTA-2K抗凝处理的全血。
测试项如下表。
表2
*总血液学测试设备(ADVIA120，BAYER DIAGNOSTICSMANUFACTURINGLTD)5)血液生物化学测试测试频率1-3组和6组在驯化期间、在第0、14、28、42、56和70天(给药前)及尸检时测试一次。
4和5组在驯化期间、第0、14、28、42、56、70天(给药前)及第84天测试一次。
实例数每组中所有样例血液取样方法使用注射器从股静脉放血大约1.2mL血液。在将该样品在室温静置20-40分钟后，在3000rpm离心15分钟，使用所得的血清。
测试项测定CRP(浊度免疫学分析(TIA)，见Clin Chim Acta1977 May 2，76(3)377-88)。
6)X光成像使用便携式X光机(DOP-82S-120-D型，Hitachi Medico，Inc.)在如下日期在氯胺酮麻醉下(使用大约10mg/kg的盐酸氯胺酮，SigmaChemical Co.，肌内注射，任选额外的注射途径，记录给药量)对踝关节，膝关节和腕关节(均为左右侧)进行放射显影分析在1-3组和6组的所有样例中(初级敏化之前)，在第0、14、28、42、56和70天(给药前)及在尸检前一天或当天；在4-5组的所有样例中，在第0、14、28、42和70天(给药前)及在尸检前一天和当天。对腕关节从前面照相(同时右侧和左侧)，对膝关节从前面(同时右侧和左侧)及侧面(单侧横向，从内侧照射，膝弯曲60°)照相，对踝关节从侧面(单侧横向，从内侧照射)照相以获得照片。照射距离设定基本相同。对X光照片进行标记。
7)骨体积测定就所有样例而言，在开始给药之前及在解剖时使用双能量X光吸收分析仪(double energy X-ray absorption analyzer)(DPX-α，LUNAR)测定股骨的远端和胫骨近端(均左右双侧)的骨体积。
8)血液抗胶原抗体值的测定血液取样频率1-3组和6组 在初级敏化之前、第0、14、28、42、56和70天(给药前)及尸检，4-5组 在初级敏化之前、第0、14、28、42和70天(给药前)及第84天。
实例数 每组所有的样例放血体积大约1mL(大约0.4mL血清)。在尸检时及给药第84天时进一步取大约7.5mL(大约3mL血清)。
血液取样方法使用注射器从股静脉取血样。将血液在室温放置20-40分钟，然后在3000rpm离心15分钟获得血清。
将所得血清在-20℃冷冻保存直至使用(在尸检时及给药第84天额外取血清(大约3mL)，在-80℃保存)。将该血清在干冰存在下送至测试请求人(AnGesMG，Inc.)。
测定方法将牛II型胶原包被于一个微滴板(microplate)上形成固相。为测定抗体值，获得的血清用作初级抗体，抗IgG(Fc)、过氧化物酶标记的山羊抗体和猿IgM(Fc)过氧化物酶标记的山羊抗体用作二级抗体以进行ELISA测定。在产生颜色之后使用平板读数器(SEM3400，Iwaki Glass，Inc.)进行测定。
9)关节内内窥镜检查测试频率给药第4、8和12周实例数给药第4周每个未处理组、对照组、NF-κB 30mg组(两周间隔)及给予类固醇组(动物编号4，19和29)均一个。
给药第8和12周未处理组一个、两个对照组(动物编号2和4)、NF-κB 10mg组一个(两周间隔)、NF-κB 30mg组一个(两周间隔)及给予类固醇组(动物编号13，19和29)一个。
测试方法在吸入麻醉或盐酸美托咪定麻醉下将关节内内窥镜插入膝关节。
10)尸检对死亡的样品在称重后迅速尸检，并对腕关节、膝关节和踝关节(左右侧)进行X光照相。另外，将针对关节观测和组织病理学检验而贮存的器官贮存在10％中性缓冲的福尔马林中。针对剩留的器官和组织，进行总体观测。根据负责尸检的人的判断，通过总体观测观测到其中有改变的组织和器官贮存在福尔马林中。根据通过前肢头(forearmcephalic)静脉给药在观测的最后时间给予活样品0.4mL/kg戊巴比妥水溶液(64.8mg/mL)(Tokyo Kasei Kogyo Co.Ltd.)。在麻醉下通过放血进行安乐死之后，将动物通过灌注10％中性缓冲的福尔马林而固定，以与针对死亡样品同样的方式进行观测。当观测到异常时，对其中出现认为是由于给予测试物质所致的变化的动物进行照相。
11)组织病理学检验实例数所有样品标本制备通过灌注而固定后获得器官(指贮存的器官)。切下腕关节、膝关节和踝关节(左右侧)(关节滑膜和关节软骨)，脱钙，在石蜡中包埋，并切成薄片，这些由Shin Nippon BiochemicalLaboratories，Ltd。将每种样品的一个进行H.E.染色的样品和两个未染色的样品送至检测仪。当需要检验其中通过总体观测观测到改变的器官和组织时，根据本领域熟知的及常规使用的技术制备H.E.染色的样品。
贮存的器官心、肺*、支气管、肝、胆囊、肾*、肾上腺*、腕关节*、膝关节*、踝关节*及异常部位。
*是指两侧均贮存的器官。
样本的贮存将上述器官和组织(大器官的一部分)在真空后贮存。
结果本实施例的结果示于图1。在图1中，通过X光照片示出了在猿胶原关节炎模型中由本发明的诱饵对关节的改变。观测到未处理及混杂诱饵无作用，而接受本发明诱饵处理的模型观测到具有显著改善，如抑制滑膜炎症改变、关节肿胀、关节软骨和关节的骨破折。
实施例2NF-κB对大鼠骨关节炎模型的作用这个实施例阐述了NF-κB诱饵组合透明质酸(hyarulonic acid)对大鼠骨关节炎模型的作用。将NF-κB与透明质酸的组合药物经关节内给予大鼠以检测其对大鼠骨关节炎模型的作用。
在切下大鼠的交叉韧带后，经关节内给予用FITC标记的NF-κB诱饵以在一和两个月后研究诱饵转移进软骨中的特性。本测试作为非GLP测试进行。
测试物质如下1)测试物质1NF-κB诱饵寡核苷酸(后文称作NF-κB诱饵)(AnGes MG)(100mg/小瓶，在-20℃冷冻保存)。
2)测试物质2低分子量的透明质酸(ARTS(商标)；SEIKAGAKUCORPORATION，在-20℃贮存)。
3)测试物质3HVJ-E导入的NF-κB(AnGes MG)(0.1mg(NF-κB)，2000 HAU(HVJ-E))，在-20℃贮存。如参考文献(Morishita R，Sugimoto T，Aoki M，Kida I，Tomita N，Moriguchi Aet al.，Nat Med.1997，3894-9)所述制备HVJ病毒-脂质体复合物。简而言之，将磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(Chol)以1∶4.8∶2的重量比混和。将该脂质混合物(10mg)在旋转蒸发器中通过除去溶剂(四氢呋喃)而沉淀在培养瓶的侧壁上。将干燥的脂质在含有200μg的ODN的200μl的生理盐水中水合。通过摇动和超声制备脂质体。将脂质体悬浮液(0.5mL，含有10mg的脂质)与在生理盐水中失活的HVJ(10000血凝单位)混和，总体积为4mL。将该混合物在4℃温育5分钟，然后在30℃轻轻摇动30分钟。通过密度梯度离心从HVJ脂质体中除去游离的HVJ。收集蔗糖梯度的上层应用。ODN的序列如下NF-κB诱饵ODN为5’-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3’(SEQ ID NO1)，混杂诱饵ODN为5’-CATGTCGTCACTGCGCTCAT-3’(SEQ ID NO7)，及5’-ATGAGCGCAGTGACGACATG-3’(SEQ ID NO8)。
测试物质的制备与给予制备方法就测试物质1而言，称重20mg的NF-κB诱饵，在室温溶解于盐水中，如果需要则加以稀释应用。弃去剩余溶液。
就测试物质2而言，在一个安瓿中(2.5mL)含有25mg透明质酸钠的溶液中制备诱饵。
就混杂诱饵而言，如NF-κB诱饵同样制备。
上述制备使用前进行。
对于测试动物，将50只雄性大鼠(Fischer 334品系)(在测试开始时体重250-300g，12周龄，Japan Charles River Inc.，Hino，Gamo-gun，Shiga)驯化，并将其中43只动物进行给药。通常，大鼠广泛用作实验动物，而且易于进行膝关节操作及进行药理学作用评价，因此用作骨关节炎模型。就动物应用伦理标准而言，本发明人根据Osaka大学规定的动物实验伦理标准的许可进行实验。
如下进行动物培养。培育温度设为26±2℃，培育湿度设为50±10％。通风频率设为15次/小时，人工照明为每天12小时(照明时间为6:00am至6:00pm)。培育笼由不锈钢制成，其大小符合USDA标准。圈养动物数设为5只/笼。所用饲料为固体饲料，动物可自由摄食。
饮用水为由自动供水装置(Okazaki Sangyo Co.Ltd.)制备的符合Water Works Law规定的水质标准的水。
动物鉴别个体鉴别应用颜料笼鉴别使用笼卡片(描述测试编号、组别、给药量、动物编号)医学观察和驯化从接受医学观察的动物中选择43个雄性大鼠并称重。操作前1周被确定为驯化期间，在此期间观察一般状况。
动物分组在驯化最后的时间随机选择在驯化期间未显示异常的动物(43个雄性动物)。不进行动物分组。未用作检查的多余动物实行安乐死。
骨关节炎模型的制备随机选择在驯化期间没有显示异常的动物(33个)。为动物肌内注射300μl的Ketalar(氯胺酮)和Celactal(甲苯噻嗪)2∶1的水溶液。在这种麻醉下，暴露膝关节并切断交叉韧带。未用作检查的多余动物实行安乐死。
如下进行给药。选择关节内给药为给药途径，这是为了根据临床给药途径而进行。选择在麻醉下直接注射进大鼠膝关节作为给药方法。关节内给药常规用于大鼠的治疗。给药量为0.05mL/关节，给药频率设定为每周8次。选择这一频率是为了预测人临床情况。
测试方法剂量和动物数将动物分为3组，创建模型。每轮操作数平均化。测试组构成和动物编号如下所示。给药计划如图4所示。
表3 第一操作组
表4 第二操作组
表5 第三操作组
在II型胶原关节炎猿模型测试中，以两周间隔给药NF-κB诱饵10mg/关节，有效率为3/4，同时观察到给予混杂诱饵的有效率为1/4。由于能关节内给予大鼠的最大剂量为0.05mL，因此给予大鼠关节的以相应于10mg/mL猿有效剂量的剂量设定为0.5mg/关节。另外，以相同量给予混杂诱饵，其DNA序列对于NF-κB诱饵是随机化的。
将临床应用的透明质酸与NF-κB诱饵组合给药，并比较NF-κB诱饵的有效性。所使用的HVJ-E如下制备用Triton灭活HVJ病毒并除去其RNA，然后与NF-κB诱饵10mg/mL混合后而将NF-κB诱饵包括进病毒。
将NF-κB诱饵包括进HVJ-E的剂量为25600HAU(1HAU＝1×106病毒)/mg的NF-κB诱饵，每个关节给予约2000HAU。
以这种方式，计算出给药量为0.1mg。因此测定包括NF-κB诱饵的HVJ-E。
观察和检查项目(给药日设定为第0天)如下1)一般状况在给药前1天、给药日给药后立即、之后每日以及尸检日进行观察，并记录存活或死亡样例。在给药日，任选地定期进行观察。
2)体重用电子称(得自A and D Co.Ltd的EP-41KA或HP-40K)对所有样例在开始日、给药日称重，之后每周称重1次，在尸检日也称重。
3)血液学测试实例数所有样例取血样日期尸检时取血样方法用注射器取血样。使用经EDTA-2K进行抗凝血处理的全血。
测试项目如下表6
*多项自动血细胞计数仪(E-4000，Sysmex Co.Ltd.)
**血细胞自动分析仪(MICROX HEG-120A，OMRON)4)血液生化测试样例数所有样例取血样日期尸检时取血样方法取血样后，室温放置40-60分钟，之后在3000rpm离心15分钟以获得血清备用。
测试项目通过免疫比浊法测定CRP。
5)X光成像在尸检时使用小动物X光系统(便携式X光装置，DOP-82S-120D，Hitachi Medico)对麻醉下对后肢进行X光照相。
6)尸检死亡实例在称重后迅速进行尸检，对腕关节、膝关节和踝关节(左右侧)进行X光照相。另外，将欲储存进行关节观察和组织病理学检查的器官储存在10％中性缓冲的福尔马林中。对于其余的器官和组织进行大致观察。根据尸检负责人员的判断，将由大致观察而观察到有变化的组织和器官储存在福尔马林中。存活实例在观察的最后一日在前臂头静脉给予0.4mL/kg戊巴比妥水溶液(64.8mg/mL)(Tokyo Kasei Kogyo Co.Ltd.)。在麻醉下放血安乐死后，以与死亡实例相同的方式观察动物。
7)组织病理学检查样品数从所有实例取后肢膝关节，之后固定、包埋在石蜡中，根据本领域常规方法制备薄切片，进行检查。
样本制备和检查方法将后肢膝关节用10％中性缓冲的福尔马林固定。固定后将样本切片，将样本包埋于石蜡中并制备薄切片，进行H.E.染色，通过显微镜观察染色情况。如果需要特殊染色，由负责检查的人员判断并进行这种染色。
储存的器官膝关节照相对代表性膝关节进行照相。
(结果)在图2中，NF-κB诱饵对骨关节炎大鼠模型的效果以关节的切片照片示出，其中显示了健康供体、胶原衍生关节炎模型以及NF-κB诱饵(10mg、30mg给药)的效果。10mg诱饵给药已经有显著改善，30mg诱饵给药完全消除了关节炎症。这一效果优于类固醇。另外，类固醇处理伴有其所特有的不利作用，但是当使用本发明诱饵时，未发现这种显著的不利作用。
尽管本文描述了一些优选的实施方案，但是这些实施方案不应被看作对权利要求书限定的本发明范围的限制。本领域技术人员在阅读说明书后能够了解并且在不偏离本发明的范围和实质的前提下做出多种其它修饰和等价替换。本文所引用的所有专利、公布的专利申请以及出版物以其全文并入参考。
工业实用性本发明提供了一种使用诱饵而治疗或预防炎症性疾病或障碍的药物组合物。另外，用于本发明治疗方法中的组合物的制备、病毒构建体、试剂盒和药物有充分的工业实用性。本发明被认为具备工业实用性，因为例如制药工业可以不通过医生而工业生产本发明的组合物。本发明方法除了纯粹的医生用药，还可用于临床试验，这是商业目的，因此本发明方法具备工业实用性。另外，直接或间接实施本发明治疗方法在医药业被认为是实用的，因此具备工业实用性。
序列表<110>安琪士多摩奇 株式会社<120>治疗和预防炎症性疾病的诱饵组合物<130>AN008PCT<150>JP2002-156524<151>2002-5-29<160>21<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceNF-κB decoy<300>
<400>1ccttgaaggga tttccctcc 20<210>2<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceSTAT-1 decoy<400>2gatctaggga tttccgggaa atgaagct 28<210>3<211>16<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial SequenceGATA-3 decoy<400>3agcttgagat agagct 16<210>4<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<223>Description of Artificial Sequencescrambled decoy ODN<400>8atgagcgcag tgacgacatg20
权利要求
1.一种治疗和预防炎症性疾病或障碍的药物组合物，其包含至少一种NF-κB诱饵，及一种药物可接受的载体。
2.权利要求1的组合物，其中所述疾病或障碍是选自如下一组的至少一种疾病或障碍肾炎、肝炎、关节炎、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉硬化、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睾炎、睾丸炎。
3.权利要求1的组合物，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
4.权利要求1的组合物，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
5.权利要求1的组合物，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
6.权利要求1的组合物，其适于膝关节给药。
7.权利要求6的组合物，其包含至少10mg所述NF-κB诱饵。
8.权利要求6的组合物，其包含至少30mg所述NF-κB诱饵。
9.一种治疗和预防关节疾病或障碍的药物组合物，其包含至少一种NF-κB诱饵，及一种药物可接受的载体。
10.权利要求9的组合物，其中所述疾病或障碍是选自如下一组的至少一种疾病或障碍类风湿性关节炎、骨关节炎、肩关节周炎、颈臂综合征和继发关节炎。
11.权利要求9的组合物，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
12.权利要求9的组合物，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
13.权利要求9的组合物，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
14.权利要求9的一种组合物，其中所述疾病或障碍是类风湿性关节炎，所述组合物包含至少治疗有效量的所述诱饵。
15.权利要求14的组合物，其中所述治疗有效量是至少0.01mg/kg体重。
16.权利要求9的组合物，其适于膝关节给药。
17.权利要求16的组合物，其包含至少10mg所述NF-κB诱饵。
18.权利要求16的组合物，其包含至少30mg所述NF-κB诱饵。
19.一种治疗或预防炎症性疾病或障碍的方法，包括给予患者一种组合物，所述组合物包含至少一种NF-κB诱饵，及一种药物可接受的载体。
20.权利要求19的方法，其中所述疾病或障碍是选自如下一组的至少一种疾病或障碍肾炎、肝炎、关节炎、急性肾衰竭、慢性肾衰竭、动脉硬化、肾小球性肾炎、肾盂肾炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睾炎、睾丸炎。
21.权利要求19的方法，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
22.权利要求19的方法，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
23.权利要求19的方法，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
24.权利要求19的方法，其中所述组合物适于膝关节给药。
25.权利要求24的方法，其中所述组合物包含至少10mg的NF-κB诱饵。
26.权利要求24的方法，其中所述组合物包含至少30mg的NF-κB诱饵。
27.一种治疗和预防关节疾病或障碍的方法，包括给予患者一种组合物，所述组合物包含至少一种NF-κB诱饵，及一种药物可接受的载体。
28.权利要求27的方法，其中所述疾病或障碍是选自如下一组的至少一种疾病或障碍类风湿性关节炎、骨关节炎、肩关节周炎、颈臂综合征和继发关节炎。
29.权利要求27的方法，其中所述药物可接受的载体是脂质体。
30.权利要求27的方法，其中所述NF-κB诱饵包含一个序列GGATTTCCC。
31.权利要求27的方法，其中所述疾病或障碍是骨关节炎或类风湿性关节炎。
32.权利要求27的方法，其中所述疾病或障碍是类风湿性关节炎，所述诱饵的量是至少治疗有效量。
33.权利要求27的方法，其中所述治疗有效量是至少0.01mg/kg体重。
34.权利要求27的方法，其中所述组合物适于膝关节给药。
35.权利要求34的方法，其中所述组合物包含至少10mg的NF-κB诱饵。
36.权利要求34的方法，其中所述组合物包含至少30mg的NF-κB诱饵。
37.至少一种NF-κB诱饵在生产治疗和预防炎症性疾病或障碍的药物中的应用。
38.至少一种NF-κB诱饵在生产治疗和预防关节疾病或障碍的药物中的应用。
全文摘要
本发明目的是有效治疗炎症性疾病而不引起副作用。这个目的可以通过提供一种治疗和预防炎症性疾病和障碍和由所述疾病和障碍引起的障碍的药物组合物实现，所述组合物含有至少一种NF－κB诱饵或类似的转录因子及一种药物可接受的载体；本发明还提供了治疗和预防的方法。
文档编号A61P19/02GK1671424SQ0381816
公开日2005年9月21日 申请日期2003年5月20日 优先权日2002年5月29日
发明者富田哲也, 吉川秀树, 森下竜一 申请人:安琪士多摩奇株式会社