靶向单一抗原决定簇的制作方法

专利名称：靶向单一抗原决定簇的制作方法
技术领域：
本发明涉及活化的特异免疫治疗(“治疗性疫苗接种”)。特别是，本发明涉及新的免疫原性试剂，其能够诱导抗自身抗原中的单一抗原决定簇的特异B细胞免疫。本发明还涉及制备这种免疫原的方法、在治疗中利用该免疫原的方法。此外，本发明涉及用于本发明方法实践中的蛋白、核酸片段、重组修饰的宿主细胞和病毒。
背景技术：
在过去的二十年里，靶向弱抗原和自身蛋白的活化特异性免疫治疗(也称治疗性疫苗接种)受到的极大的关注。刺激免疫系统靶向与病理状态相关的抗原观念包括了在病人顺应性、安全性和有效性方面的许多吸引人的方面。
传统上，已制备了作为抗原和大外来载体蛋白间的化学共轭物的治疗性疫苗，其中的后者提供作为外来物被免疫系统识别的T抗原决定簇。使用融合分子对此方法进行了改进，其融合伴侣由抗原(正常蛋白质的)和外来载体构成。这两种方法均具有使用比自身蛋白更具有免疫原性的大载体分子的缺陷，以及包括大量的B细胞抗原决定簇，因此，该免疫反应通常发展为主要针对载体蛋白的反应并随后在一段时间需要增加疫苗的给药剂量(本领域公知的免疫反应的“载体抑制”现象)。此外，大量融合构建体的使用具有掩饰抗原中抗原决定簇的倾向，由此导致该免疫反应更没有针对性。
相关的方法是将单一定义的假想B细胞抗原决定簇(以短肽的形式存在)与单一、广泛识别的T辅助细胞抗原决定簇和载体蛋白(“半抗原载体”方法)连接。因为保持衍生自较大蛋白的肽链天然构象非常困难，因此这些方法均有很难控制针对单一B细胞抗原决定簇的免疫反应的缺陷。一般而言，这种肽疫苗由于只诱导弱免疫反应而具有诸多问题。
其它的方法包括将自身抗原或抗原决定簇与非免疫原性载体连接，任意地在与含有序列的外来TH抗原决定簇组合，参照例如国际公开WO02/066056，其公开了非免疫原性多羟基聚合物载体，其上结合有B细胞抗原决定簇和TH抗原决定簇。此方法，如其它的肽为基础的方法一样，如果与非免疫原性载体结合的该肽为显著线性化的B细胞抗原决定簇，其工作良好，但对于更复杂的三维限定抗原决定簇，该方法具有不能在免疫原性相关3D构象中限制抗原决定簇的缺陷。
另一方法为制备抗识别抗原的抗体的抗独特型抗体，该抗原是需要下调的。在更大的程度上，此方法代表半抗原载体方法，其中抗独特型抗体的非独特型区域作为载体部分发挥作用，而且所述的抗独特型抗体的独特型为感兴趣抗原的抗原决定簇的三维拟态物。但问题还是该抗独特型抗体是免疫动物的外来物，因此该免疫反应在一段时间内将针对所述的抗独特型抗体非必需部分、或所述抗体为其自身并因此消弱该免疫反应。
在国际公开WO99/25378中，揭示了移植一定数量的结合对(bindingpair)到抗体的CDR(互补决定区)并使用该工程化抗体作为所有用途的免疫试剂，这种工程化抗体将与抗独特型抗体具有相同的特性。国际公开WO99/25378没有详细描述使用自体同源与异源抗体作为移植分子受者的相关问题，即没有讨论使用异源抗体作为疫苗接种或使用自体同源抗体时缺乏免疫原性的载体抑制问题。
国际公开WO95/05849揭示了克服上述载体抑制问题的一种途径，其中使用自身蛋白的最小破坏的免疫原性修饰，其通过在保持自身蛋白的三级结构的自身蛋白氨基酸序列中的单一限定的T辅助细胞抗原决定簇来产生。这种方法诱导了靶向自身蛋白中B细胞抗原决定簇大部分的免疫反应，而且所述的免疫反应不转移至载体部分。
然而，由于多种原因，某些抗原通过产生全部分子的抗体反应的疫苗接种的方式进行靶向是困难的。例如，所述抗原可以是膜蛋白，其仅有小部分暴露在细胞外并由此进行抗体的结合。而且，如果非常需要避免二级免疫机制(补体、NK活性等等)，针对抗原的多克隆抗体反应是不合适的。最终，出于安全的因素，某些抗原必需是在特定的抗原决定簇区域被靶定以避免安全问题，例如在Fc∈R结合区，IgE可被安全的靶定，但是是否该分子的其它部分在临床定位中也被靶定是有争议的。
通过特异的被动免疫治疗可靶定这种抗原，其例如给予需要其的个体单克隆抗体，单克隆抗体只识别一种单一抗原决定簇，并且它们不能激发二级免疫反应。然而，在住院阶段，必需进行单克隆抗体的输注，并且给药量的医嘱通常为每次治疗几克蛋白。因此用单克隆抗体治疗的费用相对较高。
因此，能够激发有效的针对自身抗原中特异抗原决定簇的免疫反应，且不因与载体蛋白的免疫反应性而抑制的试剂是非常需要的。
发明目的本发明的目的是提供新的免疫原性试剂，其用于诱导针对感兴趣的抗原中的单一抗原决定簇的免疫反应。本发明的另一目的是通过使用和制备这种免疫原性试剂的方法以及用于这些方法中的多种分子生物学工具。
发明概述本发明的发明者明确，丰富的自体蛋白(诸如自体同源免疫球蛋白)的使用可提供“脚手架”或“载体”，其能够展现与抗原的B细胞抗原决定簇对应或相同的单一3D结构。因为这种修饰的、丰富的自体蛋白并不能常规表现出充分的免疫原性从而产生有效的针对介入在脚手架结构中的B细胞抗原决定簇的免疫反应，因此根据本发明，将其工程化使其也包括外来T辅助细胞的抗原决定簇，该抗原决定簇刺激必需的辅助B细胞产生自身反应性抗体的T细胞。
因此，本发明最广泛和最普通的方面涉及在动物中具有免疫原性的嵌合结合蛋白，所述的嵌合结合蛋白特异结合第一受体，所述的第一受体结合在所述动物抗原中存在的第二受体，其中所述的嵌合结合蛋白包括结合位点形式的B细胞抗原决定簇，其特异结合第一受体且其与第二受体竞争结合第一受体，
稳定所述结合位点3D构象的脚手架蛋白结构，所述脚手架蛋白结构为所述哺乳动物自体同源的，及至少一种耐受断裂氨基酸序列，其在所述动物中是异源的，且结合所述动物中的MHC II类分子。
本发明还涉及编码本发明所述嵌合蛋白的核酸片段。
本发明的第三方面涉及制备本发明所述嵌合结合蛋白的方法。
本发明的第四方面涉及能够表达本发明所述核酸的载体。
本发明的第五方面涉及针对自身抗原的免疫化方法，该方法通过给予本发明的免疫原性试剂从而激发针对所述抗原的抗原决定簇的免疫反应而进行。


图1丝状噬菌体的示意图。
该图显示了具有蛋白壳的丝状噬菌体，该壳由五个不同的包被蛋白构成(pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX)。
图2噬菌体展示技术示意图。
一轮淘洗(panning)包括大肠杆菌(E.coli)抗体库的重复感染，重组噬菌体颗粒的产生，噬菌体与抗原的孵育，通过洗涤步骤将非结合噬菌体去除，结合噬菌体颗粒的洗提以及利用洗提噬菌体对新鲜大肠杆菌细胞的转导。
发明的详细描述在进行本发明的详细描述之前，为了更好的理解本发明，将对一些特定的术语和表达进行定义。
本发明所述“嵌合结合蛋白”指包括不表现与天然存在分子相关的氨基酸序列组合的蛋白/多肽。更特别地，所述嵌合结合蛋白包括至少来自哺乳动物蛋白(所述脚手架或载体)和外来TH抗原决定簇(与嵌合结合蛋白的其余部分没有天然相关的外来物)的氨基酸序列。此外，该术语意指嵌合结合蛋白包括行使结合位点功能的结构。此结合位点可以是所述脚手架的天然部分(在抗独特型抗体情况下)或其可以是移植到或诱导介入所述脚手架的结合位点。
本发明中的术语“免疫原”指诱导免疫反应的试剂(材料物质或组合物)。应理解，一些分子(例如在自体同源宿主中耐受的传统的小分子半抗原或自身蛋白)是不能诱导免疫反应。
术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可交替使用用于表示胸腺来源的淋巴细胞，其负责不同细胞介导的免疫反应以及在体液免疫反应中的辅助活化。类似地，术语“B淋巴细胞”和“B细胞”可交替使用用于表示抗体产生淋巴细胞。
本发明中的术语“多肽”意指2至10个氨基酸残基的短肽和11至100个氨基酸残基的寡肽，以及多于100个氨基酸残基的多肽。此外，该术语还包括蛋白，即包括至少一种多肽的功能生物分子；当包括至少两种多肽时，其可形成共价连接或非共价连接的复合体。所述蛋白中多肽可以是糖基化和/或酯化和/或包括非辅基(prosthetic group)。此外，术语“多氨基酸”与术语“多肽”等同。
术语“亚序列”指任何至少3个氨基酸的连续片段，或相应地，至少3个核苷酸的连续片段，其分别直接衍生自天然发生的氨基酸序列或核酸序列。
本发明中的术语“动物”通常指动物种类(优选哺乳动物)，例如，Homosapiens(人类)、Canis domesticus(犬)等等及单一的动物。然而该术语也指这些动物种类的群体，因为根据本发明方法对该个体进行免疫，所有储藏体(harbour)基本上是相同的并允许用相同的免疫原对动物进行免疫。例如如果抗原的遗传变体存在于不同的人亚群中，在不同的人群中就有必要使用不同的免疫原使得能够破坏每一群体中的针对抗原的自身耐受。本领域所述技术人员应理解，本发明中的动物为具有免疫系统的活体动物。优选所述动物为脊椎动物，例如哺乳动物。
本发明中的术语“在体下调抗原活性”指降低活体有机体中所述抗原与其受体/配体间的相互作用数量或下调任何有抗原产生的可检测的生理反应活性。通过一些机制可获得所述的下调其中，通过抗体结合产生与抗原活性位点的简单相互作用是最简单的。然而，抗体结合导致通过清除细胞(例如巨噬细胞和其它吞噬细胞)的抗原移除也在本发明的范围内。抗体与抗原结合的另一种可能性是干扰前肽到成熟多肽的正常降解。
本发明的“对免疫系统的有效提呈……”指对动物的免疫系统以控制的形式进行免疫原的刺激，如本发明以下所述，这种免疫系统刺激可以多种方式发挥作用，其中最重要的是利用含多肽的“药物疫苗”(即用于治疗或缓解正在发病疾病的疫苗)或核酸“药物疫苗”进行的疫苗接种，但活的和病毒疫苗也是本发明的范围。所实现的主要结果是哺乳动物中的免疫功能细胞以免疫有效方式面对抗原，然而对于本发明的创造性而言实现这一结果的准确方式较不重要。
术语“免疫原性有效剂量”具有本领域通常的意义，即免疫原的剂量能够诱导免疫应答，该应答明显地使与免疫原共有免疫特征的分子参与其中。
当本发明中使用已被“修饰”的蛋白的表述时，该修饰指肽的化学修饰，其构成其相关蛋白的骨架，该蛋白形成本发明嵌合结合分子的脚手架部分。这种修饰可例如是在脚手架多肽序列中某些氨基酸残基的衍生作用(例如烷化、酰化、酯化等等)，但如以下所评述的，优选的修饰包括氨基酸序列一级结构的改变(和添加)。
当讨论针对抗原的“自身耐受”时，应理解，因通过本发明靶定的抗原是待疫苗接种的群体的自身抗原，该群体中正常的个体不引起针对所述抗原的免疫反应；虽然其不排除动物群体中偶然的个体可能产生针对天然抗原的抗体，例如自身免疫病症部分。在任何等级上，动物正常地仅对其自身抗原产生自动耐受，但不排除衍生自其它动物种类或具有不同表型的群体的抗原类似物也被所述的动物所耐受。牢记不同水平的耐受的存在是重要的。在本发明中，所述动物对所述的脚手架蛋白结构的耐受高于对嵌合结合蛋白中的B细胞抗原决定簇部分的耐受水平，事实上该针对所述脚手架蛋白的耐受如此之高以至于没有显著的与所述动物天然发生脚手架蛋白有交叉反应的免疫作用产生。
“外来T细胞抗原决定簇”(或“外来T淋巴细胞抗原决定簇”)为能够与MHC分子结合且可刺激动物种类中T细胞的肽。优选地本发明外来T细胞抗原决定簇为“广泛宿主的(promiscuous)”抗原决定簇，即与动物种类和群体中MHC分子的特定类别的基本组分结合的抗原决定簇。
仅有有限数量的这种广泛宿主的T细胞抗原决定簇是已知的，以下的详述部分会对它们进行讨论。应注意，为了使本发明的免疫原在动物群体中的大部分中尽可能有效，必需1)插入一些外来T细胞抗原决定簇到相同的嵌合结合蛋白或2)制备一些嵌合结合蛋白，其中每种具有不同的广泛宿主的抗原决定簇插入。还应注意，外来T细胞抗原决定簇的概念还包括细胞毒性T细胞抗原决定簇的用途，即衍生自自体蛋白的、且当以分离的形式而不是所述自身抗原的部分存在时产生免疫原性行为的抗原决定簇。
“外来T辅助细胞淋巴细胞抗原决定簇”(外来TH抗原决定簇)为与MHCII类分子结合的外来T细胞抗原决定簇并可出现在结合了MHCII类分子的抗原提呈细胞(APC)表面上。在这种连接关系下，术语“外来”指TH抗原决定簇对于免疫的动物是外来但所述TH抗原决定簇与形成本发明嵌合结合蛋白部分的脚手架蛋白结构没有天然关系。应理解，“耐受断裂氨基酸序列”包括至少一种此类外来TH抗原决定簇。
本发明中的(生物)分子的“功能部分”指负责由该分子产生的至少一种生化或生理作用的该分子部分。本领域所属技术人员公知，有多种酶和其它的作用因子具有活性位点，其负责由所讨论的分子产生的作用。分子的其它部分可具有稳定或溶解增强作用并如果这些作用与本发明某些实施方案无关其可被忽略。例如，使用某些其它的细胞因子作为嵌合结合蛋白修饰部分(参见以下详细讨论)，并在此情况下，该稳定可以是不相关的，因在嵌合结合蛋白中的整合提供了所需的稳定。在抗体的上下文关系中，本发明的所述功能部分指抗体的片段，其能够表现与抗体相关抗原决定簇的结合。
术语“佐剂”具有疫苗技术领域中通常的意义，即材料物质或组合物，其为1)其本身不能引起针对疫苗免疫原的特异免疫反应，但其2)能够增强对免疫原的免疫反应。或换句话说，仅含有佐剂的疫苗接种不能提供针对免疫原的免疫反应，含有免疫原的疫苗接种可或不可引起针对免疫原的免疫反应，但含有免疫原和佐剂的疫苗接种组合可诱导强于单独免疫原诱导的针对免疫原的免疫反应。
本发明中的分子“靶向”指状态，其中介入所述动物中的分子将优选出现在特定的组织和优选与特定的细胞或细胞类型有关。这种作用可通过多种途径来实现，包括促进靶向的组合物中的分子制剂或促进靶向的分子基团中的介入。这些问题将在以下的详述中讨论。
“免疫系统的刺激”指材料物质或组合物表现通常的非特异的免疫刺激作用。一些佐剂和假定佐剂(例如某些细胞因子)具有刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激试剂的结果是增强免疫系统“警惕性”，指用免疫原诱导的同时或随后的免疫作用与单独使用免疫原比较能诱导显著的更加有效的免疫反应。
“产生性(productive)结合”指肽对MHC分子(I或II类)的结合使得能够刺激T细胞，该细胞应答提呈结合了MHC分子的肽的细胞。例如在APC表面与MHCII类分子结合的肽，如果该APC可刺激TH细胞与提呈的肽-MHCII分子复合体的结合，即为所述的产生性结合。
本发明依据公知常识还包括一些在治疗领域接受的安全有效的特异结合的试剂(单克隆抗体、溶解受体、小分子抑制剂等等)。其中的一些试剂为Remicade(Infliximab，抗TNF单克隆抗体)、Herceptin(Trastuzumab，抗HER-2单克隆抗体(mAB))、Xolair(Omalizumab，抗IgE单克隆抗体)及Retuximab(抗CD20单克隆抗体)。但是，大多数这些特异结合试剂需要经常给药并在医疗监督和控制下来满足安全性标准。因此，即使这些分子在某种程度上缺乏患者的耐受性，它们在临床试验中证明是安全有效的。基于上述应理解，优选的希望免疫的针对抗原是人来源的，即引起免疫反应的B细胞抗原决定簇是人抗原的B细胞抗原决定簇。
本发明的发明者目前已经实现制备疫苗是可能的，该疫苗诱导针对所述抗原的不同结构的多克隆抗体反应，本领域识别的结合试剂能够与该抗原的不同结构发生相互作用，——这种免疫反应将与单克隆抗体的给药具有相同的优点(即不激发二级免疫反应，因此时只有—种抗体与靶分子结合)，但还具有免疫频率保持相对低于抗体给药频率的优点。另一优点是诱导的抗体为多克隆的(但当然单一抗原决定簇具有高度特异性)并因此其诱导最强的结合抗体可能性是可能的。
通过3D结构的鉴定/分离可实践该技术，该3D结构为准确模拟(或等同于)结合临床安全试剂且合并有丰富的免疫原性变体、而不是非免疫原性的自身蛋白的结构。因此，本发明公开了WO95/05849的免疫原性自身蛋白的特异化变体的蛋白结构，但其主要的不同为所述对自身蛋白部分的免疫反应是非显著的，参见以下说明。
不限于任何理论，相信本发明的嵌合结合蛋白在引起对自身抗原的单一B细胞抗原决定簇的免疫反应是有效的，其有以下原因当利用例如抗独特型的IgG抗体进行免疫时，发现可产生对抗由抗独特型抗体的独特型构成的B细胞抗原决定簇的免疫反应。然而，如果抗独特型抗体的剩余部分在疫苗接种的动物中不是自体同源的，所述分子的那一部分将作为传统的载体蛋白发挥作用并因此会产生针对这一部分的更强的免疫反应。通过使用主要是自体同源的抗独特型抗体，这种作用可有效的避免花费过高，然而对于针对独特型结构的有效免疫反应，没有形成产生临床显著的B细胞反应的TH淋巴细胞的充分刺激。本发明人建议在此特殊情况下，通过在所述的抗独特型抗体介入较强的外来TH抗原决定簇由此破坏针对分子的耐受性。
此时，仍可怀疑这种情况下可能会产生对所述抗独特型抗体的有效甚至是有害的免疫反应，但是重要的是所选择的自体同源蛋白(IgG)使得其在所疫苗接种的个体血清中是丰富的自身蛋白。所述的免疫系统因此不能针对所述抗体产生相关的生理反应，其原因是由于B细胞的无能，所述的免疫系统不能完全产生针对这种蛋白的B细胞反应；或者替代的，实际上诱导了抗体产生，但由于自身抗体结构的丰度，所诱导的抗体不能与所述的独特型反应并由于结合了血清中大量的IgG使得其“被吸收”。
因此，不考虑其潜在的作用，由于与丰富的血清蛋白的反应没有“稀释”所述抗体这一部分的反应，所述的唯一的相关和有效的免疫反应将是针对所述抗独特型抗体的独特型。
应理解，本发明的方法并不限于这种免疫原性自体同源的抗独特型抗体的用途。其它的丰富的自身蛋白也可用于所希望免疫的B细胞抗原决定簇的载体结构，——重要的是，无论是没有诱导出针对丰富自身蛋白的抗体，或是，如果有针对所述丰富的自身蛋白的诱导，它们也不能在体产生因其与丰富的自身蛋白结合而产生的副作用，——换句话说，自身蛋白的浓度较高，使得其能够吸收与所感兴趣的B细胞抗原决定簇外部区域有交叉反应的抗体。
本发明嵌合结合蛋白的特性脚手架蛋白结构所述脚手架蛋白结构具有两种用途。首先，所述脚手架蛋白必须稳定B细胞抗原决定簇的天然3D构象，该决定簇是欲产生的相关免疫反应所针对的。其次，当用嵌合结合蛋白进行免疫时，由所述脚手架蛋白结构(既便全部产生)诱导的抗体不能产生副作用。
关于脚手架蛋白结构的稳定作用使用脚手架蛋白结构的暴露的环结构或活性位点是可行的。例如，通过抗体重链和轻链的恒定区的部分，抗体的互补决定区(CDR)保持其正确的构象，并且这对酶中的活性位点和具有活性或结合位点的其它分子也同样适用。
关于脚手架蛋白结构非副作用特性，优选使用衍生自丰富的蛋白的那些蛋白，也就是如果产生针对此脚手架蛋白结构的任何抗体，自然发生在所述免疫个体的大量的脚手架蛋白将会吸收这些抗体。在本发明中，特别优选衍生自丰富的血清蛋白的脚手架蛋白结构。
这种血清蛋白的丰度必须至少到达一定的浓度使得针对所述蛋白产生的抗体不会产生任何副作用。因此，根据本发明，丰富血清蛋白的正常浓度至少为每100ml血清含0.1g。更优选所述丰富血清的正常血清浓度至少为每100ml血清含0.3g，例如，每100ml血清至少含0.4g、至少含0.6g、至少含0.8g、至少含1.0g、至少含1.2g、至少含1.4g、及至少含1.5g。当丰富的血清蛋白为白蛋白时，更高的值是优选的每100ml血清至少含2.0g、以及每100ml血清至少含2.5g、至少含3.0g、至少含3.5g和至少含4.0g。
因此，特别感兴趣的脚手架蛋白结构衍生自白蛋白、免疫球蛋白(例如IgG和IgA)、转铁蛋白、α2-巨球蛋白、haptaglobin、α1-脂蛋白、β1-脂蛋白、以及所有具有高血清浓度的蛋白。
特别优选衍生自诸如IgG的抗体的嵌合结合蛋白。而且所述的脚手架蛋白结构通常衍生自所述分子的非独特型区域，即来自完整抗体的非独特型区域或来自诸如F(ab’)2片段、Fab片段及scFv的其片段。通过使用完整抗体或含有所述抗体Fc片段的大部分的片段，能够获得包括有自身佐剂成分的嵌合结合蛋白。
因此，在优选的实施方案中，所述脚手架蛋白结构包括所述动物中自体同源的多肽的基本完整的氨基酸序列，例如所述动物抗体的重链和/或轻链的Fc的基本完整的氨基酸序列。此外，为使所述脚手架蛋白结构在免疫学上代表其母体自体同源蛋白，优选所述脚手架蛋白结构包括在所述动物的自体同源脚手架蛋白结构中发现的B细胞抗原决定簇的基本成员。最优选所述脚手架蛋白结构具有与所述动物自体同源多肽相同的三级结构(及如果相关、四级结构)。再者，如果所述脚手架蛋白结构衍生自抗体，所述嵌合结合蛋白在其结构中包括基本完整的抗体分子是必需的。
保持自体同源蛋白的三级结构以及四级结构的方法是本领域公知的。例如，参见例如国际公开WO 95/05849、WO 00/20027及WO 00/15807，制备外来TH抗原决定簇被介入的类似的自体蛋白是可能的，根据本发明能够针对所述脚手架蛋白结构的修饰使用这些公开的教导，其构成了本发明的嵌合结合蛋白的部分。
本领域也描述了保持四级结构的方法并可容易地应用于适合的脚手架蛋白结构中。一种可能性是，制备多体(multimeric)蛋白，其中根据本发明只有一种单体单元有本发明的修饰(即，通过保持此单元的三级结构来修饰单体单元使得所述单体能够与所述多体蛋白的天然单体单元准确作用)，而且，制备多体变体也是可能的，其中根据这些原则每一个单体的单元被修饰。然而，还有另一种可能，根据国际公开WO 03/042244(其在此引用作为参考)的教导来“单体化”另外的多体蛋白。根据此参考文献的其它教导，充分保持结构的单体单元的适合修饰使得多体化与本发明的目的相关。
在脚手架蛋白结构为IgG分子的情况下，有时使用不能固定补体的亚类是有优势的，这样能够完全避免二级免疫反应及其作用。当用所述的嵌合结合蛋白进行免疫的靶标为IgE时，这是感兴趣的例子。然而，这种预警没有多大的关系，因为由本发明的嵌合结合蛋白诱导的临床相关抗体从不同时结合相同的抗原(除非所述的抗原决定簇为某些碳水化合物形式的重复单元特性的)，——只有一个单一的抗原决定簇被结合。因补体固定和活化需要多于一个抗体的结合，因此该反应和其它的二级效应因子机制不会出现。
嵌合结合蛋白的B细胞抗原决定簇部分从以上所述可以理解，所述的脚手架蛋白结构具有以空间构象提呈感兴趣B细胞抗原决定簇的作用，该构象与待疫苗接种的动物中发现的抗原的抗原性决定簇准一致或一致。
实现这一目的一种途径是将鉴定的抗原的B细胞抗原决定簇移植到已知存在的结构或脚手架蛋白中。例如，制备遗传修饰抗体是本领域所公知的，其中将所述的抗体互补决定区(CDR)修饰成为提呈已知的抗原的抗原决定簇的氨基酸序列。对于这种抗体，例如可利用包括CDR移植接枝(欧洲专利第0239400号；世界公开WO 91/09967；美国专利第5,530,101号；及美国专利第5,585,089号)、胶合或表面再加工(欧洲专利第0592106号；欧洲专利第0519596号；Padlan E.A.，Molecular Immunology28(4/5)489-498(1991)；Studnicka et al.，Protein Engineering 7(6)805-814(1994)；Roguska.et al.，PNAS 91969-973(1994))，以及链的移动(美国专利第5,565,332号)的不同的技术来进行人源化。
可选择地，所述B细胞抗原决定簇可以是能够根据本发明方法分离的任何的氨基酸序列，参见以下说明。如上所述，本发明部分依赖于抗独特型抗体的用途，其中所述独特型构成所述嵌合结合蛋白的B细胞抗原决定簇部分，但是能够对其它的丰富的血清蛋白的暴露的环结构进行任意的修饰并根据本发明进行筛选，从而分离适合的结合类别。通过使用本发明的创造性筛选方法，能够肯定所述嵌合结合蛋白的B细胞抗原决定簇部分确实呈现适合的构象，并由此其不需要依赖在脚手架蛋白中介入B细胞抗原决定簇，其可能或不能以满意的方式提呈B细胞抗原决定簇。
因此，本发明所述的嵌合结合蛋白优选含有B细胞抗原决定簇，其由抗体的独特型构成。这存在有几种原因首先，抗体的独特型具有已知能够与抗原决定簇结合的确定的3D构象。再者，如果抗体的独特型与不同抗体的独特型反应，那么该抗体的独特型将会模拟抗原的抗原决定簇，而不同的抗体会针对该决定簇反应。因此，不需要检测所述的抗原决定簇是否充分出现在所选择的脚手架蛋白结构中，而且无论所述抗原决定簇的特性是区域的还是聚集的拓扑形的(topographic)。再者，抗独特型抗体已经被证明能够作为疫苗试剂发挥作用，由此引起抗独特型的免疫反应。最后通过这种策略，装配完全的蛋白质的(proteinaceous)疫苗试剂是可能的其能够产生抗非蛋白质的抗原的抗体反应。
因此，在本发明优选的实施方案中，本发明所述嵌合结合蛋白为其中在免疫的动物中所述第一受体是结合第二受体的抗体的独特型或配体的特异结合区的蛋白。在本发明中，特别优选本发明所述嵌合结合蛋白为其中所述第一受体为单克隆抗体的独特型的蛋白。
耐受断裂氨基酸序列及其位置当然，在所述的嵌合结合蛋白中，所述的耐受断裂氨基酸序列可以位于任何适合的位置。例如，其可以简单的融合伴侣或共轭伴侣被介入到脚手架蛋白结构并且在这些实施方案中，所述的耐受断裂氨基酸序列可构成完整的蛋白。与此相关的技术是本领域公知的并包括通过戊二醛的方法进行载体蛋白与抗原的化学连接。
然而，优选通过在所述脚手架蛋白结构中在所述氨基酸序列中进行插入或替代的方法来介入所述耐受断裂氨基酸序列。特别优选本发明的嵌合结合蛋白为抗独特型抗体或其有效结合片段，其被修饰使其包括所述的耐受断裂氨基酸序列，其中所述的抗独特型抗体在所述欲免疫的动物中是自体同源的。
如上所述，通过在所述脚手架蛋白结构中至少一个氨基酸的插入、添加、缺失、或替代的介入来完成耐受断裂氨基酸序列的介入。当然，在所述氨基酸序列中多于一种的变化(例如，通过完整T细胞抗原决定簇进行的插入或替代)的介入是正常的，但是，要达到的重要目的是，当通过抗原提呈细胞(APC)处理时，所述嵌合结合蛋白会产生出现在APC表面的MCHII类分子上下文中的耐受断裂氨基酸序列。因此，如果在适合位置的所述脚手架蛋白结构的氨基酸序列包括一定数量的氨基酸残基，其也可出现在耐受断裂氨基酸序列中，那么通过保留外来抗原决定簇能够实现这种耐受断裂氨基酸序列的介入，该保留是通过氨基酸的插入、添加、缺失和替代来实现的。换句话说，没有必要通过插入或替代介入完整的TH抗原决定簇来实现本发明的目的。
优选氨基酸插入、缺失、替代或添加的数目为至少2个，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21及25个的插入、替代、添加或缺失。另外优选所述氨基酸插入、替代、添加或缺失的数目不超过150个，例如最多100个、最多90、最多80及最多70个。特别优选所述氨基酸替代、插入、添加或缺失的数目不超过60，特别是所述数目不超过50或甚至40。最优选的数目为不超过30。对于氨基酸添加，应注意的是，当所产生的构建为融合多肽的形式时，该数目通常考虑高于150个。
本发明优选的实施方案包括介入至少一种免疫显性耐受断裂氨基酸序列(在本说明书中，也称为“外来免疫显性TH抗原决定簇)。应理解，TH抗原决定簇免疫显性的讨论(question)依赖于所讨论的动物种类。本发明所述术语“免疫显性”简单指抗原决定簇，其在疫苗接种的个体/群体中产生显著的免疫反应，但其公知的是在一个个体/群体中为免疫显性的TH抗原决定簇在另一个相同种类的个体中不是必须免疫显性的，即使其在后者的个体中能够结合MHC-II类分子。因此，对于本发明的目的，免疫显性TH抗原决定簇为其在抗原中出现时能够有效提供T细胞辅助作用的TH抗原决定簇。通常免疫显性TH抗原决定簇具有固有的特性，其通常基本上与结合的MHCII类分子一起提呈，与其中出现的多肽无关。
另一重要的方面是TH抗原决定簇的MHC限制问题。通常，天然发生的TH抗原决定簇为MHC限制性的，即组成TH抗原决定簇的特定肽将仅与MHCII类分子的亚基有效地结合。这会产生如下作用，在大多数情况下一种特定TH抗原决定簇的使用只能产生仅在群体的一部分中有效的疫苗成分，并依赖该部分的规模，在相同的分子中包括更多的TH抗原决定簇是有必要的，或者可选择地制备多成分疫苗，其中所述的成分为变体嵌合结合蛋白，其介入TH抗原决定簇的特性互不相同。
如果所使用TH细胞的MHC的限制是完全未知的(例如，在所接种的动物的MHC组合定义不明确的情况下)，所述由特异疫苗组合物来覆盖的群体的组成部分(fraction)可通过以下公式来确定 其中，pi为对所述疫苗组合物中存在的ith外来TH抗原决定簇的应答者的群体发生频率，且n为所述疫苗组合物中的外来TH抗原决定簇总数。因此，含有3个外来TH抗原决定簇的疫苗组合物分别具有0.8、0.7和0.6的群体反应频数，将得出1-0.2×0.3×0.4＝0.976即97.6％的人群将在统计学上对所述疫苗产生MHC-II类分子介导的反应。
上述公式I不能用于已知多于或少于准确的使用肽的MHC限制形式的情况。如果例如，一种特定的肽仅结合由HLA-DR等位基因DR1、DR3、DR5和DR7编码的人MHC-II类分子，那么这种肽与另一种结合余下的由HLA-DR等位基因编码的MHC-II类分子可实现所述人群的100％覆盖。同理，如果第二肽仅结合DR3和DR5，此肽的添加不会增加总的覆盖率。如果根据对所述疫苗中的TH抗原决定簇的MHC限制的纯粹的群体反应来计算，由特异疫苗组合物覆盖的人群部分可通过以下公式的方法来确定 其中φj为编码结合任意的疫苗中TH抗原决定簇的MHC分子的等位基因单倍型的群体频率总和，并属于3个已知HLA位点(DP、DR及DQ)的jth；在实践中，首先确定那一种MHC分子会识别疫苗中的每一种TH抗原决定簇并据此由基因型(DP、DR及DQ)列出它们，随后，总和对于每种类型的不同列出的等位基因单倍型的个体频率，由此产生φ1、φ2及φ3。
公式I中的pi值超过对应的理论值πi是可能发生的πi=1-Πj=13(1-vj)2---(III)]]>其中vj为编码结合疫苗TH抗原决定簇的MHC分子的等位基因单倍型的群体频率的总和，且其属于3个已知的HLA位点(DP、DR及DQ)的jth，这意味着群体的1-πi是应答者f剩余_i＝(pi-πi)/(1-πi)的频率。因此，可调整公式II从而产生公式IV 其中术语1-f残余_i当为负值时设为0，应注意，公式IV要求针对单倍型的相同组合将所有抗原决定簇作出单倍型物理图(map)。
因此，当选择欲介入所述嵌合结合蛋白的耐受断裂氨基酸序列时，包括所有已知的抗原决定簇是重要的，其可获得1)对每一抗原决定簇的群体应答者频率，2)MHC限定数据，及3)相关单倍型的群体频率。
存在天然发生的“广泛宿主的”TH抗原决定簇，其在较大比例的动物种类个体或动物群体中是有活性的并且它们优选介入到所述的疫苗中，并由此降低在该相同的疫苗中需要非常大量的不同类似物。
所述广泛宿主的抗原决定簇可根据本发明是天然发生的人TH抗原决定簇，例如来自破伤风类毒素的抗原决定簇(例如，P2和P30抗原决定簇)，白喉类毒素、流感病毒血凝素(HA)及恶性疟原虫(P.falciparum)CS抗原。该P2和P30抗原决定簇的序列分别为Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu(SEQ ID NO1)及Phe-Asn-Asn-Phe-Thr-Val-Ser-Phe-Trp-Leu-Arg-Val-Pro-Lys-Val-Ser-Ala-Ser-His-Leu-Glu(SEQ ID NO2)。
在过去的一些年里，已鉴定了一些其它的广泛宿主的TH抗原决定簇。特别是能够结合较大比例的由不同HLA-DR等位基因编码的HLA-DR分子的肽，以及它们是所有可能的欲介入本发明使用的类似物的T细胞抗原决定簇。参见以下的关于抗原决定簇参考文献，在此全部引用作为本文的参考国际公开WO 98/23635(Frazer IH et al.，转让给TheUniversity of Queensland)；Southwood S et al.，1998，J.Immunol.1603363-3373；Sinigaglia F et al.，1988，Nature 336778-780；Chicz RM etal.，1993，J.Exp.Med 17827-47；Hammer J et al.，1993，Cell 74197-203；以及Falk K et al.，1994，Immunogenetics 39230-242。最后的文献也涉及HLA-DQ和HLA-DP配体。当用于本发明的候选耐受断裂氨基酸序列时，在这些文献中列出的所有抗原决定簇是有关的，而且与这些抗原决定簇有相同基序(motif)的抗原决定簇也是。
可选择地，所述耐受断裂氨基酸序列能够是任何人工TH抗原决定簇，其能够结合大部分的MHC-II类分子。在本发明中，国际公开WO 95/07707以及相应的文章Alexander J et al.，1994，Immunity 1751-761(两篇公开均在此引用作为参考)所述的淘洗(pan)DR抗原决定簇肽(“PADRE”)也是用于本发明的耐受性氨基酸序列的候选物。应注意，在这些文章中公开的最有效的PADRE肽在C-和N-末端携带D型氨基酸，以期改进给药时的稳定性。但是，本发明的最初目的是整合作为嵌合结合蛋白部分的相关的抗原决定簇，其随后会在APC的内部溶酶体间隔中被酶解断裂来产生MHC-II类分子上下文中的提呈，因此，将D型氨基酸整合在本发明使用的抗原决定簇中并不是有利的。
一个特别优选的PADRE肽是具有氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQ ID NO3)或其免疫性有效亚序列的肽。这种和其它具有相同的缺乏MHC限制的抗原决定簇是优选的耐受断裂氨基酸序列，其存在于本发明的嵌合结合蛋白中。这种超广泛宿主的抗原决定簇会使本发明的实施方案简单，其中仅有一种单一的嵌合结合蛋白种类出现在疫苗接种的动物免疫系统中。
根据上述应理解，在所述的脚手架蛋白结构中介入耐受断裂氨基酸序列会产生B细胞抗原决定簇基本部分或甚至保留自体同源脚手架蛋白的3D结构(或其功能域)，其根据本发明进行修饰。可通过一些途径来确定这种保留。一种简单的方法是制备多克隆抗血清来抗用于脚手架蛋白的天然分子(例如在家兔或其它适合的动物中制备的抗血清)由此利用该抗血清作为抗其产生的嵌合结合蛋白的检测试剂(例如，用于竞争ELISA)。嵌合结合蛋白，其与所述抗血清的反应程度与自体同源脚手架蛋白结构与抗血清反应的程度相同，必然视为具有与自体同源脚手架蛋白结构相同的3D结构，然而这种抗血清表现出有限的(但仍是显著和特异的)的反应性的所述嵌合分子被认为是具有原始B细胞抗原决定簇的基本组分。可选择地，可以选择与自体同源脚手架蛋白上的不同抗原决定簇反应的单克隆抗体并用于试验程序。这种方法具有使1)自体同源脚手架蛋白分子的抗原决定簇绘图(mapping)，及2)维持在所述嵌合结合蛋白中的所述抗原决定簇的绘图的优点。
当然，第三种方法将解析所述自体同源脚手架蛋白的或其生物活性截短物(truncate)(参考上述)的三维结构，并将此比作嵌合结合蛋白的解析三维结构。利用X线衍射和NMR波谱可解析三维结构。此外，为了提供关于给出分子三级结构的有用信息，在某种程度上可从循环二向色性研究中获得与三级结构有关的信息，该研究几乎不要求纯化形式的多肽(而线衍射要求结晶的多肽形式，NMR要求所述多肽的同位素变体并对所要解析的多肽有大小的限制问题)。然而，由于循环二向色性通过二级结构元件的信息只能提供准确三维结构的间接证据，因此为了获得结论性数据进行最终的X线衍射和/或NMR是必要的。
本发明依赖对特别良好适配区的识别，该适配区用于介入外来元件到脚手架蛋白结构，该元件提供必要的TH抗原决定簇。特别优选的区域为柔韧性环区域(其不直接参与三级结构)、柔韧性连接子区域以及N末端或C末端。可选择地，所述TH抗原决定簇的介入可在具有二级结构的区域中进行，该二级结构与所述抗原决定簇的二级结构具有高度相似性(可以用可形成α螺旋部分的抗原决定簇来取代α螺旋区域，可以用可形成β折叠(strand)部分的抗原决定簇来取代β折叠区域)。重要的是，当利用耐受断裂氨基酸序列在所述脚手架蛋白结构中进行氨基酸取代来制备嵌合结合蛋白时，所述的介入预计最低限度地影响相关脚手架蛋白的抗原决定簇。因此，正常的取代仅会产生所述缺失氨基酸占相关脚手架蛋白(亚)序列的30％或更少，并且在正常的条件下，此数目会更低，例如最多20％、最多15％、最多10％及最多7.5％。作为诸如完整抗体的大分子，所述数目会更低，例如最多5％、最多4％及低到最多3％或最多2％。
嵌合结合蛋白的任意构成除了包括上述讨论的以结合位点、脚手架蛋白结构和耐受断裂氨基酸序列形式存在的B细胞抗原决定簇外，本发明所述嵌合结合蛋白还可包括其它一些特征。在这些实施方案中，所述嵌合结合蛋白包括至少一个第一部分，其作用是将所述嵌合结合蛋白靶向抗原提呈细胞(APC)，和/或至少一个第二部分，其刺激所述免疫系统，和/或至少一个第三部分，其优化所述嵌合结合蛋白对免疫系统的提呈。
关于这些第一、第二、和第三部分的功能与结构特征将在以下讨论它们能以侧基的形式存在，其共价或非共价附着在所述脚手架蛋白结构的氨基酸序列的适合活性基团上。这意味着，衍生自自体同源脚手架蛋白的氨基酸残基的伸展为没有改变其原始氨基酸序列的衍生，或至少没有介入在所述链中个别氨基酸间的肽键的改变。
这些部分还能以衍生自自体同源脚手架蛋白的氨基酸序列的融合伴侣分子和/或耐受断裂氨基酸序列形式存在。在这种连接中，应提到包括将氨基酸序列连接到载体的选项的两种可能性，可参照以下讨论。换句话说，在本发明中术语“融合蛋白并不仅仅限于通过编码所述构建的DNA片段的表达的手段制备的融合构建，还存在有两种蛋白的结合物，其通过后续化学反应中的肽键方式来连接。
如上所述，所述的嵌合结合蛋白也包括第一部分的介入，其将所述的嵌合结合蛋白靶向APC或B淋巴细胞。例如，能够特异结合B淋巴细胞特异表面抗原或APC特异表面抗原的伴侣分子。许多特异表面抗原是本领域公知的。例如，这部分能够是碳水化合物，在B淋巴细胞或APC (例如甘露聚糖或甘露糖)上存在其受体。可选择地，所述的第二部分可以是半抗原。而且，特异识别APC或淋巴细胞上表面分子的抗体片段也能用于第一部分(所述的表面分子能够是巨噬细胞和单核细胞FCγ受体，例如FCγRI，或者可选择地为诸如CD40或CTLA-4的任意特异的表面标志)，在本发明中，值得注意的是本发明所述的嵌合结合蛋白的用途，该蛋白为抗独特型IgG，提供了以IgG的Fcγ受体结合区域为形式的这种第一部分。
应注意，所有这些示例性靶向分子能够作为佐剂的一部分使用，可参考以下描述。结合CD40的CD40配体、抗CD40抗体、或其变体会将所述嵌合结合蛋白靶向树突状细胞。同时，最近的研究结果表明，与CD40分子的相互作用，使TH细胞对获得CTL反应是不必要的。因此，考虑通常使用作为第一部分(或作为佐剂，参考以下描述)的CD40结合分子可相对增强所述的CTL反应；事实上，在本发明的方法中，相信这种作为佐剂和“第一部分”的这种CD40结合分子的用途其本身具有创造性。
为实现增强的免疫反应，作为所述嵌合结合蛋白靶向某种细胞类型的替代或补充，通过包括上述的刺激免疫系统的第二部分来增加免疫系统的反应水平是可能的。这种第二部分的典型的例子为细胞因子、热休克蛋白、激素以及其有效部分。
适合用于本发明的细胞因子为在疫苗组合物中作为佐剂正常行使功能的那些细胞因子，例如干扰素γ(IFN-γ)、Flt3配体(Flt3L)、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；可选择地，细胞因子的功能部分作为第二部分就足够了。作为佐剂物质的这种细胞因子的作用参见以下描述。
可选择地，所述第二部分能够是毒素，例如listeriolycin(LLO)、脂质A和热不稳定肠毒素。再者，一些诸如MDP(胞壁酰二肽)、CFA(完全弗氏(Freund)佐剂)及海藻糖二酯类TDM和TDE的分枝杆菌衍生物是有作用可能性的。
根据本发明，适合用于第二部分的热休克蛋白能够是HSP70、HSP90、HSC70(一种热休克同源物)、GRP94及钙网织蛋白(CRT)。
增强所述嵌合体结合蛋白在免疫系统中的提呈的第三部分介入的可能性是本发明的一个重要实施方案。本领域已经给出了这一原则的几个例子。例如，本领域公知的可使用博氏硫螺旋(Borrelia burgdorferi)蛋白OspA中的棕榈酰脂质化锚定物(palmitoyl lipidation anchor)来提供自体佐剂多肽(参见例如国际公开WO 96/40718)。该脂质化蛋白似乎形成微泡样结构，该结构具有由所述多肽的脂质化锚定物部分构成的核心部分以及从其中产生的分子突出的剩余部分，这导致所述抗原决定子的多重提呈。因此，使用不同脂质化锚定物(例如，肉豆蔻基、法呢基、香叶基-香叶基、GPI锚定物及N-酰基甘油二酯基(acyl diglyceride，group))的这种用途和相关方法是本发明优选的实施方案，特别是由于在重组产生的蛋白中的这种脂质化锚定物的供给是直接的并几乎不需要例如天然发生的信号序列作为所述嵌合结合蛋白的融合伴侣的使用，参见以下的描述。另一种可能性是补体因子C3或C3本身的C3d片段的使用(参见Dempsey et al.，1996，Science 271，348-350及Lou & Kohler，1998，NatureBiotechnology 16,458-462)。
本发明的免疫靶标本发明所述嵌合结合蛋白特别适合活化特异的靶标抗原的免疫治疗，其是已知的单克隆抗体治疗的适合靶标。例如，免疫球蛋白E、CD20、CD11a、β淀粉状蛋白、HER-2及TNFα均是本发明适合的靶标，意味着上述讨论的第二受体能够出现在这些抗原中，然而，在活化特异的免疫治疗中使用所述的嵌合结合蛋白是必要的，该治疗靶向任何的其它蛋白质的或非蛋白质的抗原，其中靶向一种单一抗原决定簇就足够了(或甚至必要)。
这种靶标能够是要求其仅靶向非常特异“安全的”分子区域(如在IgE中，其要求靶向FC∈R结合区来避免由交叉连接抗IgE抗体诱导的过敏反应)，或者其可定义为暴露的抗原区域，其不能接近抗体(如CD20，其中仅有一个小蛋白暴露在细胞外)。
根据本发明，特别感兴趣的免疫的靶标为










然而，在所有情况下，其中已证明单克隆抗体治疗是成功的或其中利用结合特异治疗安全抗原决定簇或受体结构的其它配体(例如可溶性受体)的治疗，制备本发明的嵌合结合试剂是有价值的。
核酸和其它分子生物学工具本发明还涉及编码本发明嵌合结合蛋白的核酸片段。这种核酸片段不但用于本发明的嵌合结合蛋白的重组制备还能作为核酸疫苗的免疫试剂部分，参照以下描述。
从以上的公开中可知，不但能够通过重组基因技术而且还可以通过化学合成或半合成手段制备所述的嵌合结合蛋白；当进行蛋白载体(例如KLH、白喉毒素、破伤风毒素及BSA)与诸如碳水化合物聚合体的非蛋白分子配对连接的修饰时，以及当所述修饰包括对多肽衍生肽链进行侧链或侧基的添加时，后两者手段是特别相关。
对于重组基因技术，以及核酸免疫，编码所述的嵌合结合蛋白或多肽的核酸片段是重要的化学产物。因此，本发明的一个重要部分涉及核酸片段，其编码上述的嵌合结合蛋白、优选多肽，其中通过插入和/或添加，优选取代和/或缺失的方式，在所述中脚手架蛋白结构介入外来TH细胞抗原决定簇。本发明的核酸片段为DNA或RNA片段。与编码本发明嵌合结合蛋白的核酸片段互补的核酸片段也包括在本发明的范围中。
本发明所述核酸片段将正常插入在适合在载体中，来形成携带本发明所述核酸片段的克隆或表达载体；这种新的载体也是本发明的一部分。关于本发明这些载体的详细描述将在本发明以下的转化细胞和微生物中讨论。依据应用的形式和目的，所述载体不仅是质粒、噬菌体、装配型质粒、微小染色体或病毒的形式，而且可以是裸DNA的形式，其仅在某些细胞中瞬时表达，是一种重要的载体。优选的本发明的克隆和表达载体能够自主复制，因此能够产生用于高水平表达的高拷贝数和用于后续克隆的高水平复制。
本发明载体的总的轮廓包括以下的5’→3’方向和在可操作的连接中的特征操纵本发明所述核酸片段表达的启动子；编码引导肽的任意核酸序列，该肽能够分泌和整合到所述多肽片段的膜中；本发明所述核酸片段；以及编码终止子的核酸序列。在生产菌株或细胞株中操纵表达载体时，为了转化细胞的遗传稳定性目的，其优选当载体介入到宿主细胞中时可整合到宿主细胞基因组中。相反，当使用有效在动物体内表达的载体(即使用DNA疫苗接种中的载体时)工作时，出于安全的原因，优选所述载体不能整合到所述宿主基因组中；通常，使用裸DNA或非整合病毒载体，对其的选择是本领域所属技术人员公知的。
本发明的载体用于转化宿主细胞来产生本发明所述的嵌合结合蛋白。也是本发明的一部分的这种转化的细胞，是用于增殖核酸片段和本发明载体或用于制备本发明所述嵌合结合蛋白的重组产物的培养细胞或细胞株。可选择地，所述转化细胞能够是适合的活疫苗菌株，其中已经插入了所述核酸片段(单一或多拷贝)来产生分泌或整合到所述细菌膜中或所述的嵌合结合蛋白细胞壁中。
本发明优选的转化细胞为微生物，例如细菌(例如埃希氏杆菌属[例如大肠杆菌]、芽孢杆菌属[例如微小芽孢杆菌]、沙门氏杆菌或分支杆菌[优选非致病性的例如牛分枝杆菌BCG])，酵母(诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和原生动物。可选择地，所述转化细胞衍生自诸如真菌、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞的多细胞有机体。最优选的细胞衍生自人类，参考以下关于细胞株和载体的讨论。
对于克隆和/或优化表达的目的，优选所述转化细胞能够复制本发明的核酸片段。表达所述核酸片段的细胞优选用于本发明的实施方案中；他们能够用于小规模或大规模的所述嵌合结合蛋白的制备，或在非致病性细菌作为活疫苗的疫苗成分的情况下。
通过转化细胞的方式来产生本发明所述的嵌合结合蛋白时，将所述的表达产物输送到培养液中或携带在转化细胞的表面是方便的，尽管并不必要。
当有效的产生者细胞被鉴定后，优选，以其为基础，建立适合的细胞株，其携带本发明的载体并表达编码本发明所述嵌合结合蛋白的核酸片段。优选地，这种适合的细胞株分泌或携带本发明所述的嵌合结合蛋白，因此促进其纯化。
通常，使用含有衍生自与所述宿主细胞匹配种属的复制子和控制序列的质粒载体与宿主细胞结合。所述载体常规携带复制位点，以及能够在宿主细胞中提供表型选择的标志序列。例如，大肠杆菌通常用pBR322来转化，该质粒衍生自大肠杆菌种属(参见例如Bolivar et al.，1977)。所述的pBR322质粒含有氨苄青霉素和四环素抗性基因并因此提供鉴定转化细胞的方便手段。所述的pBR质粒，和其它微生物质粒和噬菌体也必须含有或被修饰含有启动子，该启动子能够被原核微生物利用来表达。
这些最普遍用于重组DNA构建的启动子包括B-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang et al.，1978；Itakura et al.，1977；Goeddel et al.，1979)和色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.，1979；EP-A-0 036 776)。当非常普遍地使用这些启动子时，也发现和使用其它的微生物启动子，而且关于这些核酸序列的详细资料已经公开，使得本领域所属技术人员能够将它们功能性地与载体连接(Siebwenlist et al.，1980)。某些来自原核细胞的基因可在其自己的启动子序列下在大肠杆菌中有效地表达，排除了提供人工手段进行另一种启动子添加的需要。
除原核细胞外、可使用诸如酵母的真核微生物，且其启动子应具有驱动表达的能力。酿酒酵母属和普通面包酵母是在真核微生物中最常用的，尽管一些诸如甲醇酵母(Pichia pastoris)的其它的菌株也是有用的。对于在酿酒酵母中的表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb et al.，1979；Kingsman et al.，1979；Tschemper et al.，1980)。这种质粒已经含有trpl基因，该基因为不能在色氨酸中生长的突变株酵母提供选择性标志，例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977)。作为宿主细胞基因组特征的trpl障碍的存在提供了在缺乏色氨酸中生长来测定转化的有效的环境。
酵母载体中适合的启动序列包括磷酸甘油酸激酶(Hitzman et al.，1980)或其它糖酵解酶(Hess et al.，1968；Holland et al.，1978)的启动子，例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶及葡萄糖激酶。为构建适合的表达质粒，所述的与这些基因有关的终止序列也连接到所述表达载体的希望表达的序列的3’端来提供其mRNA的多聚腺苷酸尾和终止序列。
其它的启动子，其具有由生长条件控制的转录的附加优点，为启动子区域，用于乙醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶、以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。含有酵母匹配启动子、复制和终止序列本的任何质粒载体是适合的。
除微生物外，来源于多细胞有机体的细胞培养物也可用于宿主。原则上，无论是脊椎动物或无脊椎动物，任何这种细胞的培养物是能够工作的。但是，对脊椎动物细胞是特别感兴趣的，并且近年来培养(组织培养)的脊椎动物细胞的增殖已经成为常规的途径(Tissue Culture，1973)。这种使用的宿主细胞株的例子为VERO细胞和HeLa细胞，中华仓鼠卵巢细胞(CHO)株以及W138、BHK、COS-7293和MDCK细胞株。
对于这种细胞的表达载体通常包括(如果需要)复制本、位于表达基因前面的启动子、以及必需的核糖体结合位点、RNA拼接位点、多聚腺苷酸位点以及转录终止子序列。
对于哺乳动物中的使用，通常由病毒材料提供对所述表达载体的功能控制。例如，通常使用的启动子衍生自多瘤病毒、腺病毒2及最常用的猿病毒40(SV40)。特别使用SV40病毒的早期和晚期启动子，其原因是二者可从也含有SV40表达的复制本片段的病毒中轻易获得(Fiers et al.，1978)。只要包括在病毒复制本中从HindIII位点向Buzz位点延伸的大约250bp序列，也可使用更小或更大的SV40片段。此外，只要这种控制序列与所述的宿主细胞系统匹配，使用与所希望的基因序列正常相关的启动子或控制序列也是可能的。
可通过包括外源基因本的载体的构建来提供复制本，例如从SV40或其它病毒(例如，多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或通过宿主细胞染色体复制机制来通过。如果所述载体整合到所述的宿主细胞染色体中，后者是经常是充分的。
本发明的组合物从以上的描述中可显而易见，本发明还涉及制备免疫原性组合物，其包括本发明的嵌合结合蛋白、由于表达本发明所述的嵌合结合蛋白而具有免疫原性试剂功能的本发明的核酸片段或非致病病毒或细菌。
因此，本发明也涉及组合物，其用于诱导抗宿主自体同源中抗原的抗体的产生，所述组合物包括，本发明的嵌合结合蛋白或本发明的核酸或本发明的载体(包括诸如非致病性病毒或微生物的载体)，及药物或免疫学可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
对免疫学可接受的载体和赋形剂将在本发明的疫苗接种技术相关部分进行讨论。
多肽疫苗接种本发明涉及下调自身抗原或展示所述动物中自身抗原的抗原决定簇的细胞的方法，所述方法包括用本发明的免疫原性有效剂量的嵌合结合蛋白提呈给所述动物的免疫系统。实现这一目标的一个优选的途径需要对所述动物给予免疫原性有效剂量的嵌合结合蛋白。优选地，所述嵌合结合蛋白与药物和免疫学可接受载体和/或赋形剂以及任意的佐剂一起组方。
当通过将其给药到动物的手段将所述嵌合结合蛋白有效提呈给动物免疫系统时，所述多肽的组方遵循本领域公知的原则。
含有肽序列作为活性成分的疫苗制剂是本领域所述技术人员公知的，例如美国专利第4,608,251号；第4,601,903号；第4,599,231号；第4,599,230号；第4,596,792号及第4,578,770号，其全部引用作为本发明的参考。通常，这种疫苗制备成可注射的如液体溶液或悬浮液的形式；也可制备在注射之前适合溶解或悬浮在液体中的固体形式。所述的制剂也可以是乳化的。所述的活性免疫原性成分通常与药物可接受的并且与所述活性成分匹配的赋形剂混和。
适合的赋形剂为，例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇或其它，以及上述的组合。此外，如果需要，所述疫苗可含有较少量的辅助物质，例如润湿或乳化剂、pH缓冲剂或增强疫苗效力的佐剂；参照以下佐剂的详细描述。
通常通过注射肠道外给予疫苗，例如，皮下、皮内或肌肉内。适合其它给药方式的制剂包括栓剂和在某些情况下的口服、口腔、舌下、腹腔内、脊髓、直肠和颅内的制剂。对于栓剂，传统的结合剂和载体可包括例如，聚醚类油(polyalkalene glycols)或甘油三酯；这种栓剂可由含有剂量范围为0.5％-10％、优选1-2％的活性成分的混合物形成。口服制剂包括诸如药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等的常规使用的赋形剂。这些组合物为溶液、悬浮液。片剂、丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末，且含有10-95％的活性成分，优选含25-70％。对于口服制剂，霍乱毒素是感兴趣的制剂伴侣(也是可能的结合伴侣)。
所述嵌合结合蛋白能以天然或盐的形式组方到所述疫苗中。药物可接受的盐包括酸加合盐(与所述肽的游离氨基形成)并且其与诸如盐酸、磷酸无机酸形成，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等等的有机酸形成。与游离的羧基基团形成的盐也可衍生自诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁的无机碱，或诸如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等等的有机碱。
所述疫苗以剂量制剂匹配的方式给药，并能产生治疗有效作用和免疫原性。依据治疗的个体来确定给药的量，例如，个体免疫系统产生免疫反应的能力，预期保护的程度。适合的剂量范围是每疫苗接种几百微克等级差异的，并优选范围约0.1μg-2000μg(甚至可考虑1-10mg的高剂量范围)，诸如约0.5μg-1000μg的剂量范围，优选1μg-500μg，特别是约10μg-100μg的剂量范围。对于初始给药和强化注射的适合的给药方案也是不同的，但通常通过初始给药并随后进行后续的接种或其它的给药。
应用的形式可以在较宽的范围内变化。用于疫苗给药的任何常规方法是适用的。这些包括对固体生理可接受碱的口服应用、生理可接受分散形式、通过肠道外注射等等。依据给药途径和欲疫苗接种的个体年龄以及所述抗原的制剂形式来确定疫苗剂量。
一些所述疫苗的嵌合结合蛋白在疫苗中具有充分的免疫原性，但对于一些其它的疫苗如果所述疫苗还包括佐剂物质，免疫反应将会增强。特别优选使用促进破坏自体抗原的自体耐受性的佐剂。
实现所述疫苗的佐剂作用的各种方法是公知的。通常的原则分方法在“The Theory and Practical Application of Adjuvants”，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(ed.)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6，以及在“VaccinesNew Generation Immunological Adiuvants”，1995，GregoriadisG et al.(eds.)，Plenum Press，New York，ISBN 0-306-45283-9中有详细的描述，这两篇文献在此引用作为本发明的参考。
一组优选的佐剂能促进诸如树突状细胞的APC细胞对疫苗分子的摄取并活化这些细胞。非限制性例子选自免疫靶向佐剂；诸如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物的免疫调节佐剂；油剂；聚合物；微胞形成佐剂；皂角苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉(inulin)；及包被佐剂。通常应注意的是，涉及以所述嵌合结合蛋白中的第一、第二和第三部分使用的化合物和试剂的上述公开还指已作必要的修正的(mutatis mutandis)本发明的疫苗佐剂中的用途。
所述佐剂的应用包括，利用诸如通常在缓冲盐溶液中以0.05-0.1％的浓度使用氢氧化铝或磷酸(铝)试剂，与以0.25％溶液使用的糖合成聚合物(例如Carbopot)的掺和，通过在70℃-101℃之间的温度范围分别进行30秒至2分钟的热处理实现疫苗中的蛋白凝集或通过交联试剂的方法进行凝集也是可能的。凝集也可使用胃蛋白酶处理的抗体(Fab片段)到白蛋白的再活化，与含诸如革兰氏阴性细菌的C.parvum或内毒素或脂多糖成分的细菌细胞的混合，含诸如二缩甘露醇单油酸酯(mannide monooleate)(Aracel A)的生理可接受的油类赋形剂的乳化，或者用20％的全氟化碳溶液(Fluosol-DA)作为阻断取代的乳化。含有诸如角鲨烯和IFA的油类的掺和物也是优选的。
根据本发明，DDA(二甲基二十八烷基溴化铵)是一种感兴趣的佐剂候选物，DNA、MF59和γ-菊粉，以及Freund氏完全和不完全佐剂、诸如以及QuilA和QS21的quillaja皂角苷也同样是感兴趣的。另外的可能性是单磷酸脂质A(monophosphoryl lipid A)(MPL)和上述C3和C3d。
脂质体制剂的佐剂作用也是已知，因此本发明优选脂质体佐剂。
免疫刺激复合物基质类型(ISCOM基质)佐剂也是本发明优选的，特别是由于已经证明这种类型的佐剂能够上调APC的MHC II类分子的表达。ISCOM基质由来自Quillaja肥皂草的皂角甙(三萜类)、胆固醇和磷脂构成(任意部分化的)。当用免疫原性蛋白掺和时，所产生的微粒制剂即为已知的ISCOM颗粒，其中皂角甙构成60-70％w/w，胆固醇和磷脂为10-15％w/w，蛋白为10-15％w/w。组合物和免疫刺激复合物的详细描述参见上述的关于佐剂的教科书，以及Morein B et al.，1995，Clin.Immunother.3461-475和Barr IG and Mitchell GF，1996，Immunol.andCell Biol.748-25(引用此两篇文献作为本发明的参考)提供了完全免疫刺激复合物制备的有用的介绍。
实现佐剂作用的另一非常感兴趣(因此是优选的)的可能性是使用Gosselin et al.，1992(其在此引用作为本发明的参考)中所述的技术。简而言之，诸如本发明修饰的CEA多肽的相关抗原的提呈可通过将所述抗原结合到抗单核/巨噬细胞上Fcγ受体的抗体(和抗原结合抗体片段)来增强。特别是包括抗FcγRI或FcγRI结合结构的轭合物相信能够增强疫苗接种的免疫原性。
其它的可能性包括靶向和免疫调节物质(例如细胞因子)的使用，以上已经对这种作为所述嵌合结合蛋白的第一和第二部分的候选物的物质进行了描述。在这种关系中，合成的细胞因子如聚I∶C的诱导剂也有可能性。
适合的微生物衍生物选自胞壁酰二肽、完全弗氏(Freund)佐剂、RIBI和诸如TDM和TDE的海藻糖二酯。
适合免疫靶向佐剂选自CD40配体和CD40抗体和特异结合其的片段(参见以上的讨论)、甘露糖、Fab片段及CTLA-4。
适合的聚合物佐剂选自诸如右旋糖苷、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖的碳水化合物；和诸如乳胶颗粒的乳胶。
另一种调节免疫反应的感兴趣的途径包括在“虚拟淋巴结(VLN)”中(由Immuno Therapy，Inc.，360 Lexington Avenue，New York，NY 10017-6501开发的专利医疗装置)的免疫原(任意与佐剂和药物可接受载体和赋形剂的一起)。所述的VLN(薄管装置)模拟淋巴结的结构与功能。在皮下插入VLN产生高涨的细胞因子和趋化因子的无菌炎症反应位点。T与B细胞以及APC可快速地对危险信号产生反应，回巢到所述的炎症位点并聚集在VLN的多孔基质中。研究表明当使用VLN时，对抗原的免疫反应所需的必要的抗原剂量减少了，而且VLN的疫苗接种出现免疫保护，超过Ribi作为佐剂的常规免疫作用。这种技术参见Gelber C et al.，1998，“Elicitation of Robust Cellular and Humeral Immune Responses to SmallAmounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated theVirtual Lymph Node”，in“From the Laboratory to the Clinic，Book ofAbstracts，October 12th-15th1998，Seascape Resort，Aptos，California”的简要描述。
至少每年给药这种疫苗一次是理想的，诸如每年至少1、2、3、4、5、6和12次。更特别的是，每年1-12次是理想的，诸如每年给予需要其的个体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12次。以往证明使用这种本发明的优选的自体疫苗诱导的这种记忆免疫性并不是永久的，因此需要阶段性地用所述嵌合结合蛋白来刺激该免疫系统。
由于遗传变异，不同的个体对相同的多肽会产生不同强度的免疫反应。因此为了增强免疫反应，根据本发明的疫苗可以包括几种不同的嵌合结合蛋白多肽，也参见上述关于外来TH抗原决定簇介入的选择的讨论。这种疫苗可包括两种或多种多肽，其中所有这些多肽如上所定义。
所述疫苗可最终含有3-20条不同修饰多肽，诸如3-10条不同多肽。然而，正常的肽的数量应控制到诸如1或2条肽的最小数量。
活疫苗对所述免疫系统进行有效提呈的第二种选择是使用活疫苗技术。在活疫苗接种中，通过给予所述动物非致病微生物可优选地对所述免疫系统进行提呈，该非致病性微生物已经转化了编码所述嵌合结合蛋白的核酸片段。可选择地，所述微生物用连接有这种核酸片段的载体来转化。所述的非致病微生物是任何减毒的细菌菌株(通过传代的方法或通过重组DNA技术去除致病表达产物的方法来减毒)，例如，牛分枝杆菌BCG、非致病链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、志贺氏菌等等。关于活疫苗制备的本领域现状的综述可例如参见Saliou P，1995，Rev.Prat.451492-1496和Walker PD，1992，Vaccine 10977-990，引用这两篇文献作为本发明的参考。关于用于这种活疫苗中的核酸片段和载体的详细描述参见例如以下的讨论。
特别是BCG已经广泛地用于活细菌疫苗该BCG疫苗已经在世界范围内成功地用于预防结核病。在出生后可进行疫苗接种并几乎不产生严重的并发症，甚至在被人类免疫缺陷病毒I型感染的个体中。BCG具有较强的免疫佐剂活性，并广泛地用于浅表膀胱癌的治疗中。
对于所述的多肽疫苗，所述的TH抗原决定簇和/或第一和/或第二和/或第三部分，如果存在，可以为衍生自脚手架蛋白结构的氨基酸序列的融合伴侣分子的形式。
当选择细菌活疫苗时，以下描述的本发明的核酸片段可以结合到非毒性病毒载体中。适合的病毒载体选自豆病毒，例如牛痘病毒、MVA(改性牛痘病毒)、金丝雀豆病毒、鸟豆病毒(avi-pox)和鸡豆病毒等等。可选择地，可使用单纯疱疹病毒变体。
正常情况下，所述非致病微生物或病毒只对所述动物给药一次，但在某些情况下，在生命期中，需要多次给予所述微生物。
再者，可以用含有编码所述第一、第二和/或第三的部分的核酸来转化所述微生物，例如以上述的免疫调节物质的形式，例如讨论的用作佐剂的细胞因子。本发明优选的实施方案包括在不同的开放阅读框架中或至少在不同的启动子控制下具有所述嵌合结合蛋白编码区和该免疫调节剂的编码区。这避免产生免疫调节剂的融合伴侣分子形式的所述嵌合结合蛋白，并在某些情况下具有优势的发挥作用。可选择地，使用两种不同的核酸片段的转化试剂。
核酸疫苗接种作为替代传统的肽为基础的疫苗给药，核酸疫苗接种技术(也称为“核酸免疫”、“遗传免疫”、“基因免疫”和“DNA疫苗接种”)提供了许多诱人的特点。
首先，与传统的疫苗途径不同，核酸疫苗接种不需要消化大规模产生的免疫原性试剂的资源(例如，产生多肽疫苗接种中需要的嵌合结合蛋白的工业规模的微生物制剂)。其次，不需要对免疫原进行纯化和再折叠步骤。最后，由于核酸疫苗接种依赖于被接种疫苗个体的生化手段来产生介入核酸的表达产物，因此预期产生所述表达产物的优化的翻译后加工过程；这在自体同源疫苗接种中时非常重要的，因为如上所述，原始的B细胞抗原决定簇的有意义组分应保留在衍生自细胞外暴露多肽序列的嵌合结合蛋白中，并由于原则上的B细胞抗原决定簇能够由任何(生物)分子的部分(例如碳水化合物、脂质、蛋白等等)来构成。因此天然的免疫原的糖基化和脂质化对于完整的免疫原性是非常重要的并且宿主产生的所述免疫原可最好地确保这一点。
因此，本发明方法的重要实施方案包括由给予编码并表达本发明嵌合结合蛋白的核酸片段来产生提呈作用。
作为传统的疫苗接种途径，能够通过将至少一种编码和表达所述第二类似物的核酸片段在体介入到APC细胞的方式联合进行核酸疫苗的接种。此处也使用包括第一、第二和第三部分以及TH抗原决定簇的方案。
在这种实施方案中，所介入的核酸优选DNA，其能够为裸DNA、带电或不带电脂质组方的DNA、以脂质体形式组方的DNA、乳化DNA、病毒载体中的DNA、转染促进蛋白或多肽组方的DNA、靶向蛋白或多肽组方的DNA、钙沉淀试剂组方的DNA、连接有惰性载体分子的DNA以及佐剂组方的DNA。因此，根据核酸疫苗接种技术有修改的应用本发明涉及多肽为基础的疫苗中佐剂使用的公开。这对给药的制剂、形式、途径的其它考虑也同样适用，因此有修改地将核酸疫苗接种技术应用于产生疫苗有关的上述方案。
核酸疫苗的特别优选的制剂形式为含有DNA的微粒。适合的微粒例如国际公开WO 98/31398中所述。
此外，用于免疫的核酸试剂能够含有编码第一、第二和/或第三部分，例如采取如上所述的诸如作为佐剂使用的细胞因子的免疫调节物质。此实施方案优选的形式包括在不同的开放阅读框架中或至少在不同的启动子控制下具有所述嵌合结合蛋白编码区和该免疫调节剂的编码区。这避免产生免疫调节剂的融合伴侣分子形式的所述嵌合结合蛋白，并在保留脚手架蛋白结构方面发挥优势作用。可选择地，使用两种不同的核酸片段，但这并不是优选的，因在同一分子中含有两种编码区域有确保共表达的优点。
在正常的情况下，所述核酸疫苗以载体的形式介入，其中表达是在病毒启动子的控制下。本发明的载体的详细描述参见以下的讨论。再者，与核酸疫苗的利用和制剂有关的详细公开参见Donnelly JJ et al，1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648和Donnelly JJ et al.，1997，Life Sciences60163-172。引用这两篇文献作为本发明的参考。
构建在核酸疫苗中的表达盒(cassette)，来保证不发生表达产物的输出(例如，通过去除导致膜整合或分泌的信号序列)。这种方式中，仅有少量的表达产物输出，而保留物将被处理并以肽片段的形式出现在MHC分子上下文中。
方法的组合不同的初级-强化策略在促进改善的免疫反应中被证明是有效的。因此根据本发明，可使用任何核酸疫苗接种、活疫苗接种和多肽疫苗。然而，特别优选通过核酸疫苗或病毒疫苗进行初级免疫、用多肽疫苗进行强化免疫，优选其中多肽疫苗含有初级疫苗核酸的表达产物。
鉴定和制备嵌合结合蛋白的方法如上所述，本发明所述嵌合结合蛋白最重要的特征是产生免疫反应的能力，其仅对感兴趣的靶向B细胞抗原决定簇有作用，虽然它们可能会诱导与脚手架蛋白结构和耐受断裂氨基酸序列反应的抗体。
如果不介入所述的B细胞抗原决定簇有效提呈的尝试，就完全没有必要简单地改造嵌合结合蛋白，因为B细胞抗原决定簇可具有非常不同的结构，适合一种B细胞抗原决定簇的脚手架蛋白结构及其提呈几乎肯定不适合不同的B细胞抗原决定簇，因此本发明在已经鉴定了B细胞抗原决定簇和脚手架蛋白结构的至少一种组合的时候来实施是最佳的。
因此，鉴定本发明的嵌合结合蛋白的方法应在最广泛的范围内包括如下步骤1)提供第一分子，其结合动物中感兴趣的自身抗原，且其包括所述的第一受体；2)在第二分子库中筛选它们选择性结合所述第一分子的所述第一受体的能力；3)分离在步骤2中选择性结合的所述库的成员；及4)通过合成或重组技术的手段制备所述的嵌合结合蛋白，其含有至少a)分离自步骤3的成员的结合位点，b)所述动物中自体同源的脚手架蛋白结构，其稳定所述结合位点的天然3D结构，及c)非人类MHC II类结合氨基酸序列；或i)通过合成或重组技术的手段制备嵌合结合蛋白，其含有1)所述的第二受体或其准确的天然3D构象的模拟表位(mimotope)，2)所述动物中自体同源的脚手架蛋白结构，所述的脚手架蛋白结构稳定所述的3D构象并衍生自所述动物中的所述第二受体以外的另一种分子，及3)所述耐受断裂氨基酸序列。
有许多制备本发明这种嵌合结合蛋白的途径。如在B细胞抗原决定簇部分所述，嵌合结合分子部分能够就是所述的相关自身抗原中的感兴趣的(已经鉴定的)抗原决定簇，其被本发明的疫苗所靶向，——当所述的抗原决定簇是线性肽类抗原决定簇时，通常这是非常容易实现的。在这种情况下，所述的B细胞抗原决定簇能够插入适合的丰富的自体同源蛋白结构中，或其能够随机地介入到假定的脚手架结构中并随后筛选由此获得的库中选择性结合到所述第一受体的那些成员。因此，在此实施方案中，上述库包括已知的假定脚手架蛋白结构(其中可存在耐受断裂氨基酸序列)，其中所述的B细胞抗原决定簇或其模拟表位在此库中不同的随机位置洗牌(shuffle)，只有适合结合到所述第一受体(例如适合的mAB)的那些成员采会被选择。
可选择地，可固定所述B细胞抗原决定簇介入的位点，而所述的B细胞抗原决定簇本身是从插入到这一位置的随机序列的库中鉴定的。优选从相同类别或亚类的抗体库筛选结合所述第一受体的成员来实现这一过程。因此，在此实施方案，上述库由已知的假定脚手架蛋白结构(其中所述耐受断裂氨基酸序列可已经存在)组成，其中所述的B细胞抗原决定簇为在固定位置介入了所述脚手架蛋白结构的随机序列库的成员。从此库中，只有适合结合到所述第一受体的成员(例如适合的mAB)将被选择。
第三种可能性，其不需要上述筛选，但分离天然发生的模拟感兴趣的抗原的决定簇的抗独特型抗体是必要的。例如，如果动物储存有(harbour)抗自体同源抗原的抗体，那么该动物也储存有与这些抗体的独特型反应的抗独特型抗体。可分离、测序这种抗独特型抗体并随后制备对其修饰的类型，其中将耐受断裂氨基酸序列介入。再者，所产生的分子将包括B细胞抗原决定簇(所述抗独特型抗体的独特型)、脚手架蛋白结构(所述抗独特型抗体的非独特型区域)以及耐受断裂氨基酸序列。
该第三种可能性的已知特殊的类型使用如下的策略所述第一分子，包括第一受体，其作为免疫原使用来免疫转基因动物，该动物表达储存有所述抗原与第二受体的宿主的自体同源的抗体——如果需要，所述的第一分子可结合到免疫原性载体分子上，例如白喉类毒素、KLH和破伤风类毒素(在所述第一分子在转基因动物中是自体同源的情况下)。所述的转基因动物可例如是表达人免疫球蛋白的非人动物(例如，国际公开第WO 93/12227号、美国专利第5,877,397号、美国专利第5,874,299号、美国专利第5,814,318号、美国专利第5,789,650号、美国专利第5,770,429号、美国专利第5,661,016号、美国专利第5,633,425号、美国专利第5,625,126号、美国专利第5,569,825号、美国专利第5,545,806号、国际公开第WO 91/10741号和第WO 01/25492号)。
这种状态的第一分子会诱导人类抗体的产生，该抗体与所述第一分子反应。通过使用制备杂交瘤的常规技术(参考Khler和Millstein的常规教导)，制备产生与所述第一分子反应的单克隆抗体的杂交瘤，参见以下描述。由此筛选与所述第一受体特异结合的这些人类单克隆抗体来排除那些与第一分子其它部分非特异结合的mAB。随后分离产生特异结合mAB的杂交瘤，并使用常规的克隆和分子生物学技术，将编码这些抗体的DNA(或其片段)转化到适合的细胞株中(当然，通过例如合成或PCR的手段提供的具有相同序列的DNA也可用于转化)。对于耐受断裂氨基酸序列，当所述DNA被转化入所述的产生细胞株中时，这也包括克隆步骤的部分，但可选择的是提供一种转基因动物，其中所述IgG分子已经包括了其在所述的动物中是耐受性断裂的氨基酸序列并最终与所述mAB一同疫苗接种。
事实上，在所有上述引用的具有创造性方法的实施方案中，在较晚的阶段介入所述耐受断裂氨基酸序列是有可能的，即在已经鉴定了B细胞抗原决定簇和脚手架蛋白结构的组合后。但是，在应用时包括该耐受断裂氨基酸序列使得其出现在筛选的步骤中是有可能的。
在上述鉴定适合的本发明的嵌合结合蛋白的引用方法中，所述的第一分子优选为抗体，并且更优选为单克隆抗体。如上述已经详细描述的，能够制备例如免疫原化的抗独特型抗体，其只对所述的独特型产生相关的免疫反应。因此，最优选所述的第一受体为抗体的独特型。
应理解，所述方法的步骤2和步骤3提供了分离库中与所述第一受体特异作用的成员的方法。在所述受体为较大分子的部分的情况下(例如，当所述受体为结合抗体的部分的抗原时)，那么所述的筛选也会产生一些分离/鉴定的成员，其与所述较大分子的剩余部分反应。为排除这些非相关的作用成员，根据本发明优选在步骤3的筛选中包括排除的步骤，其能够对在所述第一受体外部结合所述第一分子库中的成员进行鉴定，从而在后续的步骤中排除这些成员。这些排除步骤包括，a)检测库成员结合所述第一受体外部区域的能力，从而排除表现这种结合的库成员，或b)检测库成员与所述第二受体竞争结合所述第一受体的能力，从而排除那些不表现此能力的成员。
换句话说，选项(a)依赖对那些结合所述脚手架蛋白结构和/或所述耐受断裂氨基酸序列的库成员的捕获，例如，在色谱步骤中，其中所述缺乏第一受体的第一分子(例如使用与作为第一分子使用的抗体亚类相同的非相关抗体)固定到色谱柱中的介质上，且在其中所述库通过所述的柱只有所述柱不留存的成员将是结合所述第一受体的成员。
选项(b)依赖竞争分析，其中只有能够与所述相关的第二受体竞争结合所述第一受体库中的成员才被选择。这也可通过色谱来分析，其中所述的第一分子(包括第一受体)固定到柱中的色谱介质上，在所述柱中应用过量的包括第二受体的分子，从而阻断所有第一受体，并最终将所述库中的成员通过所述的柱。只有流过的那些成员是结合了所述第一受体的成员。
给出第二分子库的一种适合的方法是使用噬菌体展示技术，参见例如以下的描述，同时也可使用核糖体展示技术、mRNA展示技术以及酵母表面展示技术。
实施例噬菌体展示技术以噬菌体展示技术作为例子对本发明进行示例性说明，——应理解，根据本发明，也可使用任何本领域公认的筛选结合伴侣库的方法。
噬菌体展示技术通过丝状噬菌体在其表面展示肽和蛋白的能力来提供直接表型与基因型的物理连接。
此技术利用了丝状噬菌体(如f1和M13)的感染能力，其通过与所述细菌表面的F-菌毛(pilus)的相互作用来感染细菌。不象大多数的细菌性病毒，当所述噬菌体被包装并聚集在所述细菌膜时，丝状噬菌体不能通过细胞裂解而释放，但可从所述的细胞中分泌。被感染的细菌的生长只有轻微的降低，因此其可以通过培养达到较高的噬菌体滴度(Markowski andRussel 1997)。
如图1所示，所述的丝状蛋白壳由不同的包被蛋白(pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX)来构成。为了在所述的噬菌体表面展示肽或蛋白，将所述的肽/蛋白的编码序列与所述噬菌体的包被蛋白的编码序列连接在一起。George Smith首先将小蛋白编码DNA片段克隆至噬菌体的基因组gIII(所述最小包被蛋白pIII的编码序列)中并证明所产生的噬菌体携带可以被特异抗体识别的多肽(Smith GP，1985)。后来，证明一些蛋白展示在噬菌体上时是有功能的，例如大肠杆菌碱性磷酸酶(McCafferty et al.1991)，人生长激素(Bass et al.1990)，β-内酰胺酶和抗体片段(McCafferty et al.1990及Huse et al.1989)。
有一些抗体库也展现在所述的丝状噬菌体上——例如利用全噬菌体基因组作为载体来克隆抗体库(Clackson et al.1991)。作为一种替代，噬菌粒(phagemid)载体的使用已被广泛采用。噬菌粒是质粒，其容纳了丝状噬菌体的基因区域(integenic region)。这一区域含有DNA复制区和DNA包装信号。噬菌体粒在用辅助噬菌体重复感染的细胞中增殖时，所述噬菌体粒DNA以所述噬菌体基因组本身相同的方式被包装在噬菌体颗粒中。为了展示，所述噬菌体粒携带所述的噬菌体包被蛋白(通常是pIII和pIII的部分)的编码序列，且所述抗体片段融合在其中。在辅助噬菌体重复感染的基础上，融合了所述包被蛋白的抗体片段展现在所述的噬菌体表面(Hoogenboom et al.1991，Φrum et al.1993)。
抗体库的构建可以购买到用于噬菌体展示的商业销售的抗体库(例如Dyax销售的人噬菌体抗体库)。也有产生库的方法的描述(Engberg etal.1996及Krebber et al.1997)。抗体库的构建通常从含有抗体产生细胞的来源中分离mRNA开始(Winter et al.1994)。所述mRNA随后用于RT-PCR合成cDNA的模板。所述抗体清单的PCR扩增是通过为扩增抗体片段轻链和重链而设计的特异引物来进行。然后将所扩增的重链和轻链基因克隆至载体并转化进入在其表面表达F-菌毛(pili)的大肠杆菌菌株。在液体培养基或平板上增殖该转化的细胞，由此该增殖的细胞构成了所述抗体(Engberg et al.1996，Krebber et al.1997)。
根据本发明，最优选的展示库将是人类抗体库，但也使用来自其它种属的抗体库。在这种情况下，被鉴定抗体的高变区被鉴定和代入人类抗体脚手架高变区。
生物淘洗(Biopanning)为制备所述噬菌体展示抗体库，需要用辅助噬菌体对所述的抗体库进行重复感染。重复感染后，所述感染的细菌产生重组噬菌体颗粒，其中每一种噬菌体代表唯一的由该相同噬菌体颗粒中基因编码的抗体。通过几轮的筛选，所述的抗体片段的展示使得能够进行抗原特异噬菌体的选择和纯化(生物淘洗或淘洗)。
如图2所示，一轮筛选由以下组成大肠杆菌抗体库的重复感染，重组噬菌体颗粒的产生，用所述抗原孵育噬菌体(例如选择单克隆抗体)，通过洗涤步骤去除非结合的噬菌体，洗脱结合噬菌体颗粒并用洗脱所噬菌体转导新鲜的大肠杆菌。通常利用低pH缓冲液来洗脱结合的噬菌体，但用高pH缓冲液、可溶性抗原来洗脱或蛋白水解裂解也是可能的。在后者，特异的蛋白酶识别位点插入到所述载体中的包被蛋白和抗体片段之间(Johansen et al.1995)。在几个轮次淘洗，一些单独的克隆被分离并用于对所选择抗原的结合亲和性和特异性的分析。
选择策略所述抗原(其能够是任何上述讨论的已证明用于临床的单克隆抗体，例如Herceptin或Retuximab)可以被固化在不同的固相上，例如ELISA小孔，乳胶株或磁株、免疫管或柱。对于细胞表面抗原，可以在细胞上直接选择噬菌体，或通过这些细胞的特异标记对抗原展示细胞进行分选，例如使用荧光活化细胞分选(FACS)(Hoogenboom，1997)。为避免背景结合物(结合到固化基质上的噬菌体)，可对这些方法进行组合和改变，例如在第一轮淘洗中，将所述抗原固化到ELISA小孔上，而在第二轮淘洗中，将其固化在乳胶株上。这种方法称为改变的淘洗(Andersen et al.1996)。另一种避免非特异结合的途径设计使用与非相关抗原的预孵育步骤，例如当希望得到具有MHC肽复合体特异性的抗体片段时，淘洗之前在所述噬菌体库中加入空的MHC复合体，这将会去除对其它区域而不是MHC肽复合体具有特异性的噬菌体(Krogsgaard et al.，2000)。在依赖淘洗步骤的三轮到四轮淘洗后，通常能够分离结合物。
此外，由于本发明目的是分离只结合感兴趣区域的噬菌体，该区域与欲进行疫苗接种动物中的已知受体结构产生相互作用，同时去除与所述其它区域结合的噬菌体是有利的。例如，如果所述抗原为单克隆抗体，并且其只与分离的结合到所述单克隆的独特型噬菌体相关联，那么可进行第二轮筛选，其中只有那些与所述单克隆抗体的靶配体竞争的噬菌体被选择。
通过首先将结合到色谱柱上的小株的mAB与所述的噬菌体颗粒预孵育，随后通过洗涤的步骤将非结合噬菌体去除来实现这一目的。此后，加入过量的所述mAB的配体，可以洗提由于竞争作用而替代的噬菌体。
可选择地，已经完成与所述抗原结合的步骤的噬菌体可应用于柱上，其中所述的抗原已与已知的配体预孵育了。通过所述柱的噬菌体应该是结合了被已知配体占据的位点。
在鉴定和分离结合所述抗原(＝第一受体)的噬菌体后，可容易地制备嵌合结合蛋白。
依据已经筛选的抗体库的特性，提供所述嵌合结合蛋白步骤包括简单分离和纯化所述的阳性抗体(在所述筛选的库中包括抗体或片段同时也包括耐受断裂氨基酸序列时)、编码所述阳性抗体的DNA的遗传工程化，从而介入所述耐受断裂氨基酸序列和/或所述脚手架蛋白结构的必要部分(在只有抗体片段被筛选以及必需提供所有或某些部分的剩余的脚手架蛋白结构时)，及编码所述阳性抗体的DNA的遗传工程化，从而将所述抗原结合区域移到具有耐受断裂氨基酸序列的适合的脚手架蛋白结构上。
如上所述，虽然目前的实施例集中在抗体的噬菌体展示上，但任何丰富的分子也是适合的，特别是白蛋白。
肽或蛋白展示的其它方法存在一些其它的用于鉴定特异结合伴侣的方法，其可根据本发明的提供嵌合结合分子的原则来使用。
例如，核糖体展示技术(Mattheakis，L.C.et al.(1994)Hanes，J.andPluckthun，A.(1997))，mRNA展示技术(Roberts，R.W.and Szostak，J.W.(1997)Liu，R.et al.(2000))以及酵母表面展示技术(Boder E.T and WittrupKD(1997))都是本发明所述噬菌体展示技术的可行的替代技术。此外，例如美国专利第5,498,538号所公开的分离TSAR’s(总合成亲和性试剂)的技术也可实现本发明的目的，而且酵母双杂交技术同样也可实现本发明的目的，特别是美国专利第6,074,829号所述，其中假阳性相互作用被筛选出。
特别实施例竞争Abs的Xolair的诱导所述的单克隆抗体Xolair是已知的当结合到肥大细胞和嗜碱性细胞上的Fc∈RI受体时，结合IgE而不能交叉连接IgE。为产生本发明的嵌合结合蛋白，可进行以下简单的步骤获得Xolair(例如从商业来源)，产生/获得完全的人类IgG噬菌体展示库(大概含有适合的抗原决定簇，例如来自破伤风类毒素的P2和P30抗原决定簇或上述引用的PADRE抗原决定簇)，利用Xolair在所述的噬菌体展示中探测抗体，该抗体为1)与人IgE竞争结合Xolair(阳性选择)和或2)不识别非特异IgG(阴性选择)，用选择的抗独特型抗Xolair抗体(包括P2&P30或PADRE)免疫人类，检测所产生抗体反应的特异性和安全性。
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序列表<110>法麦克萨有限公司<120>靶向单一抗原决定簇<130>15453PCT00<160>3<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>15<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>1Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu15 10 15<210>2<211>21<212>PRT<213>Clostridium tetani<400>2Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser15 10 15Ala Ser His Leu Glu20<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成淘洗DR结合肽序列(PADRE)<400>3Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala15 10
权利要求
1.在动物中具有免疫原性的嵌合结合蛋白，所述的嵌合结合蛋白特异结合第一受体，所述的第一受体结合在所述的动物中以抗原存在的第二受体，其中所述的嵌合结合蛋白包括结合位点形式的B细胞抗原决定簇，其特异结合所述的第一受体并与所述的第二受体竞争结合所述的第一受体，稳定所述结合位点3D构象的脚手架蛋白结构，所述的脚手架蛋白结构为所述哺乳动物自体同源的，及至少一种耐受断裂氨基酸序列，其在所述动物中是异源的，并在所述动物中结合MHC II类分子。
2.如权利要求1所述的嵌合结合蛋白，其中所述脚手架蛋白结构衍生自丰富的蛋白，优选丰富的血清蛋白。
3.如权利要求1或2所述的嵌合结合蛋白，其中所述脚手架蛋白结构衍生自白蛋白、免疫球蛋白、转铁蛋白和α2-巨球蛋白。
4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述脚手架蛋白结构衍生自IgG。
5.如权利要求1-4中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述脚手架蛋白结构衍生自分子的非独特型区域，所述分子的非独特型区域选自完全抗体，及诸如F(ab’)2片段、Fab片段和scFv片段的抗体片段。
6.如权利要求1-5中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述脚手架蛋白结构包含所述动物自体同源的多肽的基本完整的氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述脚手架蛋白结构包含从所述动物自体同源的脚手架蛋白结构中发现的B细胞抗原决定簇的基本成员。
8.如权利要求1-7中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述脚手架蛋白结构具有与所述动物自体同源的多肽相同的三级结构。
9.如权利要求1-8中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述B细胞抗原决定簇由抗体的独特型构成。
10.如权利要求1-9中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述第一受体为所述动物中的抗体的独特型或配体的特异结合区域，该配体结合所述的第二受体。
11.如权利要求1-10中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述第一受体为单克隆抗体的独特型。
12.如权利要求1-11中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述耐受断裂氨基酸序列通过在所述脚手架蛋白结构的氨基酸序列中进行氨基酸的插入或替代来介入。
13.如权利要求1-12中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述动物为人。
14.如权利要求1-13中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其为被修饰的抗独特型抗体或其有效结合片段，从而包括所述的耐受断裂氨基酸序列。
15.如权利要求1-14中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中包括所述第二受体的所述动物的抗原选自免疫球蛋白E、CD20、CD11a、β淀粉状蛋白、HER-2和TNFα。
16.如权利要求1-15中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其进一步包括至少一个第一部分，其作用是将所述嵌合结合蛋白靶向到抗原提呈细胞(APC)或B淋巴细胞，和/或至少一个第二部分，其刺激所述的免疫系统，和/或至少一个第三部分，其优化所述嵌合结合蛋白向所述免疫系统的提呈。
17.如权利要求16所述的嵌合结合蛋白，其中所述耐受断裂氨基酸序列和/或所述第一部分和/或所述第二部分和/或所述第三部分通过结合到所述脚手架蛋白结构的适合侧基上使其出现在所述的嵌合结合蛋白中。
18.如权利要求17所述的嵌合结合蛋白，其中所述耐受断裂氨基酸序列和/或第一部分和/或第二部分和/或第三部分通过至少一个氨基酸的取代和/或缺失和/或插入和/或添加的手段使其出现在所述的脚手架蛋白结构。
19.如权利要求1-18中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述耐受断裂氨基酸序列在所述动物属于的动物种类中是广泛宿主的。
20.如权利要求1-19中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述耐受断裂氨基酸序列选自天然广泛宿主的T辅助细胞抗原决定簇和人工MHC-II类分子结合肽序列。
21.如权利要求20所述的嵌合结合蛋白，其中所述天然T细胞抗原决定簇选自诸如P2或P30的破伤风类毒素抗原决定簇、白喉类毒素抗原决定簇、流感病毒血凝素抗原决定簇和恶性疟原虫CS抗原决定簇，且其中所述的人工MHC-II类分子结合肽序列为PADRE肽。
22.如权利要求16-21中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述的第一部分为B淋巴细胞特异表面抗原或APC细胞特异表面抗原的基本特异结合伴侣，诸如所述B淋巴细胞或APC细胞上有其受体的半抗原或碳水化合物。
23.如权利要求16-22中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述第二部分选自细胞因子和热休克蛋白。
24.如权利要求23所述的嵌合结合蛋白，其中所述细胞因子选自干扰素γ(IFN-γ)、Flt3L、白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、白介素13(IL-13)、白介素15(IL-15)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或上述任意的有效部分，及所述热休克蛋白选自HSP70、HSP90、HSC70、GRP94和钙网织蛋白(CRT)或上述任意的有效部分。
25.如权利要求16-24中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，其中所述第三部分是脂质特性的，诸如棕榈酰基、肉豆蔻基、法呢基、香叶基-香叶基、GPI锚定物及N-酰基甘油二酯基。
26.编码如权利要求1-25中任一权利要求所述嵌合结合蛋白的核酸片段或其互补的核酸片段。
27.携带如权利要求26所述核酸的载体，诸如具有自主复制能力的载体。
28.如权利要求27所述的载体，其选自质粒、噬菌体、装配型质粒、微小染色体和病毒。
29.如权利要求27或28所述的载体，在5’→3’方向和可操作的连接中，其包括用于驱动如权利要求26所述核酸片段表达的启动子；编码引导肽的任意核酸序列，该肽能够分泌和整合到所述多肽片段的膜中；权利要求26所述的核酸片段；以及任意的终止子。
30.如权利要求27-29任一权利要求所述的载体，当其介入到宿主细胞中时，能够或不能整合到所述宿主细胞的基因组中。
31.如权利要求27-30任一权利要求所述的载体，其中启动子驱动真核细胞和/或原核细胞中的表达。
32.携带有权利要求27-30任一权利要求所述的载体的转化细胞，诸如能够复制如权利要求26所述核酸片段的转化细胞。
33.如权利要求32所述的转化细胞为微生物，其选自细菌、酵母、原生动物、或衍生自多细胞有机体的细胞，所述衍生自多细胞有机体的细胞选自真菌、诸如S2或SF的昆虫细胞、植物细胞及哺乳动物细胞。
34.如权利要求32-33所述的转化细胞，其表达权利要求26所定义的核酸片段，诸如在其表面分泌或携带如权利要求1-25中任一权利要求定义的嵌合结合蛋白的转化细胞。
35.诱导抗宿主自体同源抗原的抗体的产生的组合物，所述组合物包括如权利要求1-25中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白，及药物和免疫学可接受的载体和/或佐剂。
36.诱导抗宿主自体同源抗原的抗体的产生的组合物，所述组合物包括-如权利要求26所述的核酸片段或如权利要求27-31中任一权利要求所述的载体，及药物和免疫学可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
37.适合的细胞株，其携带如权利要求27-31中任一权利要求所述的载体并表达如权利要求26所述的核酸片段，及在其表面任意分泌或携带如权利要求1-25中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白。
38.如权利要求32-34中任一权利要求所述的制备细胞的方法，所述方法包括用权利要求26所述核酸片段或用权利要求27-31中任一权利要求所述的载体转化宿主细胞。
39.制备如权利要求1-25中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤1)提供第一分子，其结合动物中感兴趣的自身抗原并包括所述的第一受体，2)用所述的任意结合到免疫原性载体的第一受体来免疫转基因动物，该转基因动物产生抗体，该抗体在所述储存有所述自身抗原的动物中是自体同源的，或者，除所述抗体也包括至少一种在所述动物中具有断裂耐受性的氨基酸序列的情况外，抗体在所述储存有所述自身抗原的动物中是自体同源的，3)制备和分离产生结合所述第一分子的抗体的杂交瘤，4)根据其产生选择性结合所述第一受体的抗体的能力对步骤3的杂交瘤进行筛选，及5)用至少编码抗体或其功能部分的遗传物质转化适合的宿主细胞，其中所述的遗传物质是或能够从步骤4的所述产生选择结合抗体的杂交瘤中分离，6)在适合至少所述抗体或其功能片段产生的条件下培养步骤5转化的所述宿主细胞，并从所述的宿主细胞培养物中恢复所述的抗体或其功能片段。
40.制备如权利要求1-25中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤1)提供第一分子，其结合动物中感兴趣的自身抗原并包括所述的第一受体，2)根据其选择性结合所述第一分子的第一受体的能力筛选第二分子库，3)分离步骤2中选择性结合的所述库中的成员，及4)通过合成或重组技术制备所述嵌合结合蛋白，所述蛋白含有至少a)步骤3分离的所述成员的结合位点，b)所述动物中自体同源的脚手架蛋白结构，其稳定所述的结合位点天然3D结构，及c)非人类MHC II类分子结合氨基酸序列；或i)通过合成或重组的技术制备嵌合结合蛋白，其含有1)正确、天然的3D构象的所述第二受体或其模拟表位，2)在所述动物中为自体同源的脚手架蛋白结构，所述脚手架蛋白结构稳定所述的3D构象并衍生自所述动物中的不是所述第二受体的另一种分子，及3)所述耐受断裂氨基酸序列。
41.如权利要求39或40所述方法，其中所述第一分子为抗体，优选单克隆抗体。
42.如权利要求41所述方法，其中所述第一受体为所述抗体的独特型。
43.如权利要求39-42中任一权利要求所述的方法，其中所述步骤3中的筛选包括排除步骤，所述步骤使得能够鉴定在所述第一受体外部结合所述第一分子的所述库的成员，从而在后续步骤中排除这些成员。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述的排除步骤包括a)检测所述库成员在所述第一受体外部结合所述第一分子的部分的能力，从而排除表现这种结合的库成员，和/或b)检测所述库成员与所述第二受体竞争结合所述第一受体的能力，从而排除那些不表现这种结合能力的库成员。
45.如权利要求40-44中任一权利要求所述方法，但在权利要求40的范围内，其中步骤3包括所述第二分子的噬菌体展示。
46.如权利要求40-44中任一权利要求所述方法，但在权利要求40的范围内，其中步骤3包括将所述第二分子库进行核糖体展示、mRNA展示、或酵母表面展示。
47.在动物中下调自身抗原或展示所述自身抗原的抗原决定簇的方法，所述方法包括将免疫原性有效剂量的权利要求1-25中任一权利要求所述的嵌合结合蛋白提呈给所述动物的免疫系统，从而诱导抗所述自身抗原的特异免疫反应，该抗原包括其自身结构中的如权利要求1或25所定义的第二受体。
48.如权利要求47所述方法，其中通过给药途径将有效剂量的所述嵌合结合蛋白给予所述动物，所述给药途径选自诸如皮下、皮内和肌肉内的肠道外途径；口服途径；口腔途径；舌下途径；脊髓途径；直肠途径和颅内途径。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述有效剂量为0.5μg-2000μg的嵌合结合蛋白。
50.如权利要求47-49中任一权利要求所述方法，其中所述的嵌合结合蛋白容纳在模拟淋巴结(VLN)装置中。
51.如权利要求47-50中任一权利要求所述方法，其中所述的嵌合结合蛋白与佐剂组方，该佐剂促进对自体抗原断裂的耐受性。
52.如权利要求47所述的方法，其中所述嵌合结合蛋白对免疫系统的提呈，通过将编码嵌合结合蛋白的核酸介入所述动物的细胞中并由此获得介入核酸细胞的在体表达来实现。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述被介入的核酸选自裸DNA、带电或不带电脂质组方的DNA、以脂质体形式组方的DNA、病毒载体中的DNA、转染促进蛋白或多肽组方的DNA、靶向蛋白或多肽组方的DNA、钙沉淀试剂组方的DNA、连接有惰性载体分子的DNA、几丁质或壳聚糖包被的DNA以及佐剂组方的DNA。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述的核酸容纳在VLN装置中。
55.如权利要求47-54中任一权利要求所述方法，其包括每年给药或介入至少一次，例如每年给药/介入至少2次、至少3次、至少4次、至少6次及至少12次。
56.如权利要求47所述的方法，其中对免疫系统的提呈是通过给予携带和表达如权利要求26所述核酸片段的非致病性微生物或病毒来产生的。
全文摘要
本发明涉及新的免疫原试剂，其能够诱导针对自身抗原中的单一抗原决定簇的特异B细胞免疫。所述的免疫原试剂为特异结合第一受体的嵌合结合蛋白，所述的第一受体结合动物中以抗原存在的第二受体，其中所述的嵌合结合蛋白包括(a)结合位点形式的B细胞抗原决定簇，其特异结合所述的第一受体并与所述的第二受体竞争结合所述的第一受体，(b)哺乳动物自体同源的脚手架蛋白结构，及(c)至少一种耐受断裂氨基酸序列，其在所述动物中是异源的，并在所述动物中结合MHC II类分子。在优选的实施方案中，所述嵌合结合蛋白为具有被介入的耐受断裂氨基酸序列的抗独特型抗体。本发明还涉及制备免疫原的方法，以及利用免疫原进行治疗的方法。再者，本发明涉及蛋白、核酸片段、重组修饰宿主细胞和病毒，其用于本发明所述方法的实践之中。
文档编号A61K9/127GK1729202SQ200380106023
公开日2006年2月1日 申请日期2003年12月11日 优先权日2002年12月11日
发明者瑟伦·莫里特森 申请人:法麦克萨有限公司