对大肠杆菌o54型的o-抗原特异的核苷酸的制作方法

专利名称：对大肠杆菌o54型的o-抗原特异的核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及大肠杆菌O54型(Escherichia coli O54)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O54型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O54型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术：
大肠杆菌O54型是一种致病菌，在1986年首先从患腹泻和水肿的幼猪中分离到[Garabal JI.et.al.(1993)“Serogroups of Escherichia coliisolated from piglets in Spain”.Vet Microbiol.48(1-2)113-23]。它可产生细胞毒素坏死因子(cytotoxic necrotising factor，CNF)，属于引起坏死的大肠杆菌(Necrotoxic Escherichia coli，NTEC)，并且对人也有潜在的致病性，能引起动物和人腹泻综合征[De Rycke J.(1999)“Necrotoxic Escherichia coli(NTEC)two emerging categories of humanand animal pathogens”Vet Res.30(2-3)221-33]，具有潜在的爆发性流行的危险。因此在农业、食品及卫生系统上急需一个可以快速、准确检测大肠杆菌O54型的方法。
位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank et al(1987)“The function of antibody and complement in the lysis of bacteria”.RevInfect Dis 1771750-1753.Pluschke G et al“Role of the capsule andthe O-antigen in resistance of O18K1Escherichia coli tocomplement-mediated king.J Bacteriol 42907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100509-516]。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen lociimplicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，116923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clustersgene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.1825256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.312118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.341622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 16417-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。
本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的基因转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf9基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC；与磷酸丝氨酸合成及转移有关的基因，包括orf7、orf8。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf5、orf6、orf9基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O54的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O54的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O54的O-抗原也是高度特异的。
本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O54的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O54。
本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO1所示的分离的核苷酸，全长14062个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
前述的对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因包括转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf9基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO1中的8961至10211碱基的核苷酸；聚合酶基因是SEQ ID NO1中的4059至5117碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的5120至5938碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO1中的5893至6711碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO1中的8107至8964碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O54的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9019至9036碱基的核苷酸和9591至9608碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9127至9144碱基的核苷酸和10040至10057碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQID NO1中的4289至4306碱基的核苷酸和5000至5017碱基的核苷酸；SEQ IDNO1中的4391至4408碱基的核苷酸和4695至4712碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。前述的对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O54的O-抗原，并成为细菌疫苗。
前述的对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，可用这些方法检测人体和环境中的细菌。
前述的对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O54，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟；之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟；加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O54中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O54的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGGATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5□细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O54的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选针对大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O54中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O54及其O-抗原都是高度特异的。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO1所示，全长14062个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它的11个基因都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf9；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC基因；参与磷酸丝氨酸的合成及转移的基因，包括orf7、orfg。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O54的O-抗原是特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf9基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O54为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，虽然在有些菌中得到了PCR产物带，但其大小不符合预期大小，这是由于引物结合到基因组的别的位置造成，这种问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O54及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O54中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的8961至10211碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO1的4059至5117碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O54都是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf9基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf9基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O54。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf5、orr6、orf9基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O54表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf9基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O54。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf9基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf9基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O54。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf9基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O54的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。实施例1基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O54，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2通过PCR扩增大肠杆菌O54中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O54的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTCGC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的WizardPCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇文库。
实施例4对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O54的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1，orf2，orf3和orf11都与许多菌的合成鼠李糖前体的dTDP-鼠李糖的四个合成酶基因有非常高的相同性(identity)，其中orf1与鲍氏志贺氏菌的RmlB在353个氨基酸中有98％的相同性，99％的相似性；orf2与鲍氏志贺氏菌的RmlD在299个氨基酸中有97％的相同性，98％的相似性；orf3与鲍氏志贺氏菌的RmlA在291个氨基酸中有97％的相同性，98％的相似性，Orf11与鲍氏志贺氏菌的RmlC在171个氨基酸中有63％的相同性，75％的相似性，说明它们都有极高的同源性，可以确定orf1、orf2、orf3、Orf11分别为dTDP-鼠李糖的rmlB基因、rmlD基因、rmlA基因、rmlC基因，因此分别命名为rmlB、rmlD、rmlA、rmlC。大肠杆菌O54的O-抗原结构未知，但以上结果表明鼠李糖是大肠杆菌O54的O-抗原中的一种单糖。用TMHMM2.0和SMART分析都表明orf4编码的蛋白中含有10个疏水区，也即10个跨膜片段，用HMMTOP分析也发现同样的10个潜在的跨膜片段，分别位于氨基酸序列中的3-21，27-46，86-104，110-128，156-180，186-205，237-255，261-279，286-307，313-332。从46-86是由40个氨基酸组成的茎环结构，这是众所周知的O-抗原聚合酶(Wzy)的典型特征。此外用blast比较表明orf4与许多Wzy蛋白相似，例如，和大肠杆菌O104在342个氨基酸中有27％的相同性48％相似性；和志贺氏菌在321个氨基酸中分别有23％的相同性48％相似性；和嗜热链球菌有20％的相同性43％相似性。所以可以确定orf4就是wzy基因，命名为wzy。在genbank中寻找保守的功能域，发现orf5与PF00535糖基转移酶家族相似，E值为2.2×e-19，通过进行blast比较发现，orf5与Bacteroides fragilis的糖基转移酶有35％的相同性，55％的相似性；也与霍乱弧菌的糖基转移酶有36％的相同性，56％的相似性，说明它们之间有较高的同源性，因此推测orf5也是糖基转移酶基因，暂命名为orf5。orf6基因编码的蛋白与嗜热链球菌的Eps11P蛋白有一定的同源关系，两者在222个氨基酸中有35％的相同性和52％的相似性。但是Eps11P蛋白还是一个未知功能的蛋白，因此orf6的功能未知，暂命名为orf6。blast比较发现，orf7与Clostridium acetobutylicum的磷酸丝氨酸磷酸化家族的酶在194个氨基酸中有24％的相同性和44％的相似性，由此推测orf7也是一个磷酸丝氨酸磷酸化酶，暂时命名为orf7。用TMHMM2.0和SMART分析O-抗原基因簇的所有开放阅读框，除了在orf4和orf10中发现跨膜片段外，在orf8中也发现了7个疏水区，但它不具有Wzx和Wzy的典型特征。通过blast比较发现，orf8与Melipona bicolor的CDP-2-乙酰甘油-磷酸丝氨酸转移酶在150个氨基酸中有24％的相同性和52％的相似性，推测它是一个磷酸丝氨酸转移酶。因此大肠杆菌O54的O-抗原中可能有丝氨酸。Orf9与PF00535糖基转移酶家族相似，E值为2.9×e-3。blast比较发现orf9编码的蛋白与痢疾志贺氏菌的鼠李糖基转移酶I在301个氨基酸中有29％的相同性，48％的相似性；与福氏志贺氏菌的RfbF蛋白在286个氨基酸中有31％的相同性，49％的相似性，而RfbF蛋白是dTDP-鼠李糖的糖基转移酶，所以推测orf9也是一个糖基转移酶基因，也是转移dTDP-鼠李糖的，暂命名为orf9。用TMHMM2.0和SMART分析都发现orf10编码的蛋白中含有10个跨膜片段，用HMMTOP分析也发现同样的10个潜在的跨膜片段，分别位于氨基酸序列中的16-36，53-73，92-116，154-174，182-202，242-260，294-314，335-355，360-380，385-404。而且blast比较表明orf10与许多Wzx蛋白相似，例如，与Methanobacterium thermoautotrophicum及Actinobacillusactinomycetemcomitans的O-抗原转运酶(Wzx)最相似，分别有53％和50％的相似性。将这三个菌的Wzx序列用Block maker软件进行分析，共找到7个保守的基序，分别为12、13、15、34、35、37、38个氨基酸组成。将它们的一致序列在数据库中运行3个循环PSI-BLAST程序后，发现除了上述两个菌外，还和许多其它菌株的Wzx相似(如Lactobacillus plantarum，Expect＝6e-56；Streptococcus pneumoniae，Expect＝6e-52；Actinobacillusactinomycetemcomitans，Expect＝1e-49)，所以可以确定orf4就是wzx基因，命名为wzx。
实施例6特异基因的筛选针对大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的wzy、wzx基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了大肠杆菌O54的O抗原基因簇的转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组。它们的来源都列于表中。
在第9组中含有大肠杆菌O54的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR在94℃预变性2分钟后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ul PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第9组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O54及其O-抗原都是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O54中筛选到对大肠杆菌O54的O-抗原高度特异的基因wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O54的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O54是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O54，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的结构，共由11个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个ATG和GTG。
序列列表SEQUENCE LISTING<110>南开大学<120>对大肠杆菌O54的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1
<210>1<211>14062<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attgtggcta cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc atgcgtccaa gaacgcggtc 60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctcttc ttgagcagcg cgtgaagcgt 120caactactgg cggaagttca gtccatctgc ccgccgggcg tgaccattat gaacgtacgt 180cagggcgaac ctttaggttt aggtcactcc attttgtgtg cacgacccgc cattggtgac 240aacccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgacg acgccagtgc cgatccgctg 300cgttacaacc ttgctgccat gattgcgcgt ttcaacgaaa cggccagcag ccaggtgctg 360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420gatcgcgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag 480acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgcaga tatttggccg 540gaacttgaac gcactcagcc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccatcgct 600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga caggtgacag ctacgactgc 660ggtaaaaaaa tgggttatat gcaagcgttc gtgaagtatg ggctgcgcaa cctgaaagaa 720ggggcgaagt tccgtaaagg cattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg 780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt 840tgcgaatttt cctgccgttg ttatatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag 900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt 960agcgtttgaa tttttcgggt ttagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtaggcatgc1020atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg tgcattaata cctctattaa1080tcaaactgag agctgcttat ttcacagcat gctctgaagt aatatggaat aaaaaagtga1140agatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt cacattataa1200ataatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga aacctggaat1260cacttgctga tgtttctgat tccgaacgct atgtttttga acatgcggat atttgcgatg1320cagctgtaat ggcacgggtt tttgctcagc atcagccgga tgcagtgatg cacctggcag1380ctgaaagcca tgttgaccgt tcaattacag gccctgcggc atttattgaa accaatattg1440ttggtactta tgtcctttta gaggccgctc ggaattactg gtctgctctt gatggcgaca1500agaaaaatag cttccgtttt catcatattt ctactgacga agtctatggt gatttgcctc1560atccagatga agtaaataat acagaagaat tacccttatt tactgagacg actgcttacg1620cgccaagcag cccttattcc gcatccaaag cttccagcga tcatttagtc cgtgcgtgga1680aacgtaccta tggtttaccg accattgtga ctaattgctc taacaattat ggtccttatc1740
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ccttcgccgc tgcggttgcc tattatgaca gctaccgttc tgctgttctg cctgctaacc 14040tgatccaggc gcagcgcgac ta 14062表1大肠杆菌O54的O抗原基因簇中wzx基因和wzy基因及其中的引物及PCR数据产生正 PCR的基因的 正向引物位置 反向引物位置 PCR产物 确大小 退火温基因功能碱基位置 长度电泳带度的组数 (℃)wzxO-抗原 8961-10211 9019-90369591-9608 590bp 0 57转运酶9127-914410040-10057931bp 0 60wzyO-抗原 4059-5117 4289-43065000-5017 729bp 0 60聚合酶4391-44084695-4712 322bp 0 61表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号 该组中含有的菌株 来源1 野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39IMVSa2 野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100 IMVS3 野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137IMVS4 野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12IMVS5 野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22 IMVS6 野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30IMVS7 野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42IMVS8 野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53IMVS9 野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61IMVS10野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70IMVS11野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81IMVS12野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90IMVS13野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101 IMVS14野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118IMVS15野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171See b16野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132， See c17野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143IMVS18野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152IMVS19野生型大肠杆菌O153，O154，O155，O156，O157，O158，O159，O164IMVS20野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111 IMVS21野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110 IMVS22鲍氏志贺氏菌血清型B2，B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14 See d23鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18 See d24痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8See d25痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13 See d26弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v7)F5(v4) See d
27宋内氏志贺氏菌D5，DRSee da.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab.O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd.中国预防医学科学院流行病学研究所表3是大肠杆菌O54的O-抗原基因簇的结构表 表4是大肠杆菌O54的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTGTGGCTA CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ATGCGTCCAA GAACGCGGTC 60GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTTC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT 120CAACTACTGG CGGAAGTTCA GTCCATCTGC CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTACGT 180CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGTCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGTGC CGATCCGCTG 300CGTTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGT TTCAACGAAA CGGCCAGCAG CCAGGTGCTG 360GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACCAA AGAACCGCTG 420GATCGCGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCAGA TATTTGGCCG 540GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATCGCT 600GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTACGACTGC 660GGTAAAAAAA TGGGTTATAT GCAAGCGTTC GTGAAGTATG GGCTGCGCAA CCTGAAAGAA 720GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG CATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG 780ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT 840TGCGAATTTT CCTGCCGTTG TTATATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG 900GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT 960AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGTCACATC GTAGGCATGC1020ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTATTAA1080orf1基因的起始密码子TCAAACTGAG AGCTGCTTAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAAAAAGTGA 1140AGATACTTGT TACTGGTGGC GCAGGATTTA TTGGTTCTGC TGTAGTTCGT CACATTATAA1200ATAATACGCA GGATAGTGTT GTTAATGTCG ATAAATTAAC GTACGCCGGA AACCTGGAAT1260CACTTGCTGA TGTTTCTGAT TCCGAACGCT ATGTTTTTGA ACATGCGGAT ATTTGCGATG1320CAGCTGTAAT GGCACGGGTT TTTGCTCAGC ATCAGCCGGA TGCAGTGATG CACCTGGCAG1380CTGAAAGCCA TGTTGACCGT TCAATTACAG GCCCTGCGGC ATTTATTGAA ACCAATATTG1440TTGGTACTTA TGTCCTTTTA GAGGCCGCTC GGAATTACTG GTCTGCTCTT GATGGCGACA1500AGAAAAATAG CTTCCGTTTT CATCATATTT CTACTGACGA AGTCTATGGT GATTTGCCTC1560ATCCAGATGA AGTAAATAAT ACAGAAGAAT TACCCTTATT TACTGAGACG ACTGCTTACG1620CGCCAAGCAG CCCTTATTCC GCATCCAAAG CTTCCAGCGA TCATTTAGTC CGTGCGTGGA1680AACGTACCTA TGGTTTACCG ACCATTGTGA CTAATTGCTC TAACAATTAT GGTCCTTATC1740ATTTCCCGGA AAAATTAATT CCACTAGTAA TTCTTAATGC TCTGGAAGGT AAAACATTAC1800
CTATTTATGG TAAAGGGGAT CAAATTCGCG ACTGGTTGTA TGTTGAAGAT CATGCGCGTG1860CGTTATATAC CGTCGTAACC GAAGGTAAAG CGGGTGAAAC TTATAACATT GGTGGACACA1920ACGAAAAGAA AAACATCGAT GTAGTGCTCA CTATTTGTGA TTTGTTGGAT GAGATTGTAC1980CGAAAGAGAA ATCTTATCGT GAGCAAATCA CTTATGTTGC CGATCGTCCG GGACACGATC2040GCCGTTATGC GATTGATGCT GAGAAGATTA GCCGCGAATT GGGATGGAAA CCACAGGAAA2100CGTTTGAGAG CGGGATTCGG AAGACAGTGG AATGGTACCT GTCCAATACA AAATGGGTTG2160orf1基因的终止密码子ATAATGTTAA AAAGTGGTGC CTATCAATCG TGGATTGAAC AGAACTATGA GGGTCGCCAG2220orf2基因的起始密码子TAATGAATAT CCTCCTTTTT GGCAAAACAG GGCAGGTAGG TTGGGAACTA CAGCGTGCTC2280TGGCACCTCT GGGGAATTTG ATTGCTCTTG ATGTTCACTC CACTGATTAC TGTGGTGATT2340TTAGTAATCC TGAAGGTGTA GCTGAAACCG TAAGAAGCAT TCGGCCTGAT ATTATTGTCA2400ACTCAGCCGC TCACACCGCA GTAGACAAAG CAGAATCAGA ACCGGAGTTT GCACAATTAC2460TTAACGCGAC GAGTGTCGAA GCGATCGCGA AAGCAGCCAA TGAAGTCGGC GCCTGGGTTA2520TTCACTACTC TACTGACTAC GTATTTCCGG GGACCGGTGA AATACCATGG CAGGAGGCGG2580ATGCAACCGC ACCGCTAAAT GTTTACGGTG AAACCAAGTT AGCTGGAGAA AAAGCATTAC2640AAGAGCATTG TGCGAAGCAC CTAATTTTCC GTACCAGCTG GGTCTATGCA GGTAAGGGAA2700ATAACTTCGC CAAAACGATG TTGCGTCTGG CAAAAGAGCG TGAAGAATTA GCCGTTATTA2760ATGATCAGTT TGGTGCGCCA ACAGGTGCTG AACTGCTGGC TGATTGTACG GCACATGCCA2820TTCGTGTGGC ACTGAATAAA CCAGAAGTCG CAGGCTTGTA CCATCTGGTA GCCAGTGGTA2880CCACAACCTG GCACGATTAT GCTGCGCTGG TTTTTGAAGA GGCACGAAAA GCAGGTATTC2940CCCTTGCACT CAACAAGCTC AACGCAGTAC CAACAACAGC CTATCCTACA CCAGCTCGTC3000GTCCACATAA CTCTCGCCTT AATACAGAAA AATTTCAGCA GAACTTTGCG CTTGTCTTGC3060CTGACTGGCA GGTTGGTGTG AAACGAATGC TCAACGAATT ATTTACGACT ACAGCAATTT3120orf2基因的终止密码子 orf3基因的起始密码子AATAGTTTTT GCATCTTGTT CGTGATGGTG GAGTAAGATG AATTAAAAGG AATGATGAAA3180TGAAAACGCG TAAAGGTATT ATTTTAGCGG GCGGTTCTGG TACACGTCTT TATCCTGTGA3240CTATGGCTGT CAGTAAACAG CTATTACCTA TTTATGATAA ACCGATGATC TATTACCCGC3300TCTCTACACT GATGTTAGCG GGTATTCGTG ATATTCTGAT TATTAGTACG CCACAGGATA3360CTCCTCGTTT TCAACAACTG CTGGGTGACG GTAGCCAGTG GGGGCTAAAT CTTCAGTACA3420AAGTGCAACC GACTCCAGAT GGGCTTGCGC AGGCATTTAT CATCGGTGAA GAGTTTATCG3480GTGGTGATGA TTGTGCTTTG GTTCTAGGTG ATAACATCTT TTACGGTCAC GATCTGCCGA3540AGTTAATGGA TGCCGCTGTT AACAAAGAAA GTGGTGCAAC GGTATTTGCC TATCACGTTA3600ATGATCCTGA ACGCTACGGT GTCGTAGAGT TTGATAAAAA CGGTACGGCA ATTAGCCTGG3660AAGAAAAACC GTTACAACCA AAGAGTAATT ATGCGGTAAC CGGGCTTTAT TTCTATGATA3720ACGGCGTTGT GGAAATGGCG AAAAACCTTA AGCCTTCTGC CCGTGGTGAA CTAGAAATTA3780CCGATATTAA CCGTATCTAT ATGGAGCAGG GGCGTTTATC CGTTGCCATG ATGGGACGTG3840GTTATGCATG GCTGGACACG GGGACACATC AAAGTCTTAT TGAAGCAAGC AACTTCATTG3900CAACAATTGA AGAACGTCAG GGGCTGAAAG TATCCTGCCC GGAAGAAATT GCTTACCGTA3960AAGGATTTAT TGATTCTGAG CAGGTCAAAG TATTAGCTGA ACCGCTGAAA AAAAATGCTT4020orf3基因的终止密码子orf4基因的起始密码子ATGGTCAGTA CTTAATCAAA TTGACACAGG GATAATAAAT GGAATCTCTA TTCATTTATT4080TTTTTGTTAC AATGGTGTTA ATTGTTTTTA CGTGTTTTTT TAAACATAAT AATAATATAT4140TGATAATTGT TTGTAGTGCT ATATTATCTG TTACATATGG GCTACGTGTT GGAATAGGTA4200ATGATTATGA ACAATACAAT AACATATTCA ACGCAATTAA TTATAACTCC TATTCTGCAA4260TAGAACCGAC ATTTATATTG CTATCCAGAT TGCTGGAACA GTATGATTAT GGCTTTAATT4320
ATCTAATGGC AATATATGCGTTTGTGACTT TTTTTCTTTG TTATATGGGG ATAAGAAAAT4380ATAATATCTA TCCTTATGTGCCATTGTTAA TGTTTTCTAC CGGTTTTATA TTTTTTGTGG4440ATAACCAAGT AAGGCAAGCACTGGCAACAT CGTTTTTTAT CTATTATATG CGGTTTATAT4500CGACAAGGGA ATTTGGGAAATATTTGATAT GTGTGATAAT ATCAACTATT TTTATGCATT4560TCAGTTCAGC GGTTTTATTGCTTGCGTACT TTGTAACTAG AAAGCGAATA AATGGAGTAG4620TTTGGATTTT ATTATTGTTGTTTGCTTATA TTTTAATGAA GTTGGACGTG GTCCACACCG4680TATTATCCAA TATTATAAGCATGGTGCCGT ACTATTCAGA ACTCTATTTG CAACGGTTTA4740ATGATATAAG TCTGAACGTAACTGGTAGTG GATTAGGTGT ATTGTTCTGG TTGATAATAG4800CTGTATTCAT TGTAATTTTTAATCAAAAAA ATGATGATGT TATTGTCTTT AATTTATTTA4860TAATTGGTAC AATAATCAATACGATTTTTA TTAATTATGA TATATTTGAG CGCGTTAGTT4920TTTATTTTAT TTATTTAAGGTTTATTCTAT TGGCAATTAT TTTTAAAAAA ATAATGTTTA4980GAAATAATGT TAATTTTATGCTTTGTGGGA TTCTAATCAC TTTAACTGTG TTTTTTACTA5040GCTATGAGGT GATAAATGATGCTAATAAAC ATGGGGTGGT ACCTTTAAGA TTCATTTATT5100orf4基因的终止密码子orf5基因的起始密码子TAGATACCGA GGTATAATCA TGGACAAGAT AGCTGTTATT ATGAGTGTCT ATAACGGAGA5160TCTACCTCAG AATGTAGAACTTGCAATTGA TAGTATTTTA AATCAAAGGT ATAAAAATTA5220TAAGTTATTT ATAATGATTGATGGGCCTGT TGCTCAAAAT ATTCTGATGA TATTAAGAAA5280ATATGAGCAA GAGCCTGCAATTGAGATATA TTCACGTGAT ATAAATAAAG GATTAGCAAC5340TTCCTTAAAT GAATTGATTGATATTATAAA AAGTAAAAAC GATTATAACT TTATTGCACG5400AATGGATAGT GATGACGAGTCATTACCTGA TCGGTTTTGT GAGCAGATAA ATTATCTGCA5460AAAAGCGCCA CATATTGACGTTGTTGGTAG TTTTTGCCAT GAATTTGGGG CTGAGTTTGC5520GTTGGATATT AAAAGGGTTCCTTTAGAACA TGAGGAACTA AAGAAATATA CATTATACAA5580ATGCCCATTT ATTCATCCAACGGTTATGTT TAGAATATCA GTTTTTAACG ACGCTCAGAT5640CAGATACCCA ACTAATACTAAACTGAGTGA AGATTTAGCC TTATGGTTTC TATTACTTTC5700TCGTGGTTAC AAATTTGCAAATATAGATAA AGTATTATTA AACTATAGAA TTGATGATGC5760TACGCTGTCA CGACGTTCTGGGGTGAAGAA AGCATTTAGT GAAATGAATA TTAGATTTCT5820TTATTCACTT AAGATGAAAAATTTTTCCGT ATTTATTTAT TCGTTGATTC TTATCCGGGG5880orf6基因的起始密码子 orf5基因的终止密码子GGTACTTGCA CTATGTCCAC TAAAATTAAA AAAAATAGTA TACAAAAAGT TTCGATGAGA 5940AAAAGAGTTG TATATACCGCAATTTTTGGT GGTTATGATA ATTTGATAGA TCCAAAAGAA6000ATTGATAAGT CGGTTGATTATATCTGTTTC ACAGATGACA AAAATATAAA ATCACATAAA6060TGGAATGTGA TATATGTTAAAACTGATGAG GAAATTGATA AAGCAAAGTT AAACAGGCAT6120TACAAATTTT TTCCTCACCTGTACTTTTCA GAATATGAGG AAAGCTTGTA CCTCGATGGT6180AATATTGAAA TAGTCAGTGAAAGAATCTCT GAGGCATTTG ATATTGCACT CAATGATTCT6240GACATTTCAA TACCAAGACACACTGAAAGA AACTGCATTT ATGAAGAAGC AAACACATGT6300TTAGAACTCG GGAAAGGTAATTCAGAGAAA ATAAAAGAAC AAATAGAATT TTATAAGCAT6360AGCGACTATC CAGAAAATAATGGTCTGTTT GAAAATAATG CTATCTTCAG AAAGCATAAT6420ACGCAAGCAA TAATAAAGTTAATGGAAGAA TGGCATGATG CTATATCAAT ATTTTCTGCC6480AGAGATCAGC TGAGTCTTTGTTTTCTAATG TGGAAAAATT CTATATGTTG CAAAGAGTTT6540TCATGGGGAC CGAAAAAATCAAATAGATTC TTTAAAATCA GATTTCATCG AGCCGAAATT6600AATAATCCAT TCTACAAGAAGATAATTTTA TATATATTAC TGAATAAAAA TATTAAGTGG6660Orf7基因的起始密码子orf6基因的终止密码子TACTATTATA CTATGAGTCTGATAATTAAC AAATTAAAGA GGATGGTATG AAAAAAGCGA 6720TTGTAGATGT TTGCTACACTCTTTATTCAC GTAATACAAC GTTTGCATTT ATTGATTATG6780TGTTGTTGAG AAAATTCAATAAAAAAAGCT ATTTAGCTAA TAAATATTTA AAGTTTTTTT6840TAGTTGGTAT TGGTAAAATTGTAAAAAGAG ATCTATATAG AAGATTTTAT ATAAGGCATT6900
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权利要求
1.一种对大肠杆菌O54型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长14062个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸。
2.按照权利要求1所述的对大肠杆菌O54型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3.按照权利要求2所述的对大肠杆菌O54型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因包括转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf9基因；其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO1中的8961至10211碱基的核苷酸；聚合酶基因是SEQ ID NO1中的4059至5117碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO1中的5120至5938碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO1中的5893至6711碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO1中的8107至8964碱基的核苷酸。
4.按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O54型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因、wzy基因中的寡核苷酸或糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf9基因的寡核苷酸；或糖合成路径基因中的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。
5.按照权利要求4所述的对大肠杆菌O54型的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的9019至9036碱基的核苷酸和9591至9608碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的9127至9144碱基的核苷酸和10040至10057碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是SEQ ID NO1中的4289至4306碱基的核苷酸和5000至5017碱基的核苷酸；SEQ ID NO1中的4391至4408碱基的核苷酸和4695至4712碱基的核苷酸。
6.权利要求1所述的对大肠杆菌O54型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7.权利要求1所述的对大肠杆菌O54型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O54型的O-抗原，并成为细菌疫苗。
8.权利要求1所述的对大肠杆菌O54型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。
9.权利要求1所述的对大肠杆菌O54型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(1)基因组的提取在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O54型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟；之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟；加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O54型中的O-抗原基因簇以大肠杆菌O54型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TCG ATT AAG TTC GC-3’)。用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1MMnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5□细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O54型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O54型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证1)对大肠杆菌O54型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O54型的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O54型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因筛选针对大肠杆菌O54型的O-抗原基因簇中wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，所有引物在大肠杆菌O54型中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O54型及其O-抗原都是高度特异的。
全文摘要
本发明提供一种对大肠杆菌O54型(Escherichiacoli O54)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O54型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO1所示的分离的核苷酸，全长14062个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O54型的O－抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因和wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O54型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O54型的方法。
文档编号A61P31/04GK1546509SQ200310107159
公开日2004年11月17日 申请日期2003年12月3日 优先权日2003年12月3日
发明者冯露, 杨静华, 郭宏杰, 王磊, 冯 露 申请人:南开大学