对鱼进行抗病毒感染的免疫的制作方法

专利名称：对鱼进行抗病毒感染的免疫的制作方法
技术领域：
本发明涉及对鱼的病毒感染进行控制。
背景技术：
据估计，在美国，饲养鱼所花费的每一美元中有20美分到30美分用在鱼的疾病上。虽然鱼的病原体包括真菌、原生动物和细菌病原体，但最受养殖业主关心的是病毒病，原因在于病毒病很大程度上难以控制。实际上，目前还没有能有效对抗鱼体内病毒的有效抗生素或其它抗病毒剂。
在许多国家的食用鱼和观赏鱼交易饲养场，鲤鱼(Cyprinus carpio)种鱼类的死亡率很高，导致严重的财政损失。虽然这种致死性疾病高度感染，而且极度恶性，但是致病和死亡仅限于锦鲤(Koi)和鲤鱼(Commoncarp)种群。几个关系相近的种，包括其它鲤科鱼如金鱼，即使长期和染病鱼共同饲养在同一个鱼箱，也未发现患这种病的病症。
在鱼塘或养殖箱中，锦鲤、鲤鱼和其它鲤科鱼的密集饲养经常导致病毒病在这些种群中频繁传播。冠状样病毒(Corona-like virus，Miyazaki，2000)、棒状病毒(Kim，1999)、虹彩病毒(Shchelkunov，1990)和疱疹病毒(Sano，1985；Hedrick，1990，2000；Calle，1999)被认为是在鲤科鱼中引起严重疾病的原因。在北美，在锦鲤的乳头瘤状皮肤生长中检测到疱疹病毒(Hedrick，1990；Calle，1999)。这种鲤鱼疱疹病毒(CHV)与日本的锦鲤种群中已知的鲤疱疹病毒(Sano，1985，1991)是一致的。在北美、欧洲和韩国也发现了在以色列的鲤科鱼中发现的一种致死疾病(Hedrick，2000；Walster，1999；Oh，2001)。
锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)被认为是造成鲤鱼种鱼类大量死亡的病因。但实际上人们只是部分表征了KHV病毒(Hedrick，2000；Gray，2002；Body，2000)。不考虑病毒的同一性，疾病具有独特的发病模式。染病鱼行动迟缓，然后死亡。在死亡之前的一段时间内，鱼鳃上出现白色的斑块。这是由于鱼鳃组织坏死和大量粘液产生而形成的，有可能还伴随着出血(Dawes，2002)。
目前，除了对染病鱼进行销毁和对养殖场的设备进行消毒，还没有控制所述疾病的办法。虽然死亡率可能高达100％，但是有些鱼可以存活，而且确实也活下来，有时候存活率超过20％。这些存活下来的鱼对随后接触的病毒产生了抗性，即使试图对它们进行再感染，它们也保持健康。
在上述和其它相关发现的基础上，以色列当地的养殖者创立了旨在使鱼产生自然免疫的七步法，所免疫的鱼被认为是安全、干净和适于销售的(Dawes，2002)。
所述七步法包括使鱼在三月份产卵和孵化，在未经分类的情况下让其一直生长到7月份，这时，将这些鱼分成不同的质量类别。然后通过将染病鱼放入养殖箱而使经过分类的鱼与染病鱼接触病毒4天并且随后给予2个为期3个月的恢复期。随着十月初温度下降，使这些鱼经历了最佳感染时期并且随后在1月份左右进行免疫检测。

发明内容
本发明提供感染鲤鱼种的分离的致病因子。根据本发明，已发现所述的致病因子是目前未被分类的DNA病毒。
已经发现，通过电子显微镜测定本发明的分离的鲤鱼病毒DNA(本文称为“CV DNA病毒”)是大的双链DN A病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm。由脉冲场凝胶电泳和对限制性酶切产物的分析测定，鲤鱼病毒DNA含有约250,000～300,000个碱基对。这个病毒与文献中所述的KHV病毒明显不同。
本发明的鲤鱼病毒可能具有一个或多个以下特征(通过下述的特定分离株发现)(a)高感染力；(b)可以通过水进行传播；(c)在开放通气的池子中以及实验室条件下观测到其在18℃～25℃的温度范围内诱导疾病；(d)宿主范围窄，因为即使亲缘关系非常近的鲤科鱼对这一病毒也具有抗性，而这种病毒是不能在鲤鱼乳头状上皮瘤(epitheliomapapillosum cyprini，EPC)培养物中繁殖的。
本发明的一个方面是提供一种分离的CV DNA病毒，该病毒在鱼中尤其是在鲤鱼种的鱼中引起病毒病。
在一个实施方案中，通过电子显微镜测定，本发明的分离的病毒为具有包膜、大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，该衣壳大小为约90nm～110nm；病毒DNA具有约250,000～300,000个碱基对。
根据另一个实施方案，通过电子显微镜测定，本发明的分离到的病毒为具有包膜的、大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，该衣壳大小为约90nm～110nm；病毒DNA具有约260,000～285,000个碱基对。
根据另一个实施方案，通过电子显微镜测定，本发明的分离的病毒为具有包膜的、大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，该衣壳大小为约90nm～110nm；病毒DNA具有约277,000个碱基对。
本发明所述的CV DNA病毒可以以纯化形式制备，即不含有其它病毒或微生物材料。
另一方面，本发明还提供一种分离所述CV DNA病毒的方法，该方法包括确认出现与CV相关的症状的鱼；获取染病鱼的组织；将染病组织和鱼细胞共培养直到所述鱼细胞中产生细胞病变效应；从共培养物中收集培养基并分离病毒颗粒。所述细胞优选经过培养的鳍细胞。当所述的鱼为鲤鱼时，所述的细胞为鲤鱼细胞，优选鲤鱼鳍细胞(CFC)。当所述的鱼为锦鲤时，所述细胞为锦鲤鳍细胞。
烈性病毒通常可分离自染病鱼的组织，优选分离自肾组织、肝组织或血液。在为鲤鱼的情况下，与CFC共培养的时间通常为5～6天，此时可以观察到细胞病变效应。
本发明还涉及烈性CV DNA病毒，该病毒被保藏在位于法国巴黎巴斯德研究所(Institut Pasteur)的国立微生物保藏中心(Collection Nationalede Cultures De Microorganisms，CNCM)，保藏号为CNCM I-3145，保藏日期为2003年12月12日。
本发明的分离的CV DNA病毒的一个用途是制备无毒形式的病毒，根据本发明，所述无毒形式的病毒可用于对鱼进行接种以对抗由CVDNA病毒引起的感染。CV DNA病毒的无毒病毒形式可以是例如病毒的减毒形式、病毒的失活形式、病毒的遗传修饰形式或裸露的DNA病毒等。
因此，本发明提供一种鲤鱼DNA病毒的无毒形式，所述鲤鱼DNA病毒为引起鱼的致死性病毒病的病毒，通过电子显微镜测定，该DNA病毒为大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm；病毒DNA具有约250,000～300,000个碱基对。
本发明还提供一种鲤鱼DNA病毒的无毒形式，该鲤鱼DNA病毒为引起鱼的致死性病毒病的病毒，通过电子显微镜测定，该DNA病毒为大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm；病毒DNA具有约260,000～285,000个碱基对。
另外，本发明还提供一种鲤鱼DNA病毒的无毒形式，该鲤鱼DNA病毒为引起鱼的致死性病毒病的病毒，通过电子显微镜测定，该DNA病毒为大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm；病毒DNA具有约277,000个碱基对。
在本发明的一个具体实施方案中，将分离的CV DNA病毒用于制备病毒的活的减毒形式，该活的减毒的形式可用于给鱼接种以对抗CVDNA病毒的感染。
本发明还提供一种分离活的减毒病毒的方法。根据该方法，将如上所述分离的烈性形式的病毒接种到CFC，鉴定由毒性降低的病毒产生的噬菌斑，从该噬菌斑中分离病毒。如果需要，可以对所获得的病毒进行纯化。优选地，将分离的病毒再次接种到鱼细胞培养物上，这些鱼细胞培养物可以从鲤鱼或各种其它鱼种获取，例如但不限于，白鲢(Hypophthalmichthys molitrix)、金鱼(Carassius aurata)或青鱼(Ctenopharyngodon idella)。然后可将上述步骤重复进行多次，直到获得充分减毒的活病毒。
本发明还涉及CV DNA病毒的活的减毒形式，该活的减毒形式的CVDNA病毒被保藏在位于法国巴黎巴斯德研究所的国立微生物保藏中心(CNCM)，保藏号为CNCM I-3146，保藏日期为2003年12月12日。
在另外一个优选实施方案中，将分离的CV DNA病毒用于制备所述病毒的失活形式，该病毒的失活形式可用于给鱼接种以对抗由CV DNA病毒引起的感染。
本发明还提供一种使此前讨论的CV DNA病毒失活的方法。该方法包括分离烈性病毒，然后通过将其进行化学处理或物理处理而获得失活的CV病毒。所述的化学或物理处理可以是本领域已知的任何处理。化学处理，例如可以是(但本发明不局限于所列举的例子)根据本领域技术人员已知的文献中的方法，将所述病毒与有机溶剂接触，所述有机溶剂如福尔马林、丙酮、甲醇或乙醇等。物理处理可包括，如紫外照射、高温处理或低温处理。
与甚至在最低浓度下也能形成噬菌斑的活的减毒病毒相比，通过本发明所述方法或本领域公知的其它方法获得的所述失活病毒即使在高滴度浓度下也不能形成噬菌斑，或只能在非常高的浓度下形成噬菌斑。
在本发明的另外一个实施方案中，将分离的CV DNA病毒用于制备所述病毒的遗传修饰形式，该遗传修饰形式可用于给鱼接种以对抗CVDNA病毒的感染。
另一方面，本发明提供CV DNA病毒的活的减毒形式，所述CV DNA病毒如前所述在鲤鱼种中引起疾病。如上所述，所述病毒的活的减毒形式可以用于接种。
本发明还提供CV DNA病毒的失活形式，所述CV DNA病毒如前所述在鲤鱼种中引起疾病。如上所述，所述病毒的失活形式也可以用于接种。
另一方面，本发明还提供一种用于对鱼进行免疫以使鱼对抗由所述CV DNA病毒引起的感染的疫苗制剂，所述疫苗制剂含有作为活性成分的所述病毒的无毒形式。这样的无毒病毒形式例如可以是，但不局限于，活的减毒病毒、失活病毒，或者两者组合。本发明还借此提供了无毒病毒在制备所述疫苗制剂中的用途，所述无毒病毒如活的减毒病毒、失活病毒，或者两者组合。
失活病毒可以用作单组分疫苗，也可以与前面所披露的活的减毒病毒或与至少一种本领域技术人员所熟悉的疫苗结合，用作多组分疫苗。失活病毒与所述至少一种其它疫苗可以同时施用，也可以在不同时间施用。例如，所述失活病毒可以在施用活的减毒病毒前几天施用。
在另外一个优选实施方案中，含有无毒病毒形式的疫苗制剂可以为干燥形式，例如，粉剂形式、冻干形式、压缩丸剂形式或片剂形式等。在另外一个实施方案中，所述病毒可以为组织培养液形式，所述培养液可以贮存在室温，优选地，贮存在-70℃，进一步优选，贮存在含有甘油的培养液中。在一个具体实施例中，组织培养液含有20％的甘油。
在另一方面，本发明提供一种用于对鱼进行被动免疫以对抗由所述CV病毒所引起的感染的疫苗制剂，所述疫苗制剂含有用于对鱼进行免疫的血清，该血清来源于用所述CV病毒的活的减毒形式免疫过的动物如鱼、马、猪、牛、小鼠、兔等。在一个优选情况下，所述动物为鱼。
在这方面，本发明还提供一种对鱼进行处理以对抗所述CV DNA病毒所引起的感染的方法。所述方法包括用本发明的无毒CV病毒免疫动物，采集经免疫动物的血清并用所述血清处理鱼，从而使鱼获得免疫。
本发明所披露的各种病毒形式可以通过多种方法转化为干燥形式。一个特别优选的干燥形式是冻干。在干燥之前，比如在冻干之前，可以向培养基中添加各种成分，如防腐剂、抗氧化剂或还原剂、各种赋形剂等，这些赋形剂也可以在干燥步骤后被添加到干燥样品中，例如添加到冻干的活的减毒病毒中。
免疫通常这样进行，即将无毒形式的病毒例如活的减毒病毒、失活病毒或者其组合加入至包含待免疫的鱼的水中。也可以给鱼直接注射疫苗制剂。为了加强免疫应答，所述制剂也可以包含各种佐剂、细胞因子或者其它免疫刺激物，尤其是所述制剂试图用于注射的情况下更应包含上述物质。疫苗制剂，尤其是用于投放到包含鱼的水中的疫苗制剂，还可以包含各种稳定剂、抗生素等。
在本发明的另一方面，本发明还提供一种抗体，该抗体与本发明的CV病毒或其组分选择性结合。在一个实施方案中，所述抗体与鱼DNA病毒或其组分特异性地结合。
在本发明的另一方面，本发明还提供了一种对上述CV病毒有关的疾病进行诊断的方法，所述方法包括从怀疑患病的鱼中分离组织，测定与CV DNA病毒相关的病毒标记的存在，若病毒标记存在则说明所检测的鱼感染了所述病毒。
本发明还提供一种试剂盒，该试剂盒包含用于对感染鲤鱼病毒的鱼进行治疗的CV DNA病毒的无毒形式和使用说明书，所述CV DNA病毒的无毒形式例如本发明的活的减毒病毒。
本发明还提供一种诊断试剂盒，该试剂盒包含用于对与CV病毒相关的疾病进行诊断的至少一种抗体或至少一种偶联抗体和使用说明书。所述试剂盒还可以进一步包含至少一种对照抗原或者包含至少一种含有所述对照抗原的对照组织样品。
本发明的诊断试剂盒可以用于诊断活鱼或死鱼是否存在本发明所述的病毒。
缩略词CFC鲤鱼鳍细胞；CHV鲤鱼疱疹病毒；CNGV鲤鱼肾炎和鳃坏死病毒；CPE细胞病变效应；CV鲤鱼病毒；EPC鲤鱼乳头状上皮瘤；HSV单纯疱疹病毒；KHV锦鲤疱疹病毒；KFC锦鲤鳍细胞；PBS磷酸缓冲盐溶液；PFU噬菌斑形成单位；PTA钨酸磷，SDS十二烷基磺酸钠；TCI从感染的鲤鱼鳍细胞中提取的总DNA；TCU从未感染的鲤鱼鳍细胞中提取的总DNA。


采用下述非限定性的优选实施方案并参考下述附图可以对本发明进行理解，并能了解本发明实际上是如何进行操作的，在所述附图中图1显示锦鲤在共饲养激发后的死亡动力学。将成鱼分为3个组，分别有114、114和115条鱼。组1(□)和组2(■)与感染的样本相接触，组3用作未感染的对照(▲)。每天检测存活鱼的数量。
图2显示从感染的鲤鱼鳍细胞(CFC)收获的CV的电子显微镜照片。纯化的病毒用2％的钨酸磷(PTA)进行负染。颗粒大小在96nm～105nm范围内，平均值为103nm。
图3描述用琼脂糖凝胶电泳对CV DNA的分析。在图3A中，利用苯酚提取方法从纯化的病毒中提取病毒基因组DNA。每个泳道表示不同的程序与蛋白酶K和SDS温育(泳道2)；只与SDS温育(泳道3)；用链霉蛋白酶和SDS处理(泳道4)；没有进行预处理(泳道5)。将经过Cla I酶切(泳道6)或未经过酶切(泳道7)的线性腺病毒质粒(pAdEasy-1)DNA作为标记物。在0.8％琼脂糖凝胶上进行分析，其中将λ噬菌体标记物DNA在泳道1和泳道8点样。在图3B中，显示利用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对CV DNA进行分析。用与图3A所述相同的DNA制备物在泳道2～7点样，经过蛋白酶K纯化的另外一个CV DNA样品在泳道8点样。使用的分子量标准为Hind III酶切的λ噬菌体DNA(泳道9)和连接的λ噬菌体DNA的梯度(连续的较大的λDNA多联体50～1000kb)(泳道1)。图3C描述用限制性酶消化CV DNA后所获得的结果。将病毒DNA在反应缓冲液(100mM NaCl、50mM Tris-HCl、10mM MgCl2和1mM二硫苏糖醇，添加有100μg/ml牛血清白蛋白(BSA))中用限制性酶Swa I于25℃温育3小时。在6V/cm和14℃的条件下，利用脉冲场凝胶电泳通过钳位均匀电场凝胶，将反应产物在1％琼脂糖凝胶上分离14小时。转换时间范围为5秒～35秒。泳道1未经过酶切的病毒DNA；泳道2用限制性酶Swa I消化的病毒DNA。
图4显示了对CV病毒蛋白质的分析。利用蔗糖梯度从组织培养基中纯化腺病毒、HSV-1和鲤鱼病毒。将病毒颗粒在laemeli缓冲液中煮沸，并在两块平行的10％丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离。一块凝胶用考马斯亮兰染色，如在板A中所示。另一块凝胶则被转移到PVDF膜并用兔抗鲤鱼病毒染色，如板B所示。血清与CV蛋白质(右泳道)反应，但不与疱疹病毒或腺病毒蛋白质反应。
图5描述了对从CFC DNA和鱼器官中通过PCR(聚合酶链式反应)扩增的CV基因组片段进行鉴定。从感染的(TCI)、未感染的(TCU)的CFC中提取的总DNA，病毒DNA(CV)以及来自病鱼和首次用于实验的鱼的肝脏的DNA(分别为LI和LU)、来自病鱼和首次用于实验的鱼的肾脏的DNA(分别为KI和KU)。M＝DNA分子量标记物。用于DNA扩增的引物源自克隆D。在PCR中使用AP1-AP2和AP1-AP3引物(分别用于板A和板B中)。
图6A～图6F描述CV基因组和其它病毒序列中的序列同源性。病毒DNA克隆经过测序，并用PubMed(NIH)BLAST程序进行分析。在本图中所使用的缩略词如下单纯疱疹病毒1、2、5和8(分别为HSV-1、HSV-2、HSV-5和HSV-8)；伪狂犬病病毒(PRV)；禽疱疹病毒(GHV)；猕猴细长病毒(Macaca mulata rhadinovirus，MMRV)；树鼩疱疹病毒(THV)；鼠巨细胞病毒(CMVm)；人巨细胞病毒(CMVh)；狨疱疹病毒(MarHV)。所有上述提到的病毒都属于疱疹病毒科(Herpesviridae)。甜菜夜蛾核多角体病毒(SENHV)、八字地老虎颗粒体病毒(XcNGV)、舞毒蛾核多角体病毒(Lymatria dispar nucleopolyhedrovirus，LDNV)；Orgyia pseudosugata nucleopolyhedrovirus(OPNV)和库蚊杆状病毒(Culexnigripapus baculovirus，CNBV)属于杆状病毒科(Baculoviridae)的成员，长囊水云病毒(ESV)是藻类病毒。Yaba样疾病病毒(Yaba-like diseasevirus，YIDV)是痘病毒。1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)、人内源病毒(HEV)和猪内源逆转录病毒(PERV)是逆转录病毒科(Retroviridea)的成员。猪腺病毒(PAdV)和人腺病毒(HAdV)是腺病毒家族的成员。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是黄病毒(flavivirus)。传染性胰脏坏死病毒(IPNV)是双RNA病毒。风疹病毒(风疹)是披膜病毒。人乳头瘤病毒27型(HPV-27)。
图7A～图7B显示用烈性病毒感染鱼后的结果。图7A显示用烈性病毒对一组50条首次用于实验的鱼进行感染的累积死亡率。图7B显示将首次感染后的存活鱼与染病鱼共饲养进行激发后鱼的死亡率。
图8A～图8B显示用活的减毒病毒感染鱼所获得的结果。图8A描述用6×103PFU/ml浓度的活的减毒病毒进行注射(I.P)后鱼的死亡率。图8B显示初次接触减毒病毒后存活下来的鱼接触染病鱼进行激发后的死亡率。
图9描述对疫苗接种后的鱼进行激发感染的死亡率。用4个克隆病毒I.P注射对鱼进行接种(在每组中鱼的数目n＝100，平均重量为50g)，所述病毒来源于转移P26的CV病毒。用PBS注射的鱼作为阴性对照(N.C)。感染后25天，将5条鱼通过与染病鱼共饲养来再次进行激发。
图10描述在减毒病毒免疫后的鱼中抗CV抗体形成的动力学。
具体实施例方式
下面，通过参考一些非限制性具体实施方案来阐述本发明。
在上下文使用的术语“鲤鱼DNA病毒”(CV DNA或CV病毒)或“鲤鱼肾炎和鳃坏死病毒”(CNGV)可互换使用并且是用于表示本发明的新病毒的同义词，本发明的病毒具有上下文所描述的特征。应当理解，这些术语，即CV或CNGV，并非将本发明限定于所述病毒的任何具体的分离物。具有这里描述的新特征的任何病毒均包含在本发明中。
在本申请的上下文中的术语“病毒”非限定性地表示下述具体分离物的密切相关的株系，即指与所述分离的株系具有类似基因型和/或表型特征的任何株系。这包括所述病毒的保留有相同功能活性的轻微修饰形式或变异体，即氨基酸或核苷酸的增加、删除或替换。
在本申请的上下文中的术语“无毒病毒形式”非限定性地表示不具有所有致病能力的病毒。这些无毒病毒可以是减毒病毒，失活病毒等，该无毒病毒用于包括主动免疫和被动免疫在内的所有类型的免疫中。能导致本文所述疾病的能力消失的天然的无毒对应物也包括在本发明的范围之内。
术语“鱼”指任何受CV病毒感染的水产鱼，包括食用和观赏的商业鱼，不管这些鱼在何种发育阶段，如幼鱼、鱼苗或成鱼。这个术语还包括任何可能受CV病毒感染的水产生物，或那些自身没有表现或显示感染CV病毒的致病鲤鱼的特征行为的感染动物。
图1描述了将俘获的首次用作实验的鲤鱼与从受感染的养殖场得到的染病样本鱼相接触。和染病样本鱼接触的鱼死亡率高。接触后8～13天后平均死亡率为74％(分别为87条和84条)。而所有对照鱼在21天的试验期间都存活下来。
鱼在死亡前的3～4天停止进食，并有异常表现，如疲乏和在浅水中表现出喘息动作。另外，鱼表现出运动不协调、游动不稳定，呈现神经混乱特征。在几条鱼中发现神经性症状，如摆尾动作的频率下降和失去平衡。在锦鲤和鲤鱼中类似的症状以前在美国也有报道(Hedrick，2000)。这些症状之后就出现严重的鳃组织坏死、表面出血和皮肤上粘液分泌增加。对病鱼进行尸验发现在肝脏中有斑状出血和其它不一致的病理变化，提示这些可能是次级感染的症状(未显示)。
在鱼箱中进行的类似试验中，将鱼饲养在29℃的温度，所有接触感染的鱼在22天时期内都存活下来(数据未显示)。这些结果显然表明，致病病毒容易在水中传播并且感染性高。病毒产生高的死亡率，但是疾病的发生限制在水温18℃～25℃的温度范围内。
根据本发明，本发明提供了一种此前描述的CV病毒的分离方法，所述方法包括对出现了与CV病毒相关的症状的鱼进行鉴别；将感染的组织和鲤鱼鳍细胞共培养，直到产生细胞病变效应；从感染组织和CFC的共培养物中获取培养基并分离病毒颗粒。
在一个具体实施例中，按照下面程序从被感染的样品中分离出所述病毒。将从染病鱼的肾脏(11个样品)和肝脏(5个样品)得到的细胞和CFC共培养，接种5～6天后出现细胞病变效应(CPE)，但来自染病鲤鱼的脑血管细胞或血清的共培养物没有出现细胞病变效应。共培养后10天，培养细胞不再粘附在烧瓶瓶底并死亡。将从与肾脏或肝脏细胞(感染后5～7天)共培养的CFC中获取的培养基首先通过离心除去细胞和细胞碎片，然后用于新鲜CFC烧瓶中的病毒滴定。
从感染的CFC培养物中获取培养基，进行离心澄清和蔗糖梯度纯化。将37％～39％蔗糖的清晰条带从梯度中取出，在PBS中稀释10倍，离心沉淀。再将沉淀悬浮在500μl的PBS中，取出样品用于在CFC中的滴定和电子显微镜分析。在培养基中的纯化的病毒制备物的滴度为106～107PFU/ml。图2显示本制备物的一对病毒颗粒，完全没有细胞碎片。对所述病毒颗粒进行负染色，呈现对称的二十面体形态，平均核直径为103nm，类似于疱疹病毒核(Riozman等，Exp.Med.Biol.，第278卷，285～291，1990)。
表1A显示首次用于实验的鱼用未感染CFC的澄清培养基接种后没有产生症状。但是，用被感染的细胞提取物或从感染的培养物中获取的澄清培养基接种的鱼，在腹膜内注射后15天内分别有75％和82％死亡。这些鱼出现的典型病理症状与在生长在鱼塘里的感染鱼中观察到的典型病症相同。
将取自表现出疾病症状的接种样品的肾脏细胞与CFC共培养。如表1B所示，噬菌斑测定结果发现，从共培养的培养物上收获的病毒在CFC中的滴度为1.5×102PFU/ml～1.8×102PFU/ml。从这些感染的CFC中获取的培养基用于对首次用于实验的幼鱼进行再感染。在感染后9～14天，10条鱼中有4条死于所述疾病(表1C)。
连续重复3次的“乒乓”型试验清楚地证明了以下事实从感染的鱼分离的病毒和在CFC中繁殖的病毒确实是该疾病的病原体。
表1A导致鲤鱼死亡的病毒的分离

表1BCFC共培养

表1C幼鲤鱼的再感染

图3A显示按照以下各种程序，对采用苯酚提取法从纯化的病毒中获取的病毒DNA基因组进行的比较与蛋白酶K和SDS温育(图3A，泳道2)；只与SDS温育(泳道3)；用链霉蛋白酶和SDS处理(泳道4)；没有进行预处理(泳道5)。通过琼脂糖凝胶电泳(0.8％)进行DNA制备物的分析。根据λ噬菌体DNA标记物进行判断，在琼脂糖凝胶上迁移的基因组CV DNA大小为25kb～35kb的DNA。以Cla I酶切的线性腺病毒质粒(pAdEasy-1)DNA(泳道6)作为标记物，迁移了大概相同的距离。
为了测定CV基因组DNA的重量，如图3B所示，对与图3A所述相同的DNA制备物通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行分析。所有4个CV DNA制备物在凝胶中慢慢迁移到λDNA标记物的250kb～350kb标记处。环状的pAdEasy-1(而不是线性的质粒DNA)也在凝胶中慢慢地迁移至150kb～200kb的λDNA标记物处。
在图3C中显示的是CV DNA经过限制性酶切后所获得的结果，该结果也支持CV是约275kb的大DNA病毒。图3C泳道1显示未经酶切的CV DNA的大小约为275kb。经过Swa I酶切后得到20kb和255kb的两条带(泳道2)。
利用考马斯蓝染色对CV病毒蛋白质进行分析，结果显示，CV与腺病毒和HSV-1病毒明显不同。而且，如图4所示，与兔抗鲤鱼病毒抗体一起染色，显示血清只与CV蛋白反应，而不与疱疹或腺病毒蛋白质反应。
这样，在本发明的另外一个方面，提供一种分离的抗体，该抗体选择性地与本发明的CV病毒或CV病毒成分相结合。在一个实施方案中，该抗体以固化形式存在。
将BamHI-EcoRI酶切的病毒DNA片段克隆到Bluescript质粒(Alting-Mees等，Nucl.Acids Res.，第17卷，9494，1989)中，病毒DNA克隆经过测序，并用BLAST程序(Altchul等，Nucl.Acids Res.，第25卷，3389～3402，1997和Short等，Nucl.Acids Res.，第16卷，7583～7600，1988)进行分析。通过使用获自克隆A～D序列的内部引物，证明了这些克隆代表病毒DNA。图5显示获自例如克隆D的引物可以有效地从病毒DNA、经感染的培养细胞DNA和染病鱼中扩增到正确的片段，但不能从未感染的CFC和首次用于实验的鱼中克隆到正确片段。从克隆A～C中也获得了类似的结果(结果未显示)。对获自CV基因组的超过3500bp进行分析，未发现超过45bp的片段与基因库(GeneBank)中描述的片段同源(图6)。虽然CV克隆只含有与其它病毒同源的小片段，但很多这些片段源自于疱疹病毒科成员和杆状病毒科家族成员。
一方面，本发明涉及与CV病毒有关的疾病的诊断方法，该方法包括从怀疑患病的鱼中分离组织，测定与CV DNA病毒有关的病毒标记的存在，病毒标记的存在说明所检测的鱼感染了本发明的病毒。
术语“组织”涉及从特定器官中获得的任何组织、从几个器官中获得的组织、整条鱼或血液。该术语还包括用于诊断所述疾病的任何器官或其部分。优选所述组织为从鳃、肾脏、脾脏、肝脏或肠获得的组织。
根据所述诊断方法，所述疾病可以非限定性地通过例如上述的PCR法、下述的免疫组织化学法、和/或下述的通过酶联免疫测定(ELISA)检测抗病毒鱼血清的方法进行。
AP(碱性磷酸酶)、辣根过氧化酶(HRP)和异硫氰酸荧光素偶联物(FITC)等方法也用于不同的诊断程序(见实施例的实验部分)中。
根据另一方面，本发明提供一种所述CV DNA病毒的活的减毒形式。术语“活的减毒的”或“减毒”是指失去毒性的病毒形式或使病毒失去致病能力的过程。已知有多种方法可用于获得活的减毒病毒。减毒可以通过以下方式获得将感染限制在机体中不会形成疾病的区域(Virology，第二版，Raven Press，NY，1990)或从由非天然宿主制备的细胞培养物中对病毒进行连续传代，在传代过程中病毒经受突变。
使用减毒的活病毒疫苗(如本发明的那些疫苗)具有几个优点。通常，活病毒疫苗激活免疫系统的所有阶段，结果使系统和局部的应答、以及免疫球蛋白和细胞介导的应答相平衡。活病毒疫苗还刺激针对病毒的每一个保护抗原的免疫应答，避免了在制备失活疫苗过程中某个保护抗原可能遭到选择性破坏的难题。而且，与失活疫苗相比，活病毒疫苗诱导的免疫通常更持久、更有效和更具有交叉反应性，而且费用更低、更容易操作(Virology，第二版，Raven Press，NY，1990)。
进一步，本发明还提供一种分离所述的活减毒病毒的方法，该方法包括在鱼细胞培养物中接种烈性病毒，优选，所述鱼细胞培养物从锦鲤或鲤鱼的尾鳍或背鳍中获取；鉴定由毒性减弱了的病毒形成的噬菌斑；从该噬菌斑中分离后代病毒。
可以将分离的病毒再次接种到从鲤鱼或各种其它鱼种中获得的鱼细胞培养物中，所述其它鱼种例如但不限于，白鲢、金鱼和青鱼。优选，其它鱼种为金鱼，而且，这些步骤可以重复多次，直到获得充分减毒的活病毒。
所述方法可以进一步包括纯化所述的分离病毒的步骤。
在一个具体的实施例中，来自第4次转移的病毒(P4)被认为是烈性的，而20次转移后(P20和以后)的病毒表现出毒性下降而被认为是减毒的。从第25次转移(P25)以后的病毒完全失去了致病能力。分离非烈性病毒的克隆并评估它们的非病原性特征和接种疫苗潜力。
从细胞培养物中的P4病毒收获培养基和细胞提取物，并用于通过腹膜内注射和浸泡首次用于实验的幼鱼来诱导疾病。
在一个优选实施方案中，分离活的减毒病毒的方法可以进一步包括以下步骤将所述含有活的减毒病毒的培养基干燥，优选通过冻干进行干燥，由此获得干燥的活的减毒病毒。
根据另一个实施方案，所述方法可以进一步包括以下步骤在所述培养基和/或于燥粉末中添加防腐剂和/或还原剂和/或糖。
为了使减毒病毒稳定和防止该病毒恢复成野生型表型，可以通过如化学处理或物理处理在病毒基因组中引入随机突变。化学处理可以使用各种不同的诱变剂，如5-溴脱氧尿苷或5-氮胞苷，物理处理可以使用紫外线照射(260nm，与样品距离为10cm，时间为5秒～30秒)。可用诱变剂处理病毒感染的细胞以确定每种诱变剂的剂量反应曲线。为了最大可能地分离突变体，应该使用半致死剂量，并挑出噬菌斑。将突变的病毒在CFC或KFC上繁殖，注射到10g的鱼中，并如前所述用P4进行激发，对其作为疫苗进行检测。在物理处理的情况下，可以使用已作必要的修正的相同方法。
对于分离所述鲤鱼病毒或分离所述活的减毒病毒的方法，本发明进一步包括通过所述方法之一所获取的鲤鱼病毒。
本发明进一步包括活的减毒病毒在制备疫苗制剂中的应用，所述疫苗制剂用于对鱼进行免疫以对抗前述CV病毒引起的感染。所述制剂包含由前述方法获得的活的减毒病毒作为活性成分。
在本发明上下文中的术语“疫苗”是指能够产生免疫应答以对抗本发明的病毒所引起的感染的物质。这样的疫苗可以产生预防上或治疗上的免疫。所述疫苗可以含有活病毒或失活(或“死”)的病毒，或它们的组合。
在本发明上下文中的术语“免疫”或“免疫应答”是指一种免疫力，所述免疫力能够针对病毒感染引起体液和/或细胞介导的免疫应答，或能够干扰病毒的活性、传播或生长。由本发明疫苗免疫的鱼可能使得感染性病毒受到限制、不生长或不传播。
在本发明的一个实施方案中，所述制剂进一步包含免疫调节佐剂、稳定剂、抗生素、免疫刺激物或其它物质。
佐剂有储存效果，在长时间内慢慢地发挥刺激免疫力的作用。在鱼中，只有疫苗与佐剂混合在一起，弱抗原才能有效，并长期起到保护作用。这些佐剂可以来自那些已在人药或兽药中使用过的佐剂。所述佐剂可以是亲水性佐剂，如氢氧化铝或磷酸铝，或疏水性佐剂，如基于矿物油的佐剂。
可以添加稳定剂如乳糖以在诸如温度变化或在冻干过程等各种条件下起到稳定疫苗制剂的作用。可以添加诸如新霉素和链霉素等抗生素以防止微生物生长的可能性。免疫刺激物可以提高由疫苗提供的保护，并提供抗各种疾病的非特异性保护。曾报道许多化学制品和其它物质在鱼中具有免疫刺激特性，所述化学制品和其它物质例如化学制剂和葡聚糖、藻类(algae-algines)的提取物(甲硅烷基藻酸酯(alginic acid silylic esters))和细胞因子。
当活的减毒病毒以干燥形式的疫苗使用时，该疫苗可以进一步包含恢复液，该恢复液优选为无菌水、盐水或生理溶液。还可以含有来自制备过程的少量残留物质，如细胞或细菌的蛋白质、蛋类蛋白质(eggprotein)、DNA、RNA等。尽管这些物质本身不是添加剂，不过它们可能在疫苗制剂中存在。
另一方面，本发明提供一种用于对鱼进行免疫以对抗CV病毒的疫苗制剂，该疫苗制剂含有前述的活减毒病毒。在一个优选实施方案中，所述疫苗制剂还含有前述的免疫调节佐剂、稳定剂、抗生素、免疫刺激物或其它物质。
在一个具体实施方案中，所述制剂含有所述活减毒病毒的干燥形式。在另一个实施方案中，所述制剂还含有组织培养液或鱼用盐水，所述组织培养液或鱼用盐水含有所述活的减毒病毒。上述液体优选保存在-70℃，最优选该液体中含有甘油。
在另一个实施方案中，所述制剂含有粉碎的染病鱼或粉碎的鱼器官，优选以干燥形式存在。所述粉碎的染病鱼或鱼器官可以通过下述方法制备，该方法包括用减毒病毒感染鱼；感染后5～6天，将所述染病鱼或鱼器官粉碎。
在一个实施方案中，所述方法还包括将所述粉碎的鱼或鱼器官干燥，优选通过冻干法进行干燥。在另一个实施方案中，该方法包括在粉碎的鱼或鱼器官和/或干燥粉末中添加防腐剂和/或还原剂和/或糖。
在一个优选实施方案中，疫苗制剂通过将干燥的活的减毒病毒溶解或悬浮在至少一种恢复液中来制备，所述恢复液未添加有佐剂或免疫刺激物。
本发明进一步涉及对鱼进行免疫以对抗由前述CV病毒引起的病毒感染的方法，该方法包括给易感染的鱼施用含有活的减毒CV病毒的疫苗制剂，如此前所述，施用的疫苗量足以对随后的CV病毒感染诱导产生免疫力。
可以给水产鱼单个口服活的减毒病毒，如通过投料或强迫口服，或者通过注射施用所述活的减毒病毒。选择性地，通过喷雾病毒、将病毒溶解和/或浸没在水体中，从而对水体中的所有鱼群同时施用所述活的减毒病毒。这些方法可用于对诸如食用鱼和观赏鱼所有种类的鱼进行疫苗接种，并可用于各种环境中，所述环境例如包括但不限于鱼塘、鱼缸、自然栖息地和新鲜蓄水池。
另一方面，将疫苗施用于1日龄的幼鱼、大约第一次摄食时的鱼苗或成鱼。
本发明进一步提供一种用于对鱼进行被动免疫以对抗CV病毒引起的病毒感染的疫苗制剂，所述疫苗制剂含有用于对鱼进行免疫的血清，所述血清来源于用所述CV病毒的活的减毒形式免疫过的动物如鱼、马、猪、牛、鼠、兔等。在一个优选方案中，所述的动物为鱼。
被动免疫可以用作接触前预防或接触后预防。但是，在鱼已经和病毒接触的鱼塘和水产养殖中最有用。可采用一种或多种此前披露的方法将疫苗施用至鱼，所述方法优选口服方法，更优选注射方法。
在这一方面，本发明进一步提供对鱼进行处理以使鱼对抗所述CV病毒引起的感染的方法。该方法包括以下步骤用本发明的减毒CV病毒免疫动物，收集免疫后动物的血清并用所述血清对鱼进行处理，借此使鱼获得免疫。
本发明进一步提供遗传构建物，该构建物包含来自CV病毒的至少一部分的核苷酸序列。所述遗传构建物可以含有所有在鲤鱼病毒中自然存在的基因组、其cDNA等价物和/或含有来自CV病毒的至少一部分基因组的核苷酸序列的所有重组构建物。
在一个具体实施方案中，提供了用于在鱼中诱导免疫应答的疫苗制剂，所述鱼优选锦鲤和鲤鱼，该疫苗制剂含有表达载体，所述表达载体包含能诱导病毒蛋白质(特别是本发明CV病毒的包膜蛋白)表达的核苷酸序列。所述表达载体可以单独施用，也可以与至少一种在同一个或另一个表达载体中的其它核苷酸序列组合施用，以对至少一种另外的疾病进行同时免疫。蛋白质在鱼的靶细胞中的表达将诱导免疫应答。当表达载体编码与不同疾病相关的蛋白或多肽时，所获得的免疫应答可以对本发明的CV病毒和其它疾病提供免疫力。
本发明的另一方面提供一种载体，该载体含有可诱导病毒蛋白质(特别是本发明CV病毒的包膜蛋白)表达的核苷酸序列。
所述载体的一种应用为在水产鱼中诱导免疫应答，所述应用包括给鱼施用疫苗制剂以诱导免疫应答，所述制剂包含表达载体，该表达载体含有编码所述鲤鱼病毒的一种或多种蛋白质的核苷酸序列和一种控制所述核苷酸序列在鲤鱼细胞中表达的控制序列。
本发明进一步涉及试剂盒，所述试剂盒含有用于对鱼中的鲤鱼病毒进行治疗的活的减毒病毒和使用说明书。所述活的减毒病毒可以是干燥形式或恢复溶液的形式，或以贮存在周围环境中、优选在-70℃中的组织培养液形式，或为含有甘油的溶液。试剂盒还可以含有活的减毒病毒，该病毒存在于切碎的鱼或鱼器官中，所述粉碎的鱼或鱼器官优选以干燥的形式存在。当病毒以干燥形式存在时，试剂盒可进一步包含恢复液。在一个优选的实施方案中，活的减毒病毒是干燥的。在另一个实施方案中，活的减毒病毒被存放在-70℃。
可将试剂盒贮存在周围环境中，优选存放在真空中。
本发明进一步提供一种抗体，该抗体选择性地或特异地结合到本发明的CV DNA病毒或其片段上。术语“抗体”是指IgG、IgM、IgD、IgA和IgG抗体。该定义还包括多克隆抗体或单克隆抗体。该术语还指含有抗CLH产品抗体的抗原结合区的整个抗体或所述抗体的片段，所述抗CLH产品抗体例如，没有Fc部分的抗体、单链抗体、主要仅由抗体的可变区和抗原结合区组成的片段等。在本发明上下文中的术语“选择性地”是指，与其它DNA病毒相比，如上所述的抗体能以较高亲和力与CV DNA病毒结合，并且根据统计检测判断，所述结合是显著的。
本发明进一步涉及诊断试剂盒，该试剂盒含有用于诊断与CV病毒相关疾病的至少一种抗体或至少一种偶联抗体，以及使用说明书。所述试剂盒还可以进一步包含有至少一种对照抗原或者含有所述对照抗原的对照组织样品。所述至少一种的抗体或至少一种偶联抗体可以为溶液形式或干燥形式，如果至少一种抗体或至少一种偶联抗体是以干燥的形式存在，所述试剂盒可以进一步包括用于反应的适当溶液。在本发明的一个实施方案中，所述至少一种偶联物是酶，在这种情况下，该试剂盒进一步包含至少一种检测反应所必需的底物。
本申请的诊断试剂盒可以用于诊断活鱼或死鱼是否存在本发明所述的病毒。在一个实施方案中，诊断试剂盒可以在采用本发明的疫苗或本领域技术人员熟知的任何其它疫苗对鱼进行处理后，对鱼的免疫水平进行评估。在这种情况下，可以从活鱼抽取血液，用诊断试剂盒来评价免疫程度，如所检测的鱼是否患病，并对感染程度进行评估。如果发现所检测的鱼没有被感染，就可以将它们放回养殖场中。
实施例概述鱼将平均重量为42g的锦鲤或鲤鱼培养在500L的鱼箱中，水温22～24℃，注入新鲜水的流速为0.9L/min。
电子显微镜将纯化的病毒制剂用2％钨酸磷进行负染色。用飞利浦120电子显微镜对载网(grid)进行检查，电压为80kV。
实施例1细胞培养物的制备将重量为50g的锦鲤或鲤鱼进行麻醉，取下鱼的尾鳍，将所得尾鳍浸泡在1％的次氯酸钠溶液中1分钟，然后用70％的乙醇漂洗几分钟。然后将鳍用含有青霉素和链霉素的PBS溶液冲洗3次，每次0.5分钟。将鳍转移到皮氏培养皿，用剪刀充分剪碎，将半干的约1mm3的小组织块放到干燥的50ml培养瓶中。室温下温育60分钟后，用细胞培养基覆盖粘附到培养瓶上的组织块，所述细胞培养基含有60％的Dulbecco改良必需培养基(DMEM)、20％的Leibovitz L-15培养基(由以色列Kibbutz BeitHaemek的Biological Industries提供)、10％胎牛血清(FCS)(由以色列Kibbutz Beit Haemek的Biological Industries提供)、10％胰蛋白磷酸盐、并添加有1％HEPES和抗生素。在22℃温育10～14天期间，从组织上长出细胞，在每块组织的周围形成单层。将单层培养物经过胰蛋白酶处理后转移到含有新鲜培养基的新培养瓶中。可以将鳍块转移到新的培养瓶以形成原代细胞的新的单层培养物。
实施例2从培养基纯化病毒将从感染的CFC获取的培养基经过离心去除细胞和细胞碎片，离心条件为10,000×g，离心时间为10分钟。然后用Beckman Ti-60转子在10,000×g离心50分钟，病毒得以沉淀。然后将沉淀悬浮在PBS中并上样至由PBS制备的15％～65％(重量/体积)蔗糖梯度上，在Beckman SW28转子在110,000×g离心60分钟。从离心管中吸取条带，用PBS稀释10倍，并重新沉淀。将沉淀悬浮在PBS中，并冷冻在-75℃以备进一步实验使用。
实施例3病毒DNA的纯化和质粒构建将纯化的病毒沉淀悬浮在含有0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)的TNE缓冲液(10mM Tris pH 7.8、100nM NaCl和l nM EDTA)中。将病毒制备物用蛋白酶K(50μg/ml)处理3小时。用苯酚提取病毒DNA，用乙醇沉淀并将DNA沉淀用TNE悬浮。
用BamHI和EcoRI酶切病毒DNA并将酶切片段克隆到BluespcriptIIKS质粒中(Alting等，Nucl.Acids Res.，第17卷，9494，1989)。用T7和T3引物通过PCR对插入的病毒DNA片段进行测序，并用标准的BLAST程序(Altschul等，Nucl.Acids Res.，第25卷，3389～3402，1997和Short等，Nucl.Acids Res.，第16卷，7583～7600，1988)对序列进行分析。
实施例4通过PCR分析诊断疾病如实施例3所述，通过苯酚从细胞中提取细胞DNA制备物，并用乙醇沉淀。按照Sambrook和Russell所述(Molecular cloningA LaboratoryManual(分子克隆实验手册)，冷泉港实验室出版社，纽约，2001，第6.7～6.10页)，将DNA沉淀悬浮在pH为7.4的TE(Tris-EDTA)缓冲液中。引物AP1、AP2和AP3分别为5’-CCCATGAGGCTGAGGAACGCCG-3’，5’-GCACCCCCGTGATGGTCTTGC-3’和5’-GGAAGATGAGGGCCAGTATGTG-3’，这些引物来自病毒DNA的克隆D(图6)。利用这些引物通过PCR扩增病毒DNA片段。DNA的扩增条件为94℃×45秒，55℃×30秒和72℃×45秒，进行30个循环。PCR产物在1％的琼脂糖凝胶(重量/体积)上进行分离，缓冲液为0.5×TAE，并进行分析。
实施例5通过间接免疫荧光显微镜诊断疾病为了产生抗鲤鱼病毒(CV)的抗体，将0.1mg纯化的CV和弗氏完全佐剂按1∶1比例进行乳化后注射至兔子。每间隔10天，用0.05mg与弗氏不完全佐剂按1∶1比例混合的的纯化CV给兔子进行3次加强免疫，并在首次免疫后的7～10周期间采血3次。将含有抗体的血清从血块中分离出来，并用由正常鱼组织制备的干粉进行吸收，以排除非特异性和非病毒性细胞抗体。
从正常鱼和染病鱼中取出肾脏、脾脏、肝脏和脑，并将其用于制备接触印记载玻片(touch imprint slide)。接触印记载玻片用3％的多聚甲醛固定，用PBS冲洗，并用含有50％FCS的低脂奶温育60分钟进行封闭。然后将载玻片与兔抗CV抗体温育1小时，用PBS冲洗，与异硫氰酸荧光素偶联的猪抗兔抗体一起温育1小时，用PBS冲洗，用配有40×平象复消色差物镜的尼康Microphot-FX显微镜在紫外灯下进行分析。
用兔CV抗血清检测病毒在染病鱼上的位置。来自染病鱼而不是首次用于实验的鱼的肾脏的接触印记用兔CV抗血清进行标记呈阳性，表明在肾脏内病毒含量丰富。这些结果与PCR实验的结果和其它显示肾脏含有大量感染性病毒的实验结果是一致的。根据这一技术检测，在染病鱼的脑和肝脏中含有病毒量是显著的，但其量低于肾脏中的病毒量。来自首次用于实验的鱼或用没有经过免疫的兔血清处理的染病鱼的相应器官的对照接触印记载玻片，用荧光素偶联的猪抗兔血清对其进行染色，没有发现染色。在染病鱼的脾脏接触印记载玻片或血涂片上没有检测到病毒抗原。
实施例6通过检测抗病毒鱼血清诊断疾病用纯化的病毒制剂包被ELISA板，并用奶液和/或明胶封闭。然后用PBS冲洗3次，用检测鱼的血清板包被孔，并在室温下温育1小时。再冲洗板，用兔抗鱼IgB处理1小时，再次冲洗。用碱性磷酸酶偶联的羊抗兔血清检测鱼抗病毒血清的滴度，与ELISA底物温育，并用ELISA读取仪进行读取。
实施例7鱼的最佳免疫年龄的测定通过将一组200条的1日龄幼鱼浸泡在加入了10ml的P4溶液的5L水池里，进行P4感染。感染后20天，将幼鱼保持在温度为23℃的水里使其发病。与未感染的幼鱼相比，感染的幼鱼的存活率较低。培育感染后存活下来的幼鱼直至45天。在此阶段，采用与上述感染幼鱼方法相同的方法，用P4溶液重新感染这些鱼苗。
此时，除了所详述的感染鱼苗外，将同一养殖场中的另一组45日龄鱼第一次接触病毒，该组鱼此前没有被病毒感染过。与同样年龄的第一次接触病毒的鱼相比，在一日龄时被感染后存活下来的鱼苗在45日龄时对疾病产生了显著抗性。
这些试验表明45日龄的鱼(7g)和更老的鱼可以被很好地免疫。较低重量的鱼，即2.5g～3g，也能被很好地免疫，但观察到高出约20％的死亡率。
实施例8用烈性病毒感染鱼通过将每条鱼注射(I.P.，腹膜内注射)0.2ml的病毒，将几组鱼(每组有50条10g的鱼)用P4致病性病毒进行感染。对照组为用生理溶液(PBS)注射的鱼。如图7A所示，注射后10～25天期间，80％的鱼死亡。
感染后存活下来的鱼，即20条感染组的鱼和50条对照组的鱼在35天后进行再感染。再感染是通过与染病鱼共饲养实现的。如图7B所示，初次感染存活下来的鱼对病毒产生免疫，只有30％的鱼死于该疾病。而观察到第一次接触病毒的鱼死亡率高，几乎达到100％。
实施例9a用活的减毒病毒感染鱼将各有25条10g的鱼的两组鱼，用0.3ml的P25减毒病毒进行注射(I.P.)，病毒的浓度为6×103PFU/ml。作为阴性对照组，用盐水注射25条鱼，而作为阳性对照组，用烈性P4病毒注射25条鱼，病毒的浓度为0.3×103PFU/ml。注射后，将这些鱼在能够发病的条件下培养30天。
从图8A可以观察到，与那些注射烈性病毒的鱼相比，几乎所有注射减毒病毒的鱼都没有发病。
注射了减毒病毒并存活下来的鱼，在第一次接触病毒后30天，通过与病鱼再接触而进行激发。如图8B所示，这些鱼对疾病表现出高度抗性，只有约5％的通过注射而初次接触减毒病毒的鱼受到感染。
这个试验证明了减毒的活病毒对鱼进行免疫以抗鲤鱼病毒的能力。这样的试验重复了3次，结果相似。
实施例9b减毒病毒的效果用转移P26的稀释CV病毒感染锦鲤鳍细胞(KFC)，然后用琼脂覆盖。从4个分离的噬菌斑获取病毒、滴定，并将其腹膜内注射到首次用于实验的鱼中。对照组的鱼用PBS进行注射。监控这些鱼的死亡率25天，在这一期间很少有鱼死亡。第25天，将这些鱼通过与染病鱼共饲养而进行激发，以评测它们对疾病的抗性。与图9得到的结论一样，95％的未感染的对照组的鱼在共饲养后很快就死亡。没有一条经过克隆病毒感染后的鱼出现病征，也没有观察到死亡。这些结果清楚表明，来自转移P26的克隆提供了抗CV病毒所诱导的感染的免疫力。
实施例10干燥的活的减毒病毒的制备将如实施例1所详述那样分离的病毒，在一系列的鲤鱼细胞系中传代培养至少30次，然后将其在限制性条件中并在高度稀释条件下进行转移。观察到所获得的噬菌斑在形态上明显区别于由烈性病毒所产生的噬菌斑。第4次转移的病毒，即P4，经测定为烈性病毒。第20次转移起(P20)病毒的致病能力减弱。第25次转移的病毒(P25)开始，它们的克隆和亚克隆全部失去了致病能力。
从转移P20的感染细胞培养物中获取培养基，分装入2个不同的试管中。其中一个试管保藏在-70℃。将另外一个试管冷冻并冻干，此后获得一种黄色粉末，将其在室温温育2小时。没有添加防腐剂如还原剂或糖。可将干燥的病毒存放在周围环境中，优选地，装在小瓶中真空存放。
为了确定冻干病毒的毒性，将一份干燥的病毒样品恢复后在新鲜的CFC上滴定。平行地，将获自第一个试管的冷冻样品解冻并用于感染新鲜培养物以作为对照。对噬菌斑的数量进行计数，测定结果是干燥病毒的滴度比对照病毒的滴度低5～10倍。
干燥的病毒用纯化的无菌水进行恢复。
实施例11用减毒病毒免疫后抗CV抗体形成的动力学将含有5条鱼的一组鱼，在0天时注射减毒病毒。注射以后，在标记的天数从这些鱼抽血，并通过下述方法评价血清中抗CV抗体的水平。用CV病毒包被ELISA板上的孔，并在添加鱼血清前用奶液封闭。准确地按以下比例稀释鱼血清1∶100、1∶500、1∶2500和1∶12500。充分冲洗每一个孔后，将孔用兔抗鱼Fc包被，如前所述，在室温包被60分钟。然后用AP偶联的羊抗兔IgG处理。
如图10清楚所示，鱼血清含有高水平的抗CV抗体。所述抗体在感染后7～14天出现。其滴度上升并在第21天达到一个高水平。其滴度在这个水平至少保持到感染后51天。这个研究清楚表明，减毒病毒诱导高水平的抗CV抗体。
实施例12被动免疫疫苗的制备将含有15条鱼的一组鱼，用本发明的减毒病毒注射3次，浓度为200PFU/Inj～2000PFU/Inj，间隔期为15天。最后一次接种后15～20天，将鱼抽血。用本领域技术人员公知的方法分离抗CNGV血清，将血清贮藏在-70℃。选择性地，将血清样品冻干并保留到使用为止。
通过将含有50条鱼的一组鱼和染病鱼共饲养使该组鱼与CV病毒接触2～4天。然后给50条鱼中的每条鱼注射抗CNGV血清，并监测发病情况。
结果发现，注射抗CNGV血清的鱼没有发病，而未免疫的鱼发病，并在与染病鱼共饲养后18天内死亡。
实施例13失活病毒的制备将烈性病毒放在离紫外灯10cm的距离在260nm照射2分钟。在2分钟结束时停止照射。将这些病毒按前面实施例所述施用于鱼。
照射结束后，如前所述，检测这些病毒形成噬菌斑的情况。没有形成噬菌斑的样品被认为是失活的，并用于鱼的免疫。
重复试验表明，只照射烈性病毒样品几秒时间就可以产生发生随机突变的活化病毒。
实施例14先后用失活病毒和活的减毒病毒的组合处理对鱼进行免疫用失活病毒注射含有32条健康鱼的一组鱼。5天后按前面详述的方法用活的减毒病毒进行注射。通过共饲养将这些鱼与染病鱼接触病毒10天时间。这些经过免疫的鱼没有一条表现出染病的行为特征(结果未显示)。
参考文献这里提供的以下参考文献是为了更好地理解本发明，而不应理解为对本发明的专利性进行限制。
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权利要求
1.一种分离的在鱼中引起致死性病毒病的鲤鱼DNA病毒，通过电子显微镜测定，所述DNA病毒是大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm所述病毒的DNA具有约250,000～300,000个碱基对。
2.一种分离的在鱼中引起致死性病毒病的鲤鱼DNA病毒，通过电子显微镜测定，所述DNA病毒是大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm；所述病毒的DNA具有约260,000～285,000个碱基对。
3.一种分离的在鱼中引起致死性病毒病的鲤鱼DNA病毒，通过电子显微镜测定，所述DNA病毒是大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm；所述病毒的DNA具有约277,000个碱基对。
4.如权利要求1～3任一项所述的病毒，其中，所述的鱼是鲤鱼种。
5.如前述任一项权利要求所述的病毒，该病毒是纯化的，不含其它病毒或微生物材料。
6.一种分离的鲤鱼DNA病毒，该鲤鱼DNA病毒的保藏号为CNCMI-3145。
7.一种在鱼中引起致死性病毒病的鲤鱼DNA病毒的无毒形式，通过电子显微镜测定，所述DNA病毒是大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm；所述病毒的DNA具有约250,000～300,000个碱基对。
8.一种在鱼中引起致死性病毒病的鲤鱼DNA病毒的无毒形式，通过电子显微镜测定，所述DNA病毒是大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm；所述病毒的DNA具有约260,000～285,000个碱基对。
9.一种在鱼中引起致死性病毒病的鲤鱼DNA病毒的无毒形式，通过电子显微镜测定，所述DNA病毒是大的双链DNA病毒，该病毒的衣壳呈二十面体形态，衣壳大小为约90nm～110nm；所述病毒的DNA具有约277,000个碱基对。
10.如权利要求7～9任一项所述的病毒的无毒形式，该病毒的无毒形式是鲤鱼DNA病毒的活的减毒病毒形式、失活的病毒形式、遗传修饰的病毒形式。
11.如权利要求10所述的病毒的无毒形式，该病毒的无毒形式是鲤鱼DNA病毒的活的减毒形式。
12.如权利要求10所述的病毒的无毒形式，该病毒的无毒形式是鲤鱼DNA病毒的失活形式。
13.如权利要求10所述的病毒的无毒形式，该病毒的无毒形式是鲤鱼DNA病毒的遗传修饰形式。
14.如权利要求7～13任一项所述的病毒的无毒形式，其中，所述的鱼是鲤鱼种。
15.如权利要求7～14任一项所述的病毒，该病毒以纯化形式存在，不含其它病毒或微生物材料。
16.如权利要求7～15任一项所述的病毒，该病毒以冷冻形式存在。
17.如权利要求1～16任一项所述的病毒，该病毒以干燥形式存在。
18.一种活的减毒的鲤鱼DNA病毒，该病毒的保藏号为CNCMI-3146。
19.一种如权利要求1～3任一项所述的鲤鱼DNA病毒的分离方法，该方法包括鉴定出现与鲤鱼病毒相关的症状的鱼；从所述感染的鱼获取组织；将鲤鱼鳍细胞与感染组织共培养直到在所述细胞中发生细胞病理效应；从鲤鱼或锦鲤鳍细胞和感染组织的共培养物中获取培养基；分离病毒颗粒。
20.如权利要求19所述的方法，其中，所述的感染器官是肾脏和肝脏组织；将感染器官和CFC的共培养直到在所述细胞中发生细胞病理效应需要5～6天。
21.如权利要求10所述的活的减毒的鲤鱼病毒的分离方法，该方法包括在鱼细胞培养物中接种如权利要求1～3任一项所述的烈性病毒；鉴定毒性减弱了的病毒所形成的噬菌斑；并从该噬菌斑中分离后代病毒。
22.如权利要求21所述的方法，其中，将所述分离的病毒再次接种到鱼细胞培养物上，该步骤重复进行多次，直到获得毒性充分减弱的活病毒。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述的细胞培养物是锦鲤或鲤鱼的细胞系的培养物。
24.如权利要求22所述的方法，其中，所述细胞培养物是其它鱼种的细胞培养物，该其它鱼种选自白鲢、金鱼或青鱼。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述其它鱼种是金鱼。
26.如权利要求21～25任一项所述的方法，其中，所述细胞培养物是从锦鲤或鲤鱼的尾鳍和/或背鳍制备的。
27.如权利要求20～26任一项所述的方法，该方法包括对分离的活的减毒病毒进行纯化的步骤。
28.如权利要求20～27任一项所述的方法，该方法包括对含有活的减毒病毒的培养基进行干燥的步骤，借此获得干燥的活的减毒病毒。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述的干燥是通过冻干进行干燥。
30.如权利要求20～29任一项所述的方法，该方法包括在-70℃将病毒冷冻在培养基中的步骤。
31.如权利要求21～30任一项所述的方法，该方法进一步包括通过在所述病毒的基因组中引入随机突变而使所述减毒病毒稳定的步骤。
32.鲤鱼病毒，其通过权利要求19或20所述的方法获得。
33.活的减毒的鲤鱼病毒，其通过权利要求21～31任一项所述的方法获得。
34.权利要求7～17任一项所述的病毒形式在疫苗制剂的制备中的应用，该疫苗制剂用于对鱼进行免疫以对抗鲤鱼病毒引起的感染。
35.如权利要求34所述的应用，其中，所述活的减毒病毒以粉碎的鱼或者粉碎的鱼的器官的形式存在。
36.如权利要求35所述的应用，其中，所述粉碎的鱼可通过将用所述减毒病毒感染后5～6天的鱼或其任何器官粉碎而获得。
37.如权利要求34～36任一项所述的应用，其中，所述制剂还包含免疫调节佐剂、稳定剂、抗生素、免疫刺激物或其它物质。
38.如权利要求34所述的应用，其中，所述的疫苗还可含有恢复液。
39.一种对鱼进行免疫以对抗鲤鱼病毒引起的感染的疫苗制剂，该疫苗试剂含有权利要求7～9任一项所述的病毒的无毒形式。
40.一种对鱼进行免疫以对抗鲤鱼病毒引起的感染的疫苗制剂，该疫苗试剂含有权利要求11所述的活的减毒病毒。
41.一种对鱼进行免疫以对抗鲤鱼病毒引起的感染的疫苗制剂，该疫苗试剂含有权利要求12所述的病毒的失活形式。
42.如权利要求39～41任一项所述的疫苗，该疫苗还含有一种或多种免疫调节佐剂、稳定剂、抗生素、免疫刺激物或其它物质。
43.一种抗体，其选择性地与权利要求1～4任一项所述的病毒或者其组分相结合。
44.如权利要求43所述的抗体，所述抗体以固化形式存在。
45.一种与权利要求1～3任一项所述的鲤鱼病毒有关的疾病的诊断方法，所述的方法包括从怀疑患病的鱼中分离组织并测定与CV DNA病毒有关的病毒标记的存在，所述病毒标记的存在表明所检测的鱼感染了本发明的病毒。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述的组织可从特定的器官、几种器官、整条鱼或血液获得。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述器官是鳃、肾脏、脾脏、肝脏或肠。
48.一种对鱼进行免疫以对抗病毒感染的方法，该方法包括给易感染的鱼施用含有权利要求7～13任一项所述的病毒的无毒形式的疫苗制剂，所述的疫苗制剂的施用量足以对随后的鲤鱼病毒感染诱导产生免疫力。
49.一种对鱼进行免疫以对抗病毒感染的方法，该方法包括给易感染的鱼施用含有权利要求11所述的活的减毒鲤鱼病毒的疫苗制剂，所述的疫苗制剂的施用量足以对随后的鲤鱼病毒感染诱导产生免疫力。
50.一种对鱼进行免疫以对抗病毒感染的方法，所述方法包括给易感染的鱼施用含有权利要求12所述的失活鲤鱼病毒的疫苗制剂，所述的疫苗制剂的施用量足以对随后的鲤鱼病毒感染诱导产生免疫力。
51.一种对鱼进行免疫以对抗病毒感染的方法，所述方法包括给易感染的鱼施用含有权利要求11所述的活的减毒鲤鱼病毒的疫苗制剂和权利要求12所述的失活病毒的疫苗制剂，每种所述疫苗制剂的施用量足以对随后的鲤鱼病毒感染诱导产生免疫力。
52.如权利要求51所述的方法，其中，所述失活的鲤鱼病毒的施用比活的减毒病毒的施用早几天。
53.如权利要求48～52任一项所述的方法，其中，所述疫苗施用于水产养殖场。
54.如权利要求48～53任一项所述的方法，其中，所述施用步骤包括给单个的鱼进行注射，或制剂喷雾或浸没到养殖场中。
55.如权利要求54所述的方法，其中，所述疫苗的施用是通过投食让鱼口服。
56.如权利要求54所述的方法，其中，所述的鱼包括幼鱼、鱼苗和成鱼。
57.一种在鱼中诱导免疫应答的疫苗制剂，该疫苗制剂包含表达载体，该表达载体含有编码权利要求1、2或3任一项所述的病毒的一种或多种蛋白质的核苷酸序列，和控制所述核苷酸序列在鲤鱼细胞中的表达的控制序列，所述疫苗制剂还包含载体、赋形剂或佐剂。
58.如权利要求57所述的疫苗制剂，其中，所述的鱼是锦鲤和鲤鱼。
59.一种在水产生物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给水产生物施用用于在鱼中诱导免疫应答的疫苗制剂，该制剂包含表达载体，该表达载体含有编码权利要求1、2或3任一项所述的病毒的一种或多种蛋白质的核苷酸序列和控制所述核苷酸序列在鲤鱼细胞中表达的控制序列，所述的疫苗制剂还包含载体、赋形剂或佐剂。
60.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求11所述的用于在鱼中进行抗鲤鱼病毒治疗的活的减毒病毒和使用说明书。
61.一种试剂盒，该试剂盒包含如权利要求12所述的用于在鱼中进行抗鲤鱼病毒治疗的失活病毒和使用说明书。
62.如权利要求60或61所述的试剂盒，其中，所述病毒以组织培养液的形式存在。
63.如权利要求62所述的试剂盒，其中，所述的组织培养液是冷冻的。
64.如权利要求62所述的试剂盒，其中，所述的组织培养液含有甘油。
65.如权利要求60或61所述的试剂盒，其中，所述的病毒以干燥形式存在。
66.如权利要求65所述的试剂盒，该试剂盒还包含有恢复液。
67.一种试剂盒，该试剂盒包含用于诊断与权利要求1、2或3任一项所述的鲤鱼病毒相关的疾病的至少一种抗体或至少一种偶联的抗体和使用说明书，所述抗体或偶联的抗体各自选择性地与本发明的CV病毒或其组分结合。
68.如权利要求67所述的试剂盒，该试剂盒还包含有至少一种对照。
69.如权利要求68所述的试剂盒，其中，所述的对照是抗原或含有抗原的组织。
70.如权利要求67所述的试剂盒，其中，所述至少一种抗体或至少一种偶联抗体存在溶液中或是干燥的。
71.如权利要求67～70任一项所述的试剂盒，该试剂盒还含有恢复液。
72.如权利要求71所述的试剂盒，该试剂盒用于诊断活鱼中的所述疾病。
73.一种用于对鱼进行免疫以对抗鲤鱼病毒引起的感染的疫苗制剂，该疫苗制剂含有动物血清，所述动物用权利要求7～13任一项所述的CV病毒的无毒形式免疫过。
74.一种用于对鱼进行抗鲤鱼病毒免疫的疫苗制剂，该疫苗制剂含有动物血清，所述动物用权利要求11所述的CV病毒的活的减毒病毒形式免疫过。
75.一种用于对鱼进行免疫以对抗鲤鱼病毒引起的感染的疫苗制剂，该疫苗制剂含有动物血清，所述动物用权利要求12所述的CV病毒的失活病毒形式免疫过。
76.如权利要求73～75任一项所述的疫苗制剂，其中，所述的动物是鱼。
77.如权利要求73～76任一项所述的疫苗制剂，其中，所述的疫苗用于鱼与鲤鱼病毒接触前或接触后。
78.一种对鱼进行处理以对抗所述CV病毒引起的感染的方法，该方法包括以下步骤用本发明的减毒CV病毒免疫动物；采集经过免疫的动物的血清并用所述血清处理鱼，借此使鱼获得免疫。
79.如权利要求78所述的方法，其中，所述的动物是鱼。
80.一种表达载体，该载体含有编码如权利要求1、2或3所述的病毒的一种或多种蛋白质的核苷酸序列。
全文摘要
本发明提供一种分离的影响鲤鱼种(Cyprinuscarpino)的病原体及其分离方法。本发明还提供病毒的无毒形式，如病毒的活的减毒形式、病毒的失活形式、病毒的遗传修饰形式，这些形式可以用于易感染的鱼的接种。
文档编号A61K39/245GK1742083SQ200380108053
公开日2006年3月1日 申请日期2003年12月22日 优先权日2003年1月1日
发明者摩西·科特勒, 阿亚纳·贝尼特, 伊扎克·贝耶罗农, 米希姆·陈, 马里纳·胡托兰, 阿里埃勒·罗农 申请人:耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发公司, 农业园林发展部渔业和水产业部