对鲍氏志贺氏菌10型的o-抗原特异的核苷酸的制作方法

专利名称：对鲍氏志贺氏菌10型的o-抗原特异的核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及鲍氏志贺氏菌10型(Escherichia coli O54)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及鲍氏志贺氏菌10型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的鲍氏志贺氏菌10型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术：
鲍氏志贺氏菌10型是一种致病菌。志贺氏菌是随着人类进化而发展起来的致病菌，能侵袭结肠膜上皮细胞，导致自限性化脓性感染病灶，引起人类的细菌性痢疾。人类对志贺氏菌有较高的敏感性，只需要少于十个菌就可以引起人的感染，儿童和成人易感染，特别是儿童，易引起急性中毒性痢疾，而志贺氏菌的O-抗原是志贺氏菌引起疾病的主要原因之一。
位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank et al(1987)“The function of ant ibody and complement in the lysis of bacteria”.RevInfect Dis 1771750-1753.Pluschke G et al“Role of the capsule andthe O-antigen in resistance of O18K1Escherichia coli tocomplement-mediated king.J Bacteriol 42907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-178；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galf和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly.conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容
本发明的目的是提供了一种对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸。它是鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因、糖基转移酶基因及orf8基因的特异的核苷酸。
本发明的一个目的是提供了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的次一目的是提供了构成鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的基因转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5基因；糖合成路径基因，包括manB、manC；未知功能的orf8基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5基因和未知功能的orf8基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原及检测和鉴定鲍氏志贺氏菌10型。
本发明的再一目的是提供了分离鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长13402个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO1的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因包括转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5基因；功能未知的orf8基因；其中所述的转运酶基因是SEQID NO1中的10458至11870碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的3195至4247碱基的核苷酸；所述的orf1基因是SEQ ID NO1中的1098至2066碱基的核苷酸；所述的orf2基因是SEQ ID NO1中的2059至3168碱基的核苷酸；所述的orf4基因是SEQ ID NO1中的4240至5331碱基的核苷酸；所述的off5基因是SEQ ID NO1中的5306至6424碱基的核苷酸；所述的orf8基因是SEQ ID NO1中的9468至10424碱基的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因或orf8基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10757至10774碱基的核苷酸和11648至11665碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10889至10906碱基的核苷酸和11915至11932碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的3538至3555碱基的核苷酸和4039至4056碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3418至3435碱基的核苷酸和3711至3728碱基的核苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9524至9541碱基的核苷酸和10154至10171碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9581至9598碱基的核苷酸和10378至10395碱基的核苷酸。
前述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，可用这些方法检测人体和环境中的细菌。
前述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养鲍氏志贺氏菌10型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟；之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌10型中的O-抗原基因簇以鲍氏志贺氏菌10型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)；用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5□细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌10型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的结构。
(6)特异基因筛选针对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中wzx、wzy、orf8基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，源于wzx、wzy基因的所有引物都在鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型中得到阳性结果，而源于orf8基因的两对引物只在鲍氏志贺氏菌10型中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小。所以wzx、wzy基因对鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型及其O-抗原都是高度特异的，而orf8基因对鲍氏志贺氏菌10型及其O-抗原是高度特异的。
也就是，本发明的第一个方面，提供了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长13402个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它的9个基因都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括manB、manC基因；未知功能的orf8基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因和orf8基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因、糖基转移酶基因和orf8基因对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原是特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5及orf8基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的源于鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因及orf8基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表1中的退火温度进行。源于wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对在以鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。源于orf8基因的寡核苷酸对只在鲍氏志贺氏菌10型中得到预期大小的产物。更详细地说，源于orf8基因的寡核苷酸对在鲍氏志贺氏菌6型中得到的PCR产物都比在鲍氏志贺氏菌10型中得到的PCR产物大得多，因此可通过PCR产物的大小区分开这两个菌，所以orf8基因内的两对寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌10型及其O-抗原都是高度特异的。所以，可以确定表1所列的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌10型及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤1)基因组的提取；2)PCR扩增鲍氏志贺氏菌10型中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶基因、编码聚合酶基因、编码糖基转移酶基因及orf8基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的10458至11870碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的3195至4247碱基)和orf8基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1中的9468至10424碱基)的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌10型都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5；源于orf8基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因及orf8基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5及未知功能的orf8基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌10型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因，编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因和编码糖基转移酶基因包括orf1、orf2、orf4、orf5及未知功能的orf8基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由鲍氏志贺氏菌10型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5及未知功能的orf8基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是鲍氏志贺氏菌10型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因，源于编码糖基转移酶基因包括orf1、orf2、orf4、orf5及未知功能的orf8基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因，(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5及未知功能的orf8基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是鲍氏志贺氏菌10型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因及糖基转移酶基因包括orf1、orf2、orf4、orf5及未知功能的orf8基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养鲍氏志贺氏菌10型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌10型中的O-抗原基因簇以鲍氏志贺氏菌10型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTCGC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的WizardPCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇文库。
实施例4对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌10型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1与鲍氏志贺氏菌6型(Shigella boydii6)的WbaS在322个氨基酸中有100％的相同性，100％的相似性，而WbaS是一个糖基转移酶，所以可以确定orf1也是一个糖基转移酶基因，命名为orf1。orf2与鲍氏志贺氏菌6型的WbaT在369个氨基酸中有100％的相同性，100％的相似性，而WbaT是一个糖基转移酶，所以可以确定orf2也是一个糖基转移酶基因，命名为orf2。orf3与鲍氏志贺氏菌6型的Wzy在360个氨基酸中有100％的相同性，100％的相似性，而Wzy是O-抗原聚合酶。用TMHMM2.0和SMART软件分析都表明orf3编码的蛋白中含有10个跨膜片段，具有O-抗原聚合酶(Wzy)的典型特征。所以可以确定orf3就是wzy基因，命名为wzy。Orf4与鲍氏志贺氏菌6型的WbaX在363个氨基酸中有100％的相同性，100％的相似性，而WbaX是一个糖基转移酶，所以可以确定orf4也是一个糖基转移酶基因，命名为orf4。Orf5与鲍氏志贺氏菌6型的WbaY在372个氨基酸中有99％的相同性，99％的相似性，而WbaY是一个糖基转移酶，所以可以确定orf5也是一个糖基转移酶基因，命名为orf5。orf6与鲍氏志贺氏菌6型的ManC在478个氨基酸序列中有99％的相同性，100％的相似性，所以orf6被命名为manC。Orf7与鲍氏志贺氏菌6型的ManB在456个氨基酸序列中有99％的相同性，99％的相似性，所以orf7被命名为manB。Orf8与Azotobactervinelandii的一个未知功能的蛋白在314个氨基酸中有40％的相同性，58％的相似性，orf8的功能也未知，所以被命名为orf8。Orf9与鲍氏志贺氏菌6型的Wzx在470个氨基酸中有99％的相同性，99％的相似性，而Wzx是O-抗原转运酶，而且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179125-142]发现orf9有10个潜在的穿膜区，它与许多wzx蛋白相似，而且在wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf9是wzx基因，命名为wzx。另外，在鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中，orf9位于负链上。分析表明，除了Orf8外，鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇与鲍氏志贺氏菌6型的O-抗原基因簇几乎是一样的。在鲍氏志贺氏菌6型的O-抗原基因簇中，orf8的内部有一个插入序列，使orf8失去了功能[Wang L.，W Qu and P.R.Reeves(2001)Sequence analysis of four Shigella boydiiO-antigen lociimplication for Escherichia coli and Shigellarelationships.Infection and Immunity.696923-6930.]。
实施例6特异基因的筛选针对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中的wzy、wzx、orf8基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了鲍氏志贺氏菌10型的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因和orf8基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。
在第23组中含有鲍氏志贺氏菌10型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR在94℃预变性2分钟后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在7 2℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第22、23组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。将第22、23组中的每个菌做PCR后发现，每对引物都在鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型中得到预期大小的正确的一条带。所以wzx、wzy基因及其内的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型及其O-抗原都是高度特异的。为了用PCR的方法鉴别出鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型，我们在orf8基因内设计了两对引物，每对引物除了在第23组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。更确切的说，这两对引物在鲍氏志贺氏菌6型中得到的PCR产物都比在鲍氏志贺氏菌10型中得到的PCR产物大得多，因此可通过PCR产物的大小区分开这两个菌，所以orf8基因内的这两对引物对鲍氏志贺氏菌10型及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从鲍氏志贺氏菌10型中筛选到对鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy、orf8基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型的O-抗原是特异的，尤其是源于上述wzx、wzy基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型，并能鉴定它们的O-抗原。而源于orf8基因内的两对引物经PCR检测后证实对鲍氏志贺氏菌10型是高度特异的，可以区分开鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型，它们可用于快速准确地检测人体和环境中的鲍氏志贺氏菌10型，并能鉴定它的O-抗原。
表3是鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的结构，共由9个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个ATG和GTG。
序列列表SEQUENCE LISTING
<110>南开大学<120>对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>13402<212>DNA<213>Shigella boydii<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaacagcg cgtgaagcgt 120caactgctgg cggaagtgca gtctatctgt ccgcctggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180cagggcgaac ctttaggttt gggccactcc attttatgtg cgcgacctgc cattggtgac 240aatccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgcta 300cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagacaaa agaaccactg 420gattgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag 480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc 660ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gactgcgcaa cctgaaagaa 720ggggctaaat tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagtg aataatgaaa atctgaccgg 780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggtgaa agtaatttgt 840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaatgag ttagcaatag 900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt 960agcgtctgaa ttttatgaat tactttggct ggtgccagag ttgacaaaga catgtagaat 1020aaaaagtgca ctggtagctt taagccaggg gcggtagcgt gtcaaatata tattttatta 1080ttgagtggct tacatatatg gatgattcgg tttctgtcgt tataccttat tacaatgatt 1140cccctcgtat tgaaaagtgt ttggatagta tatgttcaca aaccagacaa gctattgaag 1200ttataatagt tgatgattgt tcaaaagata gtgcattact actaaaaatc attgataaat 1260ttaaaaataa aataaatata cgatatttga gaaatgatga aaataaaaat ggggcatatt 1320ccagaaacgt agggatgaga gaagcaaggg gaggaattgt tgcttttctc gatgctgacg 1380actattgggc cacagatcat ctcgaggaaa gtgtaaatgc tttgttgtta aatggggtgg 1440aatttgtttt ttcaaatgta atagaggttg attgttgtgg ttgtgagagt cgaagaaaag 1500ttactaatcc ccaatatttg gataataaat acgatataat actgctttct cctcctcaaa 1560ctaattcatt cctatttagg aaaaaaatat ttgacactaa agagattttt tttgatgaaa 1620acttacgtag acatcaagat tatcaatttc ttactttaat attagaaaaa aatatttcat 1680atcaatatat tgataaatat acttcatatt atgtgcaatc acatcgtcct catactgaaa 1740gaatggatta taaatctgtt tttttatttt gggaaaaata taattcttat gtttctggga 1800gattactaaa aaaatttatt accggtttag ttcttgaggt ggttcttgtg tatgggaaaa 1860ataaaacaaa gagttttatt gattcgcatg aacttgtcaa gataaacgca tcgaaactat 1920ttctttatct tgtgttaaaa acaaattttg gtgttaatgc taatagggtg atttatcctt 1980ttttttatta tattttattc agccccaaaa gcatattaaa aaagatatca caaaggatta 2040atagaaagtt ggtacataat gcgtaataag atatctatag ttactacaaa tattactaat 2100aatggtggta ctgagcgagt aatagcaaat gttgctaatt ctctttcaga aatttatgat 2160
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aaaatccgca gatcgctaac ctgctgctgg ctccgtactt caagcaaatt gccgatgact 13260accagcaggc gctgcgcgat gtcgtcgctt atgcggtaca gaacggtatc ccggttccga 13320ccttcgccgc tgcggttgcc tattatgaca gctaccgcgc cgcagttctg cctgcgaacc 13380taatccaggc tcagcgcgac ta 13402表1鲍氏志贺氏菌10型的O抗原基因簇中wzx基因和wzy基因及其中的引物及PCR数据产生正 PCR的PCR产基基因的 正向引物位置反向引物位置确大小 退火温功能 物电泳带因 碱基位置度长度的组数(℃)wzx O-抗原 10458-11870 #351(10757-10774) #352(11648-11665) 909bp 1*58转运酶#353(10889-10906) #354(11915-11932) 1044bp1*58wzy O-抗原3195-4247 #347(3538-3555) #348(4039-4056)519bp 1*56聚合酶#349(3418-3435) #350(3711-3728)311bp 1*58orf8 功能 9468-10424 #355(9524-9541) #356(10154-648bp 0 58未知 10171)#357(9581-9598) #358(10378-814bp 0 6010395)*除了正对照外，在第22组有正确大小的带表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号 该组中含有的菌株 来源1 野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39IMVSa2 野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100 IMVS3 野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137IMVS4 野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12IMVS5 野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6 野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30IMVS7 野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42IMVS8 野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53IMVS9 野生型鲍氏志贺氏菌10型，O55，O56，O57，O58，O54，O60，O61 IMVS10野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70IMVS11野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81IMVS12野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90IMVS13野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118IMVS15野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171See b16野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， See c17野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143IMVS18野生型大肠杆菌O114，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152IMVS19野生型大肠杆菌O153，O154，O155，O156，O157，O158，O159，O164IMVS20野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS
21 野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22 鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14See d23 鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 See d24 痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8 See d25 痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 See d26 弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v7)F5(v4)See d27 宋内氏志贺氏菌D5，DR See da.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab.O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd.中国预防医学科学院流行病学研究所表3是鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的结构表 表4是鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACAGCG CGTGAAGCGT 120CAACTGCTGG CGGAAGTGCA GTCTATCTGT CCGCCTGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGCCACTCC ATTTTATGTG CGCGACCTGC CATTGGTGAC 240AATCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTA 300CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG 360GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACAAA AGAACCACTG 420GATTGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540GAACTTGAAC GCACTCAACC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATTGCT 600GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCA ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC 660GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTGCGCAA CCTGAAAGAA 720GGGGCTAAAT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGTG AATAATGAAA ATCTGACCGG 780ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGTGAA AGTAATTTGT 840TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAATGAG TTAGCAATAG 900GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT 960AGCGTCTGAA TTTTATGAAT TACTTTGGCT GGTGCCAGAG TTGACAAAGA CATGTAGAAT1020AAAAAGTGCA CTGGTAGCTT TAAGCCAGGG GCGGTAGCGT GTCAAATATA TATTTTATTA1080orf1的起始TTGAGTGGCT TACATATATGGATGATTCGG TTTCTGTCGT TATACCTTAT TACAATGATT1140CCCCTCGTAT TGAAAAGTGT TTGGATAGTA TATGTTCACA AACCAGACAA GCTATTGAAG1200TTATAATAGT TGATGATTGT TCAAAAGATA GTGCATTACT ACTAAAAATC ATTGATAAAT1260TTAAAAATAA AATAAATATA CGATATTTGA GAAATGATGA AAATAAAAAT GGGGCATATT1320CCAGAAACGT AGGGATGAGA GAAGCAAGGG GAGGAATTGT TGCTTTTCTC GATGCTGACG1380ACTATTGGGC CACAGATCAT CTCGAGGAAA GTGTAAATGC TTTGTTGTTA AATGGGGTGG1440AATTTGTTTT TTCAAATGTA ATAGAGGTTG ATTGTTGTGG TTGTGAGAGT CGAAGAAAAG1500
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TTTTACTTAG ACTTACTTAT TACTATTTAG CATTAGATTG CATTTTGATGGGCTATCTCT4140TGAATATGGC AAAAAATGGA TATACGAAAA TATTAATATA TTGCCCAACACTAATGCTAT4200Orf4的起始 Orf3的终止TTATATTAAG GTTTTATATG CAATGGAGCG AACATATCAA TGGTTGAACA TTGTAGTAAA4260AATAAAAAAA TACTCGTTGA TTGTAGAATG ATTAATGCCT CTGGAATAGGTGTTTATACT4320CGTGAAATTA TCAAAGAGTT AAAAAAATAT AGATACTTGC AGATCGAGTTATTGCTTCAA4380GAAGAACAAC AGTTACCAAT TGATGTTGAA GATATTGGAT TTAAAATCCACTATATAAAT4440TTTTCTCGCT ATAGTATTAA AAACATCGGT GGTATGAAGC ATTTACTGAATGGCTTTGAT4500GTCTATTTTA TGCCATCATT ATCGATACCA CCTCTATTAA AAAAAGGCTGTTTGATAATC4560ACAACAGTAC ATGATCTGTG TCCTGTTGCA TTACGGAAAT TATTTGGATCCAAAAAAGCT4620GTAGCTTATT GGGCTTTGCT ATTAATACAA CTTGTTTGTT CTAATAAGATAATTTCCATT4680TCAAGATTCA CTGCTAAAGA AATAAATAAG TATTACTTTG GTTTATTTAAAAGTAAATTA4740TATGTCATTG GCAATGGTAT AAGAAATATT TTTAATTTGG AATTAAATAGTGAAACAGAA4800AATTCCCATG AAGAATATGG TATTTGCGTG GGCAATATTA AGCCTCATAAAAATGTTGTA4860CCACTAATTG ATTACCTTAA GACAAACATC ATTAACAAAA AAATATATTTTATAGGTGAA4920ATAAATGGGT TTTCAACGAA AATAAATAAA AGTTTGCTTA ACGATTTGCCTGAAAATATA4980GTTTTTACAG GGAGAGTAAG TGATCAAGAA TTACATAATT ATTACCGTAATGCCAGTTTT5040TTTATATTCC CCTCATTATA CGAAGGCTTT GGTTTGCCTT TGCTAGAGGCTATGAATTAT5100AGGTTGCCTA TTTTTGCATC AAATATTGAT GTATTTAAGG AAGTTGCTGGTGAAACAATT5160AATTATTTTG ATCCATATAC ATTTGATGCT CTTGCAGATA GAATTAACAAATTAAAAAAG5220AACAAGAAAT CTATTGAATC TTATGCACGA GTTTTGCAGT TATATAGTTGGGATAATAAT5280Orf5的起始Orf4的终止GTTGCAAGTC TATTAAGGAT TATGAATGAA GAAGATATTG CTCGTAAATA AATACTATCA 5340TCCAGACATT GGTGGCGTAG AAACTGTTGT ACAACAGCAT GCTCAATTATTGAAGTATGA5400ATATAGTGTA ACAGTGTTGT GTATTAGCAA AGAATTCTCA TGGTATACAAAAAATGAATT5460CATTAATGGA GTTAAAGTAA TACGCTGTTC TCCATTGGGA ACTTATTTTTCTATGCCGTT5520ATCAATTACT TTTTTTTTGC ATTACTTCAT TAATTATTTA AAATCAGACGTGATTATTAA5580TCACATTCCG TTTCCATTAA TGGATTTAGC ATTTTTTATC ATTGATAGATTAGTCAAAAG5640AAAAAATATA TTATTTTGGC ACAGTGATAT AGTAAAGCAA AAAGCATTAAAAAAAATATT5700ACGTCCGTTC ATTATAAATA CTATTAATCG AAGCACTCAG ATTTTAACTACATCTCCAAA5760TCTCAAAGCT AATTCAGAAG ACATCGGTGA ATATCAGAAA AAAACAGATGTGTTACCATT5820ATTTATTAAT TCAAATGTTA TAAATGGTTA TATTAAAAAT TTAAACGCAGAAAAAAAATA5880TGACTTTATA TTTTTTGGAA GATTATGTTA TTATAAAGGA GTTGATATTCTTTTAGATGC5940AGTAAAAATT TTGAAAAATA AAGGAGCTGA ACCTGAAATT TTTATGGCAGGTGATGGTGA6000TTTAGTTAAT TATATCGAAA ATGAAATTAT TGAAAATAAA ATTAAAAATATAACTTTTAT6060TAAACGGTTT TTAACAGAGG AGGAAAAATA TCATTATCTT TCAATTTCAAAATGTTTTCT6120TTTCCCATCC GTTGCTGCAT CCGAAGCATT TGGTATCACT CAGCTTGAGGCAATGTCTCT6180TGGGCTCCCT GTAATAAACA CAAACCTTAA TACTGGCGTT CCTTTTGTCAGTTTAAATGG6240AGTTACGGGG ATAACAGTAA CTGCAGGTAA TCCTGATGAT TTAGCTAATGCAATGCTGTC6300TTTGTTGCGC GATGATGAAA AATATGAATC GTTCAAGACA AATTGTAAAGTTAGGGTTTC6360TGAGTTGTTT GAGGAAAATG TTGTGAAAAA TAAACTATTC AAAGTAATTGAAGAATTAAA6420Orf5的终止CTGAGAAGTT GAATTTTCAC TCATACTATA TTCATTAATT ATACGTATTTATATACTTAA6480Orf6的起始CTTATGTCAA ATAATATTAT CTGTCCTGTG ATTATGGCTG GTGGTTCTGGTAGCCGTCTA6540TGGCCTCTTT CTCGTCTTTT TTATCCAAAG CAATTTCTAA AATTAGTAGATGATTCAAGT6600
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权利要求
1.一种对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长13402个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf2、orf4、orf5基因；功能未知的orf8基因；其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO1中的10458至11870碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO1中的3195至4247碱基的核苷酸；所述的orf1基因是SEQ ID NO1中的1098至2066碱基的核苷酸；所述的orf2基因是SEQ ID NO1中的2059至3168碱基的核苷酸；所述的orf4基因是SEQ IDNO1中的4240至5331碱基的核苷酸；所述的orf5基因是SEQ ID NO1中的5306至6424碱基的核苷酸；所述的orf8基因是SEQ ID NO1中的9468至10424碱基的核苷酸。
4.按照权利要求1或2所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因、wzy基因、糖基转移酶基因或orf8基因中的寡核苷酸；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的10757至10774碱基的核苷酸和11648至11665碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的10889至10906碱基的核苷酸和11915至11932碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是；SEQ ID NO1中的3538至3555碱基的核苷酸和4039至4056碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的3418至3435碱基的核苷酸和3711至3728碱基的核苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9524至9541碱基的核苷酸和10154至10171碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9581至9598碱基的核苷酸和10378至10395碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
8.权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
9.权利要求1所述的对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养鲍氏志贺氏菌10型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟；之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟；加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增鲍氏志贺氏菌10型中的O-抗原基因簇以鲍氏志贺氏菌10型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1MMnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾；此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5□细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对鲍氏志贺氏菌10型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The NationalCenter for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因筛选针对鲍氏志贺氏菌10型的O-抗原基因簇中wzx、wzy、orf8基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，源于wzx、wzy基因的所有引物都在鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型中得到阳性结果，而源于orf8基因的两对引物只在鲍氏志贺氏菌10型中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小。所以wzx、wzy基因对鲍氏志贺氏菌10型和鲍氏志贺氏菌6型及其O-抗原都是高度特异的，而orf8基因对鲍氏志贺氏菌10型及其O-抗原是高度特异的。
全文摘要
本发明提供一种对鲍氏志贺氏菌10型(Shigellabodyii 10)的O－抗原特异的核苷酸，它是鲍氏志贺氏菌10型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长13402个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；还包括源于鲍氏志贺氏菌10型的O－抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因和wzy基因或与wzy有相似功能的基因及未知功能的orf8基因的寡核苷酸，本发明通过PCR证实寡核苷酸对鲍氏志贺氏菌10型的O－抗原都有高度的特异性，本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的鲍氏志贺氏菌10型的方法。
文档编号A61P31/04GK1546510SQ200310107160
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者冯露, 杨静华, 彭霞, 王磊, 冯 露 申请人:南开大学