专利名称：针对异构化/光学反转抗原决定簇的特异性自身免疫反应∶在自身免疫性疾病诊断中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测免疫系统组分如自身抗体和自身反应性T细胞的方法，以及发展自身免疫性疾病首次诊断和监测的诊断性免疫方法技术。
自身免疫性疾病包括一组具有共同特征的复杂疾病，在这些疾病中，机体的自身成分被免疫系统识别，并导致异常免疫应答的启动。为了发生自身免疫反应，正常维持的免疫耐受必须“停止”(Cooke1988)(见下“参考文献”)，而这种免疫耐受在正常个体中是终身持续的。发生的原因通常难以评价，因为自身免疫反应开始发生的时间通常比疾病的临床诊断早几年，并且在不同疾病中，激发事件也可能不同。假设在人体中存在大量潜在的自身抗原，值得注意的是，自身免疫性疾病似乎只局限于几个组织和抗原。假设给靶抗原和自身免疫反应的分布在机体内定位，自身免疫性疾病的分类可以是器官特异性和非器官特异性(系统性)。在每种情况下，免疫反应都可能既涉及免疫系统的体液部分(即抗体合成)，又涉及细胞部分。
本发明还涉及刻画免疫系统组分特征的技术，用来检测、量化这些免疫系统组分和自身抗原，所述免疫系统组分如自身抗体和自身反应性T细胞或B细胞，以及与之发生相互反应的分子如自身抗原。在利用本发明应用技术的实施例中，描述了与系统性自身免疫性疾病类风湿关节炎(RA)或多发硬化(MS)相关的自身免疫现象。但这仅仅是本发明的一个示例，并非旨在将本发明的范围限制在RA或MS上。本发明的基本假说本发明基于如下假说，蛋白质中易感残基的异构化和光学反转在自身免疫性疾病中可能对自身免疫应答的产生至关重要。在一些易感蛋白质中，天门冬氨酸和天门冬酰胺(Asx)和谷氨酸和谷氨酰胺(Glx)残基可能发生自发重排，其中，Asx或Glx残基与邻近残基间的正常肽键可能从侧链正常的α-羧基转变为β-羧基(Glx残基则为γ-羧基)(Clarke 1987)。异构化反应还可通过琥珀酰亚胺介导进行，在自发水解的基础上，该反应可导致4种形式如下概括的天门冬氨酸的反应图示，正常产生的αL型，异构型βL型，或两种光学反转型αD型和βD型 肽骨架氮原子对邻近天门冬氨酸残基侧链羰基的攻击，可以形成琥珀酰亚胺环(A→B)。琥珀酰亚胺环倾向于水解，产生D和L构型的光学反转肽和异构肽。光学反转过程通过负碳离子中间物介导(D，E和F)，可以通过直接的质子摄取(ADG或CFI)进行，也可以通过琥珀酰亚胺旁路(BEH)进行。在整幅图中，肽骨架以黑色粗线代表。该图描绘了发生在天门冬氨酸和甘氨酸序列之间的异构/光学反转反应，但该反应可以在含有任何易感Asx或Glx的抗原决定簇上发生。
但是，为了使环状酰亚胺形成(以及异构化/光学反转)能够发生，包绕Asx或Glx残基的三维结构必须具有光学构型和足够的弹性(Clarke 1987)。
研究显示，肽和蛋白质中Asx残基的光学反转过程主要通过琥珀酰亚胺旁路进行(BEH)(Geiger and Clarke 1987，Radkiewicset al 1996)。但是，其他旁路，如质子直接摄取或酰亚胺-δ-内酯形成可能也对光学反转有作用(Radkiewics et al 1996)。但普遍认为这些旁路较不重要(Geiger and Clarke 1987，Radkiewics et al1996)。
蛋白质或肽中引入这些结构变化，对其功能、稳定性和理化特征具有深远影响。本发明描述了这些结构变化对这些分子免疫原性的影响。
在蛋白质中引入一个异构化和/或光学反转残基可以导致新的βL，αD和βD型的形成，这些构型的蛋白在诱导免疫应答能力方面具有重要意义。特别是在自身免疫性疾病中，患者自身组织或器官的组分突然作为抗原成为免疫系统的作用对象，异构化和/或光学反转在该过程中起重要作用。
以极低速率自发发生的异构化和/或光学反转可以在分子中引入新的抗原决定簇，通常不太可能成为免疫耐受的对象。这种新的抗原决定簇可以被免疫系统的抗原提呈细胞识别，并因此诱导免疫应答。
业已提议，与Asx损伤相关的“蛋白疲劳”对蛋白质性质包括免疫原性的影响，值得进一步研究(Galletti et al 1995)。
已有报导，天门冬氨酸残基的光学反转可能影响短肽的免疫学特征(Benkirane et al 1993)。
还有进一步报导，血清白蛋白体外去酰胺化可以改变其抗原特性，并成为机体免疫原，体内发生的相似过程可能在老化机体自身免疫的发生过程中起一定作用(Lukash et al，1987)。
天门冬酰胺的去酰胺化可能是肽键异构化的结果，但去酰胺化还存在很多其他过程(Mor et al，1992)。不象以上述反应图所示的方式通过琥珀酰亚胺介导的异构化/光学反转，这种去酰胺化不会导致蛋白质骨架的结构变化。例如，去酰胺化可能是酶特异性作用去除酰胺中胺-NH2基的结果，但不改变肽键，或涉及任何光学活性的改变。
已有报导，针对含有D-氨基酸的肽的免疫应答与针对相应的只含L-氨基酸的肽的免疫应答不同(Sela & Zisman 1997，Maillere et al1995，Todome et al 1992，Sela & Fuchs 1965)。Todome et al(1992)显示，含有D-丙氨酸残基的细菌蛋白质片段能够在人类中诱发免疫应答。Maillere et al(1995)显示，取代源于蛇毒的T细胞抗原决定簇中的天然L-氨基酸，抗原改变其与T细胞受体的结合和反应特性。Sela和Fuchs(在1964年布拉格会议之前的发布会上)指出，在抗原决定簇/抗原中包括D-氨基酸，可以增强(或减弱)其抗原性，与应用含D-酪氨酸的合成寡肽进行的实验工作评价一致。Mor et al(1992)以及Sela和Zisman(1997)在综述中进一步探讨了这些结果及一些相似的观察。
这些报导中没有一篇探讨自身抗原或自身抗原的抗原决定簇包括D-氨基酸的可能性，也没有一篇探讨产生D-氨基酸诱导自身免疫应答的可能性。而且，上述研究中没有一项涉及本发明所述通过琥珀酰亚胺旁路自发的光学反转，他们描述的工作都是应用D-氨基酸合成肽进行的，但不包括*Glx和*Asx。类风湿关节炎类风湿关节炎(RA)是一种严重的慢性进行性疾病，无论发达国家还是发展中国家，累及大约1％的人口。尽管环境因素、遗传因素和疾病进展因素业已暗示在RA病因学中有一定作用，但目前建立的观点是，RA是一种自身免疫性疾病(Williams 1996)。
RA的主要临床表现是软骨和滑膜组织的异常和退化，导致关节润滑功能的严重减退，并最终导致RA患者的运动问题。受累关节显示包括多形中性粒细胞、巨噬细胞、T细胞和其他免疫系统细胞的浸润(滑膜炎)。这些细胞参与了免疫过程的活化，这些细胞的活动和它们的分泌产物介导了关节破坏(Munthe & Natvig 1972；Harris 1993)。接着，活动性滑膜炎导致新生毛细血管的生成(血管生成)，以及滑膜内层细胞进入关节，进一步损伤关节的正常功能(Munthe & Natvig1972)。
RA最具特征的血清学变化是针对自体IgG循环抗体的存在(Bernstein 1990)。这些抗IgG自身抗体又被称为类风湿因子(RFs)。RFs可以是IgM，IgG，IgA和IgE，但IgM和IgG RFs似乎更具临床意义，并主要存在于RA患者中(Jonsson & Valdimarsson1993)。在RF应答中涉及多种免疫球蛋白类型的发现强烈提示，RF的形成是抗原驱动和T细胞依赖的，并不仅仅是单克隆增生或免疫系统泛化刺激的结果(Harris 1993；Bernstein 1990)。
RFs并非RA的特异性抗体，它们也存在于相当一部分急性炎症性疾病患者、自身免疫性疾病患者和一些正常个体的血清中(Chen et al1987，Carson et al 1993，Bernstein 1990)。在滑膜组织局部形成自体相关性RF复合物只见于RA和其他系统性自身免疫性疾病，如Sjogrens综合征，系统性红斑狼疮和硬皮病(Natvig & Munthe 1975，Winchester 1975)，提示一些异常因子或免疫应答加速了IgG-RF复合物在这些疾病中的累积。
与绝大多数自身免疫性疾病的情况类似，RA的始动、致病因子尚未鉴定，这些研究难以开展，是因为自身免疫攻击可能在这些疾病临床表现出现前几年就开始了。业已建立的观点是，RA易感性高与特定MHC基因的等位基因相关，即DR-1位点的命名为Dw4和Dw14的基因(Nepom 1990)。
RF在疾病的始动和发病机理中的作用尚不知晓，而且在RA中，RF是疾病的中心事件还只是继发现象这一问题，也始终没有答案。在RA中，RF开始形成可能是IgG Fc区构型改变的结果(Johnson et al1975)。
Parekh et al(1985)观察到，在RA患者中分离的IgG显示了Fc段寡糖半乳糖苷化缺陷，这一发现导致了巨大震撼，但在IgG-糖基化状态临床意义的进一步研究中，却出现了相互矛盾的结果(Parekhet al.1988，Tomana et al.1988)。不仅如此，IgG半乳糖苷化缺陷还可能是自身免疫性疾病发生的普遍危险因子(Harris 1993；Pilkington et al.1995)。
RA患者关节的免疫组化研究发现，在类风湿滑膜中，大量含IgG的浆细胞显示RF活性(Munthe & Natvig 1972)，现在认为，RFs与自体IgG反应形成大的自体集合复合物，这些复合物可能被吞噬，导致随后溶酶体酶的释放。有几项观察支持在RA中免疫激发组织损伤的机制(Williams 1996；Carson 1993)。
RFs涉及几种免疫球蛋白类型，IgG涉及多个抗原决定簇，这些不均一性也干扰了对这些分子在疾病中作用的精确评价(Kalsi &Isenberg 1993)。与RA相关的RFs，与在其他情况下发现的RF不同，它们很显然定向针对IgG Fc区CH2和CH3功能区的抗原决定簇(Bonagura et al 1993)。
IgG包括很多天门冬酰胺和天门冬氨酸(Asx)残基，理论上可以形成环状酰亚胺(异构化/光学反转)。IgG的三维结构众所周知，并包括在一项研究人类蛋白Asx异构化潜在位点的理论研究中(Clarke1987)。在假设标准键长和几何学的情况下，Clarke基于phi，psi，chi和chi2两面角，计算了包括人类IgG在内的多种蛋白质中骨架氮原子与Asx或Glx残基侧链γ羰基碳原子的距离。这些理论考虑提示，人类IgG FcH3区的Asn-384仅需要很小的构型变化，就可形成酰亚胺。因此推测，该位点倾向于异构化(Clarke 1987)。此外，Svasti和Milstein(1972)的研究显示，鼠IgG在Fc段的Asn-Gly序列存在(Svasti and Milstein 1972)异构化。Asn-384邻近区是暴露表面，可能会对环境影响特别敏感，促进酰亚胺的形成。自身免疫反应与多发硬化多发硬化(MS)是中枢神经系统(CNS)白质的炎症性疾病，可以导致区域性脱髓鞘，以及神经功能障碍。MS的发病机理仍然需要阐释，但相信是由于自身免疫机制导致的髓鞘损伤。
与绝大多数自身免疫性疾病的情况类似，RA的始动、致病因子尚未鉴定，这些研究难以开展，是因为自身免疫攻击可能在这些疾病临床表现出现前几年就开始了。有几个事件一定在MS疾病过程到达病理水平之前就发生了。这些事件包括对正常髓鞘蛋白免疫耐受的崩溃，以及正常存在的血脑屏障的缺陷，正常状态下血脑屏障可以防止CNS组分与免疫系统的接触(de Vries et al 1997)。
自身抗原在该病的始动和发病机理方面的作用尚不知晓，而且在MS中，自身抗原形成是疾病的中心事件还只是继发现象这一问题，也始终没有答案。在MS中，自身抗原开始形成可能是髓鞘蛋白构型变化的结果。
几种髓鞘蛋白业已显示成为自身抗体和自身反应性T细胞的作用对象，包括髓鞘碱性蛋白(MBP)和髓鞘少树突细胞糖蛋白(MOG)以及αβ-晶状体球蛋白(Martin 1997，Bettadapura et al.1998，VanNoort et al 1998)。
MBP是MS中自身抗体和自身反应性T细胞的作用对象。MBP的三维结构众所周知(Beniac 1997)，该分子包括很多天门冬酰胺和天门冬氨酸残基，理论上可以形成环状酰亚胺(异构化/光学反转)。异构化/光学反转似乎可以影响该蛋白的抗原性。
MOG是位于髓鞘外表面的跨膜糖蛋白(Linington et al.1984)。由于MOG严格定位于髓鞘外表面，它在MS中为自身免疫攻击提供了理想的原发靶抗原，特别是因为抗MOG抗体存在于CNS，导致体内、体外的广泛脱髓鞘(Adelman et al 1995)。MOG是迄今为止描述的唯一一种髓鞘自身抗原，能够在EAE模型中激发脱髓鞘抗体，并包括致脑炎T细胞抗原决定簇(Linington et al.1993)。此外，业已显示，在MS患者的血液和CSF中存在抗MOG抗体(Sun et al.1991)。而且，Kerlero de Rosbo及其同事显示，在MS患者群中存在显著的针对MOG的T细胞应答(Kerlero de Rosbo et al.1993)。MOG仅包括一个光学反转/异构化潜在位点。该位点包括MOG的54-55残基，位于该分子暴露部分表面。此外，该位点属于MOG35-55序列部分，业已显示，该部分具有很强的致脑炎性，并是B细胞、T细胞应答的强(最强)诱导剂(Ichikawa et al.1996)。
因此我们认为，MBP，αβ-晶状体球蛋白或MOG易感位点的潜在异构化在MS发病机理中发挥一定作用异构化/光学反转通过提供新型免疫原性抗原决定簇而直接涉及MS的始动相，并成为免疫系统体液免疫和细胞免疫的作用对象。其他自身免疫性疾病本发明的基础理论(即自身蛋白的异构化/光学反转形成了新的不被耐受的抗原决定簇，导致自身免疫应答)还可用于其他抗原驱动的自身免疫性疾病，包括胰岛素依赖性糖尿病(IDDM )胰腺朗格罕岛中β细胞由于自身免疫反应而遭到破坏，导致胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)。在临床症状发生前，这种破坏作用已持续相当长一段时间(Gorsuch et al.1981)。在IDDM中，业已鉴定了多种作为自身抗原的自体蛋白质。
在IDDM中，神经内分泌酶谷氨酸脱羧酶(GAD)是一种主要的自身抗原(Bakkeskov et al.1990)。存在两种异型GAD，GAD65和GAD67，它们最大的差异存在于N末端前100个氨基酸中。IDDM血清主要与GAD65发生反应，但自身抗原决定簇主要位于GAD65与GAD67高度同源的区域。
业已显示，属于越膜酪氨酸磷酸酶家族的两个密切相关的蛋白IA2和IA2β(Bonifacio et al.1995，Lu et al.1996)，也很可能是IDDM的自身抗原。IDDM患者经常显示针对这些蛋白的自身抗体(Li etal.1997)。
Glima38是一种38kDa的胰岛细胞膜糖蛋白，也已显示是IDDM的一种自身抗原(Bakkeskov et al.1982，Aanstoot et al.1996)。
此外，在至少半数新近确诊的IDDM患者中，可以检测到胰岛素自身抗体(IAA)(Palmer et al 1983)，但是IAA的预测能力非常有限(Dean 1986)。重症肌无力(MG)重症肌无力(MG)是一种以骨骼肌乙酰胆碱受体(AChR)为靶向的器官特异性自身免疫性疾病(Berrih-Aknin 1995)。因此，绝大多数MG患者存在针对AChR的自身抗体，从而干扰神经肌肉传导。尽管AChR存在于胸腺，但MG患者缺乏对该蛋白的耐受。对该观察现象的一种解释是，MG患者对“改变”(异构化或光学反转)了的AChR产生了免疫应答，这种改变了的AChR包括新的抗原决定簇，从而使机体不能耐受。业已描述了几种AChR上的T细胞抗原决定簇(Zisman etal.1996，Yoshikawa et al.1997，Atassi & Oshima 1997)，其中，AChR129-145包括几个Asx和Glx残基，具有异构化/光学反转的潜在倾向性。最近，又鉴定了该病的另一种可能自身抗原Gravin，一种250kDa激酶脚手架蛋白(Nauert et al.1997)。该蛋白中的相应Asx和Glx残基倾向于发生异构化/光学反转，诱导自身免疫应答。乳糜泻(ClD)乳糜泻(ClD)的特征是针对肌内膜的IgA自身抗体和T细胞介导的对食物中谷蛋白的超敏反应。业已显示，麸朊是谷蛋白的免疫原部分，能够与来自ClD患者的T细胞克隆发生反应。ClD患者的肠道炎症可以通过暴露于饮食中的小麦麸朊而迅速发生，并且与酶组织转谷氨酰胺酶(TGase)粘膜活性的增强有关。业已鉴定，该酶(TGase)是在乳糜泻中是自身抗原(Dieterich et al.1997)。因此，98％的患者有针对(TGase)的IgA滴度增高，而95％的健康对照组呈阴性(Dieterich et al.1998)。Chagas病(CD)感染原生动物寄生虫克氏锥虫通常导致慢性心脏、肠道相关性自身免疫性疾病，称为Chagas病(CD)。这种慢性病的特征是在心肌和神经组织有丰富的炎症浸润。在这些心脏肌球蛋白(Abel et al.1997)，毒蕈碱乙酰胆碱受体(mAChR)(Goin et al.1997)，以及小核核蛋白(UsnRNP)(Bach-Elias et al.1998)中，业已鉴定出作为CD自身抗原的多种自体蛋白。银屑病(Ps)银屑病(Ps)是一种表皮慢性增生性疾病，似乎具有自身免疫特征。该病的典型临床表现是肿胀的炎症性皮肤损伤，上覆鳞状银屑。但是疾病表现差异很大，严重程度各不相同。Ps患者中有5-10％发展为银屑病关节炎，导致关节炎症核损伤。疾病的发病机理仍有争议，但通过众所周知的免疫抑制剂治疗和IL-2毒素(选择性阻滞激活T细胞生长的药物)治疗的成功，该病的自身免疫特征已基本证实(Gottlieb et al.1995)。有几项研究似乎暗示，T细胞在该病的发病机理中起一定作用(Schon et al.1997)。最近鉴定了一种公认的200kDa片状明星Ps自身抗原(Chen et al.1996)。克隆病(CrD)克隆病(CrD)是一种肠道的慢性炎症性疾病。最常位于小肠和大肠，可以导致溃疡，但CrD可以影响消化系统的任何部位。目前CrD的致病原因不清，但疾病似乎具有自身免疫特征，不过，目前尚未鉴定任何自身抗原或T细胞抗原决定簇。发明简述本发明提供了一种检测方法，包括对样本进行定量或定性测定，确定样本中是否存在(a)特异性识别抗原决定簇的自身反应性免疫系统组分，所述抗原决定簇包括异构化肽连接和/或光学反转氨基酸，和/或(b)含有所述抗原决定簇的自身抗原或其片段，和/或(c)含有所述抗原决定簇并能够诱导自身免疫应答的非自身抗原或其片段。
异构化可以发生于天门冬氨酸或天门冬酰胺氨基酸残基或谷氨酸或谷氨酰胺氨基酸残基。
所述免疫系统组分可以是细胞免疫系统组分，如T淋巴细胞。
此外，所述免疫系统组分还可以是体液免疫系统组分，如抗体。抗体可以是任何已知的抗体类型，特别是IgG。
所述抗原决定簇可以包括基本上任何蛋白质的氨基酸序列，但涉及一些自身免疫性疾病，抗原决定簇可以是异构化或光学反转IgG，MOG，MBP或αβ-晶状体球蛋白。涉及其他一些自身免疫性疾病时，抗原决定簇可以在疾病进展过程中形成攻击蛋白的部分。
检测所述自身抗体优选是自身免疫性疾病的指标，例如类风湿关节炎，多发硬化，胰岛素依赖性糖尿病，重症肌无力，乳糜泻，Chagas病，银屑病或克隆病。
所述免疫系统组分可以是针对抗原决定簇的自身抗体，所述抗原决定簇包括在任一序列中含有的氨基酸*AsxTrp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-TyrTrp-Glu-Ser-*Asx-GlyHis-Phe-Phe-Lys-*Asx-Ile-Val-Thr-ProPro-Ser-*Asx-Glu-Gly-Lys-Gly-ArgAla-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-*Asx-Ser-Val-IleTrp-Ser-Phe-Gly-Ser-Glu-*Asx-Gly-Ser-Gly-*Asx-Ser-Glu-AsnMet-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-*Asx-Asn-Gly-LysVal-Val-His-Phe-Phe-Lys-*Asx-Ile-Val-Thr-ProAla-Gly-Trp-Leu-*Asx-Gly-Ser-Val-Arg或Gly-Arg-Val-Arg-Val-*Asx-Ser-Ala-Tyr其中*Asx是在原始序列中通过异构化/光学反转天门冬氨酸或天门冬酰胺残基，形成的αD型天门冬酰胺或天门冬氨酸，或βD或βL型天门冬氨酸。
所述免疫系统组分可以是针对抗原决定簇的自身抗体，所述抗原决定簇包括在任一序列中含有的氨基酸*GlxPro-Ser-*Glx-Gly-Lys-Gly-ArgPhe-Ser-Trp-Gly-Ala-*Glx-Gly-Arg或Asp-Ala-*Glx-Gly-Thr-Leu-Ser-Lys其中*Glx是在原始序列中通过异构化/光学反转谷氨酸或谷氨酰胺残基，形成的αD型谷氨酸或谷氨酰胺，或γL或γD型谷氨酸。
正在讨论的抗原决定簇可以是T细胞抗原决定簇，也可以是B细胞抗原决定簇。
本发明包括检测自身抗原或片段的方法，包括检测所述自身抗原或片段与免疫结合配体的反应性，所述免疫结合配体可以特异性检测所述抗原中异构化肽连接或光学反转氨基酸的存在。
优选地，所述自身抗原与自身免疫性疾病相关。
本发明包括检测可以诱导免疫应答的非自身抗原的方法，所述免疫应答可以与包括异构化或光学反转氨基酸的自身抗原决定簇发生交叉反应。因此，暴露于类似自体蛋白序列的非自身原始序列，可能诱导免疫应答，该免疫应答随后可能以致病方式针对自体蛋白。此外，非自身抗原还可能诱导免疫系统产生诸如炎症反应的应答，导致自体耐受的崩溃，进而产生对其他抗原决定簇的自身免疫反应，所述抗原决定簇并不存在于激惹非自身抗原上(抗原决定簇泛化)。根据本发明的这一方面，提供了一种检测非自体抗原或其片段的方法，该方法制造一个自身免疫条件，包括检测所述抗原或其片段与免疫结合配体之间的反应性，所述免疫结合配体可以特异性检测所述抗原中异构化肽连接或光学反转氨基酸的存在。
这些方法可以提供所述探测的自身反应性免疫系统组分或自身抗原或其片段的数量，也可以是纯粹定性的。
这些推测的针对异构化发生的免疫应答对于疾病是非常重要的，即它们可能是疾病的始动或致病因子。或者，它们在疾病发展过程中处于次要地位，是疾病发生后其他免疫或细胞过程的结果。在两种情况下，都会涉及免疫系统的体液和细胞免疫。因此，本发明的目标是开发能够检测或定量免疫系统特异性组分(如抗体)存在的诊断试剂，所述特异性组分针对特异性抗原的异构化(和/或光学反转)靶抗原决定簇，并因此使疾病的诊断和监测变得更加容易。在疾病背景中，尚有争议的免疫应答无论是次要的还是致病的，改变的免疫应答都是诊断相关的。
作为本发明特定实施方案的进一步解释，我们在下面描述了特定IgG序列异构化在RA发病机理中的作用。但是，这并不意味着可以将本发明的范畴限制在不能用于其他自身免疫性疾病，在那些自身免疫性疾病中，关键抗原的异构化或光学反转也会发生，并导致与下述反应相似的反应。
如上所述，IgG的Asn-384是异构化的潜在位点(Clarke 1987)。但是，该残基不是IgG Fc区唯一可以发生异构化的表面暴露天门冬酰胺残基。在下述实施例1中，给出了直接证据，证明Asn-315也可以异构化，该残基也暴露于表面，位于FcH2区(Bonagura et al 1993)。
Tomiyama et al(1994)发现，依赖Asx残基的位置，这些残基的光学反转影响β淀粉样物质的聚集特性，根据这一发现，不难想象，IgG异构化/光学反转会改变它的溶解性和亲水性，并诱导IgG发生自动聚集。而且，根据我们的发现，异构化/光学反转几乎可以肯定，会影响蛋白质的抗原性。IgG血液清除减少和/或IgG浓度升高的个体，更倾向于发生。使该状况恶化的其他因素，如其他血清蛋白或IgG基因等位基因变异体可以降低其溶解性，或增加其聚集力。环境因素也可通过调节免疫系统功能而影响该状况。
因此，IgG易感位点的潜在异构化/光学反转可能通过两种方式在自身免疫性疾病的发病机理中起作用A)首先，异构化/光学反转可能通过提供新的免疫抗原决定簇而直接涉及RA的始动相，并成为体液免疫系统的作用对象。因此，能够识别异构化或光学反转自身IgG的特异性抗体出现，并通过产生大量不溶性免疫复合物在疾病过程中起始动作用，这些免疫复合物在关节的滑膜组织聚集，并激发炎症反应(Inman & Day 1981)。而且，免疫系统的细胞组分也会针对这一新的抗原决定簇发挥作用，介导RA中特征性滑膜组织损伤。
B)此外，RA中IgG的聚集还会降低IgG的清除，进而使聚集的IgG在迟滞时段内发生功能性异构化/光学反转。尤其是清除率非常低的滑膜液，非常容易成为该过程发生的地点。因此，在这种情况下，异构化/光学反转就成为与RA病程相关的IgG聚集的征象，但是，会如上所述，逐渐导致异型IgG特异性自身抗体的形成。同样，免疫系统的细胞组分会在此阶段介入。
上面概括的两种假说并非完全互相排斥，而且在两种情况下，识别异构化或光学反转Asx或Glx残基的自身抗体是疾病的特异性标志。有观点认为，易感天门冬酰胺或天门冬氨酸残基的异构化涉及以产生类风湿因子为特征的自身免疫反应，支持上述观点的观察包括RFs识别抗原决定簇位于所有潜在异构化位点存在的和CH3(Johnsonand Page Faulk 1976；Nardella et al.1981)。有几条证据提示，异常(非正常)IgG存在于RA中(Rawson et al.1969；Watkins etal.1972；Johnson et al.1974)。最后，IgG1，2和4中CH2区Asn315以及CH3区Asn384周围的空间构型和氨基酸序列非常适于酰亚胺键的形成(Clarke 1987)，而且潜在的抗原决定簇暴露于表面。
Glant et al业已报导，软骨聚集蛋白聚糖包括的抗原决定簇可以在鼠中产生自身免疫应答。聚集蛋白聚糖是软骨的糖蛋白组分，我们已经鉴定了其中的潜在异构化/光学反转位点，包括在聚集蛋白聚糖G-1功能区的氨基酸序列Gly-Arg-Val-Arg-Val-Asn-Ser-Ala-Tyr中。针对该序列定义的异构化和/或光学反转抗原决定簇的自身免疫应答也是本发明的目标。
软骨连接蛋白(CLP)在软骨中与聚集蛋白聚糖和hyaluronan相关，也已显示与针对该蛋白的自身免疫相关，并在动物模型中可以诱导RA(Zhang et al 1998)。我们鉴定了作为潜在异构化和/或光学反转位点的序列，Ala-Gly-Trp-Leu-Ala-Asp-Gly-Ser-Val-Arg，可能涉及自身免疫。
通过类比，针对其他关键自身抗原如MS中的MBP或MOG、或自身免疫性疾病中更普遍的异构化或光学反转抗原的自身免疫应答，可能在正在讨论的疾病的发病机理方面起相似的作用。
在本发明另一方面，其他自身免疫性疾病的特征在于关键抗原发生异构化或光学反转形式的易感性，并因此产生对于疾病来说首要或次要的免疫应答。因此，本发明并不限于只针对RA或MS的诊断试剂，还可以广泛用于其他自身免疫性疾病。
为了实施本发明，如果已知靶抗原，可以通过下述一个或多个步骤，鉴定自身免疫性疾病中靶自身抗原关键抗原决定簇的异构化/光学反转。
如果靶抗原的三维结构已知，就可以鉴定其潜在异构化/光学反转位点(如，Asx-Gly序列)。它们理论上形成异构化/光学反转的倾向性可以基于两面角phi，psi，chi和chi2的计算、以及含有β羧基的氨基酸侧链弹性来评价(Clarke 1987)。而且，还可以评价潜在变化的残基是否暴露于表面，并能为自身抗体接近。一个非常重要的参数是该蛋白质的半衰期，因为只有具有相对较长半衰期(超过10天)的蛋白质才会发生程度显著的异构化和/或光学反转。
应该指出，本发明还可用于检测对含有*Asx或*Glx的抗原决定簇具有特异性的免疫系统组分，即使这种正在讨论的变化蛋白不是正在讨论的疾病的致病因素，并且自身反应性免疫系统组分只是一种症状，而非致病原因。在这些情况下，识别自身反应性组分的存在对于首次诊断和治疗监测具有价值不匪的诊断意义。
本发明还包括在自身抗原上定位一个或多个抗原决定簇的方法，包括应用L异构型天冬氨酰(D-天冬氨酰)甲基转移酶(IAMT)-EC2.2.2.77以及标记甲基，将所述标记甲基引入到所述自身抗原的一个或多个异构化或D型天门冬氨酸中，并测定该自身抗原中引入标记甲基的至少一个位点，然后建立包括该位点区域的自身抗原氨基酸序列，并检测所述氨基酸序列肽在所述部位整合了异构化或光学反转氨基酸后，与自身反应性免疫系统组分如自身抗体的免疫反应性。
因此，感兴趣靶抗原(如I型糖尿病中的谷氨酸脱羧酶，多发硬化中的髓鞘碱性蛋白或MOG，或类风湿关节炎中的IgG)可以通过酶IAMT来分析。该酶识别αD型或βL型Asx(但不识别βD型天门冬氨酸，也不识别改变的Glx)，即该酶识别特定异构化或光学反转的天门冬氨酸和天门冬酰胺残基，并使α羧基甲基化。通过应用放射活性元素标记的甲基供体，与该酶共同孵育的异构化蛋白质或肽也将被放射活性元素标记，蛋白的标记可以通过测定整体放射活性来检验。
异构化位点的位置可以通过下述方法鉴定，该方法包括应用化学或蛋白水解法将感兴趣抗原分解为片段，然后应用已知的层析法纯化产生的抗原片段，再通过IAMT法分析这些片段。将通过IAMT法鉴定含有异构化序列的片段进行氨基酸排序和氨基酸分析，以明确它们在靶抗原中的确切位置。
应用IAMT或其他本文描述的方法鉴定的相关异构化序列包括来自IgG(RA)Asn-315Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr，His-Gln-Asp-Trp-Leu-*Asx-Gly，His-Gln-Asp-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr。Asn-384Trp-Glu-Ser-*Asx-Gly-Gln-Pro-Glu，Val-Glu-Trp-Glu-Ser-*Asx-Gly，Val-Glu-Trp-Glu-Ser-*Asx-Gly-Gln-Pro-Glu。来自MBP(MS)Asn-92His-Phe-Phe-Lys-*Asx-Ile-Val-Thr-ProGln-103Pro-Ser-*Glx-Gly-Lys-Gly-ArgGln-119Phe-Ser-Trp-Gly-Ala-*Glx-Gly-ArgGln-143Asp-Ala-*Glx-Gly-Thr-Leu-Ser-Lys来自MOG(MS)Asn-53Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-*Asx-Gly-Lys来自GAD65(I型糖尿病)Asp-297Ala-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-*Asx-Ser-Val-IleAsp-15 & 19Trp-Ser-Phe-Gly-Ser-Glu-*Asx-Gly-Ser-Gly-*Asx-Ser-Glu-Asn其中，*Asx是通过光学反转/异构化天门冬氨酸或天门冬酰胺形成的αD型天门冬氨酸或天门冬酰胺，或βD型或βL型天门冬氨酸。*Glx是通过光学反转/异构化谷氨酸或谷氨酰胺形成的αD型谷氨酸或谷氨酰胺，或γD型或γL型谷氨酸。
在本发明范畴内还包括含有任一这些氨基酸序列的抗原决定簇的肽。本发明还包括其他肽，所述肽含有应用L异型天冬氨酰(D-天冬氨酰)甲基转移酶(IAMT)定位的包括异构化或光学反转氨基酸的抗原决定簇。
如果感兴趣自身免疫性疾病的自身抗原尚未鉴定，就需要分析自身免疫损伤的靶组织或器官。如上所述，溶解并蛋白水解该组织，然后通过层析法或其他技术纯化产生的肽，随后应用IAMT法鉴定异构化/光学反转片段。这些片段再应用氨基酸排序、氨基酸分析、质谱和其他相关方法进行鉴定。检测针对异构化或光学反转抗原决定簇的自身抗体可以通过下述方法检测来自患者或动物研究对象的自身抗体，所述抗体能够识别关键自身抗原中主要抗原决定簇的异构化/光学反转的肽序列。
通常，可以采用很多已知形式和过程的免疫方法，包括ELISA，RIA，异源和同源法。以举例的方式，可以将合成的异构化或光学反转肽、或含有感兴趣抗原决定簇的真实抗原的蛋白水解片段包被到微量滴定板(MTP)的固态相上，或者与载体蛋白(如甲状腺球蛋白或血清白蛋白)结合或通过与生物素结合进而与链霉亲和素包被的MTP表面结合。然后通过在MTP孔中添加适宜稀释于实验缓冲液中的血清样本鉴定反应性自身抗体，在孔中它们可以与固定的含有抗原决定簇的物质结合。结合抗体的数量可以通过应用二级酶联抗人抗体、然后应用生色酶底物来量化。在该实验系统中必须小心，使由于吸附到MTP表面的IgG或其他血清组分而引起的非特异性反应最小化。
此外，正在讨论的抗原决定簇还可导致其他抗体的产生，这些抗体也可以固定在MTP表面。然后可以将含有正在讨论的异构化抗原决定簇的合成肽、或者含有靶抗原决定簇的真实抗原的蛋白水解片段连接到诸如过氧化物酶或碱性磷酸酶的酶上，或应用诸如生物素或地高辛配体的配体标记。然后将该试剂加入适宜的稀释剂中，与血清样本一起加入滴定板孔中。血清样本中能够与靶抗原决定簇反应的自身抗体可以阻断抗原决定簇与包被在MTP表面的抗体的结合，进而导致信号的减弱，该信号是在随后加入生色酶底物或链霉亲和素结合检测试剂后产生的。该信号可以量化，并用来评价研究样本中自身抗原的数量。
可以应用MTP平板进行另一种竞争性实验形式，所述平板包被了含有正在讨论的抗原决定簇的合成或真实肽或肽片段，如上所述，该实验应用正在讨论的抗原决定簇导致的非人抗体。该肽可以直接包被到MTP表面上，或者与载体蛋白(如甲状腺球蛋白或血清白蛋白)结合或通过与生物素结合进而与链霉亲和素包被的表面结合。在MTP中孵育适宜稀释于实验缓冲液中的人血清样本，随后或同时加入正在讨论的抗原决定簇产生的抗体。血清样本中含有的能够与正在讨论的抗原决定簇发生反应的自身抗体可以与MTP表面上的抗原决定簇反应，从而取代其他抗体的结合。通过应用与非人抗体特异性反应的酶标二抗，在与生色酶底物孵育后，可以量化结合人抗体的数量，所述非人抗体是正在讨论的抗原决定簇产生的。染色的量与结合人自身抗体的量成反比。
同源实验形式还可以通过如下步骤进行，包括将适宜稀释的人血清样本与含有正在讨论的抗原决定簇的生物素结合肽、以及与适宜酶或放射活性分子如125I共价标记的链霉亲和素孵育。人血清样本中存在的自身抗体可以与链霉亲和素分子上的靶抗原决定簇结合，然后应用蛋白A琼脂糖或其他沉淀试剂或人IgG特异性固相使之沉淀。在酶标链霉亲和素的情况下，结合抗体的量可以应用生色酶底物来定量，在放射同位素标记链霉亲和素的情况下，结合抗体的量可以应用闪烁计数来定量。检测对异构化/光学反转自身抗原的细胞免疫反应性为了帮助疾病确诊，协助治疗选择，监测并计算患者预后，对新确诊的自身免疫性疾病患者进行体外自身免疫应答研究是非常必要的。确定涉及自身免疫应答的免疫系统分子组分间的相互作用对于勾勒疾病特征、评价抗原和细胞免疫在疾病发展过程中的重要性也是非常必要的。上面的段落阐述了对βL型、αD型或βD型Asx残基(以及γL型或γD型Glx残基)靶抗原决定簇产生体液反应的分析。但是，为了监测疾病，针对变化的自身蛋白产生的细胞免疫应答可能同等/更重要。绝大多数自身免疫性疾病涉及免疫系统的细胞成分，包括在RA和MS中，T细胞作为组织损失的主要介质被提及。为了确定免疫应答是主要的还是次要的，必须测定免疫系统细胞成分的作用对象。
T细胞介导的自身免疫可以通过几种方法进行检测，如T细胞增殖法，ELISPOT法，有限稀释法，或51Cr释放法(对这些方法的总体认识，请见C.A.Janeway & P.Travers(1997))。下面给出了一些方法的简短概述，可以用来研究针对异构化和/或光学反转抗原的细胞免疫应答T细胞增殖法T细胞对抗原的特异反应性可以通过淋巴细胞增殖法测定，所述T细胞分离自自身免疫性疾病患者的外周血或受累靶器官(即RA患者的滑膜液/组织，或MS患者的CNS)，或者分离自自身免疫性疾病动物模型。将淋巴细胞置于适宜的细胞培养基中培养，所述培养基中含有βL型、αD型或βD型的特异性抗原/抗原片段，或者含有不相关对照抗原或根本不含抗原。将3H-胸腺嘧啶脱氧核苷加入培养基中，在抗原刺激下活跃分裂的淋巴细胞能够把标记的胸腺嘧啶脱氧核苷整合到DNA中。通过定量整合到DNA中的3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的量，可以评价淋巴细胞对不同形式的自身抗原或自身抗原衍生性抗原决定簇的增殖反应(Weir 1996)。抗原特异性增殖是CD4+T细胞特异性反应的特点。有限稀释法为了获得针对给定βL型、αD型或βD型(或γL型或γD型)自身抗原或其抗原决定簇的细胞免疫反应“滴度”的信息，可以进行有限稀释法。该方法包括将不同数量的淋巴样细胞(即取自外周血的细胞)以及刺激性抗原、抗原提呈细胞或特异性生长因子加入单独的培养孔中。几天后，检测每孔针对抗原的特异性反应，如靶细胞的细胞毒杀伤作用或特异性增殖。含有特异性T细胞的孔会对其作用对象产生反应，从Poisson分布曲线可以得到，对于给定稀释度的T细胞，如果37％的孔呈阴性，那么在培养开始时，每孔平均包括一个特异性T细胞。通过比较对照个体以及对异构化和/或外消旋性抗原显示自身免疫反应性的个体(即RA或MS患者)，可以在两个群体间评估T细胞滴度的差异，并将此差异作为衡量自身反应性细胞的抗原特异性扩张的标准，业已显示，这种自身反应性细胞针对抗原的特异性扩张可能在罹患自身免疫性疾病的个体中发生。ELISPOT法ELISPOT法可以作为一种敏感方法，用来从(即)外周血样本中定量单独的淋巴细胞，所述淋巴细胞可以产生特异性抗体(B细胞)或细胞因子，其特征是刺激抗原特异性T细胞。ELISPOT法通过培养淋巴细胞进行，所述淋巴细胞分离自自身免疫性疾病患者的外周血或受累靶器官(即RA患者的滑膜液/组织，或MS患者的CNS)，或者分离自自身免疫性疾病动物模型。ELISPOT法通过在硝酸纤维素薄膜或其他固体表面上的适宜培养基中培养淋巴细胞进行，所述其他固体表面能够保留淋巴细胞分泌的蛋白质和肽(Ronnelid & Klareskog，1997)。如果在培养基中添加给定抗原，将会刺激特异性针对该抗原或其抗原决定簇的淋巴细胞分泌特征性淋巴因子(即γ-干扰素，白细胞介素2或白细胞介素4)(Weir 1996，Okamoto et al 1998)。培养一段时间后，将细胞从薄膜上洗脱，然后应用特异性试剂(即抗体)检测细胞产生的淋巴因子。通过量化产生某一给定淋巴因子的细胞数量，以及产生的淋巴因子的类型，可以评价针对刺激抗原发生的反应，并了解反应特征。
本发明还应用下面的实施例来描述、举例，在实施例中，还要参考附图，附图内容见下
图1(A)显示了实施例1获得的结果，结果来自于胃蛋白酶降解人IgG的首次(片段)大小排除层析，以图的形式显示了洗脱物质的OD280nm吸收值，以及收集部分的IAMT反应性。(B)显示了通过(片段)大小排除层析分离的胃蛋白酶降解IgG不同部分的特异性异构化程度；图2显示了实施例1获得的结果，将通过(片段)大小排除层析分离获得的低分子量IgG片段在阴离子交换柱上进一步分离。收集的部分池在进一步纯化后，以a，b，c和d表示；图3显示了图2所示的阴离子交换纯化IgG肽“b池”肽进行RP-HPLC分离的结果。描绘了以下方面UV 214nm，荧光(380/297nm)，乙腈梯度和IAMT反应性；图4显示了图3纯化后b池进行第二轮RP-HPLC纯化的结果。图示了洗脱物质的UV 214nm探测信号和IAMT反应性；图5显示了实施例2获得的结果，以图的形式显示了3名患者组血清样本应用ELISA法检测获得的信号；图6显示了实施例3获得的结果，以条形图的形式显示了在竞争性肽存在的情况下，检测的6个血清样本的ELISA信号；图7显示了实施例4获得的结果，以图的形式显示了RA患者和健康对照样本在同源RIA法中获得的信号(以CPM为单位)；图8显示了实施例4获得的结果，以条形图的形式显示了在竞争性肽存在的情况下，获得的以抑制百分比表示的RIA信号；以及图9以散点图的形式显示了实施例6获得的结果，包括A，B和C。
实施例1鉴定异构化易感的IgG Fc区Asn-315根据以下方法，应用胃蛋白酶消化人IgG(Sigma cat no.I-4506)根据生产厂商(Pierce)描述的步骤，应用固定的胃蛋白酶(Pierce Cat.No.20343)进行消化。简而言之，将0.125ml的固定胃蛋白酶凝胶加入实验试管，在0.5ml消化缓冲液(20mM醋酸钠缓冲液，pH4.5)中平衡。将10mg纯品冻干IgG加入1.0ml消化缓冲液中，混合物在37℃孵育4小时。通过向孵育混合物中加入pH7.5的1.5ml 10mM Tris HCl终止消化。然后通过离心(1000g，5分钟)，从固定胃蛋白酶凝胶中分离IgG片段，移去含有片段的上清。
通过在Superdex 75 HR10/30柱(Pharmacia，Sweden)上进行凝胶过滤，将IgG片段与未消化的IgG分离。应用pH8.0的0.2MNH4HCO3，以28ml/h的速度平衡柱(2.6×72cm(总体积360mL))。装载2.75ml样本，收集0.25ml部分。柱应用下述Mw标记混合物进行校准，从而可以测定洗脱部分的大小白蛋白(67kDa)，卵白蛋白(43kDa)，糜蛋白酶原A(25kDa)，核糖核酸酶A(13.7kDa)和Aprotinin(6.5kDa)。从IgG Fc部分衍生的低分子量(分子量小于10kDa)IgG片段出现在洗脱体积22-28ml(44-56部分，图1)。
将这些部分的等分试样再次溶解于磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中，然后通过酶法应用L异构型天冬氨酰(D-天冬氨酰)甲基转移酶(IAMT)分析异构化或光学反转Asx残基的存在。简而言之，该方法就是通过IAMT酶，应用放射活性元素(氚)标记的蛋氨酸探测异构化残基。该方法以下述方式进行
在600ul Eppendorf管中加入下述试剂含有IAMT活性的15ul牛红细胞裂解液(根据Murray and Clarke 1984制备)，10ul实验缓冲液(0.25M NaH2PO4/NaOH pH7.02)，15ul样本(或已知浓度的合成异构化肽溶液校准品)，以及10ul SAM示踪剂(如下制备将3ml冷SAM加入26.1ml新鲜制备的10mM HCl中。再将100ul“热SAM”(Amersham TRA236，1000umol/L)加入20ml上述溶液中，然后以1ml等分储存于-18℃)。将混合物旋转混和后，在37℃(水浴)孵育小管60±1分钟。加入50ul Quenching溶液(0.2M NaOH，1％十二烷基硫酸钠)终止反应，然后再混和。将75ul该溶液加到滤纸上(0.75×5.5cm，预先折成“手风琴摺样”)。将滤纸置于含有2.5ml EcoscintH闪烁液的6ml闪烁管中(在管中大约半浸1.5cm)。闪烁管在室温下放置大约18小时(过夜)，这样，放射性甲醇可以扩散到闪烁液中。移去滤纸条，在下述终止条件下应用β计数器给小管计数900sec.，或最大6400CPM。可以应用标准曲线计算未知样本浓度，所述标准曲线通过测定已知浓度的合成异构肽校准品制备。
这些测定显示，胃蛋白酶降解IgG的低分子量部分具有高度IAMT活性，显然含有完整IgG分子的大部分异构化位点(44-56部分，图1)。这些部分通过反相高效液相层析(RP-HPLC)进一步纯化。
收集经(片段)大小排除层析柱处理的含有IAMT反应肽(44-56部分)的部分，将体积调整至9.5ml，然后加入20ul TFA。Sep-PakC18柱(3cc，500mg，Waters)应用10ml 80％甲醇条件化，再应用10ml 0.2％ TFA平衡。将样本装柱，应用20ml 1％ TFA洗柱。最后，应用10ml 40％乙腈，0.1％ TFA洗脱结合肽。收集洗脱液，冷冻并冻干。将洗脱液再次溶解于pH7.88的2ml 20mM Tris缓冲液中。将100ul该溶液储存，用于测定IAMT活性，其余的(1900ul)用于离子交换层析。
应用1ml mono-Q HR 5/5柱(Pharmacia 52-1622-00)进行阴离子交换层析。该柱用pH7.88的20mM Tris以1ml/min的流速平衡。样本通过手工注射器环装载，然后应用线性梯度的NaCl(0.0-0.3MNaCl，共进行30分钟)洗柱。然后应用0.3-1M的线性梯度NaCl洗脱1分钟。应用1M的NaCl持续洗脱1分钟，最后应用1-0M的线性梯度NaCl洗脱1分钟。应用该缓冲液持续洗脱2分钟。应用280nm处的UV吸收值检测洗脱肽，收集0.5ml部分(30秒)。应用IAMT法分析这些部分的等分试样，结果在图2给出。集中收集4-6部分是a，集中收集25-27部分是b，集中收集29-31部分是c，储存以备进一步分析。
如上所述，应用Sep-Pak C18柱缓冲交换集中收集的部分，然后再溶解于200ul 0.1％ w/w三氟醋酸(TFA)中，并通过RP-HPLC进一步纯化。第一轮RP-HPLC在C-18柱(Nova-Pak C-184um 3.9×150mm HPLC柱，Waters)上进行，应用0-40％的线形梯度乙腈以1ml/min的流速洗脱4 0分钟，所述乙腈溶解于0.1％(w/w)三氟醋酸(TFA)中。通过在214nm处的UV吸收值、以及荧光(在380nm(发射)，应用297nm光激发)检测洗脱肽，收集0.5ml部分(30秒)，并冻干，以备IAMT法分析。
对于从阴离子交换柱获得的“a”池，绝大多数IAMT反应性物质是在22-23.5分钟洗脱的(图3)。集中收集这些部分，如上所述，应用Sep-Pak C-18柱浓缩这些部分中的肽。样本再次溶解于200ul0.05％七氟丁酸(HFBA)中。该样本在相同的柱上进行第二轮RP-HPLC，进一步纯化，但这一次应用溶解于0.05％七氟丁酸(HFBA)中的5-30％的线形梯度乙腈，洗脱80分钟，然后收集0.5ml部分。该部分通过在214nm处的UV吸收值、以及荧光(在380nm(发射)，应用297nm光激发)监测，并将冻干的该部分再次溶解，进行IAMT法分析。
从图4可以很明显地看出，从阴离子交换柱获得的“b”池(图2)经第二轮HPLC纯化，获得的一个主峰包括绝大部分异构化Asx残基(图4)。根据生产厂商的说明书，应用Applied Biosystems model 477A序列分析仪对含有该峰的部分进行氨基酸序列分析。推导出下列序列“b池”His-Gln-Asp-Trp-Leu“c池”Thr-Val(Leu/Val)His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asp-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys(Ala/Gly)Leu-ProCH2；Thr-Val(Leu/Val)His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys-Val-Ser-Asn-Lys(Ala/Gly)Leu-Pro(Ala/Ser)(Pro/Ser)Ile-Glu-Lys-Thr-Ile-Ser-Lys(Ala/Thr)Lys
因此，分离的异构化肽来自CH2区，但通过胃蛋白酶降解，产生不同的长度。CH2区的公开序列如上，很显然，所有三个肽都与该序列匹配。以黑体给出的天门冬酰胺残基就是Asn-315。残基308在IgG2中是缬氨酸，在其他IgG亚类中是亮氨酸。以斜体给出的“c池”肽序列是从氨基酸分析推出的(见后)。根据该残基与随后甘氨酸之间的肽键，重排后从α羧基变为β羧基，给出的残基315是天门冬氨酸，而非天门冬酰胺。
所有的分离肽应用异构天冬氨酸特异性IAMT酶识别，它们的序列都不超过Asn-315残基N末端的亮氨酸残基。这一点强烈提示，Asn-315残基发生了异构化反应，因此，侧链肽键重排，从正常的α羧基变为β羧基，并伴随氨基的水解消失。肽序列分析不能超过315残基与以前的结果一致，说明异构化反应导致通过正常Edman降解法进行的肽序列分析，不能超过易感位点(Fledelius et al 1997)。实施例2检测与Asn-315具有反应性的自身抗体发明人员研究了自身抗体是否能够识别Asn-315衍生的区隔肽，以及这种自身抗体是否具有类风湿关节炎的特性。为了进行此项研究，人工合成了IgG Fc Asn-315衍生的(βL)区隔肽，Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr。所用的肽是线性(αL型)肽制剂Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr，通过下述步骤经加热促进异构化产生。将该肽溶解于缓冲液中，90℃加热4小时，促进异构化和/或光学反转产生。获得的异构化(βL)、光学反转(αD和βD)和线性(αL)肽混合物经RP-HPLC分析，在RP-HPLC中，应用溶解于0.1％ TFA的15-35％的梯度乙腈以1ml/min流速洗脱10分钟，然后如上所述，应用氨基酸分析研究获得峰的异构化状态。该肽以5mg/ml溶解于pH9.2的0.2M磷酸钠中。通过下述方法，应用戊二醛(GA)(Fluka 49626lot 43381/1)使该肽与胸腺球蛋白(Sigma lot 66H7085)结合。
溶解于pH8.0的0.1M磷酸钠缓冲液中的胸腺球蛋白(30mg/ml)0.5ml，在持续混匀的情况下，逐滴(持续2分钟)加入0.5ml下述溶液中10％ GA，40％ H2O，50％ pH8.0的0.2M磷酸钠。容器在室温持续混匀的情况下孵育过夜。通过凝胶过滤(NAP-10柱，Pharmacia)去除多余的GA，缓冲液换成PBS。终体积调整至1.5ml(每种制剂载体蛋白10mg/ml)。500ul载体蛋白与500ul 5mg/ml的肽溶液孵育。容器在室温持续混匀的情况下孵育24小时。多余的肽通过凝胶过滤(NAP-10柱，Pharmacia)转移到PBS缓冲液中。终体积调整至1500ul，应用BioRad蛋白法，根据生产厂商的使用说明，测定蛋白浓度。
将Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体溶解于PBS，终浓度为10ug/ml，并将100ul该溶液移加到微量滴定板(MTP，平底，有机聚合物担体，Nunc)的孔中。如述(Bonde et al 1994)封闭平板，加入在下述溶液中稀释100倍的血清样本10mM磷酸钠、140mM NaCl、0.1％ tween-20、1％ BSA pH7.4(实验缓冲液)。在20℃旋转混和器上放置MTP 1小时±5分钟。通过手工平板清洗器，应用清洗缓冲液(25mM tris，140mM NaCl，0.1％ tween-20，pH7.4)洗板5次。每孔加入100ul实验缓冲液，所述缓冲液中含有1000倍稀释的过氧化物酶结合的兔抗人λ链(Dako 063)和κ链(Dako 013)。在20℃旋转混和器上再次孵育MTP 1小时±5分钟。清洗5次后，加入100ul过氧化物酶底物(3，3’，5，5’四甲对二氨基联苯二盐酸(TMB)，Kirkegaard & Perry Laboratories，USA)，室温下(18-22℃)避光孵育15±2分钟。加入0.18M硫酸后，在450nm处测定吸收值。
在比较类风湿因子阳性的RA血清、类风湿因子阴性的RA血清和对照血清时发现，RA RF+患者较其他两组反应性显著升高(图5)。在应用其他不相关Thy-GA结合体(Thy-GA-Glu-Lys-Ala-His-*Asx-Gly-Gly-Arg)进行的平行实验中，虽然遵循相同的实验步骤，但结果发现，两组间没有差异。该实验说明，在RF阳性的RA患者中，针对IgG Fc Asn-315衍生序列Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr的自身抗体反应性，存在升高现象。实施例3识别异构化Asn-315的特异性自身抗体与合成肽的竞争性结合如上所述，RA自身抗体与Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr包被平板之间的结合，可以通过如下方法而被竞争性抑制，即应用溶液中含有Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr肽的血清预孵育平板。该实验如下进行。血清样本在10mM磷酸钠、140mM NaCl、0.1％tween-20、1％ BSA pH7.4(实验缓冲液)中稀释100倍。将200ul加入1.5ml聚丙稀试管中，然后再加入50ul溶解于实验缓冲液中的浓度为50ug/ml的下述试剂1.Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr(βL型抗原决定簇)2.Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr(αL型抗原决定簇)3.Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体(如实施例2所述制备)。4.单独的实验缓冲液。
试管置于4℃ 17小时，然后将100ul混合物加入包被有Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体的MTP。在如上实施例2所述条件下，进行实验。
结果如图6所示。很显然，异构化肽(1)以及Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体(3)能够与6份RA分析血清竞争性结合。该研究强烈提示，RA患者中能够识别残基315周围7个氨基酸抗原决定簇的自身抗体，是主要的异构型(βL)抗原决定簇的特异性抗体。实施例4同源放免法评价与异构化IgG Fc Asn-315衍生肽具有反应性的自身抗体的检测为了测定与IgG CH2区衍生的异构型抗原决定簇Trp-Leu-Asn-Gly-Lys-Glu-Tyr具有反应性的自身抗体，发展了同源RIA法。该方法包括以下步骤将血清样本与125I Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr孵育过夜，然后应用蛋白A琼脂糖凝胶沉淀免疫复合物。
血清样本在IMP缓冲液中以1∶200稀释(IMP缓冲液10mM磷酸钠，pH7.4，140mM NaCl，5mM EDTA，0.5％ Triton X-100，0.1％ BSA，10ug/ml大豆胰蛋白酶抑制剂)。如实施例2所述制备Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体，根据氯胺T方法应用125I碘化所述结合体在0.25M磷酸钠溶液中稀释100ug结合体，至总体积140ul。加入1.5mCi的Na125I，随后再加入10ul氯胺T(1mg/ml，新鲜制备)。旋转混和该溶液30秒，加入150ul蛋氨酸(1mg/ml)，立即旋转混和120秒。在(片段)大小排除柱(类型BIOSEP SEC S-2000，大小300×7.80mm)上纯化示踪剂，所述柱应用含有1％ BSA的PBS以流速1.0ml/min平衡。收集500ul部分，在闪烁计数器(γ计数器)上分析。收集含有示踪剂的部分，用于同源RIA法分析。
在IMP缓冲液中稀释125I Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr示踪剂，在密封的聚丙烯试管中，将75ul 200倍稀释的血清样本与25ul肽/链霉亲和素溶液混和。试管在4℃孵育过夜(16-18小时)。称量蛋白A琼脂糖(PAS)(20ul/样本试管)，并用10ml IMP清洗缓冲液清洗3次，然后应用转发移液枪将其转移到1.5mlEppendorf管中。1000 RPM离心2分钟，沉淀PAS，用吸液长颈瓶或移液枪吸取上清。抗体/抗原溶液孵育3小时后，转移到PAS沉淀上，在摇动台上室温再孵育30分钟。1000 RPM离心2分钟，沉淀PAS。应用750ul IMP清洗缓冲液清洗PAS沉淀5次。每次清洗后，都应用1000 RPM离心2分钟，沉淀PAS，用吸液长颈瓶或移液枪吸取上清。最后，在milli-Q水中再悬PAS沉淀至100ul悬液，转移到4ml聚丙烯试管中，应用γ计数器计数。如上异源ELISA法所述，应用无意肽进行对照实验。
根据该方法进行实验，血清可以获得高特异性信号。在分组基础上，RF+RA患者较对照个体的血清样本反应性更高(图7)。
通过加入25ul含有100，1000或10,000ng/ml下述肽的溶液，可以进行竞争性实验。所述肽包括Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr，Trp-Leu-Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr，Glu-Lys-Ala-His-Asp-β-Gly-Gly-Arg和Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg肽，以及“无意”对照肽His-Thr-Ala-Arg-Gln-Met-Ala-Trp-Ala-Lys，以及Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr和Thy-GA-Glu-Lys-Ala-His-*Asx-Gly-Gly-Arg结合体。在编辑所有实验观察到的反应性、并在分组基础上计算反应性时发现，在最高浓度下，针对Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr肽(以及Thy-GA-Trp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-Tyr结合体)具有显著的反应性(采用Student’s T检验，P＝0.01)，但是与其他肽却没有反应性(图8)。这一结果与前面实施例所述ELISA法的观察一致。实施例5对含有人IgG Asn-315的免疫反应性抗原决定簇进行绘图分析，所述抗原决定簇还能与RA患者经免疫亲和纯化的自身抗体发生反应IgM自身抗体分析为在自身抗体分析前从血清中去除内源性IgG揭示了可能性。实际上，业已建立的结论性观点认为，正常个体和RA患者都存在显著数量的循环异构化/光学反转IgG，可以想象，任何公认的抗异构型IgG自身抗体都可能由于这些分子的存在而被几乎完全封闭，因此，阻碍了与实验固相的结合。下面的实施例描述了一种纯化人自身抗体的方法，所述自身抗体能够与来自人IgG的异构化靶抗原决定簇发生反应，并通过与合成肽孵育，检测针对该抗原决定簇的反应性，所述合成肽是在无活性纤维素支持物上合成的。通过免疫亲和层析在IgG柱上纯化来自人血清样本的RF应用的实验方法如下1.应用生产厂商提供的使用说明(Pharmacia，Upsala，Sweden)，使IgG与CNBr激活的琼脂糖结合。2.将IgG琼脂糖装到适宜的柱中(即可以任意使用的DG10柱，BioRadlaboratories，Richmond，CA)。该柱应用至少10倍柱体积的PBS和10倍柱体积pH3.5的0.1M醋酸钠、0.15M氯化钠洗柱，最后在PBS中平衡。3.RA患者血清在PBS中稀释10倍，然后上柱。应用PBS洗柱，直至洗脱液的吸收值(OD 280nm)达到基线水平。4.应用pH3.5的0.1M醋酸钠、0.15M氯化钠洗脱结合的RF。5.在Sephadex G-200柱上，应用pH3.5的0.1M醋酸钠、0.15M氯化钠，通过凝胶过滤将IgM与IgG、IgA分离，6.洗脱的IgM在PBS-BT中稀释到1ug/ml，如下所述进行分析。合成纤维素结合肽应用前述过程(Frank，1992，Kramer et al 1994)，通过Whatman540 paper(Maidstone，UK)，采用斑点合成技术，合成了跨越Asn-315的七氨基酸肽。该肽通过斑点合成法自动制备(Abimed，Langenfeld，FRG)。下述肽被合成，并通过羧基末端共价粘附
I. Thr-Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp...
II.Val-Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu...
III.Leu-His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asp-β...
IV.His-Gln-Asp-Trp-Leu-Asp-β-Gly...
V.Gln-Asp-Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys...
VI.Asp-Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu...
VII.Trp-Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr...
VIII.Leu-Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys...
IX.Asp-β-Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys...
X.Gly-Lys-Glu-Tyr-Lys-Cys-Lys...
Asp-β表示异构化的Asp残基，其中肽连接是通过β-羧基，而非正常的α-羧基(βL型)。
...表示粘附于纤维素支持物。
含有这些肽的纤维素膜与上述通过免疫亲和纯化的RA自身抗体共同孵育。如(Kramer et al 1994)所述，应用传统免疫印迹技术进行结合抗体的孵育和目测。
该实验显示，对肽IV和VII的反应性很强。这一点强烈提示，从RA患者血清纯化的自身抗体可以识别异构化(βL型)的包绕Asn-315残基的七氨基酸抗原决定簇。实施例6检测与Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly具有反应性的自身抗体研究罹患多发硬化的患者自身抗体是否能够识别髓鞘基底蛋白(MBP)衍生性八肽Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly。
为达成这一目的，通过标准FMOC化学法人工合成了MBP衍生性八肽Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly(γL型)。根据生产厂商的使用说明，通过Bis-[sulfosuccinimidyl]suberate(BS3)，将该肽连接于牛血清白蛋白(BSA)上，然后如实施例4所述，通过氯胺T方法应用125I碘化该肽。
9名MS患者和8名健康人血清与125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly反应过夜，然后通过蛋白A琼脂糖凝胶沉淀免疫复合物。将血清样本在IMP缓冲液中以1∶200稀释。125I BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly示踪剂也在IMP缓冲液中稀释(至活性为100000 CPM/25ul)。75ul稀释血清样本与25ul示踪剂、及25ul IMP缓冲液或游离(未结合/未标记)Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly肽(溶解于IMP缓冲液中，浓度为10ug/ml)混和。该混合物在4℃孵育过夜。称量20ul/样本试管的蛋白A琼脂糖凝胶(PAS)，应用10ml IMP清洗缓冲液清洗3次，然后应用转发移液枪将其转移到1.5ml Eppendorf管中。通过2000 RPM离心2分钟沉淀PAS，应用吸移装置(或移液枪)吸取上清。抗体/抗原溶液孵育过夜后，转移到PAS沉淀上，在摇动台上室温孵育3小时。2000 RPM离心2分钟，沉淀PAS。应用750ul IMP清洗缓冲液清洗PAS沉淀5次。每次清洗后，都吸取上清。最后，在milli-Q水中再悬PAS沉淀至100ul悬液，转移到4ml聚丙烯试管中，应用γ计数器计数。根据该方法进行实验，可以应用血清获得特异性信号。在分组基础上，MS血清显示了较对照研究组血清样本更高的反应性(P＝0.0078，两尾非参数t检验)，图9A。而且，通过添加“游离”的Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly肽，可以特异性抑制125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly结合体与人免疫球蛋白的结合。因此，与对照血清相比，MS血清的免疫球蛋白结合抑制％显著为高(P＝0.008，两尾非参数t检验)，图9C。因此，MS患者具有的抗体可以针对含有异构化(γL)谷氨酸的MBP衍生性抗原决定簇。
结果如图9所示，其中3个小图如下图A，多发硬化患者(MS)和健康对照组(CO)血清中，人免疫球蛋白与125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly的结合(没有添加游离肽作为拮抗剂)。
图B，多发硬化患者(MS)和健康对照组(CO)血清中，人免疫球蛋白与125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly的结合(添加游离的Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly肽作为拮抗剂)。
图C，多发硬化患者(MS)和健康对照组(CO)血清中，人免疫球蛋白与125I-BSA-BS3-Pro-Ser-Glu-γ-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly结合的抑制百分比。
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1.一种实验方法，包括对样本进行定量或定性检测，确定样本中是否存在(a)特异性识别抗原决定簇的自身反应性免疫系统组分，所述抗原决定簇包括异构化肽连接和/或光学反转氨基酸，和/或(b)含有所述抗原决定簇的自身抗原或其片段，和/或(c)含有所述抗原决定簇并能够诱导自身免疫应答的非自身抗原或其片段。
2.权利要求1的方法，其中所述免疫系统组分是细胞免疫系统组分。
3.权利要求2的方法，其中所述免疫系统组分是T淋巴细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述免疫系统组分是体液免疫系统组分。
5.权利要求4的方法，其中所述抗原决定簇包括源自IgG的氨基酸序列，所述IgG含有异构化肽连接或光学反转氨基酸。
6.权利要求4的方法，其中所述免疫系统组分是针对抗原决定簇的自身抗体，所述抗原决定簇包括下面任一序列含有的氨基酸*AsxTrp-Leu-*Asx-Gly-Lys-Glu-TyrTrp-Glu-Ser-*Asx-GlyHis-Phe-Phe-Lys-*Asx-Ile-Val-Thr-ProPro-Ser-*Asx-Glu-Gly-Lys-Gly-ArgAla-Leu-Gly-Ile-Gly-Thr-*Asx-Ser-Val-IleTrp-Ser-Phe-Gly-Ser-Glu-*Asx-Gly-Ser-Gly-*Asx-Ser-Glu-AsnAla-Gly-Trp-Leu-*Asx-Gly-Ser-Val-Arg或Gly-Arg-Val-Arg-Val-*Asx-Ser-Ala-Tyr其中*Asx是在原始序列中通过异构化/光学反转天门冬氨酸或天门冬酰胺残基，形成的αD型天门冬氨酸或天门冬酰胺，或βD或βL型天门冬氨酸。
7.权利要求4的方法，其中所述免疫系统组分是针对抗原决定簇的自身抗体，所述抗原决定簇包括下面任一序列含有的氨基酸*AsxMet-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Pro-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-*Asx-Gly-Lys-或Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-*Asx-Ile-Val-Thr-Pro其中*Asx是在原始序列中通过异构化/光学反转天门冬氨酸或天门冬酰胺残基，形成的αD型天门冬氨酸或天门冬酰胺，或βD或βL型天门冬氨酸。
8.权利要求4的方法，其中所述免疫系统组分是针对抗原决定簇的自身抗体，所述抗原决定簇包括下面任一序列含有的氨基酸*AlxPro-Ser-*Glx-Gly-Lys-Gly-ArgPhe-Ser-Trp-Gly-Ala-*Glx-Gly-Arg或Asp-Ala-*Glx-Gly-Thr-Leu-Ser-Lys其中*Glx是在原始序列中通过异构化/光学反转谷氨酸或谷氨酰胺残基，形成的αD型谷氨酸或谷氨酰胺，或γL或γD型谷氨酸。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中检测到所述免疫系统组分或自身抗原是自身免疫性疾病的指示。
10.权利要求9的方法，其中所述疾病是类风湿关节炎，多发硬化，胰岛素依赖性糖尿病，重症肌无力，乳糜泻，Chagas病，银屑病或克隆病。
11.检测自身抗原或其片段的方法，包括检测所述自身抗原或片段与免疫结合配体的反应性，所述免疫结合配体可以特异性检测在所述自身抗原中异构化肽连接或光学反转氨基酸的存在。
12.权利要求11的方法，其中所述免疫结合配体可以特异性针对权利要求6-8任一项定义的抗原决定簇。
13.任意前述权利要求的方法，可以提供关于所述免疫系统组分或自身抗原或非自体抗原或备测抗原片段的数量的信息。
14.在自身抗原上定位一个或多个抗原决定簇的方法，包括应用L异构型天冬氨酰(D-天冬氨酰)甲基转移酶(IAMT)以及标记甲基，将所述标记甲基引入到所述自身抗原的一个或多个异构化肽连接和/或光学反转氨基酸中，并测定该自身抗原中引入标记甲基的至少一个位点，然后建立包括该位点区域的自身抗原氨基酸序列，并检测所述氨基酸序列肽在所述部位整合了异构化或光学反转氨基酸后，与自身反应性免疫系统组分的免疫反应性。
15.权利要求14的方法，其中自身抗体与自身免疫性疾病相关。
16.权利要求14的方法，其中自身免疫性疾病是类风湿关节炎，多发硬化，胰岛素依赖性糖尿病，重症肌无力，乳糜泻，Chagas病，银屑病或克隆病。
17.一种肽，包括能够为自身反应性免疫系统组分识别的抗原决定簇，其中抗原决定簇含有异构化肽连接和/或光学反转氨基酸。
18.权利要求17的肽，含有权利要求6-8任一项定义的抗原决定簇。
19.权利要求18的肽，包括变化了的氨基酸残基*Asx或*Glx，以及在N末端和/或C末端方向至少3个侧翼氨基酸残基，其中*Glx是在原始序列中通过异构化/光学反转谷氨酸或谷氨酰胺残基，形成的αD型谷氨酸或谷氨酰胺，或γL或γD型谷氨酸，*Asx是在原始序列中通过异构化/光学反转天门冬酰胺或天门冬氨酸残基，形成的αD型天门冬氨酸或天门冬酰胺，或βL或βD型天门冬氨酸。
全文摘要
我们发现,对异构化蛋白质具有免疫反应性的抗体和T淋巴细胞与自身免疫性疾病相关,所述蛋白质在天门冬氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺或谷氨酸残基上存在异构化,所述自身免疫性疾病涉及对IgG(类风湿关节炎)和髓磷脂基底蛋白(多发硬化)的自身反应性。本发明描述了对异构化蛋白序列具有自身免疫反应性的诊断方法。
文档编号G01N33/564GK1379858SQ00814441
公开日2002年11月13日 申请日期2000年8月16日 优先权日1999年8月17日
发明者P·A·C·克洛斯, S·克里斯特高 申请人:奥斯提奥米特生物技术公司