专利名称：人体组织工程皮肤的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人体组织工程皮肤的制备方法，它是由具生物活性的人体表皮角元细胞及真皮成纤维细胞培养而成的，具有与人体皮肤十分类似的组织结构。可在临床上应用于治疗难愈性糖尿病性足底溃烂，静脉性溃疡以及烧伤，烫伤等皮肤创伤。
背景技术：
根据中华医学会糖尿病病分会的最新流行病学调查资料，我国有近4000万糖尿病患者，其常见慢性并发症之一是糖尿病性足底溃烂，应用常规的清创和盐水敷裹治疗，伤口愈合缓慢，愈合率低。而应用清创及该发明的人工皮肤移植治疗，伤口愈合时间明显缩短，愈合率明显提高。此外，我国烧伤病人的数目也十分惊人，达数十万之多。深度烧伤创面的修复往往需要植皮。目前，对小面积深度烧伤多采用自体皮肤移植，然而，大面积深度烧伤时，自体供皮困难，采用结构与功能和人体皮肤十分相似的人工皮肤移植，是最优选择。与自体皮肤移植一样，人体组织工程皮肤移植可促进创面的愈合，减少体液丢失，减少疤痕的形成，避免感染，减轻痛苦，并使创面皮肤得以早期修复。在过去的十年里，人工皮肤的研究和制备技术不断深入和提高。虽有与本发明比较接近的现有技术专利，但其人体复合皮肤由培养的角元细胞表皮层及成分多元的基质凝胶和培养的成纤维细胞形成的真皮层组成。这种复合皮肤有其优点。但它存在以下缺点真皮基质形成过程中使用的成分多元，包括胃蛋白酶，壳多糖，弹性蛋白，透明质酸，硫酸软骨素，硫酸肝素，以及纤维粘连蛋白等，溶液种类繁多，而且工序十分复杂，特别是使用人胶原，取材困难，容易引发免疫疾病，造价昂贵，不利于大量生产及推广应用，至今未见有临床应用报导。另有专利文献JP97,173,362，于1997年7月8日公开的日本专利。其基质材料为胶原，甲壳素，壳多糖，明胶，透明质酸，硫酸软骨素和聚乙醇酸，细胞源自哺乳动物皮肤，经培养，冻干后制作的皮肤虽可长期保存，但它存在着以下缺点利用氨气中和制作的胶原凝胶，不利于细胞的生长发育；抵抗胶原酶消化和抗感染能力较差；由於细胞培养的时间过短，培养出的人工皮肤在其结构上与天然皮肤有较大差距，临床应用效果不佳；且基质成分复杂。
发明内容
本发明提供了一种人体组织工程皮肤的制备方法，包括人体表皮角元细胞及成纤维细胞的培养制备，溶液的配制，基质凝胶的形成及复合皮肤的培养。其基质原料和工艺技术都有别于现有技术，弥补了现有技术的不足。本发明的人体组织工程皮肤无论在生物学及物理学特征上，还是在组织学检查及临床结果方面都比现有技术要好，可大批量生产，并可直接应用于临床。
本发明是由以下技术方案来实现的。
它包括下述步骤(1)人体表皮角元细胞的制备将新鲜离体人体皮肤0.8-1.2平方厘米放入磷酸缓冲液中，震荡2-4分钟，重复2-4次，再换到新的磷酸缓冲液内；然后将组织取出放入培养皿中，加入表皮细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，培养20-24小时；剪碎至0.05～0.1平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，让组织干燥；加入表皮细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，每2-4天换培养液1次，10-25天后可收集细胞；(2)成纤维细胞的培养制备将新鲜离体人体皮肤0.8-1.2平方厘米放入磷酸缓冲液中，震荡2-4分钟，重复2-4次，再换到新的磷酸缓冲液内；然后将组织取出放入培养皿中，加入成纤维细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，培养24-28小时；剪碎至0.1～0.4平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，让组织干燥；加入成纤维细胞培养液；置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，8-10天后可长出成纤维细胞，再8-10天后可进行分盘培养，共可培养5～6代；(3)溶液的配制表皮细胞培养液的配制甲液加入0.1-0.5毫克/毫升的表皮细胞特异生长因子，0.5-2毫克/毫升清蛋白，0.4-0.6毫克/毫升透明质酸，0.6-0.9毫克/毫升硫酸软骨素，0.001-0.01毫克/毫升白细胞介素，0.001-0.008毫克/毫升干扰素，0.002-0.01毫克/毫升胰岛素，0.001-0.005毫克/毫升甲状腺素，0.002-0.008毫克/毫升霍乱毒素；乙液取8份含15-20％小牛血清的DMEM培养基与2份F12培养基混合；最后取1份甲液与9份乙液混合均匀；成纤维细胞培养液的配制丙液加入0.1-0.8毫克/毫升的成纤维细胞特异生长因子，0.6-6毫克/毫升弹性蛋白，0.4-0.6毫克/毫升透明质酸，0.6-0.9毫克/毫升硫酸软骨素，0.001-0.01毫克/毫升白细胞介素，0.001-0.008毫克/毫升干扰素，0.002-0.01毫克/毫升胰岛素，0.001-0.005毫克/毫升甲状腺素，0.002-0.008毫克/毫升霍乱毒素；丁液取8份含15-20％小牛血清的DMEM培养液与2份F12培养液混合；最后取1份丙液与9份丁液混合均匀；所述的表皮细胞培养液配制的甲液中还可以加入0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸)和200单位/毫升青，链酶素。
所述的成纤维细胞培养液配制的丙液中还可以加入0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸)和200单位/毫升青，链酶素。
(4)基质凝胶的形成将浓度为3毫克/毫升的I型猪胶原蛋白8份，10倍浓度F12的培养液1份，0.1摩尔浓度的氢氧化钠溶液0.5份，在冰浴中混合后，加入0.5份含3×106的成纤维细胞的F12培养液；然后分别取上述5-6毫升的这一成纤维细胞和凝胶混合液到100毫米滤膜培养皿中，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，使其凝固；再加DMEM培养液，于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中培养7-10天；(5)复合皮肤的培养将培养成熟的表皮角元细胞接种于已制备好的基质凝胶上，加表皮细胞培养液，放入恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中培养，每2-4天换培养液1次，7-10天后将滤膜培养皿内的培养液吸干，外周仍用表皮细胞培养液，再培养10-15天；(6)保存与运输将培养成熟的复合皮肤置于表皮细胞培养液的琼脂固体培养基上，于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳保存箱内运输。
本发明与现有技术比较具有如下特点
1)培养液的改进经过一系列的对比试验，本发明专门设计出FAD-I型和FAD-II型培养液。除了含有基本的营养成分和因子外，FAD-I型培养液含表皮角元细胞特异生长因子(EKGF)，用于表皮角元细胞的独立培养；FAD-II型培养液则含有成纤维细胞特异生长因子(FBGF)，用于成纤维细胞的独立培养。FAD-I型和FAD-II型二合一培养液则用于复合皮肤的培养。运用FAD-I型和FAD-II型培养液分别培养表皮角元细胞和成纤维细胞，可使这两种细胞的增殖速率显著高于某些报道所使用的DMEM培养液。
2)保存和运输本发明特别设计的FAD-I型和FAD-II型琼脂固体培养基能够保养滋嫩成熟的复合皮肤达7至10天仍具有完好的生物学活性，可成功地用于植皮。早于报道过的5天。
3)凝胶配制本发明的凝胶配制使用I型猪胶原蛋白，完全不同于已报道过得人胶原和牛胶原。首先，猪胶原取材极为容易，从而解决了人胶原取材极为不易的难题；猪胶原蛋白的氨基酸组成比例及蛋白质构象比牛胶原蛋白更接近人胶原蛋白，因此，含猪胶原蛋白的人工皮肤更安全更容易被人体组织所接纳，融合。
按照本发明所述方法制备的人工皮肤具备良好的生物学，组织学和物理学特征，它具有良好的弹性和柔韧性，抗压力和拉力的能力强，其大小和形状可随创面而改变，移植手术简单；有保护，分泌，和代谢功能，能够防止微生物的侵袭和感染；移植后换药次数减少，术后护理也简单。组织学检查显示，人工皮肤表皮分化良好，层次清楚，有角质层，棘层，基底层，真皮层由成纤维细胞均匀分布于基质内而成。与真实皮肤不同是本发明的人工皮肤不含色素细胞，郎格罕氏细胞，巨嗜细胞，白细胞，也没有血管，毛囊，汗腺等结构，故免疫排斥反应机率极少。
临床实验结果表明，移植后的人工皮肤能很快覆盖创面并与周围皮肤融合成一体，产生边缘效应，渐渐地真皮层中有大量的血管腔形成，胶原排列由紊乱变成规则的水平排列，表皮分化良好，有表皮钉突形成。
具体实施例方式
实施例1(A)将新鲜离体人体皮肤(保存于0.1摩尔浓度的磷酸缓冲液(PBS)，pH7.4，4度，少于24小时)0.8平方厘米从磷酸缓冲液管转入含10单位青霉素和链霉素/毫升的磷酸缓冲液管(20毫升)。震荡2分钟，重复2次，再换到新的只含20毫升磷酸缓冲液管内。然后将组织取出放入培养皿中，去掉多余的皮下组织，转到新的培养皿，加入表皮细胞培养液(FAD-I)，置于37度温箱，培养20小时。之后，转入新的培养皿中，剪碎至0.05平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，放在通风箱中1小时，让组织干燥，粘附于培养皿底部。轻轻地加入表皮细胞培养液(FAD-I)，放入37度温箱培养，每2天换培养液1次，2天后角元细胞长出，10天后可收集角元细胞。(B)将新鲜离体人体皮肤(保存于0.1摩尔浓度的磷酸缓冲液(PBS)，pH7.4，4度，少于24小时)0.8平方厘米从磷酸缓冲液管转入含10单位青霉素和链霉素/毫升的磷酸缓冲液管(20毫升)。震荡2分钟，重复2次，再换到新的只含30毫升磷酸缓冲液管内。然后将组织取出放入培养皿中，去掉多余的皮下组织，转到新的培养皿，加入成纤维细胞培养液(FAD-II)，置于37度温箱，培养24小时。之后，转入新的培养皿中，剪碎至0.1平方毫米大小，均匀地将它们分布在培养皿中，放在通风箱中2小时，让组织干燥，粘附于培养皿底部。最后加入成纤维细胞培养液(FAD-II)。在37度温箱内培养8天后可长出成纤维细胞，再8天后可进行分盘培养，共可培养5代。(C)将浓度为3毫克/毫升的高度纯化的I型猪胶原蛋白8毫升加入10倍浓度F12的培养液1毫升，再加入0.1摩尔浓度的氢氧化钠(NaOH)溶液0.5毫升，在冰浴中(1-4度)混合后(pH7.4)，加入3×106的成纤维细胞。然后分别取5毫升的这一成纤维细胞和凝胶混合液到100毫米滤膜培养皿中，置37度温箱内1小时使其凝固。再加DMEM培养液，37度温箱内培养7天。(D)将培养成熟的表皮角元细胞接种于已制备好的基质凝胶上，加FAD-I培养液，放入37度温箱培养，7天后将滤膜培养皿内的培养液吸干，外周仍用FAD-I培养液，再培养10天。
所述的表皮细胞培养液(FAD-I)的配制是在无菌条件下配制如下溶液甲液在0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸，PH7.4，)(HEPES)中，加入0.1毫克/毫升的表皮细胞特异生长因子(EFC)，0.5毫克/毫升清蛋白，200单位/毫升青，链酶素，0.4毫克/毫升透明质酸，0.6毫克/毫升硫酸软骨素，0.001毫克/毫升白细胞介素，0.001毫克/毫升干扰素，0.002毫克/毫升胰岛素，0.001毫克/毫升甲状腺素，0.002毫克/毫升霍乱毒素；乙液取8份含15％小牛血清的DMEM培养基与2份F12培养基混合；最后取1份甲液与9份乙液混合均匀。
所述的成纤维细胞培养液(FAD-II)的配制是在无菌条件下配制如下溶液丙液在0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸，PH7.4，)(HEPES)中，加入0.1毫克/毫升的成纤维细胞特异生长因子(FBGF)，0.6毫克/毫升弹性蛋白，200单位/毫升青，链酶素，0.4毫克/毫升透明质酸，0.6毫克/毫升硫酸软骨素，0.001毫克/毫升白细胞介素，0.001毫克/毫升干扰素，0.002毫克/毫升胰岛素，0.001毫克/毫升甲状腺素，0.002毫克/毫升霍乱毒素；丁液取8份含15％小牛血清的DMEM培养液与2份F12培养液混合；最后取1份丙液与9份丁液混合均匀。
实施例2(A)将新鲜离体人体皮肤1平方厘米从磷酸缓冲液管转入含10单位青霉素和链霉素/毫升的磷酸缓冲液管。震荡3分钟，重复3次，再换到新的只含20毫升磷酸缓冲液管内。然后将组织取出放入培养皿中，去掉多余的皮下组织，转到新的培养皿，加入表皮细胞培养液(FAD-I)，置于37度温箱，培养22小时。之后，转入新的培养皿中，剪碎至0.08平方毫米大小，均匀地将它们分布在培养皿中，放在通风箱中1小时，让组织干燥，粘附于培养皿底部。轻轻地加入表皮细胞培养液，放入37度温箱培养，每2天换培养液1次，约2天后角元细胞长出，约12天后可收集角元细胞。(B)将新鲜离体人体皮肤1平方厘米从磷酸缓冲液管转入含10单位青霉素和链霉素/毫升的磷酸缓冲液管。震荡3分钟，重复3次，再换到新的只含30毫升磷酸缓冲液管内。然后将组织取出放入培养皿中，去掉多余的皮下组织，转到新的培养皿，加入成纤维细胞培养液(FAD-II)，置于37度温箱，培养26小时。之后，转入新的培养皿中，剪碎至0.3平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，放在通风箱中2小时，让组织干燥，粘附于培养皿底部。最后加入的成纤维细胞培养液。在37度温箱内培养约9天后可长出成纤维细胞，再9天后可进行分盘培养，共可培养6代。(C)将浓度为3毫克/毫升的高度纯化的I型猪胶原蛋白8毫升加入F12/10倍浓度的培养液1毫升，再加入0.1摩尔浓度的氢氧化钠溶液0.5毫升，在冰浴中混合后(pH7.4)，加入3×106的成纤维细胞。然后分别取5毫升的这一成纤维细胞和凝胶混合液到100毫米滤膜培养皿中，置37度温箱内1小时使其凝固。再加DMEM培养液，37度温箱内培养7天。(D)将培养成熟的表皮角元细胞接种于已制备好的基质凝胶上，加FAD-I培养液，放入37度温箱培养，7天后将滤膜培养皿内的培养液吸干，外周仍用FAD-I培养液，再培养10天。
所述的表皮细胞培养液(FAD-I)的配制是在无菌条件下配制如下溶液甲液在0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸，PH7.4，)(HEPES)中，加入0.25毫克/毫升的表皮细胞特异生长因子(EFC)，1毫克/毫升清蛋白，200单位/毫升青，链酶素，0.5毫克/毫升透明质酸，0.7毫克/毫升硫酸软骨素，0.005毫克/毫升白细胞介素，0.005毫克/毫升干扰素，0.006毫克/毫升胰岛素，0.002毫克/毫升甲状腺素，0.005毫克/毫升霍乱毒素；乙液取8份含18％小牛血清的DMEM培养基与2份F12培养基混合；最后取1份甲液与9份乙液混合均匀。
所述的成纤维细胞培养液(FAD-II)的配制是在无菌条件下配制如下溶液丙液在0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸，PH7.4，)(HEPES)中，加入0.5毫克/毫升的成纤维细胞特异生长因子(FBGF)，3毫克/毫升弹性蛋白，200单位/毫升青，链酶素，0.5毫克/毫升透明质酸，0.8毫克/毫升硫酸软骨素，0.005毫克/毫升白细胞介素，0.005毫克/毫升干扰素，0.006毫克/毫升胰岛素，0.003毫克/毫升甲状腺素，0.005毫克/毫升霍乱毒素；丁液取8份含18％小牛血清的DMEM培养液与2份F12培养液混合；最后取1份丙液与9份丁液混合均匀。
实施例3(A)将新鲜离体人体皮肤1.2平方厘米从磷酸缓冲液管转入含10单位青霉素和链霉素/毫升的磷酸缓冲液管。震荡4分钟，重复4次，再换到新的只含20毫升磷酸缓冲液管内。然后将组织取出放入培养皿中，加入表皮细胞培养液(FAD-I)，置于37度温箱，培养24小时。之后，转入新的培养皿中，剪碎至0.1平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，组织经干燥后，粘附于培养皿底部。加入表皮细胞培养液(FAD-I)，放入37度温箱培养，每2天换培养液1次，3天后角元细胞长出，15天后可收集角元细胞。(B)将新鲜离体人体皮肤1.2平方厘米从磷酸缓冲液管转入含10单位青霉素和链霉素/毫升的磷酸缓冲液管。震荡4分钟，重复4次，再换到新的只含30毫升磷酸缓冲液管内。然后将组织取出放入培养皿中，加入成纤维细胞培养液(FAD-II)，置于37度温箱，培养28小时。之后，转入新的培养皿中，剪碎至0.4平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，组织经干燥后，粘附于培养皿底部。最后加入的成纤维细胞培养液(FAD-II)。在37度温箱内培养10天后可长出成纤维细胞，再10天后可进行分盘培养，共可培养6代。(C)将浓度为3毫克/毫升的高度纯化的I型猪胶原蛋白8毫升加入10倍浓度F12的培养液1毫升，再加入0.1摩尔浓度的氢氧化钠溶液0.5毫升，在冰浴中混合后(pH7.4)，加入3×106的成纤维细胞。然后分别取6毫升的这一成纤维细胞和凝胶混合液到100毫米滤膜培养皿中，置37度温箱内1小时使其凝固。再加DMEM培养液，37度温箱内培养7天。(D)将培养成熟的表皮角元细胞接种于已制备好的基质凝胶上，加FAD-I培养液，放入37度温箱培养，7天后将滤膜培养皿内的培养液吸干，外周仍用FAD-I培养液，再培养10天。
所述的表皮细胞培养液(FAD-I)的配制是在无菌条件下配制如下溶液甲液在0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸)，PH7.4，(HEPES)中，加入0.5毫克/毫升的表皮细胞特异生长因子(EFC)，2毫克/毫升清蛋白，200单位/毫升青，链酶素，0.6毫克/毫升透明质酸，0.9毫克/毫升硫酸软骨素，0.01毫克/毫升白细胞介素，0.008毫克/毫升干扰素，0.01毫克/毫升胰岛素，0.005毫克/毫升甲状腺素，0.008毫克/毫升霍乱毒素；乙液取8份含20％小牛血清的DMEM培养基与2份F12培养基混合；最后取1份甲液与9份乙液混合均匀。
所述的成纤维细胞培养液(FAD-II)的配制丙液在0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸，PH7.4，)(HEPES)中，加入0.8毫克/毫升的成纤维细胞特异生长因子(FBGF)，6毫克/毫升弹性蛋白，200单位/毫升青，链酶素，0.6毫克/毫升透明质酸，0.9毫克/毫升硫酸软骨素，0.01毫克/毫升白细胞介素，0.008毫克/毫升干扰素，0.01毫克/毫升胰岛素，0.005毫克/毫升甲状腺素，0.008毫克/毫升霍乱毒素；丁液取8份含20％小牛血清的DMEM培养液与2份F12培养液混合；最后取1份丙液与9份丁液混合均匀。
所述的人体皮肤可以采用死亡的新生儿包皮或新生儿包皮，早产儿包皮或早产儿皮肤，成人包皮等。
实施例4裸鼠皮肤移植实验用本发明的人工组织工程皮肤对背部皮肤缺失的裸鼠进行皮肤移植试验。移植第5天起，人工皮肤已与周围正常组织迅速融合，应用组织学方法已可观察到微血管开始向人工皮肤的真皮成纤维细胞层内生长。随着时间的推移，微血管越来越丰富，成纤维细胞增殖显著，细胞外基质分泌丰富。表皮角元细胞生长分化状况良好，层次分明。术后二周，创面愈合良好。
权利要求
1.一种人体组织工程皮肤的制备方法，其特征在于它包括下述步骤(1)人体表皮角元细胞的制备将新鲜离体人体皮肤0.8-1.2平方厘米放入磷酸缓冲液中，震荡2-4分钟，重复2-4次，再换到新的磷酸缓冲液内；然后将组织取出放入培养皿中，加入表皮细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，培养20-24小时；剪碎至0.05～0.1平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，让组织干燥；加入表皮细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，每2-4天换培养液1次，10-25天后可收集细胞；(2)成纤维细胞的培养制备将新鲜离体人体皮肤0.8-1.2平方厘米放入磷酸缓冲液中，震荡2-4分钟，重复2-4次，再换到新的磷酸缓冲液内；然后将组织取出放入培养皿中，加入成纤维细胞培养液，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，培养24-28小时；剪碎至0.1～0.4平方毫米，均匀地将它们分布在培养皿中，让组织干燥；加入成纤维细胞培养液；置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，8-10天后可长出成纤维细胞，再8-10天后可进行分盘培养，共可培养5～6代；(3)溶液的配制表皮细胞培养液的配制甲液加入0.1-0.5毫克/毫升的表皮细胞特异生长因子，0.5-2毫克/毫升清蛋白，0.4-0.6毫克/毫升透明质酸，0.6-0.9毫克/毫升硫酸软骨素，0.001-0.01毫克/毫升白细胞介素，0.001-0.008毫克/毫升干扰素，0.002-0.01毫克/毫升胰岛素，0.001-0.005毫克/毫升甲状腺素，0.002-0.008毫克/毫升霍乱毒素；乙液取8份含15-20％小牛血清的DMEM培养基与2份F12培养基混合；最后取1份甲液与9份乙液混合均匀；成纤维细胞培养液的配制丙液加入0.1-0.8毫克/毫升的成纤维细胞特异生长因子，0.6-6毫克/毫升弹性蛋白，0.4-0.6毫克/毫升透明质酸，0.6-0.9毫克/毫升硫酸软骨素，0.001-0.01毫克/毫升白细胞介素，0.001-0.008毫克/毫升干扰素，0.002-0.01毫克/毫升胰岛素，0.001-0.005毫克/毫升甲状腺素，0.002-0.008毫克/毫升霍乱毒素；丁液取8份含15-20％小牛血清的DMEM培养液与2份F12培养液混合；最后取1份丙液与9份丁液混合均匀；(4)基质凝胶的形成将浓度为3毫克/毫升的I型猪胶原蛋白8份，10倍浓度F12的培养液1份，0.1摩尔浓度的氢氧化钠溶液0.5份，在冰浴中混合后，加入0.5份含3×106的成纤维细胞的F12培养液；然后分别取上述5-6毫升的这一成纤维细胞和凝胶混合液到100毫米滤膜培养皿中，置于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中，使其凝固；再加DMEM培养液，于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中培养7-10天；(5)复合皮肤的培养将培养成熟的表皮角元细胞接种于已制备好的基质凝胶上，加表皮细胞培养液，放入恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳的环境中培养，每2-4天换培养液1次，7-10天后将滤膜培养皿内的培养液吸干，外周仍用表皮细胞培养液，再培养10-15天；(6)保存与运输将培养成熟的复合皮肤置于表皮细胞培养液的琼脂固体培养基上，于恒定37℃，95％氧气和5％二氧化碳保存箱内运输。
2.根据权利要求1所述的人体组织工程皮肤的制备方法，其特征在于所述的表皮细胞培养液配制的甲液中还可以加入0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸)和200单位/毫升青，链酶素。
3.根据权利要求1所述的人体组织工程皮肤的制备方法，其特征在于所述的成纤维细胞培养液配制的丙液中还可以加入0.1摩尔浓度的N-(2-羟乙基)六氢比秦-N-(2-乙磺酸)和200单位/毫升青，链酶素。
全文摘要
本发明涉及一种人体组织工程皮肤的制备方法，包括下述步骤(1)人体表皮角元细胞的制备；(2)成纤维细胞的培养制备；(3)表皮细胞培养液的配制和成纤维细胞培养液的配制；(4)基质凝胶的形成；(5)复合皮肤的培养；(6)保存与运输。其基质原料和工艺技术都有别于现有技术，弥补了现有技术的不足。本发明的人体组织工程皮肤无论在生物学及物理学特征上，还是在组织学检查及临床结果方面都比现有技术要好，可大批量生产，并可直接应用于临床。
文档编号A61L27/60GK1607012SQ200310104830
公开日2005年4月20日 申请日期2003年10月13日 优先权日2003年10月13日
发明者刘凯 申请人:刘凯